JP5657009B2 - 脂肪組織由来成体幹細胞遊走を誘導する方法 - Google Patents
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Description
(a)脂肪組織由来成体幹細胞にケモカインまたは成長因子を含有するカクテルで前処理する工程、
(b)前記前処理された脂肪組織由来成体幹細胞及びこれの分泌物を含有する組成物を疾患部位と直接接触しない生体内の他の部位に投与する工程を含む、脂肪組織由来成体幹細胞遊走誘導方法を提供する。この時、特に静脈で投与することが最も好ましい。
・幹細胞因子(SCF、Steel因子)、c−キットを二量化する他のリガンド、または抗体、及び同じ信号伝達経路の他の活性剤
・他のチロシンキナーゼ関連受容体、例えば血小板由来成長因子(Platelet-Derived Growth Factor、PDGF)、マクロファージコロニー刺激因子、Flt−3リガンド及び血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor、VEGF)の受容体のためのリガンド
・環状AMP濃度を高める因子、例えばホルスコリン
・gp130を誘導する因子、例えばLIFまたはオンコスタチン(Oncostatin)−M
・造血幹細胞成長因子、例えばトロンボポエチン(TPO)
・変形性成長因子、例えばTGFβ1
・他の成長因子、例えば表皮成長因子(EGF)
・ニューロトロフィン、例えばCNTF
・N−アセチル−L−システイン(NAC)
・ヒドロコルチゾンン(Hydrocortisone)
・アスコルビン酸(Ascrobic Acid)。
このような分泌物は、多様なサイトカイン、アミノ酸、成長因子等を含むが、例えば、TGF、bFGF、IGF−1、KGF、HGF、fibronectin、VEGF、アディポネクチン、レプチンまたはProcollagen等の物質でもあってもよく、これらの受容体も共に含有することができる。特に、このような脂肪由来成体幹細胞分泌物中アディポネクチンまたはレプチンは、脂肪組織由来特異的分泌物として、本発明の細胞遊走誘導機能に大きい寄与をする。
(a)脂肪組織由来成体幹細胞にケモカインまたは成長因子を含有するカクテルで前処理する工程、
(b)前記前処理された脂肪組織由来成体幹細胞及びこれの分泌物を含有する組成物を疾患部位と直接接触しない生体内の他の部位に投与する工程
を含む、脂肪組織由来成体幹細胞遊走誘導方法に関する。
(1)該当疾患の成長を阻害する、即ち、その発達を阻止する、
(2)疾患の拡散を予防する、即ち、移転を予防する、
(3)疾患を軽減させる、即ち、癌の退行を惹起させる、
(4)疾患の再発を予防する、及び
(5)疾患の症状を緩和する(palliating)。
脂肪吸引術(Liposuction)により腹部脂肪から得られたヒト脂肪組織を分離してPBSで洗浄した。組織を細かく切った後、コラゲナーゼタイプ1(1mg/mL)を添加したDMEM培地を利用して37℃で2時間消化した。PBSで洗浄後、1000rpmで5分間遠心分離した。上清液は吸引し、底に残ったペレットはPBSで洗浄した後、1000rpmで5分間遠心分離した。100umメッシュでろ過して残渣を取り除いてからPBSで洗浄した後、DMEM(10%FBS、2mM NAC、0.2mMアスコルビン酸)培地で培養した。
一夜過ぎた後、付着しなかった細胞はPBSで洗浄し、5%FBS、2mM NAC、0.2mMアスコルビン酸、0.09mM calcium、5ng/mL rEGF、5μg/mLインシュリン及び74ng/mL Hydrocortisoneを含有したKeratinocyte−SFM mediaを2日毎に取り替えながら継代培養して、脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を分離した。
2-1:表2のケモカインまたは成長因子で細胞移動誘導
前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を各ウェルに2x104cells/200μLで播種(seeding)して、以下ケモカインまたは成長因子で細胞移動を誘導した。陽性対照群としてFBS30%を使った。
前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を24時間FBS free Media(図2A)とTNF−α(図2B、2C)、走化性因子(chemotactic factor)(図2D)で前処理して培養した後0.25%トリプシン/1mM EDTAを処理して細胞を分離した後、PBSで洗浄して1,500rpmで5分間遠心分離して細胞を回収した。
その結果、図2A〜2Dに示したように、何も処理しなかった脂肪幹細胞(図2A、2B)に比べて前処理した脂肪幹細胞(図2C、2D)の遊走率が高くて細胞が密になることが確認できた。
前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を以下ケモカインまたは成長因子で24時間前処理した後、各ウェルに2x104cells/200μLでシーディングして10%FBSで細胞遊走を誘導した。30%FBSに比べて弁別力を観察しようとした。一方、前処理しなかった脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を陰性対照群とした(未処理)。
実施例3から得られた実験結果を参照して、前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞をTNF−αで24時間前処理した後、各ウェルに2x104細胞/200μLでシーディングして以下の表4に記載している多様なケモカインまたは成長因子で細胞遊走を誘導した。
前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞を以下の表5に記載したケモカインまたは成長因子で約24時間前処理した後、各ウェルに2x104細胞/200μLでシーディングし、前処理に使った各同一因子を利用して細胞遊走を誘導した。
実施例1で取得した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞が各々のケモカインまたは成長因子受容体を発現するか否かを、相応する受容体の抗体及びフローサイトメトリー(FACS)を介して確認した。
一方、各ケモカインまたは成長因子に対する受容体とリガンド名は下記の表6の通りである。
実施例1で取得した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞が、各々のケモカインまたは成長因子受容体のmRNAを発現するか否かを、RT−PCRを介して確認した。
T75フラスコで培養した脂肪幹細胞を0.25%トリプシン/1mM EDTAを処理して細胞を分離した後、PBSで洗浄して1,500rpmで5分間遠心分離して細胞を収集した。収集した細胞は、Total RNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology)を利用してトータルRNAを抽出した。
