KR102297470B1 - 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법 - Google Patents

줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102297470B1
KR102297470B1 KR1020190083683A KR20190083683A KR102297470B1 KR 102297470 B1 KR102297470 B1 KR 102297470B1 KR 1020190083683 A KR1020190083683 A KR 1020190083683A KR 20190083683 A KR20190083683 A KR 20190083683A KR 102297470 B1 KR102297470 B1 KR 102297470B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cells
cancer
cancer cells
mesenchymal stem
Prior art date
Application number
KR1020190083683A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210007358A (ko
Inventor
강동우
홍정희
박준영
이동운
심선진
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
루다큐어 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가천대학교 산학협력단, 루다큐어 주식회사 filed Critical 가천대학교 산학협력단
Priority to KR1020190083683A priority Critical patent/KR102297470B1/ko
Priority to US16/926,015 priority patent/US20210008118A1/en
Publication of KR20210007358A publication Critical patent/KR20210007358A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102297470B1 publication Critical patent/KR102297470B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화방법에 관한 것으로서, 배양중인 줄기세포에 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 및 선택적으로 음이온 채널 활성화제를 처리하는 줄기세포 교육단계를 포함하는 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법을 제공한다.

Description

줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법{Method for enhancing migration of stem cells into cancer cells}
본 발명은 줄기세포의 성능 강화 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법에 관한 것이다.
현재, 암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이는 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용되고 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이고, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 및 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등을 유발하기 때문이다. 이러한 항암제의 부작용을 최소화하기 위해 표적항암제의 개발이 활발히 일어나고 있으며, 현재까지 18종 이상의 표적항암제가 개발되어 임상에 적용되고 있고, 200여종 이상이 임상실험 중이다. 하지만 이러한 표적항암제는 같은 종류의 암이라도 특정 표적인자가 나타난 환자에게 효과가 있다는 한계가 있으며, 표적치료제는 장기간에 걸쳐서 투여해야하기 때문에 내성을 유발하는 문제가 있어 이를 보완하기 위해 표적치료제를 기존의 강력한 항암제와 병합하는 칵테일 요법과 여러 표적인자를 동시에 공격함으로써, 단 시간에 암을 제거하는 단일항암제를 사용하는 방법 등이 있는데, 이것 또한 심각한 부작용을 유발할 위험성을 내포하고 있다. 따라서 부작용이 적으면서도 효율적으로 암을 치료할 수 있는 표적치료제로 금나노 물질(Gold Nanoparticle), 생분해성 폴리머류(Biodegradable polymers) 및 탄소 나노튜브(carbon nanotubes)를 이용한 항암제의 연구가 활발히 진행중이다.
보다 효율적인 항암제치료를 위해 개발되어 온 기존의 나노 항암제들의 경우 제형에 사용되어 온 생분해성 폴리머가 산성 pH 및 혈액조건에서 항암제가 나노 물질로부터 쉽게 해리되어 표적 부위로의 항암제 전달에 한계가 있어 왔고 실리카, 자성입자, 탄소계 나노입자 등의 비분해성 나노입자는 독성 극복 항암제 용량에서 효능에 대한 검증이 안 되어 세망내피계(reticular endothelial system; RES) 기관에 축적되는 등의 단점을 가지고 있는 등, 종래의 나노 항암제들은 아직 해결해야 할 난제를 가지고 있다.
이에 대한 대안으로, 암세포에 대한 표적능을 가지고 있는 줄기세포를 이들 나노 항암제의 약물 전달체로 사용하고자 하는 연구가 시도되고 있다(Zhang et al., Oncotarget, 8(43): 75756-75766, 2017; Auffinger et al., Oncotarget, 4(3): 378-396, 2013; Mooney et al., ACS Nano 8(12): 12450-12460, 2014).
그러나 상기 선행기술의 경우, 줄기세포의 암 표적능이 그리 높지 않기 때문에 약물 전달체로 많은 수의 줄기세포를 사용해야 하기 때문에, 비용이 많이 소요되는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 줄기세포의 암세포로의 이동능 또는 표적능을 혁신적으로 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 배양중인 줄기세포에 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 및 선택적으로 음이온 채널 활성화제를 처리하는 줄기세포 교육단계를 포함하는 상기 줄기세포의 상기 암세포로의 이동능력 강화 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 상기 암세포로의 이동능력 강화용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 처리하여 교육된 상기 암세포로의 이동능력이 강화된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 상기 암세포로의 항암 물질 전달용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 표면에 항암제가 적재된 탄소 나노튜브(CNT) 또는 금(Au) 나노입자가 결합된, 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 줄기세포는 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 또는 상기 세포배양액 및 음이온 채널 활성화제를 처리하여 상기 암세포에 대한 이동능력이 강화된 이동능 강화 줄기세포인, 줄기세포-나노 항암제 복합체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 줄기세포-나노 항암제 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 또는 상기 세포배양액 및 음이온 채널 활성화제를 처리하여 상기 암세포에 대한 이동능력이 강화된 이동능 강화 줄기세포 표면에 항암제가 적재된 탄소나노튜브 또는 금 나노입자가 결합된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 암환자의 암 치료방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 줄기세포의 치료대상 암세포로의 이동 및 표적능력이 대폭 강화가 되기 때문에, 보다 적은 양의 줄기세포를 이용하더라도 항암치료 효과를 극대화시킬 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 암세포와 공배양시 중간엽 줄기세포의 암세포로의 이동능있어서, 다양한 케모카인의 차단의 효과를 확인한 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 트랜스웰을 이용한 중간엽 줄기세포(MSC) 및 암세포의 공배양시 다양한 케모카인 또는 케모카인 수용체(CCL1, CCL3, CXCR1, 및 CXCR4)의 차단에 의한 줄기세포의 암세로로의 이동능을 평가하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 개요도이고, 도 2b는 상기 실험 설계 대로 수행된 실험결과로 췌장암세포(PANC-1)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이며, 도 2c는 도 2b의 실험결과를 정량화한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 2d는 상기 실험 설계 대로 수행된 실험결과로 다양한 케모카인 또는 케모카인 수용체(CCL2, CXCR1 및 CXCR4) 차단시 폐암세포인 A549가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이며, 도 2e는 다양한 케모카인 또는 케모카인 수용체(CCL2, CXCR1 및 CXCR4) 차단시 폐암세포인 H1975가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 2f는 다양한 케모카인 또는 케모카인 수용체(CCR1, CCR3 및 CXCR4) 차단시 뇌종양 세포인 U87MG가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이며, 도 2g는 상기 도 2f의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 3a는 트랜스웰을 이용한 중간엽 줄기세포 및 폐암 