WO2023153832A1 - 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법 Download PDF

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stem cells
ectosome
nanoparticles
derived
biodegradable polymer
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강동우
박준영
정용규
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가천대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a novel ectosome-biodegradable polymer nanoparticle complex and a method for preparing the same, and more particularly, to an ectosome-biodegradable polymer nanoparticle complex with enhanced targeting ability to tumor and inflammatory sites and a method for preparing the same will be.
  • Ectosomes are vesicles of various sizes (0.1-1 ⁇ m in diameter) that sprout directly from the plasma membrane and are secreted into the extracellular space. Unlike living cells, ectosomes have a phospholipid, phosphatidylserine, on their surface. Although ectosomes are produced and secreted by direct budding of the cell membrane, it is known that the cargo components contained inside are not the same as those of the parent cell, and the internal components vary depending on the state of the cell (Cocucci and Meldolesi, Curr. Biol 21(23): R940-R940, 2011).
  • Ectosomes are different from exosomes, which are secreted from endosomes extracellularly through the multivesicular body (MVB) pathway, in the way they are produced and the substances contained inside, but they interact in the extracellular space and interact with target cells. It is known that the manner is similar to that of exosomes. However, whereas exosomes have been focused on functional aspects such as disease treatment and diagnosis, relatively few studies have been conducted on ectosomes.
  • Patent No. 2162727 regarding a cell therapy composition for anticancer cells containing natural killer cells and extracellular vesicles derived from the cells.
  • the present invention is to solve various problems including the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel ectosome-derived drug delivery system having better targeting ability to tumor and inflammatory sites and a manufacturing method thereof.
  • these tasks are illustrative, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • biodegradable polymer nanoparticles coated with a stem cell-derived ectosome membrane are provided.
  • a drug delivery system containing the nanoparticle as an active ingredient is provided.
  • a pharmaceutical composition containing the drug delivery system and an effective drug loaded on the drug delivery system is provided.
  • a pharmaceutical composition for cancer treatment comprising, as an active ingredient, biodegradable polymer nanoparticles coated with the stem cell-derived ectosome membrane and loaded with an anticancer agent.
  • a cancer treatment method comprising administering the pharmaceutical composition to a subject suffering from cancer is provided.
  • a pharmaceutical composition for treating inflammation which includes, as an active ingredient, biodegradable polymer nanoparticles coated with a stem cell-derived ectosome membrane and loaded with an anti-inflammatory agent.
  • a method for treating inflammation comprising administering the pharmaceutical composition to an inflamed subject.
  • preparing the educated stem cells by educating the stem cells with cells derived from the lesion; Separating ectosomes from the educated stem cells; and preparing biodegradable polymer nanoparticles coated with the ectosome membrane by mixing the ectosome or the ectosome membrane produced by degradation of the ectosome with biodegradable polymer nanoparticles.
  • a method for preparing a bit-biodegradable polymer nanoparticle complex is provided.
  • the stem cell-derived ectosome-biodegradable polymer nanoparticle complex of the present invention made as described above has improved targeting to the tumor or inflammatory region, which is a target disease, when loaded with anticancer drugs and anti-inflammatory drugs, very effective anticancer drugs and It can be used as a therapeutic agent for inflammation and the manufacturing method of the complex can be used to prepare a drug delivery system with improved targetability to a lesion.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • Figure 1 is a pancreatic cancer or brain tumor target adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC)-derived ectosomes (nano-endoplasmic reticulum) coated with biodegradable polymer (PLGA) ectosome-biodegradable It is a figure schematically showing the manufacturing process of polymer (PLGA).
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • PLGA biodegradable polymer
  • ectosome coated with ectosomes (nanoendoplasmic reticulum) isolated from tumor-targeted adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) educated with tumor cells prepared according to an embodiment of the present invention - biodegradable polymer It is a photomicrograph showing the result of confirming that the ectosomes are well coated on the PLGA using a transmission electron microscope (TME) after preparing (PLGA).
  • TEM transmission electron microscope
  • Figure 3 shows PLGA, PLGA-DID, AD-MSC-derived ectosomes, AD-MSC-derived ectosomes coated with PLGA-DID, and brain tumor cells (U87MG) educated with AD-MSC-derived ectosomes and brain tumor cells (U87MG)
  • This is a series of graphs showing the results of analyzing the hydrodynamic sizes and electrical potentials of PLGA-DID coated with AD-MSC-derived ectosomes.
  • FIG. 4 is a graph showing the results obtained by analyzing the fluorescence intensity of PLGA-DID using a Victor 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) at an excitation wavelength of 646 nm and an emission wavelength of 661 nm.
  • Figure 5 is PLGA (PLGA-DIO) stained with DiO, a fluorescent substance in the GFP wavelength range, to evaluate the migration ability of ectosome-PLGA to pancreatic cancer cells (PANC-1) and brain tumor cells (U87MG).
  • PANC-1 pancreatic cancer cells
  • U87MG brain tumor cells
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • DID fluorescence A series of fluorescence micrographs visualizing
  • Figure 6a is a pancreatic cancer cell (PANC-1) xenograft tumor in which the polymeric polymer (PLGA) coated with ectosomes (nano endoplasmic reticulum) isolated from tumor-targeting adipose-derived stem cells educated as tumor cells according to an embodiment of the present invention.
  • PANC-1 pancreatic cancer cell
  • PLGA polymeric polymer coated with ectosomes isolated from tumor-targeting adipose-derived stem cells educated as tumor cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6B is a series of photographs showing the distribution of cancer cells (top) and ectosome-PLGA (bottom) in the tumor tissues extracted from the experimental model by in vivo fluorescence imaging.
  • Figure 7 analyzes the hydrodynamic sizes and electrical potentials of PLGA-DOX coated with ectosomes isolated from AD-MSC trained with PLGA, PLGA-DOX, and pancreatic cancer cells (PANC-1). A graph showing the result.
  • Figure 8a is a brain cancer cell (U87MG) xenograft tumor model animal in which a polymeric polymer (PLGA) coated with ectosomes (nanoendoplasmic reticulum) isolated from tumor-targeting adipose-derived stem cells trained as tumor cells according to an embodiment of the present invention
  • PLGA polymeric polymer coated with ectosomes isolated from tumor-targeting adipose-derived stem cells trained as tumor cells according to an embodiment of the present invention
  • 8B is a series of photographs showing the distribution of cancer cells (top) and ectosome-PLGA (bottom) in the tumor tissues extracted from the experimental model by in vivo fluorescence imaging.
  • ectosomes nano-endoplasmic reticulum isolated from tumor-targeting adipose-derived stem cells educated to evaluate the tumor-targeting ability and anticancer effect of the ectosome-PLGA-DOX complex according to an embodiment of the present invention
  • This is a picture showing the result of whole-body fluorescence imaging of the distribution in vivo after injecting the polymer (PLGA) into pancreatic cancer cells (PANC-1) and brain cancer cells (U87MG) xenograft tumor model animals.
  • 10A is a schematic diagram briefly illustrating an experimental method for evaluating the targeting ability of an educated stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complex to arthritic cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10b is a whole body fluorescence imaging picture (left) and inflammatory synovial cells obtained to evaluate the targeting ability of an educated stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention in an animal model of arthritis (FLSs), a confocal microscopy image for evaluating uptake capacity in inflammatory macrophages (J774) (upper right corner) and a graph showing the quantification of fluorescence intensity in the confocal microscopy image (lower right corner).
  • FLSs animal model of arthritis
  • J774 a confocal microscopy image for evaluating uptake capacity in inflammatory macrophages
  • J774 upper right corner
  • a graph showing the quantification of fluorescence intensity in the confocal microscopy image lower right corner
  • ectosome refers to nano-vesicles of a phospholipid membrane structure with a diameter of 100 to 500 nm, which are produced by budding of a plasmamembrane, unlike 'exosomes' among extracellular vesicles. do.
  • biodegradable polymer refers to a polymer or a physiologically harmless polymer that is degraded by an enzyme action in a living body.
  • Biodegradable polymers include natural polymers such as starch, chitin, cellulose, polyalginate, and collagen, as well as PLGA (poly(lactic-co-glycolic) acid), PGA (poly (glycolic acid) ⁇ , and PLA (poly (lactic acid)).
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic) acid
  • PGA poly (glycolic acid) ⁇
  • PLA poly (poly (lactic acid)
  • ⁇ PCL ⁇ poly(caprolactone) ⁇
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • drug delivery carrier used in this document refers to a substance used to deliver a drug well to a required area and maintain it for an appropriate period of time. is called a drug delivery system.
  • biodegradable polymer nanoparticles coated with a stem cell-derived ectosome membrane are provided.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or induced-pluripotent stem cells, and the mesenchymal stem cells may be bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stem cells, or pulp-derived stem cells. They may be stem cells or peripheral blood-derived stem cells.
  • the stem cells may be stem cells educated as cells derived from lesions, and the cells derived from lesions may be cancer cells or inflammatory cells, and the educated stem cells may be in contact with a culture solution culturing the cells derived from lesions. It may be a cultured stem cell.
