CN101974485A

CN101974485A - 具有最佳迁移能力的间充质干细胞的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101974485A
Application number: CN2010105424990A
Authority: CN
Inventors: 张焕相; 徐晓静; 贺丽虹
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明属于生物制品领域，公开了一种具有最佳迁移效率的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)分离培养间充质干细胞，诱导分化，在分化的不同时段收集细胞，得到处于不同分化状态的间充质干细胞；(2)确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，分析计算步骤(1)所得不同分化状态间充质干细胞对该趋化因子情况作用下的迁移效率，找到迁移效率最佳的间充质干细胞的分化状态，由此即可制备得到对该迁移区域所需的具有最佳迁移效率的间充质干细胞。本发明所述间充质干细胞，可以针对不同情况的病灶区提供最佳迁移效率的间充质干细胞，增加迁移到病灶区的间充质干细胞，改善治疗效果，为干细胞移植治疗提供了最根本的保障。

Description

具有最佳迁移能力的间充质干细胞的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种具有最高迁移效率的充质干细胞的制备方法及所得充质干细胞的应用。

背景技术

当今世纪是生命科学飞速发展的世纪，干细胞的研究在神经系统疾病（帕金森病、阿尔海默兹病、脊髓损伤、中枢神经系统损伤、脑卒中、恶性胶质瘤等）中有着重要的理论意义和临床应用价值。长期以来神经系统疾病缺乏有效的治疗方法，严重影响着人类的健康和幸福。使用干细胞治疗一些急慢性神经系统疾病为人们带来了新的希望。以中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤为例，CNS一旦损伤，神经功能的恢复非常困难，主要原因是脑内神经元的再生能力极差。目前研究证明脑内虽然有神经干细胞（neural stem cells，NSC）存在，且能分化成神经元和神经胶质细胞，但是由于神经干细胞存在的部位很局限，数量也非常少，故将其用于神经元损伤修复还是非常困难的。随着干细胞领域的研究不断深入，发现其他部位的干细胞也可以分化成神经细胞。将胚胎神经细胞或脐血干细胞移植到受损伤的鼠脑内，可以适度改善其神经功能，但是由于伦理道德，免疫排斥等因素限制了这些干细胞在临床上的广泛应用。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类非造血干细胞，具有自我复制能力和多向分化潜能。在不同的条件下能诱导分化为多种细胞系，包括软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及神经细胞等。同时间充质干细胞取材方便、培养方法容易掌握、培养纯度高、具有多向分化潜能的特点使之成为生物学和临床应用的研究热点，目前总政后勤卫生部已经授权骨髓间充质干细胞的体内移植，这对优秀间充质干细胞的需要更为迫切。

目前关于间充质干细胞的基础研究主要包括体内和体外两个方面。体外培养研究主要集中在未分化状态的间充质干细胞的鉴定和诱导分化等方面，体内的研究主要是通过不同的注射方式或模式动物来研究未分化状态的间充质干细胞的趋化性迁移，并且两方面的结果均在不同程度上证明了间充质干细胞的在体内外的多潜能分化特性和良好的生物安全性，为间充质干细胞在临床上的应用提供了良好的理论基础。并且随着现代技术的进步，在人体内的体内试验也在不同的病例身上得到实现，并得到良好的治疗效果，更加表明了间充质干细胞在临床上应用的潜在价值。关于间充质干细胞体内移植，前人已有众多研究，即注射时间、输入细胞的数目以及注射位点，都可能影响MSCs的移植效率以及趋向靶位点的迁移效率。

然而，在临床上的细胞移植往往是将未知状态的间充质干细胞注射入体内，在治疗周期完成后，真正迁移到病灶部位的细胞十分有限，其中真正分化为神经细胞并行使功能的间充质干细胞更为稀少。这使得间充质干细胞在临床应用上遇到了一个瓶颈。

发明内容

本发明目的是提供一种具有最高迁移效率的间充质干细胞的制备方法，以提高间充质干细胞的迁移效率，增加迁移到病灶部位的间充质干细胞数量。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种具有最高迁移效率的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