세포(A549 및 H1975)의 공배양시 중간엽줄기세포의 이동능에 음이온 채널 억제제인 DIDS가 미치는 영향을 분석한 실험결과로, 암세포(A549 및 H1975)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 3b는 상기 도 3a의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 3c는 트랜스웰을 이용한 중간엽 줄기세포 및 췌장암 세포(PANC-1)의 공배양시 중간엽줄기세포의 이동능에 음이온 채널 억제제인 DIDS가 미치는 영향을 분석한 실험결과로, 췌장암세포가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 3d는 도 3c의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 트랜스웰을 이용한 중간엽 줄기세포 및 암세포의 공배양시 암세포 배양액의 수소이온 농도를 낮추기 위해 중탄산나트륨 공수송체(sodiu bicarbonate cotransprter) SLCA4A4 또는 SLCA4A7에 특이적인 항체 처리시 줄기세포의 암세포로의 이농등의 변화를 관찰한 실험결과로 췌장암 세포(PANC-1)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 4b는 상기 도 4a의 실험결과를 정량화한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4b는 트랜스웰을 이용한 중간엽 줄기세포 및 암세포의 공배양시 암세포 배양액의 수소이온 농도를 낮추기 위해 중탄산나트륨 공수송체(sodiu bicarbonate cotransprter) SLCA4A4 또는 SLCA4A7에 특이적인 항체 처리시 줄기세포의 암세포로의 이농등의 변화를 관찰한 실험결과로 뇌종양 세포(U87MG)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 4d는 상기 도 4c의 실험결과를 정량화한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 중간엽 줄기세포의 암세포로의 이동능의 향상이 암세포의 환경, 즉, 낮은 pH에 의해 기인하는 것인지 확인하기 위한 실험의 결과를 나타내는 것으로서 도 5a는 하부웰에 암세포(A549) 없이 배양액을 산성으로 조절한 후(pH 6.5), 트랜스웰의 중간엽 줄기세포(BMMSC)의 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 5b는 상기 도 5a의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 5c는 하부웰에 암세포(PANC-1) 없이 배양액을 산성으로 조절한 후(pH 6.5), 트랜스웰의 중간엽 줄기세포(ADMSC)의 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 5d는 상기 도 5c의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 5e는 하부웰에 암세포(U87MG) 없이 배양액을 산성으로 조절한 후(pH 6.5), 트랜스웰의 중간엽 줄기세포(ADMSC)의 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 5f는 상기 도 5e의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포에 음이온 채널 활성화제인 forskolin을 처리하거나, 암세포 배양액을 미리 처리하여 줄기세포의 케모카인 수용체를 활성화시키거나(education 1), 또는 줄기세포에 forskolin 및 암세포 배양액을 함께 처리한(education 2) 후 줄기세포의 페암 세포(A549)로의 이동 정도를 측정한 결과로서, 폐암 세포(A549)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 6b는 상기 도 6a의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6c는 줄기세포에 음이온 채널 활성화제인 forskolin을 처리하거나, 암세포 배양액을 미리 처리하여 줄기세포의 케모카인 수용체를 활성화시키거나(education 1), 또는 줄기세포에 forskolin 및 암세포 배양액을 함께 처리한(education 2) 후 줄기세포의 췌장암 세포(PANC-1)로의 이동 정도를 측정한 결과로서, 췌장암 세포(PANC-1)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 6d는 상기 도 6c의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6e는 줄기세포에 음이온 채널 활성화제인 forskolin을 처리하거나, 암세포 배양액을 미리 처리하여 줄기세포의 케모카인 수용체를 활성화시키거나(education 1), 또는 줄기세포에 forskolin 및 암세포 배양액을 함께 처리한(education 2) 후 줄기세포의 뇌종양 세포(U87MG)로의 이동 정도를 측정한 결과로서, 뇌종양 세포(U87MG)가 위치하는 아래층으로 이동된 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 6f는 상기 도 6e의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 중간엽 줄기세포의 교육에 의한 암세포 표적 증진 효과가 교육대상 암세포에 특이적인 현상인지 확인하기 위한 실험 결과를 도시한 것으로서, 도 7a는 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 폐암세포(A459) 배양액으로 교육시키거나 췌장암 세포(PANC-1) 배양액으로 교육시킨 후 트랜스웰에서 폐암세포가 존재하는 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 7b는 상기 도 7a에서 하부웰로 이동한 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 7c는 지방유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 췌장암 세포(PANC-1) 배양액으로 교육시키거나 폐암 세포(A549) 배양액으로 교육시킨 후 트랜스웰에서 췌장암 세포가 존재하는 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 7d는 상기 도 7c에서 하부웰로 이동한 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 7e는 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 폐암세포(A459) 배양액으로 교육시키거나 췌장암 세포(PANC-1) 배양액으로 교육시킨 후 트랜스웰에서 폐암세포가 존재하는 하부웰로의 이동능을 조사한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 7b는 상기 도 7a에서 하부웰로 이동한 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 골수유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)를 폐암 세포(A549) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이고, 도 8b는 상기 실험동물에서 적출된 주요 장기 및 종양조직에서의 중간엽 줄기세포의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이며, 도 8c는 상기 실험동물에서 적출된 폐를 단일세포화한 후 폐암 세포 및 골수유래 중간엽 줄기세포에 각각 특이적인 표지자에 대하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 지방유래 중간엽 줄기세포를 췌장암 세포(PANC-1) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이고, 도 9b는 상기 실험동물에서 적출된 주요 장기 및 췌장에서의 중간엽 줄기세포의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이며, 도 9c는 상기 실험동물에서 적출된 췌장을 단일세포화한 후 폐암 세포 및 골수유래 중간엽 줄기세포에 각각 특이적인 표지자에 대하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 지방유래 중간엽 줄기세포를 뇌종양 세포(U87MG) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이고, 도 10b는 상기 실험동물에서 적출된 주요 장기 및 뇌에서의 중간엽 줄기세포의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이며, 도 10c는 상기 실험동물에서 적출된 뇌에서 암세포(상단) 및 줄기세포(하단)의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이고, 도 10d는 적출된 뇌를 단일세포화한 후 뇌종양 세포 및 지방유래 중간엽 줄기세포에 각각 특이적인 표지자에 대하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)"는 성체 줄기세포 중 성체 중간엽 줄기세포(Adult mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미하며 골수나 제대혈, 지방세포에서 유래되며 다분화능을 가진 것이 특징이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "나노 항암제 복합체"는 항암제의 방출, 흡수를 제어 하거나, 체내의 특정부위에 항암제를 표적화(targeting)하여 전달하기 위한 것으로, 항암제의 부작용을 줄이면서 효능을 극대화 시켜 필요한 양의 항암제를 표적부위에 일정시간 동안 효과적으로 머무를 수 있도록 조절하기 위한 것으로 나노기술을 이용한 항암제 전달 시스템을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. 