KR20160125759A - 인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제 - Google Patents

인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제 Download PDF

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양세란
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포는 증식율이 우수하며 미분화 상태로 장기간 유지되고, 골형성세포, 연골형성세포, 지방세포, 간세포 등 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있는 것이 특징이다. 따라서, 상기 줄기세포를 함유하는 세포 치료제로서 관련 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.

Description

인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제{ADULT STEM CELL DERIVED SKIN TISSUE OF HUMAN AND CELL THERAPEUTIC AGENT}
본 발명은 인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다.
줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포(embryonic stem cells, ES cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있으며, 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등이 이에 해당한다.
줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 대책안으로 생각 되어지고 있으며(대한민국 공개특허 2015-0016117호) 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었지만, 면역거부반응이나 공급 장기 부족, 또는 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 인한 효율적인 실용화가 미진한 상태이다. 이에 따라 줄기세포연구에 대한 관심이 지속적으로 고조 되고 있으며, 줄기세포를 이용한 장기재생이나 파킨슨병, 당뇨병, 척수손상 등의 치료에 다양하게 줄기세포의 가능성을 제시해 오고 있다. 그러나 각각의 장기에서 분리한 줄기세포의 분화능이 다르고, 치료에 적용하기 위한 충분한 세포 수를 확보하기가 어려운 문제점들이 있다.
대한민국 공개특허 2015-0016117호
본 발명은 증식율이 우수하며 미분화 상태로 장기간 유지되고, 골형성세포, 연골형성세포, 지방세포, 간전구세포 등 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있는 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 인간 피부조직에서 유래된 성체줄기세포를 절편 배양(explant culture)하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양방법을 제공한다.
일 구현예는 배양방법이 피부조직에서 표피조직과 진피조직을 분리하는 단계; 및 상기 진피조직을 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 일 구현예는 배양하는 단계가 진피조직을 1 내지 2 mm2 크기로 잘라 배양하는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 줄기세포가 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포로 분화되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 배양 배지가 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 및 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지, 배지 199(Medium 199)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 배지가 우태아혈청(FBS)를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된, 인간 피부조직 유래의 줄기세포를 제공한다.
일 구현예는 피부조직이 진피조직인 것일 수 있다.
다른 일 구현예는 줄기세포가 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포로 분화되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.
일 구현예는 세포치료제가 지방세포, 골세포, 연골세포, 또는 간세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용되는 것일 수 있다.
다른 일 구현예는 세포치료제가 연골 재생용인 것일 수 있다.
본 발명의 줄기세포는 증식율이 우수하며 미분화 상태로 장기간 유지되고, 골형성세포, 연골형성세포, 지방세포, 간세포 등 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있는 것이 특징이다.
따라서, 상기 줄기세포를 함유하는 세포 치료제로서 관련 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.
도 1은 실험예 1에 따른 줄기세포를 관찰한 사진을 나타낸 것이다 (A: 심은 조직에서 세포가 뻗어 나오는 것, B: 2 passage 및 15 passage에서의 세포의 모양)
도 2는 계대수에 따른 CPDL값을 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2에 따른 면역학적 특성분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 2에 따른 핵형 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 3에 따른 일반 배지로 배양한 세포(CTL)와 분화된 지방세포(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 3에 따른 Oil Red O의 흡광도를 측정한 수치를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 3에 따른 지방세포의 마커인 PPARγ와 FABP4의 발현이 증가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 4에 따른 일반 배지로 배양한 세포(CTL)와 분화된 골세포(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 4에 따른 Alizarin Red S의 흡광도 측정수치를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 4에 따른 골세포의 마커인 Osteorix와 Runx2의 발현이 증가한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 5에 따른 일반 배지로 배양한 세포(CTL)와 분화된 연골세포(오른쪽)을 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 5에 따른 분화된 연골세포를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 5에 따른 연골세포의 마커인 CD44와 Sox9의 발현이 증가한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 6에 따른 일반 배지로 배양한 세포(CTL)와 분화된 간전구세포(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 6에 따른 간전구세포의 마커인 a-fectoprotein의 발현이 증가한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 인간 피부조직 유래 성체줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 피부조직에서 유래된 성체줄기세포를 절편 배양(explant culture)하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양방법을 제공한다.
상기 배양방법은 진피조직을 분리한 후 적절한 크기로 잘라 배양함에 따라, 콜라겐 등의 물질을 이용하지 않고 인간 피부조직에서 유래된 성체줄기세포를 배양하는 것이 특징이다.