  • the biodegradable polymer may be a natural biodegradable polymer or an artificial biodegradable polymer, and the natural biodegradable polymer may be starch, chitin, cellulose, polyalginate, or collagen, and the artificial biodegradable polymer may be
  • the polymer may be PLGA (poly(lactic-co-glycolic) acid) ⁇ , PGA (poly(glycolic acid) ⁇ , PLA (poly(lactic acid) ⁇ , PCL (poly(caprolactone) ⁇ , or PHA (polyhydroxyalkanoate).
  • the nanoparticles may have a size of 100 to 350 nm in diameter.
  • a drug delivery system containing the nanoparticle as an active ingredient is provided.
  • a pharmaceutical composition containing the drug delivery system and an effective drug loaded on the drug delivery system is provided.
  • the effective drug may be an anticancer agent or an anti-inflammatory agent.
  • the anticancer agent is exemplarily described as follows:
  • anthracycline anthracycline, doxorubicin, daunorubicin, idarubicin and actinomycin D;
  • the anti-inflammatory agent may be a glucocorticoid or a non-steroidal anti-inflammatory agent.
  • the glucocorticoid is hydrocortisone, hydrocortisone acetate, cortisone, cortisone acetate, tixocortol pivalate, hydrocortisone- 17-valate (hydrocortisone-17-valate), halometasone, alclometasone dipropionate, betamethasone valerate, betamethasone dipropionate, preticabate (prednicarbate), clobetasone-17-butyrate, clobetasol-17-propionate, fluocortolone caproate, fluocortolone pival fluocortolone pivalate, fluprednidene acetate, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, dexamethasone, dexamethasone sodium phosphate, betamethasone, beta metasone Bethamethasone sodium phosphate, fluocortolone, tri
  • the non-steroidal anti-inflammatory agent may be a cyclooxygenase (COX) inhibitor.
  • the cyclooxygenase inhibitor may be a nonselective nonselective COX-1/COX-2 inhibitor, a selective COX-1 inhibitor or a selective COX-2 inhibitor, and the selective COX-2 inhibitor is apricoxib ), celecoxib, rofecoxib, parecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, or firocoxib.
  • a pharmaceutical composition for cancer treatment comprising, as an active ingredient, biodegradable polymer nanoparticles coated with a stem cell-derived ectosome membrane and loaded with an anticancer agent.
  • the stem cells may be education stem cells educated as cancer cells to be treated, and the anticancer agent is as described above.
  • the method in which the anticancer agent is loaded into the biodegradable polymer nanoparticles is that the loading is carried out in such a way that the anticancer drug is bound to the surface or inside of the nanoparticles by a covalent or non-covalent bond or is enclosed inside the core-shell structured nanoparticles.
  • the anticancer agent may be covalently bonded to the terminal or side chain of a biodegradable polymer.
  • it may be loaded by being presented on the surface by covalently or non-covalently binding to the surface of the externally coated ectosome membrane.
  • a cancer treatment method comprising administering the pharmaceutical composition to a subject suffering from cancer is provided.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of inflammation comprising, as an active ingredient, biodegradable polymer nanoparticles coated with a stem cell-derived ectosome membrane and loaded with an anti-inflammatory agent.
  • the stem cells may be educational stem cells educated with inflammatory cells obtained from the inflammatory region to be treated, and the anti-inflammatory agent is as described above.
  • the method in which the anti-inflammatory agent is loaded into the biodegradable polymer nanoparticles is bound by covalent or non-covalent bonds to the surface or inside of the nanoparticles, or is loaded in a manner that is encapsulated inside the core-shell structured nanoparticles.
  • the anticancer agent may be covalently bonded to the terminal or side chain of a biodegradable polymer.
  • it may be loaded by being presented on the surface by covalently or non-covalently binding to the surface of the externally coated ectosome membrane.
  • a method for treating inflammation comprising administering a pharmaceutical composition to an inflamed subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of affected area of the patient, application area, treatment frequency, treatment time, dosage form, patient's condition, type of adjuvant, and the like.
  • the amount used is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g/kg/day to 10 mg/kg/day.
  • the daily dose may be administered once a day, divided into 2 to 3 times a day at appropriate intervals, or may be administered intermittently at intervals of several days.
  • the compound in the pharmaceutical composition of the present invention, can be administered orally or parenterally, and preferably parenteral administration includes intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, and intracerebrospinal fluid injection. , can be administered by intramuscular injection and intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • solid or liquid formulation additives may be used in the preparation of the pharmaceutical composition. Any of organic or inorganic may be sufficient as the additive for formulation.
  • the excipient include lactose, sucrose, white sugar, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbitol, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide.
  • binder examples include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, dextrin and pectin; and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oil.
  • any colorant can be used as long as it is permitted to be added to ordinary pharmaceuticals.
  • These tablets and granules may be appropriately coated with sugar coating, gelatin coating, or other needs.
  • preservatives, antioxidants, etc. can be added as needed.
  • the pharmaceutical composition when it is a drug, it may additionally include at least one selected from among fillers, anti-agglomerating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, and preservatives.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be in a preferred form depending on the method of use, and in particular, a method known in the art is adopted to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. It is better to formulate it.
  • Examples of specific formulations include PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, POWDERS, SYRUPS, LIQUIDS AND SOLUTIONS), aerosols, EXTRACTS, ELIXIRS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, SUSPENSIONS, DECOCTIONS, INFUSIONS, tablets (TABLETS), SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, CAPSULES, TROCHES, TINCTURES, PASTES, It may be any one selected from pills, soft or hard gelatin capsules.
  • compositions commonly used in the pharmaceutical composition of the present invention may further be further included, for example, conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers and flavoring agents, and carriers.
  • the pharmaceutical composition or joint cavity injection may include various carriers suitable for direct injection into the affected area.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, including, but not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil; it is not going to be
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences ( 19th Ed., 1995).
  • preparing the educated stem cells by educating the stem cells with cells derived from the lesion; Separating ectosomes from the educated stem cells; and preparing biodegradable polymer nanoparticles coated with the ectosome membrane by mixing the ectosome or the ectosome membrane produced by degradation of the ectosome with biodegradable polymer nanoparticles.
  • a method for preparing a bit-biodegradable polymer nanoparticle complex is provided.
  • the ectosome membrane may be produced through mechanical extrusion or ultrasonic treatment of the ectosome.
  • the degradation of the ectosome and the coating of the ectosome membrane with the biodegradable polymer nanoparticles may be performed simultaneously or sequentially.
  • ectosomes are first mixed with biodegradable polymer nanoparticles and then ultrasonicated, ectosome membrane disassembly and coating can be achieved simultaneously.
  • the separated ectosomes may be treated with ultrasonic waves to first degrade the membrane, and then the ectosome membrane coating may be performed by mixing the resulting ectosome membrane fragments with biodegradable polymer nanoparticles.
  • the mechanical extrusion can be performed by passing ectosomes through a membrane for extrusion having pores of an appropriate size (20 to 200 nm).
  • a membrane for extrusion having pores of an appropriate size (20 to 200 nm).
  • biodegradable polymer nanoparticles By mixing the ectosome membrane produced by the extrusion process with biodegradable polymer nanoparticles, the ectosome membrane is formed.
  • the coated biodegradable polymer nanoparticles can be prepared, and the biodegradable polymer nanoparticles coated with the ectosome membrane can be prepared by secondary extrusion of a mixture of the ectosome membrane and the biodegradable polymer nanoparticles (van Deun et al . al., Cells , 9(8): 1797, 2020).
  • the stem cells may be embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or induced-pluripotent stem cells, and the mesenchymal stem cells may be bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stem cells, or pulp-derived stem cells. It may be stem cells or peripheral blood-derived stem cells, and the education may be performed by culturing the stem cells by contacting them with a culture medium in which the cells derived from the lesion are being cultured.
  • the biodegradable polymer may be a natural biodegradable polymer or an artificial biodegradable polymer, and the natural biodegradable polymer may be starch, chitin, cellulose, polyalginate, or collagen, and the artificial biodegradable polymer may be
  • the polymer may be PLGA (poly(lactic-co-glycolic) acid) ⁇ , PGA (poly(glycolic acid) ⁇ , PLA (poly(lactic acid) ⁇ , PCL (poly(caprolactone) ⁇ , or PHA (polyhydroxyalkanoate).
  • the nanoparticles may have a size of 100 to 350 nm in diameter, and the nanoparticles may be loaded with an effective drug, and the effective drug may be the anticancer agent or the anti-inflammatory agent.
  • the non-steroidal anti-inflammatory agent may be a cyclooxygenase (COX) inhibitor.
  • the cyclooxygenase inhibitor may be a nonselective nonselective COX-1/COX-2 inhibitor, a selective COX-1 inhibitor or a selective COX-2 inhibitor, and the selective COX-2 inhibitor is apricoxib ), celecoxib, rofecoxib, parecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, or firocoxib.
  • the method in which the effective drug is loaded into the biodegradable polymer nanoparticles is bound by covalent or non-covalent bonds to the surface or inside of the nanoparticles, or to the inside of the nanoparticles having a core-shell structure. It can be loaded in a way that is enclosed.