RNA2μgをmaxime RT Pre mix kit(iNtRON Biotechnology)でcDNAを合成した。1X h−Taq buffer、0.2mM dNTP、0.4pMフォワードプライマー、0.4pMリバースプライマー、0.25U/μL h−Taq DNA polymerase(Solgent)でcDNA1μLを95℃で20秒間DNAを変成させた後、以下の表8の各温度(アニーリング温度)で40秒間プライマーを加熱して、72℃で1分間PCR産物を伸張させる反応を40cycle条件で遺伝子増幅を行った。実験に使われた受容体プライマーと加熱温度は以下の表8の通りである。
8−1:アディポネクチンの濃度毎誘導能確認
前記実施例1で分離した脂肪組織由来多分化能中間葉幹細胞をアディポネクチンで24時間前処理した後、アディポネクチンを各濃度(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)で処理して細胞遊走を誘導した。
その結果を図8に示した。10ng/mLの時に比べて100ng/mLで処理した時、2倍程高い遊走量を示す結果から、濃度が高いほど細胞遊走誘導能が高いことを確認することができた。
実施例7の方法と同様の方法で表8に記載されたプライマーとアニーリング温度を使ってRT−PCRを行って脂肪幹細胞でアディポネクチン受容体が発現するか否かを確認した。
その結果、図9に示したように、アディポネクチンの受容体2種類(1:ADIPOR1(337bp)、2:ADIPOR2(538bp)が、脂肪幹細胞で発現することを確認した。これにより、アディポネクチンの前処理によってアディポネクチン受容体の発現率が高まって、これらの間の反応性を利用する可能性があることを確認した。
Claims (8)
- アディポネクチンで前処理された脂肪組織由来成体幹細胞及びアディポネクチンを有効成分として含有する脂肪幹細胞遊走誘導用組成物。
- 前記脂肪組織由来成体幹細胞はランテス(Rantes)、MCP−1(Monocyte chemoattractant protein-1)、MIP−3β(Monocyte inflammatory protein-3β)、SDF−1α(Stromal cell-derived factor-1α)、BCA−1(B cell attracting chemokine-1)、CXCL16(Chemokine C-X-C motif ligand 16)、EGF(Endothelial growth factor)、B−FGF(basic Fibroblast Growth Factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、TGF−β1(Transforming growth factor beta 1)、IGF−1(Insulin-like growth factor1)、PDGF−AB(Platelet Derived Growth Factor AB)及びTNF−α(Tumornecrosis factor-α)からなる群から選択される1種以上であるケモカインまたは成長因子の受容体を、細胞表面に発現することを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物はFBS(ウシ胎児血清)をさらに含有することを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- ランテス(Rantes)、MCP−1(Monocyte chemoattractant protein-1)、MIP−3β(Monocyte inflammatory protein-3β)、SDF−1α(Stromal cell-derived factor-1α)、BCA−1(B cell attracting chemokine-1)、CXCL16(Chemokine C-X-C motif ligand 16)、EGF(Endothelial growth factor)、B−FGF(basic Fibroblast Growth Factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、TGF−β1(Transforming growth factor beta 1)、IGF−1(Insulin-like growth factor 1)、PDGF−AB(Platelet Derived Growth Factor AB)及びTNF−α(Tumor necrosis factor-α)からなる群から選択される1種以上のケモカインまたは成長因子の受容体をさらに含むことを特徴とする請求項1または請求項3に記載の組成物。
- 前記脂肪組織由来成体幹細胞は、ランテス(Rantes)、MCP−1(Monocyte chemoattractant protein-1)、MIP−3β(Monocyte inflammatory protein-3β)、SDF−1α(Stromal cell-derived factor-1α)、BCA−1(B cell attracting chemokine-1)、CXCL16(Chemokine C-X-C motif ligand 16)、EGF(Endothelial growth factor)、B−FGF(basic Fibroblast Growth Factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、TGF−β1(Transforming growth factor beta 1)、IGF−1(Insulin-like growth factor 1)、PDGF−AB(Platelet Derived Growth Factor AB)及びTNF−α(Tumor necrosis factor-α)からなる群から選択される1種以上のケモカインまたは成長因子を含有するカクテルでさらに前処理されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記カクテルは、ランテス(Rantes)、SDF−1α(Stromal cell-derived factor-1α)、HGF(Hepatocyte growth factor)、TNF−α(Tumor necrosis factor-α)、PDGF−AB(Platelet Derived Growth Factor AB)及びTGF−β1(Transforming growth factor beta 1)からなる群から選択される1種以上の因子を含有することを特徴とする請求項5に記載の組成物。
- 前記脂肪組織由来成体幹細胞は、ヒト脂肪組織由来中間葉幹細胞(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell、AdMSCs)であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記脂肪組織由来成体幹細胞は、1x107cells〜1x1010cellsの数で含まれることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
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