CN114836381B - 诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及血小板裂解物诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞中的用途及诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法和产品。本发明发现了特定分子量的血小板裂解物与巴戟天寡糖组合在体外诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞具有尚未被发现的特性，具体体现为，极显著地提高成熟神经细胞的分化率和增殖速度，且分化后的成熟神经细胞高表达nestin、GFAP、MAP2、NEFH神经细胞特异性基因。显示，具有明确且理想的诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的能力。

Description

诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法及其培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法及其培养基。

背景技术

目前用于体外诱导MSCs分化为神经细胞的主要方法包括生长因子组合法和化学制剂法两种，其普遍存在细胞转分化率不高，成熟神经细胞比例低，分化细胞表型维持时间短，分化稳定性较差的问题。

血小板裂解物含有多种神经营养生长因子，如PDGF、BDNF、VEGF、TGE-β、bFGF和EGE等。bFGF能够通过与组织特异性受体结合，激活靶细胞内酪氨酸蛋白激酶而发挥作用，具有促进细胞增殖、分化、迁移等多种生物学效应；广泛参与血管生成、组织修复、肿瘤发生等生命过程。其作为重要的生长因子，目前在中枢神经系统中的功能逐渐受到重视，其对于神经组织的主要作用体现在神经发生、轴突生长、神经保护与再生等。目前有学者研究了血小板裂解物作为血清替代物对体外培养间充质干细胞的影响，结果显示，血小板裂解物培养间充质干细胞，基本能够代替血清的功能，可满足细胞长期的传代扩增所需，细胞形态稳定，细胞表型及成骨、成脂分化潜能保持稳定。

但血小板裂解物对间充质干细胞体外定向分化为神经细胞的影响未见研究，且血小板裂解物中含有的纤维蛋白原对神经突生长存在抑制作用，这些可能会影响血小板裂解物诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的能力，这也是目前未见将血小板裂解物用于诱导间充质干细胞分化为神经细胞的原因。

王力等研究发现巴戟天的醇提取物可以影响骨髓间充质干细胞在体外的增殖速率^[1]；黄有霖等研究发现，巴戟天的蒽醌苷类提取物在体外也能够明显促进骨髓间充质干细胞的增殖^[2]；凌昆等人在试验中发现，巴戟天的醇提取物能够显著刺激成骨细胞的增殖；巴戟天的正丁醇提取物可促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶，还可促进转录生长因子β1的表达，从而分泌Ⅰ型胶原，促进钙盐沉积^[3]；李楠等人的研究发现，巴戟天多糖可以显著抑制成骨细胞的凋亡，其作用机制为通过影响Bcl-2基因和Bax基因的表达来发挥作用^[4]；朱孟勇等通过动物试验发现巴戟天多糖能够提高去势大鼠的骨密度，巴戟天多糖干预后大鼠骨质密度和骨矿物质明显高于模型组，并且剂量越高，效果越显著^[5]。这些研究都表明，某些特定浓度下的巴戟天多糖或巴戟天提取物具有在体外促进成骨细胞增殖的能力。但是未见研究巴戟天寡糖对间充质干细胞体外定向分化为神经细胞的影响。

[1]王力,王和鸣,李楠.巴戟天醇提物对骨髓基质细胞增殖影响的血清药理学试验方法的建立[J].江西中医学院学报,2004(06):39-41.

[2]黄有霖,郭素华,赵诣.闽产南靖巴戟天中促进骨髓基质细胞增殖成分的初步研究[J].海峡药学,2007(10):38-40.

[3]凌昆,赵诣,郭素华.巴戟天药物血清对成骨细胞生物学特性的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(06):846-849.

[4]李楠,王和鸣,郭素华,林旭，郑良朴，王力.巴戟天多糖含药血清对体外培养成骨细胞凋亡的保护作用观察[J].中国骨伤,2008(01):39-41.

[5]朱孟勇,赫长胜,王彩娇.巴戟天多糖对骨质疏松大鼠骨密度及血清微量元素的影响[J].中草药,2010，41(09):1513-1515.