따라서 이러한 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 풀어지고 T 림프구가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 상기 "면역 검문소"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다. PD-1 저해제로는 Pembrolizumab(상표명: Keytruda), Nivolumab(상표명: Opdivo) 등이 존재하고, PD-1의 리간드인 PD-L1 저해제로는 Atezolizumab(상표명: Tecentriq), 및 Avelumab(상표명: Bavencio) 등이 존재한다. 한편 CTLA-4/B7-1/B7-2의 상호작용을 저해하는 CTLA-4 저해제로는 Ipilimumab(상표명: Yervoy) 등이 FDA의 승인을 받은 바 있다. 최근 몇 년 동안 특히 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 또는 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma) 환자에게서 인상적인 성공을 거두었으며 다른 유형의 암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 많은 가능성을 보여주고 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 불리우며, 박테리아나 바이러스와 같은 외래성 물질을 확인하거나 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용되는 플라스마 세포로부터 생성되는 Y-자 형태의 단백질을 의미한다. 본 문서에서 사용되는 상기 항체에는 항체 유래의 다양한 "기능성 단편", 예컨대, Fab, F(ab')2, Fab', ScFv 및 sdAb가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 항체에서 유래한 항원결합능을 가지고 있는 단편으로서 항체를 단백질 절단효소로 절단하여 생성된 단편은 물론 재조합 방식에 생성된 단일쇄 단편을 모두 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigenbinding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystallizable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 F(ab')2를 약한 환원조건에서 분리시킴으로써 생성되는 Fab와 구조가 유사한 분자이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "ScFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사량체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체나 그로부터 유래한 항체의 기능성 단편과는 달리, 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 단일쇄 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 Alphabody, Avimer, Affilin, nanoCLAMPs, Adnectin, Affibody, Anticalin, DARPin, Fynomer, Kunitz domain, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 배양중인 줄기세포에 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 및 선택적으로 음이온 채널 활성화제를 처리하는 줄기세포 교육단계를 포함하는 상기 줄기세포의 상기 암세포로의 이동능력 강화 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 치수유래 중간엽 줄기세포 또는 말초혈액 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 음이온 채널 활성화제는 Cl- 채널 활성화제 또는 바이카보네이트(bicarbonate) 채널 활성화제일 수 있고, 상기 음이온 채널 활성화제는 포스콜린(forskolin), 데누포솔(denufosol), 브레베날(brevenal), 루비프로스톤(lubiprostone), N-aroylaminothiazole "activators"(Eact) analogue일 수 있다. 이들 음이온 채널 활성화제에 대하여는 Namkung 등(FASEB J. 25(11): 4048-4062, 2011)에 잘 정리되어 있다. 상기 문헌은 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 상기 암세포로의 이동능력 강화용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 치수유래 중간엽 줄기세포 또는 말초혈액 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 음이온 채널 활성화제는 Cl- 채널 활성화제 또는 바이카보네이트 채널 활성화제일 수 있고, 상기 음이온 채널 활성화제는 포스콜린(forskolin), 데누포솔(denufosol), 브레베날(brevenal), 루비프로스톤(lubiprostone), N-aroylaminothiazole "activators"(Eact) analogue일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 처리하여 교육된 상기 암세포로의 이동능력이 강화된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 상기 암세포로의 항암 물질 전달용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 표면에 항암제를 포함하는 나노입자가 결합된, 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 줄기세포는 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 또는 상기 세포배양액 및 음이온 채널 활성화제를 처리하여 상기 암세포에 대한 이동능력이 강화된 이동능 강화 줄기세포인, 줄기세포-나노 항암제 복합체가 제공된다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 항암제는 화학적 제제 또는 생물학적 제제일 수 있고, 상기 화학적 제제는 독소루비신, 파클리탁셀, ABT737, 5-플루오로우라실, BCNU, CCNU, 6-메르캅토퓨린, 나이트로젠 머스타드, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메소트렉세이트, 시타라빈 싸이오테파, 부설판 또는 프로카바진일 수 있고, 상기 생물학적 제제는 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역 활성화 단백질 또는 암세포 표지 단백질을 표적으로 하는 항체 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 상기 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 면역 검문소는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, B7-1 또는 B7-2일 수 있고, 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제일 수 있다. 상기 PD-1/PDL1 상호작용 저해제는 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체일 수 있고, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제 역시 상기 CTLA-4, B7-1 또는 B7-2를 표적으로 하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체일 수 있으며, 상기 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있으며, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다. 상기 면역 활성화 단백질은 C-reactive protein, Serum amyloid P component, Serum amyloid A, Mannan-binding lectin, Fibrinogen, prothrombin, factor VIII, von Willebrand factor, Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), Alpha 2-macroglobulin, Hepcidin, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Orosomucoid(Alpha-1-acid glycoprotein, AGP), Alpha 1-antitrypsin, 또는 Alpha 1-antichymotrypsin일 수 있다. 상기 암세포 표지 단백질은 암세포 표면에 과발현된 단백질로서 AFP(alphafetoprotein), EGFR(epidermal growth factor receptor), CEA(carcinoembryonic antigen), CA-123, MUC-1, ETA(epithelial tumor antigen), tyrosinase, 또는 MAGE(melanoma-associated antigen)일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 나노입자는 유기 나노입자 또는 무기 나노입자일 수 있고, 상기 유기 나노입자는 생분해성 고분자로 구성되는 다공성(porous) 또는 쉘/코어 구조(core/shell structure)의 나노입자일 수 있고, 상기 생분해성 고분자는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PVA{poly(vinyl alcohol)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, PHA{poly(hydroxyalkanoate)}, 지방족 폴리에스터 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 아울러, 상기 무기 나노입자는 금 나노입자 또는 탄소 나노튜브 계열의 나노입자일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 나노입자는 줄기세포 표지 단백질에 특이적인 항체가 부착되어 상기 줄기세포에 결합될 수 있고 상기 줄기세포 표지 단백질은 CD90, CD73 또는 CD105일 수 있다.