分离、培养、鉴定间充质干细胞，诱导分化，在分化的不同时段收集细胞，得到处于不同分化状态的间充质干细胞；

确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，分析计算步骤

所得不同分化状态间充质干细胞对该趋化因子情况作用下的迁移效率，找到迁移效率最高的间充质干细胞的分化状态，由此即可制备得到该迁移区域所需的具有最高迁移效率的间充质干细胞。

上述技术方案中，步骤所述间充质干细胞的体外培养，分化以及鉴定的方法为本领域技术人员公知的现有技术。

上述技术方案中，步骤

中，所述迁移区域为目的病灶区域，迁移区域趋化因子情况一般指病灶区域的趋化因子的种类和浓度；优选的技术方案中，可以向病灶区域补充趋化因子，更好地诱导移植的神经干细胞趋向性迁移到病灶部位，提高治疗效果，所述补充趋化因子的方法为本领域技术人员惯用手段。其中，测定目标病灶区的趋化因子的种类和浓度为本领域技术人员公知的现有技术，例如：临床上测定病人体内诱导干细胞迁移的细胞因子的含量的方法为：采集病人血液样品，经夹心酶联免疫吸附试验（Sandwich ELISA）法测定即可（参见：Atsushi Morita 等.Evaluation of human thymus and activation-regulated chemokine concentrations in blood using a new sandwich ELISA based on monoclonal antibodies. Clinica Chimica Acta 322 (2002) 67–75; SVMaru等.神经免疫学杂志(Journal of Neuroimmunology)199（2008）35-45）。

上述技术方案中，步骤

所述迁移效率，是指细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向迁移至病灶部位的能力越强；测定间充质干细胞的迁移效率的方法可选自但不限于：运用Dunn chamber 测定干细胞的迁移效率（参见：Zhang 等. 细胞生物学杂志(The Journal of Cell Biology) 163 (2003) 1375-1384）。

上述技术方案中，步骤

具体包括以下步骤：确定迁移区域趋化因子情况，所述趋化因子情况包括趋化因子的种类和浓度，在分化培养基中加入与迁移区域相同种类、相同浓度的趋化因子，诱导细胞迁移；对细胞的定向迁移效率进行分析，找到对迁移区域具有最高迁移效率的间充质干细胞的分化状态，所述分化状态的间充质干细胞即为该迁移区域所需的具有最高迁移效率的间充质干细胞。

上述技术方案中，所述的间充质干细胞来源于来源包括人、动物（包括猿、猴、猪、大鼠、小鼠、兔、犬等）的骨髓、脐带血或其它部位、经过基因工程修饰或其他经过人工改造的间充质干细胞；在完全培养液中培养3-6 d开始诱导分化。

优选的技术方案中，制备处于不同的分化状态的间充质干细胞的方法为：选取生长状况良好的间充质干细胞，按5×10 ⁴ /ml接种于含包被PLL盖玻片的35mm培养皿中；用间充质干细胞生长培养基(L-DMEM+10%CS)培养(设为A点)；接种24h后观察细胞生长状况，待细胞60%铺满盖玻片时，弃生长培养基，加入含10ng/mlbFGF的预诱导培养基；预诱导24h后(设为B点)，换为无血清的诱导培养基(含2%DMSO和200μmol/LBHA)；诱导5h时(设为C点)，换成维持培养基；维持18h时设为D点，继续维持至48h(设为E点)；收集A、B、C、D、E各点的细胞即得到为不同分化状态的间充质干细胞。

上述技术方案中，所述间充质干细胞迁移效率的分析方法为：运用邓恩室（Dunn chamber），结合活细胞工作站（Leica AF6000，Germany）对单个细胞的迁移行为进行追踪，使用Image J软件分析间充质干细胞迁移的具体轨迹，计算干细胞的迁移效率，即从细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值。

上述技术方案中，所述趋化因子为诱导间充质干细胞趋向性迁移的因子，包括所有能够引起不同分化状态的间充质干细胞定向迁移的炎症趋化因子和细胞生长因子，如VEGF、HGF、PDGF、SDF、SCF、BNDF、NGF、BFGF、EGF、LIF、TPO、G-CSF、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15等。