  • the effective drug may be covalently bonded to the terminal or side chain of the biodegradable polymer.
  • the effective drug may be loaded by covalently or non-covalently bound to the surface of the externally coated ectosome membrane and displayed on the surface.
  • the present inventors have identified through previous studies that stem cells educated in cancer cell or inflammatory cell culture medium have improved targeting ability to tumor tissue or inflammatory tissue. From this, it was hypothesized that the ectosome secreted from the educated stem cells as described above would also have a targeting ability for a lesion such as a tumor tissue or an inflammatory tissue.
  • ectosome-biodegradable nanoparticle complexes coated with ectosome membranes were prepared by isolating ectosomes from educated stem cells and mixing them with PLGA nanoparticles, a biodegradable polymer (see FIG. 1). Whether these nanoparticle complexes were well targeted to tumor and inflammatory tissues was investigated.
  • the ectosome-biodegradable nanoparticle complex isolated from educated stem cells according to an embodiment of the present invention has a significantly higher tumor cell target compared to the non-educated stem cell-derived ectosome-biodegradable polymer nanoparticle complex. It was confirmed that it showed the ability (see Figs. 5, 6 and 8). Furthermore, when an anticancer agent such as doxorubicin is loaded on the ectosome-biodegradable polymer nanoparticle complex and administered to a tumor model mouse, tumor growth compared to the administration of the anticancer agent alone or the biodegradable polymer nanoparticle loaded with the anticancer agent. It was confirmed that it significantly suppressed (see FIG. 9).
  • an anticancer agent such as doxorubicin
  • the present inventors investigated whether the improvement of the tumor cell targeting ability was also shown in other lesions, such as inflammatory tissues. Specifically, the present inventors isolated ectosomes from adipose-derived stem cells educated with fibroblast-like synovial cells (FLSs) isolated from inflammatory tissues and coated them on PLGA nanoparticles as described above to obtain an ectosome-PLGA nanoparticle complex. prepared, and as a result of administering it to a collagen-induced arthritis model animal, it was confirmed that the ectosome-PLGA nanoparticle complex specifically aggregated in inflamed tissue (see FIG. 10B).
  • FLSs fibroblast-like synovial cells
  • Example 1 Isolation of ectosomes (nano endoplasmic reticulum) from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) whose targeting ability was enhanced by training as cancer cells
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • ectosomes (nano endoplasmic reticulum) to be used in the production of high-molecular polymer (PLGA) coated with adipose-derived mesenchymal stem cell (ADMSC)-derived ectosomes (nano endoplasmic reticulum) whose targeting ability is enhanced by training with a cancer cell medium was separated.
  • PLGA high-molecular polymer
  • ADMSC adipose-derived mesenchymal stem cell
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • PANC-1 pancreatic cancer cells
  • U87MG brain tumor cells
  • cytochalasin B 5 ⁇ l of 10 ⁇ g/ ⁇ l of cytochalasin B was added to the plate in which the adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) educated with the cancer cell culture medium were cultured. After the cells were detached, they were vortexed for 3 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was removed by centrifugation at 4,000 rpm for 15 minutes to obtain an ectosome pellet, which was added to 10 ⁇ l of DW. After resuspension, it was quantified using nanodrop.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells educated with the cancer cell culture medium were cultured. After the cells were detached, they were vortexed for 3 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was
  • Polylactate-co-glycolate is a representative biodegradable high molecular weight polymer.
  • the PLGA copolymer [CAS#: 26780-50-7], 50:50 Carboxylated End Group (nominal), Lactel, Part #B6013-2P) was added as a solvent.
  • 1 ml of a PLGA solution prepared by dissolving 5 mg/ml in phosphorus acetone was added dropwise to 3 ml of 1% PVA. The solvent, acetone, was removed while concentrating for 10 minutes in a vacuum using a rotary evaporator.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 4° C. and 17,000 xg for 10 minutes using a centrifuge to remove residual PLGA that did not form nanoparticles. Then, the amount of PLGA nanoparticles produced was quantified using a spectrophotometer (UV-VIS).
  • Example 2 The ectosomes extracted in Example 1 and the PLGA nanoparticles prepared in Example 2-1 were mixed at a ratio of 1:10 (mass ratio), and sonication was performed in a bath sonicator for 5 minutes. Using a transmission electron microscope (TEM), it was confirmed that the ectosomes were properly attached to the PLGA (FIG. 2).
  • TEM transmission electron microscope
  • the generated PLGA nanoparticles were quantified using a spectrophotometer (UV-VIS).
  • UV-VIS spectrophotometer
  • the prepared ectosomes were mixed with DID or DIO prepared above at a ratio of 1:10 (mass ratio), and sonication was performed for 5 minutes in a bath sonicator, then a Victor 1420 at 646 nm excitation wavelength and 661 nm emission wavelength.
  • the presence or absence of fluorescence was confirmed using a Multilabel Counter (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) As a result, as shown in Fig. 4, it was found that PLGA encapsulated with DID or DIO was properly attached with fluorescence. .
  • the size distribution and potential of ectosome-PLGA were analyzed using a nanoparticle size analyzer (Anton Paar LiteSizer 500).
  • a nanoparticle size analyzer Anton Paar LiteSizer 500.
  • the ectosome-PLGA nanoparticle complex according to one embodiment of the present invention exhibited a particle size and potential similar to those of simple PLGA nanoparticles.
  • both PLGA nanoparticles and ectosome-coated PLGA nanoparticles are very similar to the particle size of the ectosome itself.
  • the present inventors investigated the uptake ability of the ectosome-PLGA nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention into tumor cells. Specifically, the inventors seeded brain tumor cell U87MG and pancreatic cancer cell PANC-1 on poly-d-lysine-coated cover slips (5 ⁇ 10 4 cells) and cultured them overnight. Then, PLGA nanoparticles (PLGA) labeled with DIO, a fluorescent substance in the GFP wavelength band, ectosome-PLGA nanoparticle complexes (ADMSC-PLGA) isolated from non-educated adipose-derived stem cells labeled with DIO and labeled with DIO.
  • PLGA nanoparticles PLGA
  • ADMSC-PLGA ectosome-PLGA nanoparticle complexes isolated from non-educated adipose-derived stem cells labeled with DIO and labeled with DIO.
  • 0.5 ⁇ g/mL of the ectosome-PLGA nanoparticle complex isolated from educated adipose-derived stem cells according to an embodiment of the present invention was added to the cells in culture, and cultured at 37° C. for 6 hours. After 6 hours, all samples were fixed overnight with 4% paraformaldehyde in medium at 4°C, and DIO fluorescence in the tumor cells was photographed using an LSM700 confocal microscope (Carl Zeiss). As a result, as confirmed in FIG. 5, fluorescence was not detected inside the tumor cells treated with simple PLGA nanoparticles, and fluorescence was observed inside tumor cells treated with non-educated stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complexes. However, in one embodiment of the present invention, the fluorescence intensity was lower than that of the other educated stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complex treatment.
  • the targeting ability of ectosome-PLGA was analyzed in an in vivo animal model.
  • pancreatic cancer model was prepared by injecting pancreatic cancer cells (PANC-1-luciferase-GFP) genetically engineered to express fluorescent protein and bioluminescent enzyme ( PANC-1-luciferase-GFP) into BALB/c nude mice through the tail vein.
  • PANC-1-luciferase-GFP pancreatic cancer cells
  • PANC-1-luciferase-GFP bioluminescent enzyme
  • pancreatic cancer After confirming the size of pancreatic cancer using an IVIS imaging system for 4 weeks, and confirming that pancreatic cancer was formed, ectosome-PLGA (1x10 6 cells isolated from AD-MSC educated using pancreatic cancer cells) , 5 mg/kg), free AD-MSC (1x10 6 cells), trained AD-MSC (1x10 6 cells), and PLGA (5 mg/kg) each once a day for a total of 3 days in the tail of the mouse of the pancreatic cancer model. It was injected intravenously through a vein.
  • the targeting ability to tumor tissue was improved in the case of ectosome-PLGA trained by treating the cancer cell culture medium, which is, according to an embodiment of the present invention.
  • the derived stem cells can be used very efficiently for cancer cell-specific drug delivery, especially for pancreatic cancer, a typical intractable malignant tumor.
  • PLGA copolymer [CAS#: 26780-50-7], 50:50 Carboxylated End Group (nominal), Lactel, Part #B6013- 2P) was added dropwise to 3 ml of a 1% PVA solution mixed with 600 ⁇ l of 1 mg/ml doxorubicin. Then, while concentrating for 10 minutes in a vacuum using a rotary evaporator, the solvent, acetone, was removed. Subsequently, the supernatant was removed by centrifugation at 4° C.
  • the amount of PLGA nanoparticles produced was quantified using a spectrophotometer (UV-VIS), while the particle size and potential of the resulting composites were analyzed in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the doxorubicin-loaded educated stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complex also showed a particle size distribution and potential similar to those of the PLGA nanoparticles or the doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles.
