CN112779212A - 一种促进间充质干细胞球运动的方法 - Google Patents

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江圣杰
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Abstract

本发明涉及一种促进间充质干细胞球运动的方法，其解决了间充质干细胞以细胞球植入后运动规律不可控且不能满足成骨需要存在的技术问题，本发明使用内皮生长因子来促进间充质细胞球扩散。本发明可用于间充质干细胞球的植入领域。

Description

一种促进间充质干细胞球运动的方法
技术领域
本发明涉及一种促进细胞运动的方法，具体地说，涉及一种促进间充质干细胞球运动的方法。
背景技术
目前，间充质干细胞的植入都是分散植入的方式，这种间充质干细胞植入方法让干细胞单独暴露在微环境中，其主要存在分散植入时干细胞早期存活率低、分散植入细胞量低于球体植入的细胞量、分散植入成骨效果差等问题。
如果将间充质干细胞以细胞球的方法植入，虽然可以解决上述干细胞分散植入存在的早期存活率低、植入量少、植入效果差等问题，但是间充质干细胞以细胞球植入后，其运动规律不可控，并且植入后细胞球展开需要时间，不能满足成骨需要。
发明内容
本发明就是为了解决间充质干细胞以细胞球植入后运动规律不可控且不能满足成骨需要存在的技术问题，提供一种促进间充质干细胞球运动的方法。
为此，本发明提供一种促进间充质干细胞球运动的方法，使用内皮生长因子来促进间充质细胞球扩散。
优选的，本发明包括如下步骤：(1)制备培养基；(2)制备间充质细胞球；(3)向所述培养基中加入内皮生长因子，促进间充质细胞球扩散。
优选的，所述步骤(1)中：琼脂糖溶液，熔化后，滴加至微组织球体三维培养皿微模(MicroTissue 3D Petri Dish micro-mold spheroids)，静置，琼脂糖凝固成培养基。
优选的，所述步骤(2)中，培养至第五代的hMSCs细胞消化后，在所述的培养基上接种培养，细胞团聚成细胞球。
优选的，所述步骤(3)中，所述培养基中加入50-150ng/ml内皮生长因子。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过加入内皮生长因子从而上调RAC1的功能，可以达到调控细胞群体在软基质上扩展运动的作用。
附图说明
图1a和图1b是本发明中细胞球光学显微镜下形态，其中图1a为细胞球接种1h的形态；图1b为细胞球接种24h时的形态(标尺为100μm)；
图2a和图2b为本发明中细胞球三维铺展模拟示意图；
图3a为本发明中细胞球24h Dapi免疫荧光染色(标尺100μm)；图3b为本发明中细胞球24h RAC1免疫荧光染色(标尺25μm)；图3c为本发明中细胞球24h phallodin免疫荧光染色(标尺25μm)；
图4为本发明中Cell-IQ活细胞动态监测(标尺为100μm)；
图5a、图5b、图5c、图5d、图5e、图5f为本发明中软基底Cell-IQ活细胞动态监测图；其中，图5a为培养基中加入100ng/ml内皮生长因子培养24h；图5b为培养基中加入100ng/ml内皮生长因子培养48h；图5c为培养基中加入50ng/ml内皮生长因子培养24h；图5d为培养基中加入50ng/ml内皮生长因子培养48h；图5e为培养基中加入150ng/ml内皮生长因子培养24h；图5f为培养基中加入150ng/ml内皮生长因子培养48h。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
2％琼脂糖溶液，高温高压熔化后，缓慢滴加500μl加入至微组织球体三维培养皿微模(MicroTissue 3D Petri Dish micro-mold spheroids)，静置至室温后，琼脂糖凝固成细胞培养模具。
培养至第五代的hMSCs细胞消化后在上述的模具接种，在模具种培养12h，细胞团聚成细胞球后，用移液枪轻轻吹打吸出。便可用于后续操作。
培养基中加入100ng/ml内皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，激活RAC1功能促进细胞球扩散。
如图1a所示，体式显微镜下观察的结果显示细胞球最初形成规律的圆形，在玻璃基底上其能够以放散的规律向外扩散。初始刚接种时细胞球直径约为200μm；如图1b所示，24小时后迅速扩张，铺展前沿明显呈现梭形以及间充质干细胞多角形形态，而内部中心的细胞则是呈现细胞与细胞间连接团聚状。
如图2a和图2b所示，以此运动形态通过作图软件绘制，三维构建了这种运动模式的示意图，最初细胞呈现球状与基底首先发生接触，之后其像液滴一样像外扩展，外围细胞相互牵拉向外脱离，内群细胞仍保持多层叠加的状态。
如图3a、图3b和图3c所示，通过免疫荧光对RAC1蛋白的特异性染色，hMSCs细胞球在胶原包被的玻璃基底上铺展24h后的样本固定染色，观察到在hMSCs细胞球最前沿的位置的外群细胞RAC1有着明显高表达。而在细胞球中心团聚部位的细胞RAC1表达明显减弱。高倍镜下，外围细胞铺展更大，细胞骨架结构更为明显并且与RAC1表达量呈现正相关，而在细胞球团聚的中心位置细胞骨架不清晰，hMSCs的RAC1的表达量相对于细胞球外围的表达量明显减弱。
如图5a-图5f所示，通过Cell-IQ活细胞动态观测仪，在24h实时观测在软基底材料上hMSCs活细胞球动态铺展运动。当细胞球给予了RAC1激动剂的时候，48h时细胞球铺展的面积明显更大，表明通过上调RAC1的功能可以达到人为调控细胞群体在软基质上扩展运动的作用。
图5a、图5b为内皮生长因子浓度50ng/ml作用后铺展状态，当内皮生长因子浓度上升为100ng/ml后细胞球的铺展面积明显上调，细胞球伸出更多突触。当浓度上升为150ng/ml后细胞球的铺展面积微弱上调，但细胞球突触更多。
实施例2
培养基中加入50ng/ml内皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，激活RAC1功能促进细胞球扩散。
实施例3
培养基中加入150ng/ml内皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)，激活RAC1功能促进细胞球扩散。
对比例1
培养基中加入100μM trihydrochloride，抑制RAC1功能显著抑制细胞球扩散功能。其它步骤同实施例1。
如图4所示，通过Cell-IQ活细胞动态观测仪，在24h实时观测hMSCs活细胞动态铺展运动。当细胞球给予了RAC1抑制剂(第二排)的时候，24h时细胞球铺展的面积明显更小。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。

Claims (5)

1.一种促进间充质干细胞球运动的方法，其特征是，使用内皮生长因子来促进间充质细胞球扩散。
2.根据权利要求1所述的促进间充质干细胞球运动的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备培养基；
(2)制备间充质细胞球；
(3)向所述培养基中加入内皮生长因子，促进间充质细胞球扩散。
3.根据权利要求2所述的促进间充质干细胞球运动的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：琼脂糖溶液，熔化后，滴加至微组织球体三维培养皿微模，静置，琼脂糖凝固成培养基。
4.根据权利要求2所述的促进间充质干细胞球运动的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，培养至第五代的hMSCs细胞消化后，在所述的培养基上接种培养，细胞团聚成细胞球。
5.根据权利要求2所述的促进间充质干细胞球运动的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述培养基中加入50-150ng/ml内皮生长因子。
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