发明内容

本发明意想不到的发现，尽可能耗尽了纤维蛋白原的，具备特定分子量的血小板裂解物联合巴戟天多糖表现出惊人的诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的能力，表现为诱导分化率高，分化表型和潜能稳定，且分化后神经细胞增殖速度高。据此，产生了用于诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的产品及使用该培养基诱导干细胞定向分化的培养方法。

在一个方面，本发明提供了一种尽可能耗尽了纤维蛋白原的血小板裂解物的制备方法，其包括以下步骤：

步骤S1、对血小板进行裂解，提供血小板裂解物；

步骤S2、50～70℃热处理所述血小板裂解物；

步骤S3、添加金属盐与纤维蛋白原形成可去除的团块；

步骤S4、超滤，收集其中所含组分表现出的最大分子量为90～150kDa的级分；灭菌。

步骤S1中，血小板可通过血小板分离术或通过血沉棕黄层分离法从全血中制备得到。可通过本领域内已知的方法实现裂解血小板，例如采用超声处理、反复冻融。反复冻融通常在-80℃冻存8～24h，37℃空气浴融化，反复冻融3～5次，以血小板裂解率达到95％以上。

步骤S2对所述血小板裂解物进行热处理能够引起其中某些蛋白质沉淀，降低蛋白质含量；热处理时间优选为10～20min，更优选为15min；热处理后，离心保留上清液，上清液继续进行下述步骤S3；离心可以在2～5℃下进行，离心速度优选为1000～3000rpm，离心时间优选为5～8min。

步骤S3中，金属盐优选为氯化钙，通过搅拌等方式使其与上清液中的纤维蛋白原充分形成团块，其中，氯化钙的添加量为0.3～0.6g/L，形成的团块可通过离心后去除，该步骤尽可能的耗尽了纤维蛋白原的含量，因为纤维蛋白原含量的降低对于其在某些用途中是极其有利的。离心可以在20～25℃下进行，离心速度优选为1000～3000rpm，离心时间优选为10～30min。

步骤S4中可通过具有特定截止值的过滤器收集获得特定分子量的血小板裂解物。在进行步骤S4前可通过至少一个以上深层过滤器去除悬浮固体，如残留的血小板碎片、细胞碎片；这种深层过滤器优选为采用0.2μm的滤器进行。

在一个方面，本发明提供了所述血小板裂解物在诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞中的用途，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为90～150kDa或100～150kDa或110～150kDa或120～150kDa或140～150kDa之间的任意值。

在本发明其中一个实施方案中，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa。优选为120kDa、130kDa、140kDa或150kDa；更优选为120kDa。

本发明采取了某些方法将血小板裂解物中的纤维蛋白原尽可能耗尽，同时预期随着纤维蛋白原含量的降低有利于血小板裂解物在体外诱导间充质干细胞分化为神经细胞。但出乎意料的是，尽管尽可能地耗尽了血小板裂解物中的纤维蛋白原，但是仍然无法达到预期的诱导间充质干细胞的效果。

令人吃惊的且意外的是，尽管上述条件制备的血小板裂解物在体外培养及诱导干细胞分化神经细胞方面并未表现出显然有利的特性，但是在加入巴戟天寡糖后却得到了截然相反的结果。且添加巴戟天寡糖后，分子量尽可能靠近90～150kDa的血小板裂解物表现出强大的促进神经细胞定向分化，增殖的能力，这种趋势也与不添加巴戟天寡糖时相反(不添加巴戟天寡糖时，不同分子量的血小板裂解物在诱导定向分化方面表现无明显差异)。

在其中一个实施方案中，巴戟天寡糖的含量1～10μg/ml，更优选为2～10μg/ml、3～10μg/ml、4～10μg/ml、5～10μg/ml、6～10μg/ml、7～10μg/ml、8～10μg/ml和9～10μg/ml之间的任意值。更优选地，巴戟天寡糖的含量最好是3μg/ml、5μg/ml或8μg/ml。

在另一个方面，本发明提供了血小板裂解物在制备诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞产品中的用途，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为90～150kDa或100～150kDa或110～150kDa或120～150kDa或140～150kDa之间的任意值。

在本发明其中一个实施方案中，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa。优选为120kDa、130kDa、140kDa或150kDa；更优选为120kDa。

在本发明其中一个实施方案中，所述产品包括但不限于：培养基、诱导液、试剂盒等。

在另一个方面，本发明所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或神经干细胞；优选为脐带间充质干细胞。试验发现，含有特定分子量的血小板裂解物具备在体外促进离体骨髓干细胞、神经干细胞、脐带间充质干细胞定向分化为神经细胞的作用。

在另一个方面，本发明提供了一种诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞培养基，至少包含：

血小板裂解物1～10wt％；其中，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为90～150kDa；

巴戟天寡糖1～10μg/ml；和

基础培养基余量。

在本发明其中一个实施方案中，所述基础培养基为DMEN/F12培养基、DMEM培养基、α-MEM培养基或RPMI-1640培养基。优选为DMEN/F12培养基。

在本发明其中一个实施方案中，所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量为100～150kDa或110～150kDa或120～150kDa或140～150kDa。所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量更优选为120～150kDa；进一步所述血小板裂解物中所含组分表现出的最大分子量更优选为90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa。甚至优选为120kDa、130kDa、140kDa或150kDa；更优选为120kDa。