  • the targeting ability of ectosome-PLGA was analyzed in an in vivo animal model.
  • brain tumor cells U87MG-luciferase-GFP
  • fluorescent protein and bioluminescent enzyme luciferase
  • ectosome-PLGA (1x10 6 cells, 5 mg/kg) extracted from the educated AD-MSC, free AD- MSC (1x10 6 cells), trained AD-MSC (1x10 6 cells), and PLGA (5 mg/kg) were intravenously injected once a day for a total of 3 days through the tail vein of the brain tumor model mice.
  • the targeting ability to brain tumor tissue was improved in the case of the ectosome-PLGA trained by treating the cancer cell culture medium, and the results of this experiment showed that stem cell-derived, not stem cells
  • the ectosome-polymer nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention passes through the blood-brain barrier to a brain tumor
  • the antitumor efficacy of ectosome-PLGA nanoparticles was analyzed in an in vivo animal model.
  • the cancer cell killing effect of ectosome-PLGA was confirmed by in vivo fluorescence imaging using the IVIS animal fluorescence imaging system in a mouse model of fluorescent/emitting PANC-1-luciferase-GFP tumor.
  • pancreatic cancer cells PANC-1 emitting luciferase-GFP fluorescence were injected into nude mice, and 4 weeks later, ectosomes extracted from AD-MSC trained - PLGA (5 mg/kg), PLGA-DOX (5 mg/kg) ) were intravenously injected twice a week for a total of 6 times for 3 weeks, and luciferin 150 mg/kg IV was injected 1 hour before measurement to activate luciferase. The changes in were analyzed.
  • Example 5 Isolation of ectosomes (nano endoplasmic reticulum) from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) whose targeting ability was enhanced by educating inflammatory cells
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • ecto to be used in the production of high-molecular polymer (PLGA) coated with adipose-derived mesenchymal stem cell (ADMSC)-derived ectosomes (nano-endoplasmic reticulum) having enhanced targeting ability to inflammatory sites by training with an inflammatory cell medium
  • ADMSC adipose-derived mesenchymal stem cell
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • FLS inflammatory synovial cells
  • J774 inflammatory macrophages
  • cytochalasin B 5 ⁇ l of 10 ⁇ g/ ⁇ l of cytochalasin B was added to the plate in which the adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) educated with the inflammatory cell culture medium were cultured. After the cells were detached, they were vortexed for 3 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was removed by centrifugation at 4,000 rpm for 15 minutes to obtain an ectosome pellet, which was added to 10 ⁇ l of DW. After resuspension, it was quantified using nanodrop.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells educated with the inflammatory cell culture medium were cultured. After the cells were detached, they were vortexed for 3 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes using a centrifuge, and the superna
  • Example 5 Coating of PLGA nanoparticles and DIO or DID-labeled PLGA nanoparticles on ectosomes isolated from inflammatory cell-educated adipose-derived stem cells isolated in Example 5 was performed in the same manner as described in Example 2.
  • the present inventors investigated the uptake ability of the ectosome-PLGA nanoparticle complex according to an embodiment of the present invention into inflammatory cells. Specifically, the inventors seeded fibroblast-like synoviocytes (FLSs) and 774 cells on poly-d-lysine-coated cover slips (5 x 10 4 cells) and cultured them overnight. Then, PLGA nanoparticles (PLGA) encapsulated with DIO, a fluorescent substance in the GFP wavelength band, and 0.5 ⁇ g of ectosome-PLGA nanoparticle complex isolated from educated adipose-derived stem cells according to an embodiment of the present invention encapsulated with DIO /mL was added to the cells and incubated for 6 hours at 37°C.
  • FLSs fibroblast-like synoviocytes
  • DIO a fluorescent substance in the GFP wavelength band
  • DBA/1 mice male, 4-6 weeks old, weight 20-25 g
  • CIA-induced mice were established through intradermal injection of complete Freund's adjuvant (CFA) to evaluate the arthritic targeting ability of ectosome-PLGA in DBA/1 mice in which an arthritis model was formed (FIG. 10a )
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the targeting ability of ectosome-PLGA to arthritic cells was analyzed using an IVIS imaging system and histological images.
  • Ectosome-PLGA-DID (1x10 6 cells, 5 mg/kg) and PLGA-DID (5 mg/kg) extracted from the trained AD-MSC were injected once a day for a total of 3 days through the tail vein of arthritis model mice. intravenous injection. On day 4, whole-body bioimaging was performed on the experimental animals to analyze the targeting ability of ectosome-PLGA to arthritic cells. As a result, as confirmed in FIG. 10B , it was confirmed that the stem cell-derived ectosome-PLGA nanoparticle complex educated with inflammatory cells according to an embodiment of the present invention was selectively accumulated in inflammatory tissue.
  • the biodegradable nanoparticle complex coated with stem cell-derived ectosome membrane educated with cells derived from lesions such as tumors or inflammations has a specific targeting ability derived from cells used for education. I was able to confirm the possession.
  • path-specific education is ectosomes derived from the stem cells when stem cells are educated using cells highly related to pathological symptoms present in the lesions where degenerative neurological diseases or various metabolic diseases occur in addition to tumor or inflammation. It can be used for the preparation of a drug delivery system specific to the corresponding lesion.

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Abstract

본 발명은 신규 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 된 생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 병소에 대한 표적능이 강화된 상기 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체의 제조방법를 제공한다.

Description

병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법
본 발명은 신규 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양 및 염증 부위에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
엑토좀(ectosome)은 원형질막에서 직접 출아하는 다양한 크기(직경 0.1~1 μm)의 소포로서, 세포외 공간으로 분비된다. 살아있는 세포와 달리 엑토솜은 표면에 인지질인 포스파티딜세린을 가지고 있다. 엑토좀은 세포막이 직접 출아함으로써 생성·분비됨에도 불구하고 내부에 포함되는 화물(cargo) 성분이 모세포와 동일하지 않고 세포의 상태에 따라 내부 성분이 상이해진다고 알려져 있다(Cocucci and Meldolesi, Curr. Biol. 21(23): R940-R940, 2011). 엑토좀은 엔도좀에서 다포성체(MVB) 경로를 통해 세포 외로 분비되는 엑소좀과는 생성 방식과 내부에 포함된 물질 등에 있어서 차이가 있으나, 세포외 공간에서의 상호작용 그리고 표적 세포와의 상호작용 방식은 엑소좀과 유사한 것으로 알려져 있다. 그러나, 엑소좀이 질병 치료 및 진단 등의 기능적 측면에서 집중을 받은데 반하여 엑토좀은 상대적으로 많은 연구가 진행되지 않았다.
관련 선행기술로는 자연 살해 세포(Natural Killer Cell) 및 상기 세포 유래의 세포외 소포체(Extracellular Vesicle)를 포함하는 항암용 세포치료제 조성물에 관한 특허 제2162727호가 존재한다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 상기 세포외 소포체가 엑토좀인지 아니면 엑소좀인지 여부가 불분명하고 단독으로는 항암 치료효과가 거의 없다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 우수한 종양 및 염증 부위에 대한 표적능을 가진 새로운 엑토좀 유래 약물전달체 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 된 생분해성 고분자 나노입자가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물 전달체 및 상기 약물전달체에 적재된 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항암제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항염증제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 염증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 염증이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 병소 유래 세포로 줄기세포를 교육함으로써 교육된 줄기세포를 제조하는 단계; 상기 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및 상기 엑토좀 또는 상기 엑토좀의 분해에 의해 생성된 엑토좀 막을 생분해성 고분자 나노입자와 혼합하여 엑토좀 막이 코팅된 생분해성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 줄기세포 유래 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체는 표적 질환인 종양 또는 염증 부위에 대한 향상된 표적성을 가지고 있기 때문에, 항암제 및 항염증제를 적재시킬 경우 매우 효율적인 항암 치료제 및 염증 치료제로 사용될 수 있고 상기 복합체의 제조방법은 병소에 대한 향상된 표적성을 가지는 약물 전달체의 제조에 활용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 췌장암 혹은 뇌종양 표적 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) 유래 엑토좀(나노소포체)이 코팅된 생분해성 고분자(PLGA)인 엑토좀-생분해성 고분자(PLGA)의 제조과정을 개략적으로 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 종양세포로 교육된 종양 표적화 지방-유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)로부터 분리된 엑토좀(나노소포체)이 코팅된 엑토좀-생분해성 고분자(PLGA)를 제조 후 투과 전자현미경(TME)을 이용하여 엑토좀이 PLGA에 잘 코팅되어 있음을 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3은 PLGA, PLGA-DID, AD-MSC 유래 엑토좀, AD-MSC 유래 엑토좀 코팅된 PLGA-DID, 뇌종양 세포(U87MG)로 교육된 AD-MSC 유래 엑토좀, 뇌종양 세포(U87MG)로 교육된 AD-MSC 유래 엑토좀 코팅된 PLGA-DID의 유체 역학적 크기(hydrodynamic sizes) 및 전위(electrical potentials)를 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 4는 PLGA-DID의 형광 세기(fluorescence intensity)를 646 nm 여기 파장 및 661 nm 방출 파장에서 Victor 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 엑토좀-PLGA의 췌장암세포(PANC-1), 뇌종양 세포(U87MG)로의 이동능을 평가하기 위해 GFP 파장대의 형광물질인 DiO로 염색된 PLGA(PLGA-DIO), GFP 파장대의 형광물질인 DiO로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)로부터 분리된 엑토좀으로 코팅된 PLGA, DID 형광물질로 염색된 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토좀으로 코팅된 PLGA의 흡수(uptake)를 시각화한 일련의 형광현미경 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 종양세포로 교육된 종양 표적화 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀(나노소포체)이 코팅된 고분자 고분자(PLGA)를 췌장암 세포(PANC-1) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이고,
도 6b는 상기 실험모델에서 적출된 종양조직에서의 암세포(상단) 및 엑토좀-PLGA(하단)의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 7은 PLGA, PLGA-DOX, 췌장암 세포(PANC-1)으로 교육된 AD-MSC로부터 분리된 엑토좀이 코팅된 PLGA-DOX를 유체 역학적 크기(hydrodynamic sizes) 및 전위(electrical potentials)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 종양세포로 교육된 종양 표적화 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀(나노소포체)이 코팅된 고분자 고분자(PLGA)를 뇌암 세포(U87MG) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이고,
도 8b는 상기 실험모델에서 적출된 종양조직에서의 암세포(상단) 및 엑토좀-PLGA(하단)의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 엑토좀-PLGA-DOX 복합체의 종양 표적화 능력 및 항암효과를 평가하기 위해 교육된 종양 표적화 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀(나노소포체)이 코팅된 고분자 고분자(PLGA)를 췌장암 세포(PANC-1), 뇌암 세포(U87MG) 이종이식 종양 모델 동물에 주입한 뒤 생체내 분포를 전신 생체 형광 이미징으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체의 관절염증 세포로의 표적화 능력을 평가하기 위한 실험 방법을 간략하게 나타낸 개요도이다.