상기 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서, 상기 나노입자는 카르복실기를 갖는 고분자 물질이 코팅될 수 있고 상기 카르복실기를 갖는 고분자 물질은 카르복실화 PEG(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PLA{poly( lactic acid)} 또는 PGA{poly(glycolic acid)}일 수 있다.
선택적으로, 상기 항암제가 생물학적 제제일 경우 상기 줄기세포가 직접 상기 생물학적 제제를 발현할 수 있도록 형질전환된 것일 수도 있다. 이 경우 줄기세포의 유전자 발현에 적절한 전사조절인자 예컨대 프로모터 및 인핸서에 작동가능하도록 연결된 상기 생물학적 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제조한 후 이를 줄기세포에 다양한 방법으로 형질도입함으로써 형질전환된 줄기세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 줄기세포-나노 항암제 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 암 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 항암제용 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 항암제용 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 항암제의 활성, 항암제에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 항암제를 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 암 치료용 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 다른 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 또는 상기 세포배양액 및 음이온 채널 활성화제를 처리하여 상기 암세포에 대한 이동능력이 강화된 이동능 강화 줄기세포 표면에 항암제가 포함된 나노입자가 결합된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 암환자의 암 치료방법이 제공된다.
본 발명자들은 암세포로의 표적능을 가진 줄기세포의 능력에 주목하여 줄기세포 표면에 항암 화합물을 적재하고 있는 금 나노입자와 같은 나노입자를 결합시킨 줄기세포-항암 나노입자 복합체를 제조하여 그의 안전성과 항암 치료효과를 확인한 바 있다. 그리나, 줄기세포의 암 표적능이 완전하지 않기 때문에 줄기세포 치용 항암제의 경우 많은 양의 줄기세포를 필요로 하는 문제점을 가지고 있다. 이는 줄기세포 이용 암치료제의 개발에 있어서 큰 걸림돌인데, 왜냐하면 줄기세포의 배양 및 증식에 큰 비용이 소요되기 때문이다. 따라서, 보다 적은 양으로도 최대의 효과를 나타낼 수 있도록 줄기세포의 암세포로의 표적능을 강화시킬 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포의 암세포로의 표적능을 극대화하고자 예의노력한 결과, 줄기세포의 음이온 채널을 활성화시킬 경우 줄기세포의 표적 암세포로의 이동능력이 강화되고 이러한 암세포 이동능력은 표적 암세포의 세포배양액을 처리하여 일정 시간 교육시킬 경우에도 마찬가지로 강화되며, 두 가지(음이온 채널 활성화제 및 표적 암세포의 세포배양액)를 줄기세포에 동시에 처리하여 교육시킬 경우 당해 표적 암세포에 대한 이동능력이 더 현저하게 상승함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 줄기세포의 시험관내 이동 능력 측정
본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 시험관내 이동 능력 측정은 8 μm 크기의 구멍을 갖는 트랜스웰 멤브레인 이중층 플레이트를 사용하였다. 멤브레인 아래 층에는 줄기세포를 자극하기 위한 암세포를 배양하였으며, 위에는 줄기세포를 배양하여 아래쪽으로 세포가 투과하도록 하였다. 이 때 투과된 줄기세포의 수를 통해 이동 능력을 측정하였다.
1-1: 암세포 유래 케모카인(chemokine)에 따른 줄기세포 추적능력 검색
본 발명자들은 줄기세포의 암세포로의 이동능력이 암세포가 분비하는 케모카인에 대한 반응에 의한 것인지 조사하고자 하였다. 이를 위해 본 발명자들은 암세포에서 분비하는 케모카인에 반응하는 줄기세포의 케모카인 수용체를 항체로 저해함으로써 케모카인의 영향력을 조사하였다(도 1). 구체적으로, 폐암세포의 경우, 트랜스웰 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)와 실험군인 폐암세포(A549 및 H1975)를 각각 5x104 개씩 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 케모카인 수용체(CXCR1, CXCR4 및 CCL2)에 특이적으로 결합하는 항체를 30분간 처리한 BM-MSC 5x104개를 트랜스웰에 분주한 후 하부웰에 상기 트랜스웰을 삽입하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 췌장암 세포의 경우, 트랜스웰 아래층에 대조군인 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 실험군인 췌장암 세포(PANC-1)를 각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, BM-MSC에 케모카인 수용체(CCR1 및 CCR3)에 특이적으로 결합하는 항체를 30분간 처리하고 트랜스웰에 5x104개 씩 분주한 후 암세포가 존재하지 않는 새 하부웰에 삽입하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 뇌종양 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 실험군인 뇌종양 세포(U87MG)를 각 5x104 개씩 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 케모카인 수용체(CCR1, CCR5 및 CXCR4)에 특이적으로 결합하는 항체를 30분간 처리한 후 AD-MSC를 계수하여 5x104 개씩 트랜스웰에 파종하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 하부웰로 이동한 세포 메탄올로 고정시킨 뒤 세포핵을 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 이어, 공초점 형광현미경을 통해 투과된 줄기세포를 계수하여 이동능력을 측정하였다.