在本发明其中一个实施方案中，还包括巴戟天寡糖1～10μg/ml。更优选为2～10μg/ml、3～10μg/ml、4～10μg/ml、5～10μg/ml、6～10μg/ml、7～10μg/ml、8～10μg/ml和9～10μg/ml。更优选地，巴戟天寡糖的含量最好是3μg/ml、5μg/ml或8μg/ml。

在本发明其中一个实施方案中，所述培养基中，血小板裂解物的含量1～10wt％。更优选为3～10wt％、5～10wt％、8～10wt％；更优选为3wt％、5wt％、8wt％、10wt％。

在另一方面，本发明还提供一种诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法，包括以下步骤：

a.取间充质干细胞；

b.采用根据上述培养基培养上述间充质干细胞。

在本发明其中一个实施方案中，所述培养时间为6～10天。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现了特定分子量的血小板裂解物与巴戟天寡糖组合在体外诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞具有尚未被发现的特性，具体体现为，极显著地提高成熟神经细胞的分化率和增殖速度，且分化后的成熟神经细胞高表达nestin、GFAP、MAP2、NEFH神经细胞特异性基因。显示，具有明确且理想的诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的能力。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1、特定分子量的血小板裂解物制备

步骤S1、：将血小板在-80℃冻存12h，37℃空气浴融化，反复冻融5次；

步骤S2、将反复冻融后的血小板裂解物在55℃下热处理15min；5℃下1500rpm离心5min，保留上清液；

步骤S3、往上述上清液中加入0.4g/L的氯化钙，搅拌，使之形成团块；25℃，2000rpm离心25min，保留上清液；

步骤S4、将上清液经0.2μm深层过滤器去除悬浮固体，采用具有特定截止值的离心过滤器收集得到所含组分表现出的最大分子量为50KDa、90KDa、100KDa、120KDa、150KDa、200KDa的血小板裂解物，分别命名为PL50、PL90、PL100、PL120、PL150及PL200，灭菌，备用。

表1：含有血小板裂解物的培养基

组分	CM1	CM2	CM3	CM4	CM5	CM6	CM7	CM8	CM9
										PL50	8wt％	-	-	-	-	-	-	-	-
PL90	-	8wt％	-	-	-	-	-	-	-
										PL100	-	-	8wt％	-	-	-	-	-	-
PL120	-	-	-	8wt％	-	-	8wt％	8wt％	-
										PL150	-	-	-	-	8wt％	-	-	-	-
PL200	-	-	-	-	-	8wt％	-	-	-
										MO	5	5	5	5	5	5	-	-	5
海藻糖	-	-	-	-	-	-	-	0.3	-
										DMEN/F12	余量	余量	余量	余量	余量	余量	余量	余量	余量

注：MO是指巴戟天寡糖，单位μg/m L；海藻糖单位mg/L。

制备方法：将上述配方中各组分按照比例混合均匀即得，

试验例一、血小板裂解物诱导脐带间充质干细胞体外定向分化为神经细胞的研究

1.脐带间充质干细胞培养及传代扩增：取健康足月剖腹产脐带组织，将其置于1％青链霉素无菌生理盐水中，清洗3次。剔除血管，将其剪成1cm×1cm的组织块，均匀放入培养皿中，加入含10％FBS的DMEN/F12培养基，于37℃、5％CO₂条件下进行培养。培养第3天开始，每天半换培养液。待培养皿出现4-5个比较明显的克隆，去掉组织继续培养；待细胞融合度达到80％以上，用0.25％胰蛋白酶EDTA进行消化，按1:2比例传代扩增。

2.诱导脐带间充质干细胞定向分化为神经细胞：取对数生长期P3代细胞，0.25％胰蛋白酶EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种于96孔板。待细胞达到80％以上融合时，分别加入CM1-CM9培养基进行诱导分化，诱导分化时间为6天，同时以DMEN/F12培养基作为阴性对照组。

3.检测

3.1分化率：从诱导分化的第一天开始持续用倒置显微镜每天观察细胞形态及变化，若细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上则可定义为神经样细胞，以此作为定向分化为神经细胞的指标，计算出神经样细胞占总细胞数的比例，计算分化率，结果如表1所示。

从表1可以看出，同时添加血小板裂解物和巴戟天寡糖或海藻糖干预培养均能够促进脐带间充质干细胞定向分化为神经细胞，且其中，以90～150kDa血小板裂解物与巴戟天寡糖同时干预培养效果最好，增殖速率最快。