도 10b는 관절염증 동물 모델에서의 본 발명의 일 실시예에 따른 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체의 표적화 능력을 평가하기 위해 수득한 전신 생체 형광 이미징 사진(좌측) 및 염증성 활막세포(FLSs), 염증성 대식세포(J774)에서의 흡수 능력을 평가하기 위한 공초점 현미경 이미지(우상귀) 및 상기 공초점 현미경 이미지에서 형광 강도를 정량화하여 나타낸 그래프(우하귀)이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "엑토좀(ectosome)"은 세포외 소포 중 '엑소좀'과 달리 세포막(plasmamembrane)의 출아에 의해 생성되는 100 내지 500 nm의 직경을 갖는 인지질막 구조의 나노 소포체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "생분해성 고분자(biodebgradable polymer)"는 중합체이나 생체 내의 효소 작용에 의해 분해가 되는 생리학적으로 무해한 중합체를 의미한다. 생분해성 고분자에는 전분, 키틴, 셀룰로오스, 폴리알기네이트, 콜라겐 등의 천연 고분자와 PLGA{poly(lactic-co-glycolic) acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, PHA(polyhydroxyalkanoate) 등의 인공 고분자가 존재한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약물 전달체(drug delivery carrier)"는 약물을 필요한 병소에 잘 전달하고 적정 시간 동안 유지되도록 하는데 사용되는 물질을 의미하며, 약물 전달체를 이용하여 약물을 병소에 효과적으로 전달하는 방법을 약물 전달 시스템(drug delivery system)이라고 한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 된 생분해성 고분자 나노입자가 제공된다.
상기 나노입자에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포일 수 있고 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포일 수 있다.
상기 나노입자에 있어서, 상기 줄기세포는 병소 유래 세포로 교육된 줄기세포일 수 있고 상기 병소 유래 세포는 암 세포 또는 염증세포일 수 있으며 상기 교육된 줄기세포는 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액과 접촉하여 배양된 줄기세포일 수 있다.
상기 나노입자에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 인공 생분해성 고분자일 수 있고, 상기 천연 생분해성 고분자는 전분, 키틴, 셀룰로오스, 폴리알기네이트, 또는 콜라겐일 수 있으며, 상기 인공 생분해성 고분자는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic) acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, 또는 PHA(polyhydroxyalkanoate)일 수 있다.
상기 나노입자는, 직경 100 내지 350 nm의 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물 전달체 및 상기 약물전달체에 적재된 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유효약물은 항암제 또는 항염증제일 수 있다.
상기 항암제를 예시적으로 설명하면 하기와 같다:
(ⅰ) 아스파라기나제(asparaginase);
(ⅱ) 메토트렉세이트(methotrexate);
(ⅲ) 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs)
예: 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine) 및 아라비노실시토신(arabinosylcytosine);
(ⅳ) 히드록시우레아(hydroxy urea);
(ⅴ) 퓨린 유사체(purine analogs)
머캅토퓨린(mercaptopurine) 및 티오구아닌(thioguanine);
(ⅵ) 알킬화제(alkylating agents)
니트로겐 머스타드(nitrogen mustad) 및 사이클로스포라미드(cyclosporamide);
(ⅶ) 안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclines)
안트라사이클린(anthracycline), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 악티노마이신 D(actinomycin D);
(ⅷ) 유사분열 억제제(mitotic inhibitors)
빈크리스틴(vincristine) 및 탁솔(taxol);
(ⅸ) 항혈관생성제
VEGF에 특이적인 항체, 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4), 푸마길린(Fumagillin), 허비마이신 A(herbimycin A), 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol), OGT 2115, TNP 470, 트라닐라스트(tranilast), XRP44X, 탈리도마이드(thalidomide), 엔도스타틴(endostatin), 살모신(salmosin), 안지오스타틴(angiostatin) 또는 플라스미노겐(plasminogen) 또는 아포리포단백질(apolipoprotein)의 크링글 도메인(kringle domain);
(ⅹ) 삽입성 물질(intercalating agents)
카르보틀라틴(carboplatin) 및 시스플라틴(cisplatin); 및
(ⅹi) 방사성 핵종(radionuclides)
18F, 90Y, 188Re, 32P, 89Sr, 165Dy, 186Re, 198Au, 153Sm, 131I, 169Er, 125I, 99Tc 및 166Ho, 등.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항염증제는 당질 코르티코이드 또는 비-스테로이드성 항염증제일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 당질 코르티코이드는 하이드로코르티손(hydrocortisone), 하이드로코르티손 아세테이트(hydrocortisone acetate), 코르티손(cortisone), 코르티손 아세테이트(cortisone acetate), 틱소코르톨 피발레이트(tixocortol pivalate), 하이드로코르티손-17-발레이트(hydrocortisone-17-valate), 할로메타손(halometasone), 알클로메타손(alclometasone dipropionate), 베타메타손 발레이트(betamethasone valerate), 베타메타손 디프로피오네이트(betamethasone dipropionate), 프레트니카베이트(prednicarbate), 클로베타손-17-부티레이트(clobetasone-17-butyrate), 클로베타솔-17-프로피오네이트(clobetasol-17-propionate), 플루오코르톨론 카프로에이트(fluocortolone caproate), 플루오코르톨론 피발레이트(fluocortolone pivalate), 플루프레드니덴 아세테이트(fluprednidene acetate), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 덱사메타손(dexamethasone), 덱사메타손 소디움 포스페이트(dexamethasone sodiumphosphate), 베타메타손(betamethasone), 베타메타손 소디움 포스페이트(bethamethasone sodium phosphate), 플루오코르톨론(fluocortolone), 트리암시아놀론(triamcinolone), 트리암시아놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 모메타손(mometasone), 암시노나이드(amcinonide), 데소나이드(desonide), 플루오시노나이드(fluocinonide), 플루오시놀론 아세토나이드(fluocinolone acetonide), 할시노나이드(hacinonide), 베클로메타손(beclomethasone), 플루드로코르티손 아세테이트(fludrocortisone acetate), 하이드로코르티손 부티레이트(hydrocortisone-17-butyrate), 하이드로코르티손-17-아세포테니트(dkhydrocortisone-17-aceponate), 하이드로코르티손-17-부테프레이트(hydrocortisone-17-buteprate), 시클레소나이드(ciclesonide) 또는 프레드니카베이트(prednicarbate)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 비-스테로이드성 소염제는 사이클로옥시게네이즈(cyclooxygenase, COX) 저해제일 수 있다. 아울러, 상기 사이클로옥시게네이즈 저해제는 비선택성 비선택성 COX-1/COX-2 저해제, 선택적 COX-1 저해제 또는 선택적COX-2 저해제일 수 있고, 상기 선택적 COX-2 저해제는 아프리콕시브(apricoxib), 셀레콕시브(celecoxib), 로페콕시브(rofecoxib), 파레콕시브(parecoxib), 루미라콕시브(lumiracoxib), 에토리콕시브(etoricoxib), 또는 피로콕시브(firocoxib)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항암제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 치료대상 암세포로 교육된 교육 줄기세포일 수 있고 항암제는 상술한 바와 같다.
