WO2016117769A1 - Dna 결합 단백질을 이용한 나노입자 클러스터 제작방법 - Google Patents

Dna 결합 단백질을 이용한 나노입자 클러스터 제작방법 Download PDF

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WO2016117769A1
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zinc finger
binding
dna
nanoparticle cluster
nanoparticles
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PCT/KR2015/005050
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김학성
류이슬
김종문
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한국과학기술원
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing size-adjustable magnetic nanoparticle clusters (NPCs), and more particularly, (a) a sequence specifically binding to the zinc finger protein to the zinc finger protein in which the first binding material is modified. Binding a DNA template comprising a zinc finger to form a DNA complex; And (b) combining the zinc finger-DNA complex with the nanoparticles modified with the second binding material to form nanoparticle clusters in which the zinc finger-composites are bonded to the nanoparticles.
  • the present invention relates to a method for producing a nanoparticle cluster to which a complex is bonded and to a nanoparticle cluster manufactured by the above method.
  • Nanodia cluster structures which are composed of nanoparticles such as magnetic nanoparticles, gold nanoparticles, and quantum dots, are attracting attention because they have unique collective characteristics different from that of a single nanoparticle.
  • Nanoparticle clusters specifically exhibit optical or physical properties such as coupled-plasmon absorbance, interparticle energy transfer, electron transfer and conductivity. This change in properties can be applied to nanoelectronic or nanoplasmonic devices.
  • One-dimensional or related aggregates of nanoparticles also exhibit unusual mechanical properties, such as viscosity reduction, and can also form supra-crystals such as ionic solids or ionic liquids.
  • ionic solids or ionic liquids In the case of biological sensors and biomedical imaging, there is an example of using a cluster phenomenon of gold nanoparticles and magnetic nanoparticles.
  • the associated plasmon absorbance between particles shifts to a lower energy level than a single nanoparticle.
  • Magnetic particles greatly shorten the transverse relaxation time of protons of adjacent water molecules in the presence of an external magnetic field. Since the transverse relaxation rate is proportional to the cross-sectional area of the magnetic material, clusters such as multimers or self-assemblies of magnetic nanoparticles having a large effective cross-sectional area have a much higher transverse relaxation rate, and thus The degree of shortening is also significantly shortened.
  • nanoparticle clusters with a wide range of applications require a clear and well-regulated configuration to fabricate their properties better.
  • Many attempts have been reported to allow nanoparticle clusters to be scaled and shaped (Nat. Commun. 2010, 1, 87; Acc. Chem. Res. 2014, 47, 1881-1890; ACS Nano 2014, 8 , 3272-3284; Langmuir 2014, 30, 7313-7318).
  • nanoparticle clusters made using DNA are receiving great attention.
  • Methods include electrostatic binding to a largely negative DNA phosphate backbone, binding to chemically modified DNA, and base complementation to single stranded DNA.
  • these methods require chemical reduction of metal ions or modification of DNA structure, and have a difficult problem of modifying the surface of nanoparticles, which are required for additional modification such as attaching molecules.
  • zinc finger protein is a kind of protein that binds to DNA, and has zinc ions at two cysteine and histidine residues in its structure, and has a specifically recognized sequence.
  • Zincfingers generally consist of tandem arrays of two or three fingers, with one finger recognizing and binding three base pairs of double-stranded DNA.
  • the finger specificity of zinc finger and optimization of the linker between the fingers can be easily adjusted the sequence specificity and binding strength of the zinc finger.
  • the production of nanoparticle clusters using the properties of zinc finger is expected to be a more bio-friendly method of manufacturing can be controlled.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for manufacturing a nanoparticle cluster that can be controlled in size.
  • a property of zinc finger protein binding to DNA template DNA designed to have a plurality of zinc finger binding sites and
  • the nanoparticles are bound to the zinc finger-DNA complexes incorporating the zinc finger protein, it was confirmed that the nanoparticle clusters that can be adjusted in size can be prepared, and the present invention has been completed.
  • An object of the present invention to provide a method for producing a nanoparticle cluster that can be adjusted in size.
  • Another object of the present invention is to provide a nanoparticle cluster prepared by the above method, the size is adjustable.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell target composition containing the nanoparticle cluster.
  • the present invention provides a zinc finger-DNA complex by (a) binding a DNA template comprising a sequence specifically binding to the zinc finger protein to the zinc finger protein modified with the first binding material Forming; And (b) combining the zinc finger-DNA complex with the nanoparticles modified with the second binding material to form nanoparticle clusters in which the zinc finger-composites are bonded to the nanoparticles. It provides a method for producing a nanoparticle cluster is bonded to the complex.
  • the present invention also provides a nanoparticle cluster comprising a sequence that specifically binds to a zinc finger protein, wherein a zinc finger-DNA complex and a nanoparticle to which a DNA template and a zinc finger protein are bound are bound.