상기 배양방법은 피부조직에서 표피조직과 진피조직을 분리하는 단계; 및 상기 진피조직을 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 인간 피부조직을 분리하여 적절한 크기로 자른 후 표피조직과 진피조직을 분리하고, 상기 분리된 진피조직을 적절한 크기로 잘라 배양한 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계에서 진피조직은 1 내지 2 mm2 크기로 잘라 배양하는 것일 수 있다. 진피조직이 상기 범위 내의 크기로 잘리는 경우, 심어진 조직 바깥부분에서 세포가 뻗어나오므로 작은 조직을 여러 개 심는 것이 세포획득에 유리할 수 있다.
상기 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 및 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 배지는 우태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된, 인간 피부조직 유래, 바람직하게는 인간 피부의 진피조직 유래의 줄기세포를 제공한다.
상기 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포 또는 췌장베타세포로 분화되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포로 분화되는 것일 수 있다.
상기 분화는 줄기세포에 분화유도제를 처리함으로써 지방세포 등으로 분화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서, 세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다
상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌장베타세포, 혈관세포 또는 폐세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용되는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용되는 것일 수 있다.
특히, 상기 세포치료제는 연골 재생용인 것일 수 있다.
상기 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여(intravenous therapy, i.v), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
상기 세포치료제의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 일반건강상태, 성별 및 식이, 투여경로 등 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 상기 세포치료제를 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다.
상기 포유동물이란 함은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
[ 실시예 ]
1. 인간 피부조직 유래 성체줄기세포의 분리 및 배양
강원대학교 병원에서 분양 받은 여성의 피부조직을 4-6 mm2 크기로 자른 다음 1mg/ml 의 Dispase II 용액에 담궈서 4℃ 에서 하룻밤 두었다. 표피조직과 진피조직(dermis)을 분리한 후 진피 조직부분만 1 mm2 크기로 작게주었으며, 작게 잘려진 진피조직을 100mm 배양디쉬에 적당한 간격을 두고 하나씩 놓은 후 그 위에 FBS를 포함한 DMEM 배지를 10 ml 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 에서 배양하며 배지는 3일마다 교체하여 주었다.
2. CPDL 측정
인간 피부조직 유래 성체줄기세포를 분리 한 후 증식율을 조사하기 위해 계대수에 따라 CPDL(cumulative population doubling level) 값을 조사하였다. CPDL은 세포의 증식율을 나타내는 지수로서, 다음과 같은 식으로 표현된다.
CPDL = ln(Nf/Ni)/ln2
(Ni: 초기 seeding한 세포수; Nf: 최종 세포수)
3. 핵형 검사 ( karyotype analysis)
염색체 핵형 분석은 ChIPS-Karyo (GenDix, Inc., Seoul, Korea)를 사용하였다.
4. FACs
인간 피부조직 유래 성체줄기세포의 면역학적 특성을 알아보기 위해 FACS를 이용하였다. 성체줄기세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 sample수 만큼 1 ×105 cells을 분주하였다. 각 웰(well)에 항체(antibody)를 넣고, 얼음에 40분동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 다시 한번, 상기 상층액 제거후 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분동안 원심분리하는 과정을 반복하였다. 싱글(single)화 하고, 플로우 사이토미터를 이용해 분석하였다.
5. RT- PCR
분화능의 정도를 확인하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. Trizol (Invitrogen, CA)을 이용 하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용해 RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 증폭시켰으며, 증폭된 RT-PCR 산물은 1% 아가로스겔에 loading하여 100V 조건에서 30분 동안 전기영동을 통하여 확인하였다.
유전자 구분 프라이머 서열 서열번호
PPARγ Forward 5`-gaccactcccactcctttga-3` 1
Reverse 5`-cgacattcaattgccatgag-3` 2
FABP4 Forward 5`-catcagtgtgaatggggatg-3` 3
Reverse 5`-gtggaagtgacgcctttcat-3` 4
Osteorix Forward 5`-gcagctagaagggagtggtg-3` 5
Reverse 5`-gcaggcaggtgaacttcttc-3` 6
Runx2 Forward 5`-ttacttacaccccgccagtc-3` 7
Reverse 5`-cagcgtcaacaccatcattc-3` 8
CD44 Forward 5`-catctaccccagcaacccta-3` 9
Reverse 5`-ctgtctgtgctgtcggtgat-3` 10
Sox9 Forward 5`-gaggaagtcggtgaagaacg-3` 11
Reverse 5`-aagtcgatagggggctgtct-3` 12
α-fetoprotein Forward 5`-agcttggtggtggatgaaac-3` 13
Reverse 5`-ccctcttcagcaaagcagac-3` 14
Albumin Forward 5`-tgctaatttccctccgtttg-3` 15
Reverse 5`-ctgagcaaaggcaatcaaca-3` 16
GAPDH Forward 5`-gagtcaacggatttggtcgt-3` 17
Reverse 5`-ttgattttggagggatctcg-3` 18
6. 분화 유도 방법
골세포, 연골세포, 지방세포로의 분화는 각각 StemPro Osteogenesis Differentiation Kit, StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit, and Stem pro Adipogenesis Differentiation Kit (Life Technology, CA, USA)을 사용하여 분화유도 하였다. 지방세포로의 분화는 Oil Red O 염색법과 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 골세포로의 분화는 Alizarin Red S 염색법과 RT-PCR을 이용해 분석하였다. 연골세포로의 분화는 Alcian blue 염색법과 RT-PCR을 이용해 분석하였다. 간전구세포로의 분화는 10% FBS, 5 ng/ml oncostatin M, 20 ng/ml hepatocyte growth factor, 100 nM dexamethasone 을 함유한 DMEM 배지에서 20일 배양한 후 RT-PCR을 이용해 분석하였다.
7. 통계 분석
본 실험에 대한 실험결과는 평균과 표준편차 (Mean±SD)로 나타내었으며, 각 군간의 분석에 대한 유의성은 Student’s T-test로 검증하였으며 p<0.05 를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
[ 실험예 ]
1. 세포의 모양과 증식률 측정
상기 실시예에 따라 세포의 모양을 관찰하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 작게 자른 조직을 배양 디쉬에 붙여서 배양한 결과 조직으로부터 세포가 뻗어 나오는 것을 확인할 수 있었으며, 그 세포의 모양이 전형적인 성체 줄기세포와 비슷한 모양을 나타내었다.