그 결과, 도 2a 내지 2g에서 확인되는 바와 같이, 줄기세포의 암세로로의 이동능은 케모카인 또는 케모카인 수용체를 차단함으로써 감소하는 것으로 나타났으며, 특히 두 가지 이상의 케모카인 또는 케모카인 수용체를 동시에 차단할 경우 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 이는, 암세포에서 분비하는 케모카인을 줄기세포 표면에 존재하는 케모카인 수용체가 인지하는 것이 줄기세포의 암세포로의 주화성에 있어서 중요한 반응임을 시사하는 것이다.
1-2: 이온 채널 활성에 따른 줄기세포 이동 능력 검색
본 발명자들은 줄기세포의 암세포로의 이동능력에 이온 채널의 활성이 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 실시예 1-1과 유사한 분석을 이온 채널 저해제인 DIDS(4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid)와 이온 채널(SLC4A4, SLC4A7)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 폐암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)와 실험군인 폐암세포(A549 및 H1975)를 각각 5x104 개씩 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 트랜스웰에 이온 채널에 특이적으로 결합하는 항체 또는 DIDS 500 μM를 처리한 BM-MSC를 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 췌장암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 AD-MSC와 실험군인 췌장암 세포(PANC-1)를 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 트랜스웰 위에 DIDS 또는 이온 채널에 특이적으로 결합하는 항체를 처리한 AD-MSC를 5x104 개씩 파종하고 상기 하부웰에 삽입하여 3시간 동안 추가 배양하였다. 뇌종양 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 AD-MSC와 실험군인 뇌종양 세포(U87MG)를 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 트랜스웰 위에 DIDS 또는 이온 채널에 특이적으로 결합하는 항체를 처리한 AD-MSC를 5x104 개씩 파종하고 상기 하부웰에 삽입하여 3시간 동안 추가 배양하였다. 배양이 끝난 아래층 웰의 세포를 메탄올로 고정시킨 뒤 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 투과된 줄기세포의 핵을 염색시켰다. 이어, 공초점 형광현미경을 통해 투과된 줄기세포를 계수하여 이동능력을 측정하였다(도 3a 내지 4d).
그 결과, 도 3a 내지 4d에서 나타난 바와 같이, 시험에 사용된 모든 암세포에 대한 중간엽 줄기세포의 이동능력은 음이온 채널 차단제인 DIDS와 음이온 채널 특이적 항체(anti-SLC4A4, anti-SLC4A7) 처리에 의해 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이는, 음이온의 활성이 줄기세포의 암세로포의 이동에 있어서 중요한 인자임을 시사하는 것이다.
1-3: 산성도가 줄기세포 이동에 미치는 영향
암세포의 미세환경은 정상조직과 달리 산성을 나타낸다. 이에, 본 발명자들은 줄기세포의 암세로로의 이동에 있어서 암의 미세환경 즉 산성조건이 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 이를 위해 구체적으로, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 폐암세포(A549)를 각각 5x104 개씩 분주하고 실험군으로 암세포 없이 pH 6.5로 조정한 배양배지를 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 트랜스웰에 BM-MSC를 5x104 개씩 파종한 후 상기 하부웰에 삽입하고 6시간 동안 배양하였다. 췌장암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 췌장암 세포(PANC-1)를 각각 5x104 개씩 분주하고 실험군으로 암세포 없이 pH 6.5로 조정한 배양배지를 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 트랜스웰에 위에 AD-MSC를 5x104 개씩 파종한 후 하부웰에 삽입하고 3시간 동안 배양하였다. 뇌종양 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 뇌종양 세포(U87MG)를 각각 5x104 개씩 분주하고 실험군으로 암세포 없이 pH 6.5로 조정한 배양배지를 분주한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이어, 트랜스웰에 위에 AD-MSC를 5x104 개씩 파종한 후 하부웰에 삽입하고 3시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 아래층 웰의 세포를 메탄올로 고정시킨 뒤 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 투과된 줄기세포의 핵을 염색시켰다. 이어, 공초점 형광현미경을 통해 투과된 줄기세포를 계수하여 이동능력을 측정하였다(도 5a 내지 5f).
그 결과, 도 5a 내지 5f에서 나타난 바와 같이, 암세포가 없는 경우라도 pH가 약산성으로 조정된 배지로의 줄기세포의 이동이 대조구에 비해서 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는, 줄기세포가 암세포에서 분비되는 케모카인과의 반응과 독립적인 기전으로 pH 의존적인 이동능을 나타냄을 시사하는 것이다.