  • the present invention also provides a contrast agent composition containing the nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a cell target nanoparticle cluster, characterized in that the cell target material is modified in the nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a cell targeting composition containing a cell targeting nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a nanoparticle cluster for cancer diagnosis, characterized in that the cancer cell target material is modified in the nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a cancer diagnostic composition containing the cancer diagnostic nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a nanoparticle cluster for cancer treatment, characterized in that the cancer cell target therapeutic substance is modified in the nanoparticle cluster.
  • the present invention also provides a composition for treating cancer containing the nanoparticle cluster for treating cancer.
  • A DNA binding zinc finger proteins
  • B DNA template designs for three lengths
  • Figure 2 is an electron transmission micrograph and DLS analysis graph showing the purification of NPCs using the glycerol density gradient method of the present invention.
  • Figure 3 is an electron transmission micrograph and a graph showing the formation by size of the magnetic nanoparticle cluster according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing a comparison of T2 relaxation rate between magnetic nanoparticle clusters and Feridex according to an embodiment of the present invention and a T2-weighted image.
  • the zinc finger protein using the ability of the zinc finger protein to bind to the DNA of a specific sequence, to prepare a zinc finger-DNA complex that can adjust the length of the DNA template binding to the zinc finger, the zinc finger-DNA complex and nanoparticles Combining the resulting nanoparticle clusters that can be adjusted in size was prepared.
  • the present invention in one aspect, the present invention (a) by combining a DNA template comprising a sequence specifically binding to the zinc finger protein to the zinc finger protein modified first zinc-DNA Forming a complex; And (b) combining the zinc finger-DNA complex with the nanoparticles modified with the second binding material to form nanoparticle clusters in which the zinc finger-composites are bonded to the nanoparticles.
  • the present invention relates to a method for manufacturing a nanoparticle cluster to which a complex is bound.
  • the DNA template contains one or more zinc finger binding sequences, and two or more DNA blocks containing one or more zinc finger binding sequences are linked by a linker having a restriction enzyme recognition site.
  • the zinc finger protein used in the present invention may be used without limitation as long as it is a zinc finger protein having DNA binding ability.
  • Examples of the zinc finger protein that can be used include Cys2His2, Gag knuckle, and treble clef including QNK-QNK-RHR. (Treble clef), zinc ribbon, Zn2 / Cys6, TAZ2 domain like.
  • the zinc finger protein was used as QNK-QNK-RHR, and the DNA sequence to which the zinc finger protein QNK-QNK-RHR specifically binds is "GAGGCAGAA”.
  • the DNA template may be characterized in that the DNA structure containing various forms of DNA origami (origami).
  • the nanoparticles are Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 , Zn 2+ and Mn 2+ doped with magnetic particles selected from the group consisting of nanoparticles, gold nanoparticles, quantum dots and combinations thereof, and the like. It may be, but is not limited thereto.
  • the first binding material and the second binding material may be characterized in that the DNA, RNA, protein, peptide, fat, or carbohydrate that can bind to each other.
  • the first binding agent is biotin
  • the second binding agent is selected from the group consisting of streptavidin, avidin, avitravidin, and captavidin.
  • the first binding material is selected from the group consisting of streptavidin, avidin, avidin, neutravidin, and captavidin, and the second binding material is biotin. It may be characterized by.
  • the present invention relates to a DNA template comprising a sequence that specifically binds a zinc finger protein, a nanoparticle cluster to which a zinc finger-DNA complex and a nanoparticle are bound to which a zinc finger protein is bound.
  • FIG. 1 One embodiment of a method for producing magnetic NPCs using the DNA binding zinc finger protein of the present invention is shown in FIG. 1.
  • the first biomolecule is biotin
  • the second biomolecule is neutravidin
  • the zinc finger is a zinc finger consisting of three fingers of F1-F2-F3 (finger1-finger2-finger3).
  • F1-F2-F3 finger1-finger2-finger3
  • QNK-QNK-RHR a zinc finger consisting of three fingers of F1-F2-F3
  • Neutravidin of magnetic nanoparticles forms magnetic nanoparticle clusters by specific binding with modified biotin at the N-terminus of zinc finger.
  • the designed DNA template of three different lengths in Figure 1 it consists of 2, 4, 8 blocks (blocks), each containing seven zinc finger binding sites. Therefore, due to the specific binding between the zinc finger and the DNA, the size of the magnetic nanoparticle clusters produced according to the length of the DNA template can be controlled.
  • QNK-QNK-RHR which is one of the zinc finger proteins
  • the present invention is not limited thereto.
  • the same principle can be used. Accordingly, if the DNA sequence or form is also capable of specific binding with a specific zinc finger, any sequence or any structure or form including the sequence can be used, but is not limited thereto.
  • the first biomolecule may be any one of DNA, RNA, protein, peptide, fat or carbohydrate as long as it can form a cluster of magnetic nanoparticles by specific binding with the second biomolecule.
  • the second biomolecule may be a DNA / RNA having a sequence complementary to the first biomolecule or a fragment thereof.
  • a ligand capable of specifically binding to the second biomolecule may be used as the second biomolecule.