아울러 상기 항암제가 상기 생분해성 고분자 나노입자에 적재되는 방식은 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 될 수 있고 공유결합에 의해 적재되는 경우 생분해성 고분자의 말단 또는 측쇄에 상기 항암제가 공유결합된 것일 수 있다. 선택적으로는 외부에 코팅된 엑토좀 막 표면에 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 결합하여 표면에 제시되는 방식으로도 적재가 될 수도 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항염증제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 치료대상 염증부위에서 수득된 염증세로로 교육된 교육 줄기세포일 수 있고 상기 항염증제는 상술한 바와 같다.
아울러 상기 항염증제가 상기 생분해성 고분자 나노입자에 적재되는 방식은 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 될 수 있고 공유결합에 의해 적재되는 경우 생분해성 고분자의 말단 또는 측쇄에 상기 항암제가 공유결합된 것일 수 있다. 선택적으로는 외부에 코팅된 엑토좀 막 표면에 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 결합하여 표면에 제시되는 방식으로도 적재가 될 수도 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약학적 조성물을 염증이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 치료방법이 제공된다.
본 발명의 약학적 조성물은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수있다. 또한 약학적 조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가로 더 포함할 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 또는 관절강 주사제는 환부에 직접 주입에 적합한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th Ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 병소 유래 세포로 줄기세포를 교육함으로써 교육된 줄기세포를 제조하는 단계; 상기 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및 상기 엑토좀 또는 상기 엑토좀의 분해에 의해 생성된 엑토좀 막을 생분해성 고분자 나노입자와 혼합하여 엑토좀 막이 코팅된 생분해성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체의 제조방법이 제공된다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 엑토좀 막은 상기 엑토좀에 대한 기계적 압출 또는 초음파 처리를 통해 생성될 수 있다.
아울러, 엑토좀의 분해 및 생분해성 고분자 나노입자의 엑토좀 막 코팅은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 동시에 수행되는 경우 엑토좀을 생분해성 고분자 나노입자와 먼저 혼합한 후 초음파 처리를 할 경우 엑토좀 막 분해와 코팅이 동시에 달성이 된다. 반대로 분리된 엑토좀을 초음파 처리하여 막 분해를 먼저 수행한 후, 생성된 엑토좀 막 단편을 생분해성 고분자 나노입자와 혼합함으로써 엑토좀 막 코팅을 수행할 수 있다. 엑토좀과 같은 세포외 소포(EV)로 나노입자를 코팅하는 방법에 대하여는 선행문헌에 잘 기재되어 있다(Fathi et al., VIEW, 2(2): 20200187, 2020; van Deun et al., Cells, 9(8): 1797, 2020).
상기 기계적 압출은 적절한 크기(20 내지 200 nm)의 구멍이 형성된 압출용 멤브레인에 엑토좀을 통과시킴으로써 수행될 수 있는데 이렇게 압출 공정에 의해 생성된 엑토좀 막을 생분해성 고분자 나노입자와 혼합함으로써 엑토좀 막이 코팅된 생분해성 고분자 나노입자를 제조할 수 있고, 상기 엑토좀 막 및 생분해성 고분자 나노입자의 혼합물을 2차 압출함으로써 엑토좀 막이 코팅된 생분해성 고분자 나노입자를 제조할 수 도 있다(van Deun et al., Cells, 9(8): 1797, 2020).
상기 제조방법에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포일 수 있고 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포일 수 있으며 상기 교육은 상기 줄기세포를 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액에 접촉시켜 배양함으로써 수행될 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 인공 생분해성 고분자일 수 있고, 상기 천연 생분해성 고분자는 전분, 키틴, 셀룰로오스, 폴리알기네이트, 또는 콜라겐일 수 있으며, 상기 인공 생분해성 고분자는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic) acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, 또는 PHA(polyhydroxyalkanoate)일 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 나노입자는 직경 100 내지 350 nm의 크기를 가질 수 있고 상기 나노입자는 유효 약물을 적재한 것일 수 있으며 상기 유효 약물은 상기 항암제 또는 상기 항염증제일 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 비-스테로이드성 소염제는 사이클로옥시게네이즈(cyclooxygenase, COX) 저해제일 수 있다. 아울러, 상기 사이클로옥시게네이즈 저해제는 비선택성 비선택성 COX-1/COX-2 저해제, 선택적 COX-1 저해제 또는 선택적COX-2 저해제일 수 있고, 상기 선택적 COX-2 저해제는 아프리콕시브(apricoxib), 셀레콕시브(celecoxib), 로페콕시브(rofecoxib), 파레콕시브(parecoxib), 루미라콕시브(lumiracoxib), 에토리콕시브(etoricoxib), 또는 피로콕시브(firocoxib)일 수 있다.
아울러 상기 제조방법에 있어서, 상기 유효 약물이 상기 생분해성 고분자 나노입자에 적재되는 방식은 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 될 수 있다. 공유결합에 의해 적재되는 경우 생분해성 고분자의 말단 또는 측쇄에 상기 유효 약물이 공유결합된 것일 수 있다. 선택적으로는 상기 유효 약물이 외부에 코팅된 엑토좀 막 표면에 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 결합하여 표면에 제시되는 방식으로도 적재가 될 수도 있다.
본 발명자들은 종래 연구를 통해서 암세포나 염증세포 배양액으로 교육시킨 줄기세포가 종양조직 또는 염증조직에 대한 표적능이 향상됨을 규명한 바 있다. 이로부터 상기와 같이 교육받은 줄기세포로부터 분비되는 엑토좀 역시 종양조직이나 염증조직과 같은 병소에 대하여 표적능이 있을 것이라는 가설을 세웠다. 상기 가설을 입증하기 위해 교육받은 줄기세포로 부터 엑토좀을 분리한 후 생분해성 고분자인 PLGA 나노입자와 혼합함으로써 엑토좀 막이 코팅된 엑토좀-생분해성 나노입자 복합체를 제조하였으며(도 1 참조), 이러한 나노입자 복합체가 종양조직 및 염증조직에 잘 표적화되는지 여부를 조사하였다. 그 결과 본 발명의 일 실시예에 따른 교육받은 줄기세포로부터 분리된 엑토좀-생분해성 나노입자 복합체는 비교육된 줄기세포 유래 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체와 비교하여 현저하게 높은 종양세포 표적능을 나타냄을 확인하였다(도 5, 6 및 8 참조). 더 나아가, 상기 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체에 독소루비신과 같은 항암제를 적재하여 종양 모델 마우스에 투여할 경우, 항암제 단독 투여나, 항암제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자 투여시와 비교하여 종양 성장을 유의미하게 억제함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
더 나아가, 본 발명자들은 상기 종양세포 표적능 향상이 다른 병소 예컨대, 염증조직에 대하여도 동일하게 나타나는지 여부를 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 염증조직에서 분리된 섬유아세포-유사 활막세포(FLSs)로 교육시킨 지방유래 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하여 상기와 같이 PLGA 나노입자에 코팅함으로써 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체를 제조하였으며, 이를 콜라겐 유도 관절염 모델 동물에 투여한 결과, 당해 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체가 염증조직 특이적으로 결집함을 확인하였다(도 10b 참조).
이러한 결과들은 본 발명의 일 실시예에 따른 교육받은 줄기세포 유래 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체가 교육에 이용된 병소 유래 세포와 동일한 종류의 병소에 대한 표적능을 증가시킴으로써 해당 병소에 대한 유효약물의 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 암세포로 교육시켜 표적능을 강화시킨 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)로부터 엑토좀(나노소포체) 분리
본 발명의 일 실시예에 따라 암세포 배지로 교육시켜 표적능력을 강화한 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC) 유래 엑토좀(나노소포체)로 코팅시킨 고분자 중합체(PLGA) 제조에 사용될 엑토좀(나노소포체)을 분리하였다.
1-1: 줄기세포에 대한 교육 방법
본 발명자들은 암세포로의 표적능력을 강화시키기 위해 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 췌장암 세포(PANC-1)와 뇌종양 세포(U87MG)를 100π 배양 플레이트에 웰당 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 췌장암 세포 또는 뇌종양 세포가 배양중인 플레이트에서 배양액(배지)을 모아 5 ml 씩 배양 중인 줄기세포에 분주하여 24시간 동안 추가 배양하였다(education).
1-2: 교육된 줄기세포로부터 엑토좀의 분리
암세포 배양액으로 교육된 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)가 배양된 플레이트에 cytochalasin B 10 μg/μl를 5 μl 첨가하였다. 세포를 떼어준 후, 3분 동안 볼텍싱하였다. 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 10분 원심분리를 수행하여 상등액을 모으고, 4,000 rpm에서 15분동안 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하여 엑토좀 펠렛(pellet)을 수득하였으며, 이를 DW 10 μl에 재현탁한 후, nanodrop을 사용하여 정량하였다.