所述具有最高迁移效率的间充质干细胞可以结合组织工程材料再应用于临床移植。通过体外培养、诱导得到不同分化状态的间充质干细胞，结合或不结合趋化因子，应用于组织工程材料上再移植；或将间充质干细胞与组织工程材料共培养，结合或不结合趋化因子，以取得最佳迁移状态的间充质干细胞，再用于移植。采用上述技术方案所得的具有最佳迁移效率的间充质干细胞的临床适用范围包括各种神经系统疾病（帕金森病、阿尔海默兹病、中枢神经系统损伤、外周神经系统损伤、脑卒中、恶性胶质瘤、脑出血后遗症、老年性痴呆）、运动系统疾病（运动神经元病、共济失调）、心血管系统（缺血性心脏病）、视神经发育不全、视神经萎缩、股骨头坏死、糖尿病、足下肢血管病等。可以通过注射或其它途径应用于临床移植治疗，注射方式包括：肌肉注射、血液（静脉、动脉）注射、局部定点注射、脑脊液注射、立体定位注射法（病灶近端、远端）、腰穿细胞悬液注射法、静脉内细胞悬液输入法等。

采用上述方法制备得到的间充质干细胞治疗上述疾病的原理为：由于神经系统疾病一旦患上，神经功能的恢复非常困难，主要原因是神经元的再生能力极差。目前研究证明脑内虽然有神经干细胞存在，且能分化成神经元和神经胶质细胞，但是由于神经干细胞存在的部位很局限，数量也非常少，故将其用于神经元损伤修复还是非常困难。随着干细胞领域的研究不断深入，发现其他部位的干细胞也可以分化成神经细胞。而间充质干细胞就是一粒优秀的后备种子，将具有最佳迁移效率的间充质干细胞移植到体内，迅速发挥干细胞的潜能，必将达到理想的治疗效果。

神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，具有扩散和浸润的特性，即使经过外科手术切除，并辅以放疗或化疗，也难以彻底治愈。因此，需要新的治疗方法来追踪逃离常规治疗的散在瘤细胞。间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞，而且能够趋向胶质瘤及多种趋化因子迁移，从而成为治疗胶质瘤的理想载体细胞。

因此，本发明同时要求保护一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物，所述药物包括：采用上述技术方案所得的间充质干细胞；优选的技术方案中，还包括趋化因子。

本发明同时要求保护一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物载体，所述药物载体包括：采用上述技术方案所得的间充质干细胞；优选的技术方案中，还包括趋化因子。

所述趋化因子为诱导神经干细胞趋向性迁移的因子，选自：所有能够引起不同分化状态的间充质干细胞定向迁移的炎症趋化因子或细胞生长因子中的一种或两种以上的混合物。

上述技术方案中，所述趋化因子包括：VEGF、HGF、PDGF、SDF、SCF、BNDF、NGF、BFGF、EGF、LIF、TPO、G-CSF、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15。

本发明的思路是：发明人创造性的研究发现，不同分化状态的间充质干细胞的趋向性迁移能力不同。未分化的间充质干细胞往往具有较强的向损伤部位迁移的能力，但是这种细胞的定向分化能力差，可以不定向分化，消减了临床治疗的效果。成熟的神经样细胞迁移能力很弱，但它们却可以为组织损伤提供替代的功能细胞。很显然，只有在这两者中找到最适合的平衡点才能更好的使用细胞移植治疗神经系统疾病。另外，不同分化状态的间充质干细胞对各种趋化因子的应答强弱不同，表现为趋向性迁移能力，尤其是迁移效率的差异。所谓迁移效率，是指细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向迁移至病灶部位的能力越强。因此，如果利用具有最高迁移效率的间充质干细胞进行临床移植，那么定向迁移到病灶部位的间充质干细胞数无疑会大大增加，从而提高治疗效果。鉴于临床上脊髓损伤、中枢神经系统损伤、脑卒中、恶性胶质瘤等疾病的复杂性、多样性及病灶部位所分泌细胞因子的种类和含量的多样性，用于移植的间充质干细胞的分化状态也应是不同的，但所要达到的临床效果都是相同的，那就是所移植的间充质干细胞群体具有最佳的迁移效率，能够高效地迁移到病灶部位，提高治疗效果。

