JP2018080166A - 骨代謝調整剤 - Google Patents
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Abstract
Description
骨吸収では、破骨細胞が骨を融解してカルシウムが血中に行き、血中のカルシウム濃度が上がる。
一方、骨形成では、骨芽細胞が骨表面を覆って新しい骨のもととなる骨基質蛋白を産生し、カルシウムを石灰化して沈着させる機能を有する。
したがって、骨代謝のバランスが崩れると、骨粗鬆症等の原因になる。
そこで本発明者は、人体に優しい天然物由来の骨代謝調整剤を検討した結果、本発明に至った。
しかし、ツバキの葉を用いた場合にエタノール抽出物では、マウス骨芽細胞前駆細胞株の継続培養実験にて、骨芽細胞の分化において誘導されるタンパク質ALP(アルカリフォスファターゼ)を例にその発現量を調査した結果、ツバキ葉の熱水抽出物よりも少ないことが明らかになった。
ここで、熱水抽出物を濃縮及び/又は凍結乾燥してもよい。
また、骨芽細胞の分化を誘導し、破骨細胞の分化を抑制する。
本発明に係るツバキ科ツバキ属に属する植物としては、ツバキ(Camellia japonica)が代表的であり、ヤブツバキ,ユキツバキ,ユキバタツバキ等が例として挙げられる。
医薬組成物の形態に制限はなく、錠剤,顆粒剤,カプセル剤,ドリンク剤等が例として挙げられる。
他のお茶飲料等の各種飲料に添加した飲料、あるいは種々の食品に添加してもよい。
このようなツバキ葉熱水抽出物添加飲料又は食品は、骨代謝の改善,骨代謝異常に伴う疾病の予防に用いることができる。
また、サプリメントとしてもよい。
骨芽細胞の分化及び破骨細胞の分化誘導の各段階で発現する因子に着目して、実験を行った。
ツバキの葉を細断し、15分間熱水(沸騰)にて抽出を行った。
熱水抽出の条件は80℃以上の温水でもよいが、本実験ではツバキ葉を沸騰水に10〜15分間浸けた。
後述するALP染色においては、濾液をフィルター減菌し、タンパク質濃度をDCプロテインアッセイ(BIU RAD社)を使用して定量し、実験に使用した。
また、骨芽細胞関連及び破骨細胞関連の評価には、エバポレーターで濃縮し、さらに凍結乾燥して得られた粉末を用いた。
以下、必要に応じてツバキ葉熱水抽出物をCHEと表現する。
なお、熱水抽出とエタノール抽出とを比較した。
<<ALP染色の実験手順>>
1.10%FBS添加条件下で、マウス骨芽細胞前駆細胞株,MC3T3−E1細胞を2.5×105cells/mlの濃度で播種し、24時間の前培養を実施した。
2.前培養後、ツバキ葉熱水抽出物(CHE)を0.12〜3.91μg/ml(タンパク質濃度)、骨芽細胞分化誘導因子であるβ−グリセロリン酸(10mM)とL−アスコルビン酸(50μg/ml)、10%FBSを添加し、10日間の継続培養を実施した。
3.継続培養後、ALP陽性細胞数を評価するためにTRAP/ALP染色キット(和光純薬株式会社)を使用して、ALP染色を行った。
ここで、各略語は次のとおりである。
ALP:Alkaline Phosphatase(アルカリフォスファターゼ)
TRAP:Tartarate-resistant acid phosphatase (酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ)
その結果を図1のグラフに示す。
ツバキ葉抽出物を添加しないコントロールに対しては、熱水抽出物,エタノール抽出物のいずれの添加も染色面積が増大したが、熱水抽出物の方がエタノール抽出物よりも染色面積が大きく、優れたALP活性を有していた。
<<骨芽細胞遺伝子発現評価の実験手順>>
1.10%FBS添加条件下でMC3T3−E1細胞を2.5×105cells/mlの濃度で播種し、24時間の前培養を実施した。
2.前培養後、ツバキ葉熱水抽出物(CHE)を0.01〜1μg/ml、β−グリセロリン酸(10mM)、L−アスコルビン酸(50μg/ml)、10%FBSを添加し、10日間の継続培養を実施した。
3.継続培養後、ISOGEN2(ニッポン・ジーン社)でtotal RNAを回収した。