실시예 2: 엑토좀-PLGA 코팅
2-1: PLGA 나노입자의 제조
폴리락테이트-co-글라이콜레이트(PLGA)는 대표적인 생분해성 고분자 중합체이다. PLGA 합성을 진행하기 위해 tip sonicator 30 hz를 가동시킨 후, PLGA 공중합체([CAS#: 26780-50-7], 50:50 Carboxylated End Group (nominal), Lactel, Part #B6013-2P)를 용매인 아세톤에 5 mg/ml로 녹여 준비한 PLGA 용액 1 ml를 1% PVA 3 ml에 적가하였다. 회전 농축기를 이용하여 진공상태에서 10분 동안 농축하면서 용매인 아세톤을 제거하였다. 이어, 원심분리기를 이용하여 4℃, 17,000 xg에서 10분동안 원심분리를 수행하여 상층액을 제거함으로써 나노입자를 형성하지 못한 잔여 PLGA를 제거하였다. 그런 다음, 분광 광도계(UV-VIS)를 사용하여 생성된 PLGA 나노입자의 양을 정량하였다.
2-2: 엑토좀 코팅 PLGA 나노입자 제조
상기 실시예 1에서 추출된 엑토좀과 상기 실시예 2-1에서 제조된 PLGA 나노입자를 1:10(질량비)로 섞어주고 bath sonicatior에서 sonication을 5분 동안 진행하였다. 투과 전자현미경(TEM)을 사용하여 PLGA에 엑토좀이 제대로 부착되어 있음을 확인하였다(도 2).
실시예 3: DID,DIO로 표지된 엑토좀-PLGA의 준비
본 발명자들은 엑토좀-PLGA 복합체에 형광 다이인 DiD 또는 DIO가 봉입된 복합체의 제조를 위해, tip sonicator 30 hz를 가동시킨 후, 1% PVA 3 ml에 DID((1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt, D7757, Thermo Fisher Scientific, USA), 또는 DIO(3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate, D275, Thermo Fisher Scientific, USA)를 혼합한 후, 아세톤에 용해된 5 mg/ml의 PLGA 1 ml을 적가하였다. 이후, 회전 농축기를 이용하여 진공상태에서 10분 동안 용매인 아세톤을 제거하였다. 이어, 원심분리기를 이용하여 4℃, 17,000 xg에서 10분동안 원심분리를 수행하여 상층액을 제거함으로써 나노입자화되지 못한 잔여 PLGA를 제거한 후, 분광 분석계(UV-VIS)를 사용하여 생성된 PLGA 나노입자를 정량하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 분리된 엑토좀과 상기에서 제조된 DID 또는 DIO가 봉입된 1:10(질량비)로 혼합하고, bath sonicatior에서 sonication을 5분 동안 진행하였다. 그런 다음, 646 nm 여기 파장 및 661 nm 방출 파장에서 Victor 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 형광 부착 여부를 확인하였다. 그 결과 도 4에서 확인되는 바와 같이, DID, 또는 DIO가 봉입된 PLGA는 형광이 제대로 부착되어 있음을 알 수 있었다.
실험예 1: 물리 화학적 특성
엑토좀-PLGA의 크기 분포 및 전위는 나노입도 분석기(Anton Paar LiteSizer 500)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 다른 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체는 단순 PLGA 나노입자와 유사한 입도 및 전위를 나타냈다. 흥미로운 점은 PLGA 나노입자나 엑토좀 코팅된 PLGA 나노입자 모두 엑토좀 자체의 입도와 매우 유사하다는 점이다.
실험예 2: 종양세포로의 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체의 흡수능력 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체의 종양세포로의 흡수능력을 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 뇌종양 세포U87MG와 췌장암 세포 PANC-1을 폴리-d-리신-코팅된 커버 슬립에 파종하고(5 x 104 세포) 밤새 배양하였다. 그 후, GFP 파장대의 형광물질인 DIO로 표지된 PLGA 나노입자(PLGA), DIO로 표지된 비교육 지방유래 줄기세포에서 분리된 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체(ADMSC-PLGA) 및 DIO로 표지된 본 발명의 일 실시예에 따른 교육받은 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체 0.5 ㎍/mL를 배양중인 세포에 첨가하였고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 경과 후, 모든 시료들을 4℃의 중간 배지에서 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정시켰고, 상기 종양세포 내에서의 DIO 형광을 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 촬영하였다. 그 결과 도 5에서 확인되는 바와 같이, 단순 PLGA 나노입자를 처리한 종양세포 내부에서는 형광이 검출되지 않았으며, 비교육 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체로 처리된 종양세포 내부에서는 형광이 관찰되었으나, 본 발명의 일 실시예에 다른 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체 처리시와 비교하여 형광의 강도는 낮게 나타났다.
실험예 3: 췌장암 모델에서의 엑토좀-PLGA 종양조직 표적능력 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 엑토좀-PLGA의 표적능력을 분석하였다.
구체적으로, BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 췌장암 세포(PANC-1-luciferase-GFP)를 1x106 개씩 꼬리정맥을 통해 주사하여 췌장암 모델을 제조하였다. 이후 4주간 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 췌장암의 크기를 확인하여, 췌장암이 형성된 것을 확인한 뒤, 췌장암 세포를 이용하여 교육된 AD-MSC에서 분리된 엑토좀-PLGA(1x106 cells, 5 mg/kg), 유리 AD-MSC(1x106 cells), 교육된 AD-MSC(1x106 cells), PLGA(5 mg/kg)를 각각 하루에 한 번씩 총 3일간 상기 췌장암 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 4일차에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행하고, 실험동물을 희생시킨 후 종양이 형성된 췌장을 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 수행함으로써, 엑토좀-PLGA의 종양조직으로의 표적능력을 분석하였다(도 6a 및 6b).
그 결과, 도 6a 및 6b에서 확인되는 바와 같이, 암세포 배양배지를 처리함으로써 교육된 엑토좀-PLGA의 경우 종양 조직으로의 표적능이 향상되었음을 알 수 있었으며, 이는, 본 발명의 일 실시예에 따라 교육된 줄기세포가 암세포 특이적인 약물 전달, 특히 대표적인 난치성 악성종양인 췌장암에 대한 약물전달에 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 4: 독소루비신 적재 엑토좀-PLGA의 제조
독소루비신 적재 엑토좀-PLGA의 제조를 위해 tip sonicator 30 hz를 가동시킨 후, PLGA 공중합체([CAS#: 26780-50-7], 50:50 Carboxylated End Group (nominal), Lactel, Part #B6013-2P)를 용매인 아세톤에 5 mg/ml로 녹여 준비한 PLGA 용액 1 ml를 1 mg/ml의 독소루비신 600 μl이 혼합된 1% PVA 용액 3 ml에 적가하였다. 그런 다음, 회전 농축기를 이용하여 진공상태에서 10분 동안 농축하면서 용매인 아세톤을 제거하였다. 이어, 원심분리기를 이용하여 4℃, 17,000 xg에서 10분동안 원심분리를 수행하여 상층액을 제거함으로써 나노입자를 형성하지 못한 잔여 PLGA를 제거하였다. 그런 다음, 분광 광도계(UV-VIS)를 사용하여 생성된 PLGA 나노입자의 양을 정량하는 한편, 상기 실험예 1과 동일한 방식으로 생성된 복합체의 입도 및 전위를 분석하였다. 그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 독소루비신이 적재된 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체 역시 PLGA 나노입자나 독소루비신 적재 PLGA 나노입자와 유사한 입도 분포 및 전위를 나타내었다.
실험예 4: 뇌종양 모델에서의 엑토좀-PLGA 종양조직 표적능력 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 엑토좀-PLGA의 표적능력을 분석하였다.
구체적으로, BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 뇌종양세포(U87MG-luciferase-GFP)를 3x105 개씩 수술을 통해 뇌에 직접 주사함으로써 형성하였다. 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 뇌종양 크기를 확인하여, 뇌종양이 형성된 것을 확인한 뒤, 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토좀-PLGA(1x106 cells, 5 mg/kg), 유리 AD-MSC(1x106 cells), 교육된 AD-MSC(1x106 cells), PLGA(5 mg/kg)를 각각 하루에 한 번씩 총 3일간 상기 뇌종양 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 4일차에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행하고 실험동물을 희생시킨 후, 종양이 형성된 뇌암을 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 수행함으로써, 엑토좀-PLGA의 종양조직으로의 표적능력을 분석하였다.
그 결과, 도 8a 및 8b에서 확인되는 바와 같이, 암세포 배양배지를 처리함으로써 교육된 엑토좀-PLGA의 경우 뇌종양 조직으로의 표적능이 향상되었음을 알 수 있었으며, 본 실험 결과는 줄기세포가 아닌 줄기세포 유래 엑토좀 성분을 포함하는 생분해성 고분자 나노입자 복합체를 정맥주사를 통해 실험동물에 주입하여 달성된 결과로서 본 발명의 일 실시예에 따른 엑토좀-고분자 나노입자 복합체가 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌종양으로 정확하게 이동한 것을 입증한 것으로서, 종래 혈뇌장벽의 존재로 인해서 항암제 치료가 제한적이었던 뇌종양 치료에 있어서 중요한 기술적 난제를 해결할 수 있는 실마리를 제공하는 것이다.