因此，本发明根据目标病灶部位的趋化因子的具体情况，包括趋化因子的浓度和种类，测定该情况下不同分化程度的间充质干细胞的迁移效率，选出迁移效率最佳的分化状态的间充质干细胞。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

利用本发明建立的方法制备得到的间充质干细胞，处于特定的分化状态且具有最佳的趋化性迁移效率（针对目的病灶区的趋化因子的情况、种类、浓度），解决了困扰间充质干细胞临床应用的主要问题，可以针对不同情况的病灶区提供最佳迁移效率的间充质干细胞，增加迁移到病灶区的间充质干细胞，改善治疗情况，为干细胞移植治疗提供了最根本的保障。

附图说明

附图1为实施例一中免疫荧光检测BMSCs的表面抗原的图；其中，A：CD29; B：CD71; C：CD90; D：CD106；比例尺(Scale bar) =50 μm；

附图2为实施例一中BMSCs分化的示意图；

附图3为实施例一中倒置相差显微镜观察BMSCs在向神经样细胞分化过程中的形态变化；其中，A: 接种24 h； B: 预诱导24 h； C: 诱导5 h； D: 维持18 h；E: 维持48 h；比例尺(Scale bar) =50 μm；

图4为实施例一中免疫荧光染色检测BMSCs在诱导分化过程中CD29的表达情况；A: 接种24 h； B: 预诱导24 h； C: 诱导5 h； D: 维持18 h； E: 维持48 h；比例尺(Scale bar) =50 μm；

附图5为实施例一中免疫荧光染色检测BMSCs在诱导分化过程中Nestin的表达情况；A:接种24h；B:预诱导24h；C:诱导5h；D:维持18h；E:维持48h；比例尺(Scalebar)=50μm；

附图6为实施例一中免疫荧光染色检测BMSCs在诱导分化过程中β-III-Tubulin的表达情况；A: 接种24 h； B: 预诱导24 h； C: 诱导5 h； D: 维持18 h； E: 维持48 h；比例尺(Scale bar) =50 μm；

附图7为实施例一中免疫荧光染色检测BMSCs在诱导分化过程中NSE的表达情况； A: 接种24 h； B: 预诱导24 h； C: 诱导5 h； D: 维持18 h； E: 维持48 h；比例尺(Scale bar) =50 μm；

附图8为实施例一中Dunn chamber示意图；其中，（A）Dunn chamber示意图，outer well是外槽，inner well是内槽，bridge是桥，filling slit是加外槽液体的缝隙，coverslip是盖玻片；（B）Dunn chamber桥上细胞的相差照片，白色箭头所指方向为外槽方向；比例尺(Scale bar) =50 μm；

附图9为实施例一中细胞的迁移效率示意图；

附图10为实施例二中分化细胞的迁移效率；(A)接种24 h；(B)预诱导24 h；(C)诱导5 h；(D)维持18 h；(E)维持48 h；(* P<0.05)；

附图11为实施例三中不同浓度PDGF对间充质干细胞迁移效率的影响；其中，控制组(Control)：内外槽均加无血清的L-DMEM； PDGF：内槽加L-DMEM，而外槽加含不同浓度PDGF的培养基；*p< 0.05 是和其它组相比；

附图12为实施例三中PDGF对成神经分化不同阶段间充质干细胞迁移效率的影响；其中，控制组(Control)：内外槽均加无血清的L-DMEM； PDGF：内槽加L-DMEM，而外槽加含50 ng/mL PDGF的培养基；*p< 0.05 是和控制组(Control)相比(A：未诱导BMSCs；B：预诱导24小时；C：诱导5 小时；D：维持18小时；E：维持48小时)；

附图13为实施例四中HGF诱导BMSCs定向迁移；其中，（A）迁移速率；（C）迁移效率；（*p<0.05）；

附图14为实施例四中成神经分化BMSCs趋向HGF的迁移效率，其中，A：未分化；B：预诱导24 h；C：诱导5 h；D：维持18 h；E：维持48 h；（*p<0.05）；