1-4: 줄기세포에 대한 교육의 효과 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1-1 내지 1-3의 결과로부터 줄기세포를 교육시킬 경우 암세포에 대한 이동능력이 강화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 폐암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)와 실험군인 폐암세포(A549 및 H1975)를 각각 5x104 개씩 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 하부웰의 배양과 동시에, 골수유래 중간엽 줄기세포를 폐암 세포를 24시간 동안 37℃에서 배양했던 무세포 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 트랜스웰에 5x104 개씩 분주한 후 골수유래 중간엽 줄기세포 또는 폐암세포가 배양중인 하부웰에 삽입하고 6시간 동안 추가 배양하였다(education). 췌장암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 실험군인 췌장암 세포(PANC-1)를 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 상기 폐암 세포와 마찬가지로 상기 하부웰의 배양과 동시에, 지방유래 중간엽 줄기세포를 췌장암 세포를 24시간 동안 37℃에서 배양했던 무세포 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 트랜스웰에 5x104 개씩 분주한 후 상기 지방유래 중간엽 줄기세포 또는 췌장암 세포가 배양중인 하부웰에 삽입하고 3시간 동안 추가 배양하였다(education). 뇌종양 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 실험군인 뇌종양 세포(U87MG)를 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 상기 폐암 세포 및 췌장암 세포와 마찬가지로 상기 하부웰의 배양과 동시에, 지방유래 중간엽 줄기세포를 뇌종양 세포를 48시간 동안 37℃에서 배양했던 무세포 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 트랜스웰에 5x104 개씩 분주하고 상기 지방유래 중간엽 줄기세포 또는 뇌종양 세포가 배양중인 하부웰에 삽입하고 3시간 동안 추가 배양하였다(education). 한편, 상기 실시예 1-3에서, 음이온 채널 억제제 처리시 줄기세포의 암세포로의 이동능력이 감소된 결과로부터 음이온 채널을 활성화시킬 경우 반대로 줄기세포의 이동능력이 증가하는지 확인하기 위해 모든 실험에서 음이온 활성화제(anion channel activator)인 100 nM의 포스콜린(forskolin)을 단독으로 처리하였으며(+forskolin), 포스콜린과 상기 암세포 배양배지의 병용처리시(education2 또는 e2) 줄기세포의 이동능이 증가하는지 여부를 조사하였다.
배양이 끝난 아래층 웰의 세포를 메탄올로 고정시킨 뒤 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 투과된 줄기세포의 핵을 염색시켰다. 이어, 공초점 형광현미경을 통해 투과된 줄기세포를 계수하여 이동능력을 측정하였다(도 6a 내지 6f). 상기 실험결과 도 6a 내지 6f에서 나타난 바와 같이, 줄기세포에 포스콜린을 처리할 경우 줄기세포의 암세포로의 이동능이 유의하게 증가하였으며, 암세포 배양액으로 미리 교육시킨 줄기세포의 경우 상기 포스콜린 처리 줄기세포보다 더 우수한 이동능을 나타냈으며, 포스콜린 및 암세포 배양액의 병용 처리시(education2 또는 e2) 가장 우수한 이동능을 나타냈다. 이는 본 발명의 줄기세포 교육방법이 줄기세포의 암세포로의 표적능을 현저하게 개선시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
1-5: 줄기세포의 교육이 암세포 특이적인지 여부 조사
본 발명자들은 상기 결과로부터 암세포 배양액을 이용한 줄기세포의 교육이 해당 암세포에만 특이적으로 작용하는 것인지 아니면 다른 암세포에 대하여도 동일한 효과가 나타나는 것인지 조사하기 위해, 표적 암세포를 변경한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-4와 동일한 실험을 수행하였다. 이를 위해 구체적으로, 폐암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)와 실험군인 폐암세포(A549)를 각각 5x104 개씩 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 트랜스웰에 폐암 세포(A549)를 24시간 동안 37℃에서 배양했던 배지에서 24시간 동안 37℃에서 배양하거나 췌장암 세포(PANC-1)를 48시간 동안 37℃에서 배양했던 배지에서 24시간 동안 37℃에서 배양한 BM-MSC 세포를 각각 5x104 개씩 분주한 후 상기 하부웰에 삽입하고 6시간 동안 배양하였고(education), 췌장암 세포의 경우, 하부웰에 대조군인 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 실험군인 췌장암 세포(PANC-1)을 각각 5x104 개씩 분주한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 트랜스웰에 췌장암 세포(PANC1)를 48시간 동안 37℃에서 배양했던 배지에서 24시간 동안 37℃에서 배양하거나 폐암 세포(A549)를 24시간 동안 37℃에서 배양했던 배지에서 24시간 동안 37℃에서 배양한 AD-MSC 세포를 각각 5x104 개씩 분주한 후 상기 하부웰에 삽입하고 6시간 동안 배양하였다(education).
그 결과 도 7a 내지 7d에서 나타난 바와 같이, 다른 종류의 암세포 교육시킨 줄기세포는 대조군 줄기세포와 유의한 차이가 없는 이동능을 나타냈다. 이는, 본 발명의 줄기세포 교육방법이 표적 대상 암세포에 특이적인 것임을 시사하는 것이다.
실시예 2: 줄기세포의 생체내 암 표적능 측정
본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 생체내 이동 능력 측정은 BALB/c 누드 마우스를 사용하였다. 종양모델은 줄기세포를 자극하기 위한 암세포{폐암(A549), 뇌암(U87MG), 췌장암(PANC-1)}를 주사함으로써 제조하였으며, 줄기세포를 주사한 뒤 종양 조직 내의 줄기세포를 계수하여 이동 능력을 측정하였다.
2-1: 폐암 모델에서의 줄기세포의 종양조직 표적능력 분석
구체적으로, BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 폐암 세포(A549-luciferase-RFP)를 1x106 개씩 꼬리정맥을 통해 주사하여 폐암모델을 형성였다. 이후 4~8주간 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 폐암의 크기를 확인하여, 폐암이 형성이 된 것을 확인한 뒤(도 8a), 형광 표지(vivotrack 680)된 골수유래 줄기세포(BM-MSC) 1x106 개를 상기 폐암 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 줄기세포 정맥주사 5일 후에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행한 후, 실험동물을 희생시킨 후 종양을 포함한 주요 장기를 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 수행함으로써, 전신 및 주요 장기 내의 줄기세포의 분포를 확인하였다(도 8b). 아울러, 이미징을 마친 적출된 폐얌세포를 포함하고 있는 폐조직을 단일세포화한 후, 유세포 분석을 함으로써, 종양조직 내로 침투한 줄기세포의 양을 분석하였다. 단일세포화를 위해 적출된 조직을 잘게 자른 뒤 콜라겐 분해효소와 함께 30분간 37℃에서 배양하였다. 배양된 조직을 10 μm 크기의 거름망을 갖는 필터에 거른 뒤 걸러진 세포를 PBS에 세척하였다. 이와 같이 분리된 세포를 5% FBS/PBS 수용액에 재현탁한 후, RFP 및 vivotrack 680의 방출 파장에 따라 유세포 분석을 수행함으로써 각 실험군의 세포 분포를 측정하였다(도 8c).
