JP2019506431A - 幹細胞の効能改善のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、間葉系幹細胞はin vitro状態でコロニー(colony)を形成して線維芽細胞(fibroblast)に類似した特徴を有して培養されるので、これをコロニー形成単位線維芽細胞(colony forming unit fibroblasts、以下CFU−Fs)というが、CFU−Fsは1つの間葉系幹細胞が増殖してコロニーを形成するものであることが明らかにされた。すなわち、CFU−Fsが間葉系幹細胞の数を意味し、高い効能を示すため、CFU−Fsが大きいほど大量に優れた間葉系幹細胞特性を有する細胞が得られるので、in vitroで培養する際にCFU−Fsを大量生産できなければならない。
さらに、本発明は、前記方法で製造された幹細胞を含む細胞治療剤組成物を提供する。
さらに、本発明は、低級脂肪酸又はその塩を被験体に投与するステップを含む、ヒトを除く被験体において骨髄由来造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法を提供する。
さらに、本発明は、低級脂肪酸又はその塩を有効成分として含む、幹細胞の移動能増進用組成物を提供する。
本発明の方法は、エクスビボ(ex vivo)又はインビトロ(in vitro)で行われてもよい。
本発明における培地(media)とは、in vitroで細胞の成長及び生存を支える培地を意味し、当該分野において通常用いられる細胞の培養に好適な培地が全て含まれる。細胞の種類に応じて培地と培養条件を選択することができる。培養に用いられる培地は、好ましくは細胞培養最小培地(cell culture minimum medium:CCMM)であり、一般に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地としては、例えばDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、MEM(Minimal essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI1640、F−10、F−12、αMEM(α Minimal essential Medium)、GMEM(Glasgow’s Minimal essential Medium)、Iscove’s Modified Dulbecco’s Mediumなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記培地は、ペニシリン(penicillin)、ストレプトマイシン(streptomycin)、ゲンタマイシン(gentamicin)などの抗生剤を含んでもよい。
本発明における前記低級脂肪酸又はその塩は、前記培地に有効濃度で含まれるようにしなければならない。
前記低級脂肪酸又はその塩で幹細胞を処理するステップは、一般血清培地で行ってもよく、血清培地で継代培養した幹細胞を無血清培地に移して行ってもよい。無血清培地における培養は、血清培地から培養液を除去し、細胞をリン酸塩緩衝液で洗浄してから行ってもよい。
本発明の幹細胞の移動能増進方法によれば、低級脂肪酸又はその塩での処理により、幹細胞のin vitro及びin vivoでの移動能が大きく増進するので、幹細胞を移植に適した状態に活性化し、その特性を人体に適するように変形させることにより、細胞治療剤に適した幹細胞の特性を有する幹細胞を提供することができる。
また、本発明は、低級脂肪酸又はその塩で幹細胞を処理するステップを含む、幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法で製造された幹細胞を提供する。好ましくは、本発明は、幹細胞の移動能増進方法で製造された幹細胞を提供する。
本発明の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能が増進した幹細胞自体を用いて疾病を治療することができる。前記細胞は、動物の生体内に注射(injection)、注入(infusion)、移植されて迅速に病変に移動したり、末梢血液への移動を促進したり、特定タイプの細胞集団(population)に直接接触して特定タイプの細胞に分化することにより、好適に疾病を治療することができ、治療できる疾病の種類に制限はない。
本発明の骨髄由来造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法によれば、骨髄から末梢血液への造血幹細胞の移動が促進されることにより、末梢血液において移動した多くの幹細胞の分離が容易になるので、骨髄由来幹細胞の移植のための幹細胞の採取が容易になり、このような移動促進により疾患の治療効能を向上させることができるという利点がある。特に、本発明の骨髄由来造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法によれば、従来の方法に比べて低侵襲方法で自己骨髄由来造血幹細胞を採取できるという利点を有する。また、本発明の骨髄由来造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法は、前記造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法の後に、移動した骨髄由来造血幹細胞を採取するステップをさらに含んでもよい。
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進の確認
移動性分析(Migration Assay)を行って低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進を確認した。
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進シグナル伝達因子の変化の確認
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進シグナル伝達因子の変化をウェスタンブロットにより確認した。
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の侵襲(Invasion)促進の確認
侵襲性分析(Invasion assay)を行って低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の侵襲促進を確認した。
低級脂肪酸処理によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進の確認
移動性分析(Migration Assay)を行って低級脂肪酸処理によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の移動能促進を確認した。
[実施例5]
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞のコロニー形成能増進の確認