附图15为实施例五中SCF对成神经分化不同阶段BMSCs迁移效率的影响，其中，控制组(Control)：内外槽均加无血清的L-DMEM；SCF：内槽加L-DMEM，而外槽加含50 ng/mL SCF的L-DMEM。*p < 0.05；A:未诱导的BMSCs；B: 预诱导24 h；C: 诱导5 h；D: 维持18 h；E：维持48 h。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1. 间充质干细胞的分离、培养与鉴定

1.1 间充质干细胞的分离、培养：

取体重为150g左右的SD大鼠，用颈椎脱臼法处死。用75%的酒精浸泡消毒5min后，分离后肢皮下组织，取出股骨、胫骨，用75%酒精消毒后，移入超净台。剪断股骨、胫骨骨干两端，用2ml注射器吸取L-DMEM反复冲洗骨髓腔，缓慢吹打制成均匀的细胞悬液。将细胞悬液加于PercollTM分离液液面上，20℃，3000r/min，离心30min。去上清，吸取白膜层，PBS洗2遍，20℃，1800r/min，离心10min。用含10%FCS的L-DMEM悬浮细胞，计数，将细胞密度调至2×10 ⁶ /cm ² ，接种于75 ml培养瓶中。置于CO ₂ 37℃、饱和湿度、5%CO ₂ 的培养箱中培养。每隔3 d换液一次。

1.2间充质干细胞的鉴定

1.2.1 多聚赖氨酸(PLL)包被盖玻片

22×22 mm盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗10次，三蒸水冲洗3次，浸泡于75%酒精中备用。

包被时取出75%酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入35 mm ² 培养皿中，吸取0.5 ml浓度为50 μg/ml的PLL滴加在盖玻片上，37℃放置1 h，回收多余的PLL。盖玻片于超净工作台内晾干。使用前用无菌水洗2-3次。

1.2.2免疫荧光染色

将预先经过灭菌处理并包被PLL的盖玻片置于35 mm ² 培养皿中，将第8代BMSCs用0.25%胰酶消化，按1×10 ⁵ /ml密度接种，37℃、5% CO ₂ 条件下培养。待细胞长到70%汇合时去除培养基，用PBS清洗，加入4% 的PFA固定，4℃过夜。PBS洗3次后，分别滴加用PBS+NaN ₃ (0.02%)+BSA(3%)+ TritonX-100(0.2%) 稀释的单克隆抗体孵育，室温90 min。PBS洗3次。细胞核用Hoechst 33258染色，室温放置5 min并冲洗。用50%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照，结果参见图1。本实验所用抗体稀释比例主要为：FITC标记的羊抗鼠CD34抗体 (1:200)；FITC标记的羊抗鼠CD45抗体 (1:200)；FITC标记的羊抗鼠CD29 抗体(1:200)；FITC标记的羊抗鼠CD71抗体 (1:200)；FITC标记的羊抗鼠CD90抗体 (1:200)；PE标记的羊抗鼠CD106抗体 (1:200)。结果是：CD29、CD90和 CD106均为阳性(图1)，不表达CD34。

2.不同分化状态间充质干细胞的准备

2.1 诱导方法

参见图2，将骨髓间充质干细胞诱导过程设为A、B、C、D、E五个点。选取生长状况良好的第8代BMSCs，按5×10 ⁴ /ml接种于含包被PLL盖玻片的35mm培养皿中。用BMSCs生长培养基(L-DMEM+10%CS)培养(设为A点)。接种24h后观察细胞生长状况，待细胞60%铺满盖玻片时，弃生长培养基，加入含10ng/mlbFGF的预诱导培养基。预诱导24h后(设为B点)，换为无血清的诱导培养基(含2%DMSO和200μmol/LBHA)。诱导5h时(设为C点)，换成维持培养基。维持18h时设为D点，继续维持至48h(设为E点)。我们在视察显微镜下观察各个分化点间充质干细胞的形态变化，结果如图3所示，通过免疫荧光技术检测CD29，Nestin，β-III-Tubulin，NSE和GFAP的表达情况如图3。免疫荧光检测不同分化状态的间充质干细胞，得图4、5、6、7，其中，预诱导24h的细胞，Nestin和β-III-Tubulin的表达较对照明显增强，此时NSE的表达没有明显变化，可能是bFGF发挥了作用，使BMSCs朝着神经样细胞分化。诱导5h的细胞表达Nestin和β-III-Tubulin达到最强，而NSE的表达仍没有显著变化。说明BMSCs在分化为神经样细胞之前，经历了短暂的前体细胞阶段。NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，被认为是成熟神经元的标记。当换成维持培养基，维持48h，此时NSE的表达才显著增强，而Nestin和β-III-Tubulin表达明显减弱，GFAP的表达一直是阴性，提示用此方法诱导的细胞是类似于神经元的细胞（图4-7）。收集A、B、C、D、E各点的细胞即得到为不同分化状态的间充质干细胞。