실험예 5: 엑토좀-PLGA의 췌장암 억제효능 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 엑토좀-PLGA 나노입자의 항종양 효능을 분석하였다.
구체적으로, in vivo 형광 이미징을 엑토좀-PLGA의 암세포의 사멸효능을 형광/발광되는 PANC-1-luciferase-GFP 종양 마우스 모델에서 IVIS 동물 형광 이미지 시스템을 이용하여 확인하였다. 먼저, 누드마우스에 luciferase-GFP 형광을 발광하는 췌장암세포(PANC-1)를 주입하고 4주후 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토좀-PLGA(5 mg/kg), PLGA-DOX(5 mg/kg)를 각각 일주일에 2 번씩 3주간 총 6회 정맥주사하였고 측정 1시간 전 루시페린 150 mg/kg IV 주사하여 루시퍼레이즈를 활성화시킨 후, 형광 이미징 장비를 이용하여 시간별로 췌장암세포(PANC-1) 형광의 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 9에서 확인되는 바와 같이, 엑토좀-PLGA의 투여가 luciferase-GFP 형광을 발현하는 췌장암세포의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 5: 염증세포로 교육시켜 표적능을 강화시킨 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)로부터 엑토좀(나노소포체) 분리
본 발명의 일 실시예에 따라 염증세포 배지로 교육시켜 염증부위에 대한 표적능력을 강화한 지방유래 중간엽 줄기세포(ADMSC) 유래 엑토좀(나노소포체)로 코팅시킨 고분자 중합체(PLGA) 제조에 사용될 엑토좀(나노소포체)을 분리하였다.
5-1: 줄기세포에 대한 교육 방법
본 발명자들은 염증세포로의 표적능력을 강화시키기 위해 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 염증성 활막세포(FLS)와 염증성 대식세포(J774)를 100π 배양 플레이트에 웰당 각각 5x104 개씩 분주한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 염증세포가 배양중인 플레이트에서 배양액(배지)을 모아 5 ml 씩 배양 중인 줄기세포에 분주하여 24시간 동안 추가 배양하였다(education).
5-2: 교육된 줄기세포로부터 엑토좀의 분리
염증세포 배양액으로 교육된 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)가 배양된 플레이트에 cytochalasin B 10 μg/μl를 5 μl 첨가하였다. 세포를 떼어준 후, 3분 동안 볼텍싱하였다. 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 10분 원심분리를 수행하여 상등액을 모으고, 4,000 rpm에서 15분동안 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하여 엑토좀 펠렛(pellet)을 수득하였으며, 이를 DW 10 μl에 재현탁한 후, nanodrop을 사용하여 정량하였다.
실시예 6: 엑토좀-PLGA 코팅
상기 실시예 5에서 분리된 염증세포 교육 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀에 대한 PLGA 나노입자 및 DIO 또는 DID-표지 PLGA 나노입자의 코팅은 실시예 2에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다.
실험예 6: FLSs 및 J774 세포에서 엑토좀-PLGA 흡수 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체의 염증세포로의 흡수능력을 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 섬유아세포-유사 활막세포(fibroblast-like synoviocytes, FLSs) 및 774 세포를 폴리-d-리신-코팅된 커버 슬립에 시딩하고(5 x 104 세포) 밤새 배양하였다. 그 후, GFP 파장대의 형광물질인 DIO가 봉입된 PLGA 나노입자(PLGA), DIO가 봉입된 본 발명의 일 실시예에 따른 교육받은 지방유래 줄기세포로부터 분리된 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체 0.5 ㎍/mL를 세포에 첨가하였고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 경과 후, 모든 샘플을 4℃의 중간 배지에서 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정시켰고, 상기 염증세포 내에서의 DIO 형광을 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 촬영하였다. 그 결과 도 10b의 우상단에서 확인되는 바와 같이, 단순 PLGA 나노입자를 처리한 염증세포 내부에서는 형광이 검출되지 않았으며, 본 발명의 일 실시예에 다른 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체 처리시 형광이 검출된 것을 확인하였다.
실험예 7: CIA(collagen-induced arthritis) 모델 형성
DBA/1 마우스(수컷, 4-6 주령, 체중 20-25 g)는 오리엔트 바이오 (Seoul, Korea)에서 구입하였고 상기 마우스를 7-14일 동안 12시간 명/암주기(오전 6:30에점등)로 온도 및 습도 제어된 특정 병원체가 없는 환경에 수용하여 실험 전에 순응시켰다. 모든 동물 실험은 가천대학교 실험동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었다. 또한 관절염은 2 mg/mL CFA(Chondrex)의 꼬리-기반 피내 주사(intradermal injection)로 유도하였다. 27일째에 염증의 첫 징후가 관찰된 후 AIA-유도 관절염을 갖는 동물을 6개의 군(n = 6)으로 무작위 할당하였다.
실험예 7: 관절염 모델에서의 엑토좀-PLGA의 관절염증 표적 능력분석
구체적으로, 관절염 모델이 형성된 DBA/1 마우스에서의 엑토좀-PLGA의 관절염증 표적 능력을 평가하기 위해 완전한 Freund's adjuvant(CFA)의 피내 주사(intradermal injection)를 통해 CIA 유도 마우스를 확립하였다(도 10a)(L. Bevaart, et al., Arthritis Rheum. 66-3362(8): 2192-2205, 2010). 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)와 조직학적 이미지를 이용하여 엑토좀-PLGA의 관절염증세포로의 표적 능력을 분석하였다. 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토좀-PLGA-DID(1x106 cells, 5 mg/kg), PLGA-DID(5 mg/kg)를 각각 하루에 한 번씩 총 3일간 관절염 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 4일차에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행해 엑토좀-PLGA의 관절염증세포로의 표적능력을 분석하였다. 그 결과 도 10b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 염증세포로 교육된 줄기세포 유래 엑토좀-PLGA 나노입자 복합체는 염증조직에 선택적으로 축적됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 종양이나 염증과 같은 병소 유래 세포로 교육된 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅된 생분해성 나노입자 복합체는 교육에 사용된 세포가 유래한 병소 특이적인 표적능을 가짐을 확인할 수 있었다. 이러한 병소 특이적 교육은 종양이나 염증 이외에도 퇴행성 신경질환이나 다양한 대사 관련 질환이 발생하는 병소에 존재하는 병리학적 증상과 관련성이 높은 세포를 이용하여 줄기세포를 교육할 경우 해당 줄기세포로부터 유래한 엑토좀을 이용하여 해당 병소 특이적인 약물전달체의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할것이다.

Claims (29)

  1. 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 된 생분해성 고분자 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포인, 나노입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포인, 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 병소 유래 세포로 교육된 줄기세포인, 나노입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 교육된 줄기세포는 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액과 접촉하여 배양된 줄기세포인, 나노입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 인공 생분해성 고분자인, 나노입자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 천연 생분해성 고분자는 전분, 키틴, 셀룰로오스, 폴리알기네이트, 또는 콜라겐인, 나노입자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 인공 생분해성 고분자는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic) acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, 또는 PHA(polyhydroxyalkanoate)인, 나노입자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 직경 100 내지 350 nm의 크기를 갖는, 나노입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체.
  11. 제10항의 약물 전달체 및 상기 약물전달체에 적재된 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유효약물은 항암제 또는 항염증제인, 약학적 조성물.
  13. 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항암제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 줄기세포는 치료대상 암세포로 교육된 교육 줄기세포인, 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 항암제는 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 된 것인, 약학적 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.
  17. 줄기세포 유래 엑토좀 막으로 코팅이 되고 항염증제가 적재된 생분해성 고분자 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 줄기세포는 치료대상 염증부위에서 수득된 염증세로로 교육된 교육 줄기세포인, 약학적 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 항염증제는 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 된 것인, 약학적 조성물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 염증이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 치료방법.
  21. 병소 유래 세포로 줄기세포를 교육함으로써 교육된 줄기세포를 제조하는 단계;
    상기 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및
    상기 엑토좀 또는 상기 엑토좀의 분해에 의해 생성된 엑토좀 막을 생분해성 고분자 나노입자와 혼합하여 엑토좀 막이 코팅된 생분해성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 병소에 대한 표적능이 강화된 엑토좀-생분해성 고분자 나노입자 복합체의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 엑토좀 막은 상기 엑토좀에 대한 기계적 압출 또는 초음파 처리를 통해 생성되는, 제조방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포인, 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포인, 제조방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 교육은 상기 줄기세포를 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액에 접촉시켜 배양함으로써 수행되는, 제조방법.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 인공 생분해성 고분자인, 제조방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 천연 생분해성 고분자는 전분, 키틴, 셀룰로오스, 폴리알기네이트, 또는 콜라겐인, 제조방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 인공 생분해성 고분자는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic) acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PCL{poly(caprolactone)}, 또는 PHA(polyhydroxyalkanoate)인, 제조방법.
  29. 제21항에 있어서,
    상기 나노입자는 직경 100 내지 350 nm의 크기를 갖는, 제조방법.
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