コロニー形成単位線維芽細胞分析(Colony−forming unit fibroblast(CFU−F)assay)を行って低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞のコロニー形成能増進を確認した。
[実施例6]
低級脂肪酸処理による造血前駆細胞の移動能増進の確認
流動細胞分析を行って低級脂肪酸処理による造血前駆細胞の移動能増進を確認した。
低級脂肪酸処理によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞のコロニー形成能増進の確認
コロニー形成単位線維芽細胞分析(Colony−forming unit fibroblast(CFU−F)assay)を行って低級脂肪酸処理によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)のコロニー形成能増進を確認した。
図8から分かるように、低級脂肪酸又はその塩である酢酸ナトリウム処理によりコロニー形成能が約5倍に大きく増進することが確認された。
低級脂肪酸を含む飲料水の摂取によるマウスにおける骨髄由来間葉系幹細胞の細胞集団のサイズ増加の確認
コロニー形成単位線維芽細胞(CFU−F)分析を行って低級脂肪酸を含む飲料水の摂取によるマウスにおける骨髄由来間葉系幹細胞の細胞集団のサイズ増加を確認した。
図9から分かるように、低級脂肪酸又はその塩である酢酸ナトリウムを含む飲料水を摂取したマウスから採取した骨髄由来間葉系幹細胞の頻度及び細胞集団のサイズは、酢酸ナトリウムを含まない飲料水を摂取したマウスに比べて約2倍に増加することが確認された。
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の抗炎症免疫抑制及び血管新生促進シグナル関連因子の発現増加の確認
低級脂肪酸処理によるマウス骨髄由来間葉系幹細胞の抗炎症免疫抑制及び血管新生促進シグナル関連因子の変化をmRNA発現増加により確認した。
図10から分かるように、酢酸ナトリウム処理により抗炎症免疫抑制機能を示すIL−10の発現は酢酸ナトリウムで処理していない対照群(CON)に比べて約2.4倍、血管新生促進機能を示すVEGFの発現は約2.5倍に増加することが確認された。すなわち、低級脂肪酸又はその塩の処理により幹細胞が活性化し、幹細胞の抗炎症免疫抑制及び血管新生促進シグナル関連因子の合成が増加することが確認された。
Claims (13)
- 低級脂肪酸又はその塩で幹細胞を処理するステップを含む、幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 前記低級脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸(C6)、カプリル酸(C8)、カプリン酸(C10)、ラウリン酸(C12)、ミリスチン酸(C14)、パルミチン酸(C16)、ステアリン酸(C18)、オレイン酸(C18:1)、エライジン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)、α−リノレン酸(C18:3)、γ−リノレン酸(C18:3)、アラキドン酸(C20:3)、エイコサペンタエン酸(C20:5)、ドコサヘキサエン酸(C22:6)、5,6−エポキシエイコサトリエン酸及び8,9−エポキシエイコサトリエン酸から選択される少なくともいずれか1つである、請求項1に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 前記幹細胞は、間葉系幹細胞又は造血幹細胞である、請求項1に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 前記低級脂肪酸又はその塩で幹細胞を処理するステップは、エクスビボ(ex vivo)又はインビトロ(in vitro)で行われる、請求項1に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 前記低級脂肪酸又はその塩で幹細胞を処理するステップは、無血清DMEM培地又はRPMI1640培地で3時間〜14日間処理される、請求項1に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 低級脂肪酸又はその塩を有効成分として含む、幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 前記低級脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸(C6)、カプリル酸(C8)、カプリン酸(C10)、ラウリン酸(C12)、ミリスチン酸(C14)、パルミチン酸(C16)、ステアリン酸(C18)、オレイン酸(C18:1)、エライジン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)、α−リノレン酸(C18:3)、γ−リノレン酸(C18:3)、アラキドン酸(C20:3)、エイコサペンタエン酸(C20:5)、ドコサヘキサエン酸(C22:6)、5,6−エポキシエイコサトリエン酸及び8,9−エポキシエイコサトリエン酸から選択される少なくともいずれか1つである、請求項6に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つを増進する方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法により製造された幹細胞。
- 請求項8に記載の幹細胞を含む細胞治療剤組成物。
- 低級脂肪酸又はその塩を被験体に投与するステップを含む、ヒトを除く被験体において骨髄由来造血幹細胞の末梢血液への移動を促進する方法。
- 低級脂肪酸又はその塩を有効成分として含む、幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つの増進用組成物。
- 前記低級脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸(C6)、カプリル酸(C8)、カプリン酸(C10)、ラウリン酸(C12)、ミリスチン酸(C14)、パルミチン酸(C16)、ステアリン酸(C18)、オレイン酸(C18:1)、エライジン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)、α−リノレン酸(C18:3)、γ−リノレン酸(C18:3)、アラキドン酸(C20:3)、エイコサペンタエン酸(C20:5)、ドコサヘキサエン酸(C22:6)、5,6−エポキシエイコサトリエン酸及び8,9−エポキシエイコサトリエン酸から選択される少なくともいずれか1つである、請求項11に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つの増進用組成物。
- 前記幹細胞は、間葉系幹細胞又は造血幹細胞である、請求項11に記載の幹細胞の移動能、生着能、CFU−Fs形成能、抗炎症免疫抑制誘導機能及び血管新生促進能から選択される少なくともいずれか1つの増進用組成物。
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