3不同分化状态间充质干细胞迁移效率的分析

运用Dunn chamber、Boyden chamber 分析不同分化状态的间充质干细胞的趋化性迁移能力。其中Boyden chamber反映细胞群体的迁移水平，Dunn chamber反映个体细胞的趋向性迁移速率与效率。

3.1 Dunn chamber（图8）：

在Dunn chamber的外槽中加入趋化因子，在内槽中加入L-DMEM或者相应点的分化培养基。将长有神经干细胞的盖片细胞面朝下盖在桥的正上方，并使盖玻片的一端盖住桥而不盖住外槽，用工业凡士林封住盖片的三面。用吸水纸吸出外槽的液体后加入趋化因子，工业凡士林封口。用Leica AF6000活细胞工作站（Germany）对桥上细胞的迁移行为进行跟踪观察，每5 min拍摄一次，4 h为一个拍摄周期。

使用Image J软件分析间充质干细胞迁移的具体轨迹，计算从细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，即为细胞的迁移效率（FMI）（如图9），它反映细胞迁移持续性的高低，数值越大表明迁移的持续性越高。

图9中，Y轴正方向代表Dunn chamber外槽方向，通过标准化使每个细胞的起始点都位于X、Y轴的交叉点（0, 0），虚线表示细胞的迁移路径，A ₄ 点代表细胞迁移的最终位置，FMI值即细胞迁移终点在Y轴上的截距与细胞迁移总距离的比值。

4不同迁移能力神经干细胞的制备

根据Dunn chamber、Boyden chamber 的分析结果，确定针对某一种细胞因子在某一浓度时具有最高迁移效率的间充质干细胞的分化状态。按前述方法制备该分化状态的间充质干细胞，即可得到针对该因子在该浓度时具有最高迁移效率的间充质干细胞群体。由此，可为临床移植提供特定状态具有最高迁移效率的间充质干细胞种子。

实施例二成神经分化的间充质干细胞向C6细胞条件培养基和SDF-1α的趋化性迁移

神经胶质瘤细胞可以释放多种炎症趋化因子和生长因子，如SDF-1α，SCF-1（干细胞生长因子stem cell factor-1)，MCP-1（单核细胞趋化蛋白monocyte chemoattractant protein-1)。这些因子可以诱导间充质干细胞定向迁移至肿瘤细胞所在区域。本实施例分析了不同分化状态的间充质干细胞对C6 胶质瘤细胞系制备的条件培养基及趋化因子SDF-1α趋化性迁移效率。

1.研究方法

1.1不同分化状态间充质干细胞的制备见实施例一的技术方案。

1.2 C6细胞条件培养基的收集

C6细胞在75 cm ² 培养瓶长到80%汇合度，弃培养基，PBS洗细胞，加入10 ml L-DMEM，24 h后收集这些培养液，离心除去细胞碎片，即为C6条件培养基，置-20℃保存备用。

1.3 Dunn chamber研究分化细胞的趋化性迁移

方法如下：分析不同分化状态的单个间充质干细胞对C6条件培养基的趋化性迁移行为。BMSCs成神经诱导，取诱导前及预诱导24h、诱导后5h、维持18h和48h的细胞，chamber内外槽加满L-DMEM，将长有细胞的盖玻片盖在槽的正上方，细胞面朝下，并使盖玻片一方紧盖住桥，而不盖住外槽；工业凡士林封住盖玻片三方，吸水纸吸出外槽液体，加入C6细胞条件培养基或20ng/mlSDF-1α(L-DMEM稀释)，工业凡士林封口；对照组则不需吸出外槽的L-DMEM，直接用凡士林封住四面。Dunnchamber的使用方法和实验结果的统计同实施例一。