さらにTotal RNAからReverTra Ace(TOYOBO社)を使用してcDNAを合成した。
その後、Takara Taq(タカラバイオ社)でPCR反応を行い、骨芽細胞分化マーカーであるOPN,OCN,OSNの遺伝子発現を評価した。
なお、比較対象としてBMP−2(PeproTech)についても評価した。
ここで、各略語は次の通りである。
OPN:Osteopontin(オステオポンチン)
OCN:Osteocalcin(オステオカルシン)
OSN:Osteonectin(オステオネクチン)
MBP−2:Bone morphogenetic protein-2(骨形成タンパク質2)
その結果を、図2のグラフに示す。
図2のグラフ中「CHE」は、ツバキ葉熱水抽出物をいい、このCHEを添加することでコントロールを1とした相対量で、OPN:約3倍,OCN:約6倍の発現量の増加を確認できた。
まずは、破骨細胞の分化に特異的に発現するマーカー酵素であるTRAPについて調査した。
<<TRAP活性の実験手順>>
1.ddY系統メスマウス大腿骨から骨髄細胞を回収後2×105cells/ml細胞密度で播種し、10%FBS、20ng/ml M−CSF(和光純薬株式会社)添加条件下で3日間培養した。
2.培養後、ツバキ葉熱水抽出物(CHE)を0.01〜10μg/ml、さらに10%FBS、20ng/ml M−CSF、20ng/ml RANKL(peprotech社)添加条件下で4日間の継続培養を実施した。
なお、CHEを添加していないRANKL(−)とRANKL(+)を設けた。
3.継続培養後、培地を除去し、以下のように調製したSA buffer添加し、37℃で10分間インキュベートし415nmにおける吸光度を測定した。
600mM SA buffer(Sodium acetate buffer)
・17.6mg/ml L−ascorbic acid
・9.2mg/ml sodium tartrate dehydrate
・3.6mg/ml 4−nitrophenylphosphate−sodium
・0.3% Triton−X100
・6mM EDTA
・600mM NaCl
・600mM CH3COONa
ここで、各略語は次のとおりである。
M−CSF:Macrophage colony-stimulating factor(マクロファージコロニー刺激因子)
RANKL:Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand(NF−B活性化受容体リガンド)
その結果を図3のグラフに示す。
グラフ中、NC:M−CSF(+),RANKL(+)及びPC:M−CSF(+),RANKL(−)条件とした。
なお、RANKLは破骨細胞の分化に必須のサイトカインである。
この結果、CHEは、TRAP酵素活性を抑制することが明らかになった。
<<破骨細胞関連遺伝子発現評価の実験手順>>
1.マウスから骨髄細胞を回収後2×105cells/mlで播種し、10%FBS、20ng/ml M−CSF添加条件下で3日間培養した。
2.培養後、ツバキ葉熱水抽出物を1〜10μg/ml、さらに10%FBS、20ng/ml M−CSF、20ng/ml RANKL添加条件下で4日間の継続培養を実施した。
なお、比較対象としてCHEを添加していないRANKL(−)とRANKL(+)を設けた。
3.継続培養後、ISOGEN2でtotal RNAを回収した。
さらにTotal RNAからReverTra Aceを使用してcDNAを合成した。
その後、Takara TaqでPCR反応を行い、破骨細胞分化マーカーである、TRAP、MMP−9、NFATc1、RANKの遺伝子発現を評価した。
ここで、各略語は次のとおりである。
TRAP:Tartarate-resistant acid phosphatase(酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ)
MMP9:Matrix metalloproteinase 9(マトリックスメタロプロテアーゼ9)
NFATcl:Nuclear factor of activated T cell c1