表1：不同时间点分化为神经样细胞的百分数

组别

1d

2d

3d

4d

5d

6d

CM1

3.2％

10.5％

21.8％

41.7％

53.6％

64.5％

CM2

6.7％

24.4％

43.6％

68.1％

76.3％

82.7％

CM3

8.1％

33.0％

60.2％

75.9％

89.9％

92.0％

CM4

10.6％

38.9％

68.4％

82.5％

91.7％

95.4％

CM5

8.9％

31.5％

54.9％

71.6％

85.6％

90.8％

CM6

5.3％

16.1％

30.6％

49.0％

62.2％

71.3％

CM7

0.5％

2.1％

5.8％

10.9％

18.4％

32.3％

CM8

4.8％

12.9％

28.7％

33.7％

51.0％

60.5％

CM9

0

0

1.5％

6.4％

11.5％

19.7％

阴性对照组

0

1.0％

2.3％

5.5％

10.5％

22.6％

3.2神经细胞标志蛋白观察

于诱导培养第6天，取各组培养的细胞采用PBS洗涤2次后，加入4％多聚甲醛固定15min，用1％PBS Triton洗涤2次；加入封闭液封闭1h；分别滴加适当浓度的一抗[小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白GFAP(1:100)、兔抗大鼠Tujl单克隆抗体(1:200)、nestin(1:150)]，37℃孵育1h，1％PBS Triton洗涤2次，分别对应加入二抗[异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG(1:150)、Cy3标记的羊抗兔IgG(1:200)、Cy3标记的羊抗小鼠IgG(1:100)]室温孵育1h，加入Hoechst 332585min，PBS洗涤2次，加入抗猝灭剂，荧光显微镜下观察，统计平均荧光强度，结果如下表2所示。

结果显示，诱导6天后，除阴性对照组和单独添加巴戟天寡糖组外，同时添加血小板裂解物和巴戟天寡糖或海藻糖干预培养获得的细胞大部分呈现出典型的神经细胞形态，即细胞周围出现较多类似神经细胞的树突或轴突，细胞呈现神经细胞样改变。经免疫荧光染色，CM2～CM6绝大部分细胞神经标志蛋白Tujl、nestin和GFAP表达阳性，与阴性对照组存在极显著差异，说明经特定分子量血小板裂解物和巴戟天寡糖干预培养获得的是成熟的神经细胞。各组染色平均荧光强度下下表2所示。

表2：不同培养基诱导分化的神经细胞表面标志蛋白观察结果

组别	平均荧光强度
		CM1	1.14±0.24<sup>##**</sup>
CM2	3.25±0.20<sup>##*</sup>
		CM3	4.11±0.54<sup>##</sup>
CM4	4.36±0.62<sup>##</sup>
		CM5	3.82±0.21<sup>##</sup>
CM6	2.08±0.33<sup>##**</sup>
		CM7	0.51±0.14<sup>**</sup>
CM8	1.02±0.11<sup>##**</sup>
		CM9	0.23±0.04<sup>**</sup>
阴性对照组	0.21±0.06

注：与阴性对照组相比，^#P＜0.05；^##P＜0.01；与CM4组相比，^*P＜0.05；^**P＜0.01。

3.3神经样细胞分化标记基因表达水平检测：诱导第6天时，提取各组细胞RNA，按照cDNA合成cDNA，qPCR试剂盒进行qPCR试验，检测与神经细胞分化相关的nestin、GFAP、MAP2、NEFH基因的表达情况，选人Gapdh基因为内参基因。针对上述基因的引物信息如表3，结果如表4所示。

表3基因引物信息

表4：不同培养基诱导分化的神经细胞基因表达情况

注：与阴性对照组相比，^#P＜0.05；^##P＜0.01；与CM4组相比，^*P＜0.05；^**P＜0.01。

从表4可看出，添加血小板裂解物和巴戟天寡糖同时干预培养，分化后的细胞高度表达GFAP、nestin、MAP2和NEFH神经细胞特异性基因，其中，特定分子量(90～150kDa)的血小板裂解物与巴戟天寡糖取得的效果最好；而单独添加血小板裂解物并未显示出较为明显的促进间充质干细胞定向分化为神经细胞的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的培养基，其特征在于，至少包含：

血小板裂解物8wt%；

巴戟天寡糖5μg/ml；和

基础培养基余量；

所述血小板裂解物的制备包括以下步骤：

对血小板进行裂解，提供血小板裂解物；

50~70℃热处理所述血小板裂解物；

添加金属盐与纤维蛋白原形成可去除的团块；

超滤，收集其中所含组分表现出的最大分子量为90~150kDa的级分；

灭菌。

2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述超滤步骤中收集其中所含组分表现出的最大分子量为120~150kDa的级分。

5.一种诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.取间充质干细胞；

b.采用根据权利要求1~4任一所述培养基培养上述间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤b培养时间为6~10天。