2.研究结果

如图10所示，我们可以看出，与对照组相比，C6细胞条件培养基能提高预诱导24 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率，且存在显著性差（P<0.05），这表明预诱导24 h和维持48 h的分化细胞对C6胶质瘤细胞条件培养基的趋向性迁移效率最佳；SDF-1α提高了BMSCs维持18 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率，与对照组相比，存在显著性差异（P<0.05），这表明维持18 h和

维持48 h的分化细胞对SDF-1α的趋向性迁移效率最佳。

实施例三不同分化状态BMSCs趋向PDGF迁移

血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)在胶质瘤组织中高表达，且胶质瘤恶性级别越高其表达越强。PDGF在胶质瘤血管生成中发挥重要的作用，其与位于细胞表面的受体二聚体结合，通过酪氨酸激酶激活的方式对细胞众多生理过程都有重要的调节作用，包括细胞的增殖、存活、迁移以及细胞外基质和组织修复因子的沉积。本实施例分析了不同分化状态的神经干细胞对C6 胶质瘤细胞系制备的条件培养基及趋化因子SDF-1α趋化性迁移效率。

1.研究方法

1.2 Dunn chamber：

为了研究分化不同时期的间充质干细胞对PDGF的趋化性，首先需要摸索最佳的趋化浓度，为此本实验采用的是Dunn chamber趋化性迁移实验，即用不同浓度梯度的PDGF作用于未诱导的间充质干细胞。Dunn chamber类似于细胞计数板，只是在其中心位置有两个同心圆槽，两个槽间留有一个1mm宽的桥。加到外槽的趋化剂会沿着桥向内槽扩散，这样就形成了从外槽到内槽逐渐降低的趋化剂浓度梯度。这个装置可以使细胞的迁移具有方向性。在我们的实验中，Dunn chamber外槽加满含不同浓度梯度PDGF的L-DMEM，而内槽仅为L-DMEM。这样外槽的PDGF就会向内槽扩散，30 min内就形成了线性的稳定的浓度梯度，这种梯度大约可以维持10~30小时。具体方法为：Dunn chamber内外槽均加满L-DMEM，将长有间充质干细胞的盖玻片盖在槽的正上方，细胞面朝下，并使盖玻片一方紧盖住桥，而不盖住外槽；工业凡士林封住盖玻片三方，吸水纸吸出外槽液体，加入5 ng/ml，50 ng/ml 和100 ng/ml PDGF (L-DMEM稀释)，工业凡士林封口。对照组则不需吸出外槽的L-DMEM，直接用凡士林封住四面。对处于内外槽间的桥上的细胞用德国Leica AF6000荧光显微镜37℃活细胞跟踪拍摄6 h，每次间隔5 min。结果显示(图11)，PDGF在0~50 ng/ml范围内，间充质干细胞的迁移效率均随着浓度的增加而增加，50 ng/ml和对照组与5 ng/ml 相比均有显著性差异，而当浓度达到100 ng/ml时则和50 ng/ml无显著性差异，因此50 ng/ml为最佳的PDGF趋化浓度，在下面的实验中将按这一浓度进行。

分析不同分化状态的间充质干细胞对PDGF的趋化性迁移行为。在间充质干细胞分化的不同时间点（A、B、C、D、E点），外槽加入50ng/ml的PDGF，以不添加PDGF的分化培养基为对照。Dunnchamber的使用方法和实验结果的统计同发明实施例一。

2.实验结果

由图12中可以看出外槽为含50 ng/ml PDGF的培养基时，同时PDGF提高了未诱导的BMSCs、维持18 h和维持48 h的分化细胞的迁移效率。这说明维持18 h和维持48 h的分化细胞与未分化的细胞对PDGF的趋向性迁移效率相当。在临床应用方面，我们优先考虑使用分化的细胞，这样细胞可以更快地分化成特定细胞以发挥它的作用。