그 결과, 도 8a 내지 8c에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 두 가지 교육법을 적용할 경우 종양 조직으로의 줄기세포의 표적능이 향상되었음을 알 수 있었다. 도 8c에서 1사분면(Q1) 및 2분면(Q2)는 줄기세포가 존재하는 영역이고 2사분면(Q2) 및 3사분면(Q3)는 암세포가 존재하는 영역으로 Q2의 경우 암세포와 줄기세포가 결합된 형태로 존재하는 것으로 해석이 가능하다. 4사분면(Q4)은 종양조직 내의 정상 세포가 존재하는 구역이다. 도 8c의 유세포분석 결과를 보면 2사분면(Q2)에 존재하는 세포들(암세포와 줄기세포가 결합한 형태)이 줄기세포 처리에 의해 증가하는데, 교육시 Q2/Q3의 비율이 대조군 중간엽 줄기세포에 비하여 현저하게 상승함을 알 수 있다. 특히 포스콜린 및 암세포 배양배지를 처리함으로써 교육시킨 실험군(MSC-e2)의 경우 비록 Q2에 존재하는 세포의 백분율은 다소 낮으나 이는 상대적으로 암세포의 비율이 낮아서 그런 것으로, Q2/Q3 비율은 제일 높은 것으로 나타나 암세포로의 표적능이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 줄기세포가 암세포 특이적인 약물 전달에 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
3-2: 췌장암 모델에서의 줄기세포의 종양조직 표적능력 분석
구체적으로, BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 췌장암 세포(PANC-1-luciferase-RFP)를 1x106 개씩 꼬리정맥을 통해 주사하여 췌장암 모델을 형성였다. 이후 4~8주간 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 췌장암의 크기를 확인하여, 췌장암이 형성이 된 것을 확인한 뒤(도 9a), 형광 표지(vivotrack 680)된 지방유래 줄기세포(AD-MSC) 1x106 개를 상기 췌장암 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 줄기세포 정맥주사 5일 후에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행한 후, 실험동물을 희생시킨 후 종양이 형성된 췌장을 포함한 주요 장기를 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 수행함으로써, 전신 및 주요 장기 내의 줄기세포의 분포를 확인하였다(도 9b). FACS 분석은 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 수행하였다(도 9c).
그 결과, 도 9a 내지 9c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 두 가지 교육법을 적용할 경우 종양 조직으로의 줄기세포의 표적능이 향상되었음을 알 수 있었으며, 특히 포스콜린 및 암세포 배양배지를 처리함으로써 교육시킨 실험군(PANC-e2)의 경우 암세포 배양배지를 처리한 실험군(PANC-e1)에 비해 Q1 및 Q2에 존재하는 줄기세포의 비율은 다소 낮게 나타나나, 세포군의 패턴을 보면 정상 췌장 세포, 중간엽 줄기세포(MSC), MSC와 췌장암 세포가 결합된 형태의 세 가지 세포군이 명확하게 구분되고 있어, 췌장암 세포로의 표적능이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 줄기세포가 암세포 특이적인 약물 전달, 특히 대표적인 난치성 악성종양인 췌장암에 대한 약물전달에 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
3-3: 뇌종양 모델에서의 줄기세포의 종양조직 표적능력 분석
뇌종양 모델은 BALB/c 누드 마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 뇌종양 세포(U87MG-luciferase-RFP)를 각 3x105 개씩 수술을 통해 뇌에 직접 주사함으로써 형성하였다. 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 뇌종양의 크기를 확인하여, 뇌종양이 형성이 된 것을 확인한 뒤(도 10a), 형광 표지(vivotrack 680)된 지방유래 줄기세포(AD-MSC) 1x106 개를 상기 뇌종양 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 줄기세포 정맥주사 5일 후에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행한 후, 실험동물을 희생시킨 후 종양이 형성된 뇌를 포함한 주요 장기를 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 수행함으로써, 전신, 주요 장기 및 뇌에서의 줄기세포의 분포를 확인하였다(도 10b). FACS 분석은 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 수행하였다(도 10c).
그 결과, 도 10a 내지 10d에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 줄기세포는 뇌종양에 특이적인 표적능을 나타냈으며, 특히 도 10 d에서 나타난 바와 같이, 뇌종양 세포 배양액 단독 처리군(ADMSC e) 및 뇌종양 세포 배양액과 포스콜린으로 교육시킨 실험군(ADMSC e2)의 경우 2사분면(Q2)로의 천이가 두드러지게 나타나 미교육 줄기세포를 사용한 대조군보다 뇌종양에 대한 표적능이 현저하게 증가하였음을 알 수 있다. 특히, 본 실험 결과는 줄기세포를 정맥주사를 통해 실험동물에 주입하여 달성된 결과로서 줄기세포가 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌종양으로 정확하게 이동한 것을 입증한 것으로서, 종래 혈뇌장벽의 존재로 인해서 항암제 치료가 제한적이었던 뇌종양 치료에 있어서 중요한 기술적 난제를 해결할 수 있는 실마리를 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 배양중인 줄기세포에 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 및 선택적으로 음이온 채널 활성화제를 처리하는 줄기세포 교육단계를 포함하는 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인, 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 치수유래 중간엽 줄기세포 또는 말초혈액 유래 중간엽 줄기세포인, 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 음이온 채널 활성화제는 Cl- 채널 활성화제 또는 바이카보네이트 채널 활성화제인, 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 음이온 채널 활성화제는 포스콜린(forskolin), 데누포솔(denufosol), 브레베날(brevenal), 루비프로스톤(lubiprostone), N-aroylaminothiazole "activators"(Eact) 유사체인, 줄기세포의 암세포로의 이동능력 강화 방법.