RANK:Receptor activator of nuclear factor kappa-B(NF−κB活性化受容体)
その結果を図4,図5のグラフに示す。
CHEの添加により、破骨細胞の細胞内シグナル伝達因子における遺伝子の発現が抑制されているのが分かる。
実施方法は、Dentin slice上でddYマウス骨髄細胞由来マクロファージを培養し破骨細胞へと分化させた。
同時にCHEを添加した。
12日後、Dentin sliceを取り出しマイクロチューブに回収した。
細胞を剥離させるため、1 M アンモニア水にDentin sliceを浸透させ、超音波処理を行った。
超音波処理後のDentin sliceを蒸留水で洗浄し、水分を除いた後、固定処理を行い、ギムザ液に浸透させ染色した。
染色後は蒸留水で洗浄し、Dentin sliceを乾燥させた。
骨吸収窩のレベルを比較すると、破骨細胞の分化に必須のRANKLを添加したものに対して、CHEを0.1,1,5μg/ml添加すると、骨溶解能が抑制されていた。
具体的には、ddYマウスから骨髄細胞を調製し、破骨細胞分化誘導と同時にCHEを添加し、12日間培養した。
培養後、細胞を回収し、FITC標識CD11b抗体、FITC標識CD44抗体、FITC標識CD61抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図8は、骨髄系細胞に強く発現するCD11bをRANKL(+)とCHE10μg/mlにて比較した結果を示し、CHEの添加によりCD11bの発現が上昇していた。
図9は、破骨細胞の分化過程にて増大することが知られているCD44の発現を比較した結果を示し、CHE10μg/ml添加することで、CD44の発現を抑制することが確認できた。
図10は、細胞接着因子CD61の発現を比較した結果を示し、CEE10μg/mgの添加により、このCD61の発現が抑えられていた。
7週齢のddYマウスを1週間の予備飼育後、卵巣摘出コントロール群をOVX群、OVXマウスにツバキ葉熱水抽出物を100mg/kg/day経口投与するCHE100群、OVXマウスにツバキ葉熱水抽出物を250mg/kg/day経口投与するCHE250群、OVXマウスにツバキ葉熱水抽出物を500mg/kg/day経口投与するCHE500群、疑似手術を行ったsham群の計5群(各群5匹)に分別した。
図11は、28日間CHEを経口投与行った後、マウスの体重測定を行った結果及びマウスの子宮重量を測定した結果を示す。
CHE投与により体重は大きく変化しなかったが、子宮重量が大きく増大した。
全てのマウスから血液を回収し、血清を調製し、図12は血清中のカルシウム、リン、マグネシウム濃度の測定結果を示し、濃度の測定にはそれぞれカルシウムE−テストワコー、ホスファC−テストワコー、マグネシウムB−テストワコー(いずれも和光純薬)を使用した。
その結果、CHE投与により血清中のCa,P,Mgが減少していた。
図14左に、マウスから摘出した大腿骨を50℃の乾燥機で3日間乾燥させた後に、大腿骨から筋肉片を取り除き、重量を測定した結果を示す。
図13に乾燥させた大腿骨の研磨標本を作製し、顕微鏡で観察を行った結果を示し、図14右にデジタルノギス(ミツトヨ社)を使用して海綿骨領域の長さを測定した結果を示す。
これらから、CHE経口投与により骨重量が増加し、海綿骨領域の範囲が増加することが確認された。
Claims (4)
- ツバキ科ツバキ属に属する植物の葉から熱水で抽出した熱水抽出物からなる骨代謝調整剤。
- 前記熱水抽出物を濃縮及び/又は凍結乾燥した請求項1記載の骨代謝調整剤。
- ALP(アルカリフォスファターゼ)活性を有し、且つTRAP(酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ)酵素活性を抑制する作用を有する請求項1又は2記載の骨代謝調整剤。
- 骨芽細胞の分化を誘導し、破骨細胞の分化を抑制する請求項1又は2記載の骨代謝調整剤。
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