또한, 상기 실시예 2에 따라 CPDL을 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, CPDL결과 계대수가 15일 때 CPDL 이 50 정도로 높은 증식률을 보여주었다.
2. 인체 피부조직 유래 줄기세포의 면역학적 특성분석과 핵형 검사
상기 실시예 4에 따라 플루오 사이토 미터를 이용해 중간엽 줄기세포의 면역학적 특성을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 성체 줄기세포의양성 마커인 CD105, CD73, CD90에서 90% 이상의 양성을 보였고, 음성 마커인 HLA-DR, CD45, CD34는 거의 발현하지 않았다.
또한, 상기 실시예 3에 따라 핵형 검사를 진행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 핵형 검사 결과 정상적인 소견을 나타내었다.
3. 인체 피부조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화
상기 실시예 6에 따라 지방세포유도 배지를 이용하여 10일동안 분화 유도 후 Oil Red O 와 RT-PCR로 분화정도를 분석(실시예 5 참조)하였으며, 그 결과를 도 5, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 5, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 지방구로 분화한 세포들이 Oil red o 에 빨갛게 염색된 것을 확인하였으며, 지방세포의 마커인 PPARγ 와 FABP4도 발현이 증가한 것을 확인하였다
4. 인체 피부조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화
상기 실시예 6에 따라 골세포분화 유도 배지를 이용하여 3주동안 분화 유도후 Alizarin Red S 염색과 RT-PCR을 통해 분화 정도를 분석(실시예 5 참조)하였으며, 그 결과를 도 8, 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 8, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 골로 분화한 세포들이 Alizarin Red S 염색이 된 것을 확인하였고, 골세포 마커인 osterix와 Runx2 의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
5. 인체 피부조직 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화
상기 실시예 6에 따라 연골세포분화 유도 배지를 이용하여 3주동안 분화 유도후 Alcian blue 염색과 RT-PCR을 이용하여 분화 정도를 분석(실시예 5 참조)하였으며, 그 결과를 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.
도 11, 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 연골 형태로 구모양으로 형성이 되는 것을 확인하였고, 이것을 Alcian blue로 염색한 결과 분화한 부분이 염색이 된 것을 확인하였으며 또한 연골세포 관련 마커인 CD44 와 Sox9의 발현도 증가한 것을 확인하였다.
6. 인체 피부조직 유래 줄기세포의 간세포로의 분화
상기 실시예 6에 따라 간세포 분화 유도 배지를 20 일 동안 처치하여 간세포로의 분화를 유도하였으며, RT-PCR을 이용하여 분화 정도를 분석(실시예 5 참조)하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 성숙한 간세포 마커인 albumin의 발현은 증가하지 않았지만 그 이전단계인 간전구세포의 마커인 a-fectoprotein의 발현은 증가하였다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> ADULT STEM CELL DERIVED SKIN TISSUE OF HUMAN AND CELL THERAPEUTIC AGENT <130> HY150089 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gaccactccc actcctttga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 cgacattcaa ttgccatgag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 catcagtgtg aatggggatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gtggaagtga cgcctttcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gcagctagaa gggagtggtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gcaggcaggt gaacttcttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 ttacttacac cccgccagtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 cagcgtcaac accatcattc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 catctacccc agcaacccta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ctgtctgtgc tgtcggtgat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 gaggaagtcg gtgaagaacg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 aagtcgatag ggggctgtct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 agcttggtgg tggatgaaac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 ccctcttcag caaagcagac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 tgctaatttc cctccgtttg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 ctgagcaaag gcaatcaaca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 ttgattttgg agggatctcg 20

Claims (12)

  1. 인간 피부조직에서 유래된 성체줄기세포를 절편 배양(explant culture)하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양방법은 피부조직에서 표피조직과 진피조직을 분리하는 단계; 및 상기 진피조직을 배양하는 단계를 포함하는 것인, 줄기세포 배양방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배양하는 단계는 진피조직을 1 내지 2 mm2 크기로 잘라 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포로 분화되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 및 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포 배양방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배지는 우태아혈청(FBS)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양방법.
  7. 제1항의 방법에 의해 수득된, 인간 피부조직 유래의 줄기세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 피부조직은 진피조직인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포 또는 간세포로 분화되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  10. 제7항의 줄기세포를 포함하는 세포치료제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포치료제가 지방세포, 골세포, 연골세포, 또는 간세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포치료제가 연골 재생용인 것을 특징으로 하는 세포치료제.
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