  6. 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 상기 암세포로의 이동능력 강화용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 치수유래 중간엽 줄기세포 또는 말초혈액 유래 중간엽 줄기세포인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 음이온 채널 활성화제는 Cl- 채널 활성화제 또는 바이카보네이트 채널 활성화제인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 음이온 채널 활성화제는 포스콜린(forskolin), 데누포솔(denufosol), 브레베날(brevenal), 루비프로스톤(lubiprostone), N-aroylaminothiazole "activators"(Eact) 유사체인, 조성물.
  11. 음이온 채널 활성화제 및 치료대상 환자로부터 수득된 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액을 처리하여 교육된 상기 암세포로의 이동능력이 강화된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 상기 암세포로의 항암 물질 전달용 조성물.
  12. 줄기세포 표면에 항암제가 포함된 나노입자가 결합된, 줄기세포-나노 항암제 복합체에 있어서,
    상기 줄기세포는 치료대상 암환자로부터 수득한 암세포의 시험관내 세포배양물의 세포배양액 또는 상기 세포배양액 및 음이온 채널 활성화제를 처리하여 상기 암세포에 대한 이동능력이 강화된 이동능 강화 줄기세포인, 줄기세포-나노 항암제 복합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 항암제는 화학적 제제 또는 생물학적 제제인, 줄기세포-나노 항암제 복합체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 생물학적 제제는 면역검문소 억제제, 면역 활성화 단백질 또는 암세포 표지 단백질을 표적으로 하는 항체 또는 그의 기능성 단편인, 줄기세포-나노 항암제 복합체.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 나노입자는 무기 또는 유기성 나노입자인, 줄기세포-나노 항암제 복합체.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 나노입자는 줄기세포 표지 단백질에 특이적인 항체가 부착되어 상기 줄기세포에 결합되는, 줄기세포-나노 항암제 복합체.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 줄기세포-나노 항암제 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.
KR1020190083683A 2019-07-11 2019-07-11 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법 KR102297470B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190083683A KR102297470B1 (ko) 2019-07-11 2019-07-11 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법
US16/926,015 US20210008118A1 (en) 2019-07-11 2020-07-10 Method for enhancing migration of stem cells into cancer cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190083683A KR102297470B1 (ko) 2019-07-11 2019-07-11 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210007358A KR20210007358A (ko) 2021-01-20
KR102297470B1 true KR102297470B1 (ko) 2021-09-02

Family

ID=74102521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190083683A KR102297470B1 (ko) 2019-07-11 2019-07-11 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20210008118A1 (ko)
KR (1) KR102297470B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153832A1 (ko) * 2022-02-14 2023-08-17 가천대학교 산학협력단 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102596422B1 (ko) * 2021-02-17 2023-10-30 가천대학교 산학협력단 줄기세포의 염증부위로의 이동능 강화방법
CN113943708A (zh) * 2021-10-20 2022-01-18 四川大学华西医院 用于构建胆管癌异种移植模型的移植体及制备方法和用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277368B1 (en) * 1996-07-25 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine
RU2527182C2 (ru) * 2009-10-23 2014-08-27 Рнл Био Ко., Лтд Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани
KR102036711B1 (ko) * 2017-04-21 2019-11-26 가천대학교 산학협력단 줄기세포-나노 복합체의 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153832A1 (ko) * 2022-02-14 2023-08-17 가천대학교 산학협력단 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20210008118A1 (en) 2021-01-14
KR20210007358A (ko) 2021-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Izci et al. The use of alternative strategies for enhanced nanoparticle delivery to solid tumors
Wu et al. Gold nanorod photothermal therapy alters cell junctions and actin network in inhibiting cancer cell collective migration
Smith et al. Selective uptake of single-walled carbon nanotubes by circulating monocytes for enhanced tumour delivery
Taherkhani et al. Covalent binding of nanoliposomes to the surface of magnetotactic bacteria for the synthesis of self-propelled therapeutic agents
Hayashi et al. Differential nanoparticle sequestration by macrophages and scavenger endothelial cells visualized in vivo in real-time and at ultrastructural resolution
Wen et al. Sustained delivery and molecular targeting of a therapeutic monoclonal antibody to metastases in the central nervous system of mice
Ni et al. Nanoparticle-based cell trackers for biomedical applications
Wegner et al. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors
KR102297470B1 (ko) 줄기세포의 암세포로의 이동성 강화 방법
Miller et al. Imaging of anticancer drug action in single cells
Papasani et al. Gold nanoparticles: the importance of physiological principles to devise strategies for targeted drug delivery
Jain et al. Comparison of avidin, neutravidin, and streptavidin as nanocarriers for efficient siRNA delivery
Velasco-Aguirre et al. Peptides and proteins used to enhance gold nanoparticle delivery to the brain: preclinical approaches
Cabezon et al. Trafficking of gold nanoparticles coated with the 8D3 anti-transferrin receptor antibody at the mouse blood–brain barrier
Xu et al. Bioconjugated quantum rods as targeted probes for efficient transmigration across an in vitro blood− brain barrier
Kawasaki et al. Nanotechnology, nanomedicine, and the development of new, effective therapies for cancer
Pardridge Drug transport across the blood–brain barrier
Anand et al. Tailored delivery of analgesic ziconotide across a blood brain barrier model using viral nanocontainers
Confeld et al. Targeting the tumor core: hypoxia-responsive nanoparticles for the delivery of chemotherapy to pancreatic tumors
Yu et al. Molecular targeting nanoprobes with non-overlap emission in the second near-infrared window for in vivo two-color colocalization of immune cells
Marangon et al. Intercellular carbon nanotube translocation assessed by flow cytometry imaging
ElSohly et al. Synthetically modified viral capsids as versatile carriers for use in antibody-based cell targeting
Mezzaroba et al. New potential therapeutic approach for the treatment of B-Cell malignancies using chlorambucil/hydroxychloroquine-loaded anti-CD20 nanoparticles
Trusel et al. Internalization of carbon nano-onions by hippocampal cells preserves neuronal circuit function and recognition memory
US20190275175A1 (en) Carbon Nanotubes for Imaging and Drug Delivery

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right