实施例四不同分化状态BMSCs趋向HGF迁移

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是骨髓微环境的主要因子之一，可以调节造血细胞的分化，并通过激活整合蛋白等细胞黏附分子调节造血细胞的黏附和迁移。HGF不仅可以促进肿瘤细胞的侵袭，而且已经证明胶质瘤分泌的HGF能够趋化NSCs迁移。研究表明BMSCs表达HGF的受体c-met。有研究发现在大鼠的局部缺血/再灌注眼模型中移植BMSCs，大部分移植细胞沿着内界膜分布，只有少数细胞迁移到了视网膜，推测是细胞处于不同分化状态所致。另外，有研究报道肝癌细胞的迁移能力与其分化状态有一定关系。然而，目前关于HGF诱导BMSCs迁移的研究还相对较少，成神经分化不同状态BMSCs趋向HGF迁移的研究更未见报道。本实验旨在研究HGF对BMSCs以及成神经分化不同状态BMSCs定向迁移的影响。

1.2 Dunn chamber：

为了研究HGF是否能诱导BMSCs定向迁移，在Dunn chamber外槽加入不同浓度（5 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml）HGF，内槽只加L-DMEM。对照组，内外槽均为L-DMEM。分析方法见实施例三。结果显示，外槽加入不同浓度HGF，BMSCs的迁移速率没有变化，与对照相比无差异，都在18-20 μm/h范围内。迁移效率却随着HGF浓度的增加而增高，50 ng/ml与100 ng/ml HGF均显著提高了细胞的迁移效率，但两者之间无差异（图13），表明HGF能够诱导BMSCs定向迁移。

分析不同分化状态的间充质干细胞对HGF的趋化性迁移行为。在间充质干细胞分化的不同时间点（A、B、C、D、E点），外槽加入50 ng/ml的HGF，内槽为L-DMEM；对照组，内外槽均加入L-DMEM。Dunn chamber的使用方法和实验结果的统计同发明实施例一。

2.实验结果

实验组外槽加入50 ng/mlHGF，内槽为L-DMEM；对照组，内外槽均加入L-DMEM。结果显示（图14），外槽加入50 ng/ml HGF显著提高了未分化、预诱导24 h、诱导5 h以及维持48 h细胞的迁移效率。这说明未分化、预诱导24 h、诱导5 h以及维持48 h细胞的迁移效率相当，在临床治疗上，我们优先考虑移植分化成熟的细胞，可以尽快发挥其功能。

实施例五不同分化状态BMSCs趋向SCF迁移

1.2 Dunn chamber：

分析不同分化状态的间充质干细胞对SCF的趋化性迁移行为。在间充质干细胞分化的不同时间点（A、B、C、D、E点），外槽加入50 ng/ml的SCF，内槽为L-DMEM；对照组，内外槽均加入L-DMEM。Dunn chamber的使用方法和实验结果的统计同发明实施例一。

2.实验结果

如图15所示，在迁移效率方面未诱导、维持18 h和维持48 h的细胞BMSCs，SCF组明显高于对照组。这说明未诱导、维持18 h和维持48 h的细胞BMSCs的迁移效率相当。我们可以根据疾病所需，移植不同分化状态的细胞。

Claims

1.一种具有最高迁移效率的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤所述迁移效率，是指细胞迁移起始点到终点的最短距离与细胞迁移总距离的比值，数值越大表明迁移的持续性越高，定向迁移至病灶部位的能力越强。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述趋化因子为诱导间充质干细胞趋向性迁移的因子，包括所有能够引起不同分化状态的间充质干细胞定向迁移的炎症趋化因子和细胞生长因子。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述趋化因子为：VEGF、HGF、PDGF、SDF、SCF、BNDF、NGF、BFGF、EGF、LIF、TPO、G-CSF、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15。

6.一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物，其特征在于，所述药物包括：采用权利要求1的技术方案所得的间充质干细胞。

7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述药物还包括趋化因子。

8.一种治疗神经系统疾病、运动系统疾病、心血管系统疾病的药物载体，所述药物载体包括：采用权利要求1的方案所得的间充质干细胞。

9.根据权利要求7所述药物载体，其特征在于，还包括趋化因子。