  • the first biomolecule is biotin as in the embodiment of the present invention
  • the second biomolecule may be any one capable of specific binding with the biotin, and streptavidin, avidin, and neutra.
  • Vidin (neutravidin) or captavidin may be used, but is not limited thereto.
  • the magnetic nanoparticles may be any of Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 or the like, which are conventionally known as magnetic materials having a size of several tens to several tens of nanometers.
  • the nanoparticles may be any one of magnetic nanoparticles as well as gold nanoparticles, silver nanoparticles, and quantum dots as long as the particles have the same nano range size.
  • NPCs are formed by the specific binding of the first biomolecule located at the N-terminus of the zinc finger and the second biomolecule on the surface of the magnetic nanoparticle, the probability of crosslinking of NPCs due to the plurality of second biomolecules during the manufacturing This is high.
  • the binding ratio of the magnetic nanoparticles to the DNA-ZinkFinger complex was adjusted to 200 when NPCs were formed. Crosslinking between clusters could not be observed when reacting with 200-fold excess of magnetic nanoparticles, which was demonstrated by a nanoparticle analyzer (DLS) (FIG. 2). The results show that it is necessary to react 200 times more magnetic nanoparticles to make NPCs effective without crosslinking.
  • the sedimentation velocity of the NPCs will vary depending on the type of nanoparticles. Purification purity of NPCs will greatly affect applications later, so it is important to obtain high purity NPCs.
  • the conditions optimized for high purity purification of the prepared magnetic nanoparticle clusters were established, which was proved through an electron transmission microscope (TEM) and a nanoparticle analyzer (FIG. 2).
  • TEM electron transmission microscope
  • FOG. 2 nanoparticle analyzer
  • the optimal number of nanoparticles or the size and shape of NPCs in the optimal NPCs will depend on the type and size and composition of the nanoparticles used and the shape and size of the DNA template. It will be easy for one skilled in the art to select the optimum conditions for this.
  • the present invention relates to a contrast agent composition containing the nanoparticle cluster and the use of the contrast agent of the nanoparticle cluster.
  • the magnetic nanoclusters produced by the method of manufacturing magnetic nanoparticle clusters of the present invention can further be used for application of MRI to T2-weighted image contrast medium and specific intracellular delivery and imaging.
  • the TPC relaxation rate (r2) was compared with the conventional MRI contrast agent Feridex using the NPCs prepared in the following example (FIG. 4).
  • the r2 of the NPCs prepared by the present invention was 315.1 mM-1s-1, which was about 3 times higher than that of Feridex (108.2 mM-1s-1).
  • the present invention provides a cell target nanoparticle cluster and a cell target composition containing the cell target nanoparticle cluster, wherein the nanoparticle cluster is characterized in that the cell target material is modified in the nanoparticle cluster.
  • the present invention relates to a cell targeting method and a cell targeting method using the nanoparticle cluster.
  • the cell target material may be used without limitation as long as it is a cell target material for recognizing a specific cell, and a ligand of a receptor possessed by a specific cell may be used as an example.
  • the present invention is a cancer diagnostic nanoparticle cluster, characterized in that the cancer cell target material is modified in the nanoparticle cluster and a cancer diagnostic composition containing the cancer diagnostic nanoparticle cluster, cancer of the nanoparticle cluster
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer, which comprises using the nanoparticle cluster for diagnosis and for cancer diagnosis.
  • the cancer cell target material may use a material capable of binding to a receptor specifically expressed in cancer cells, and may use a target material previously used for cancer diagnosis, and may be used for antibodies, antisense, PNA, and cancer cell specific receptors.
  • Ligand material and the like can be used.
  • the present invention for cancer treatment containing the nanoparticle cluster for cancer treatment and the nanoparticle cluster for cancer treatment, characterized in that the cancer cell target material is modified to the nanoparticle cluster, the cancer treatment agent is bound to
  • the present invention relates to a composition, a method for treating cancer of the nanoparticle cluster, and a method for treating cancer, characterized by using the nanoparticle cluster for cancer treatment.
  • the cancer cell therapeutic material may use a material that can be specifically combined and treated in cancer cells, and may use a target therapeutic material conventionally used for cancer treatment.
  • cancer therapeutic agents that can be used in the various embodiments of the present invention, including the pharmaceutical compositions and dosage forms and kits of the present invention, include, but are not limited to, axibicin; Aclarubicin; Acodazole hydrochloride; Acronin; Adozelesin; Aldesleukin; Altretamine; Ambomycin; Amethanetron acetate; Aminoglutetimides; Amsacrine; Anastrozole; Anthracycin; Asparaginase; Asperlin; Azacytidine; Azethepa; Azotomycin; Batimastad; Benzodepa; Bicalutamide; Bisantrene hydrochloride; Bisnapid dimesylate; Bizelesin; Bleomycin sulfate; Brequinar sodium; Bropyrimin; Busulfan; Cocktinomycin; Calusosterone; Carracemide; Carbetimers; Carboplatin; Carmustine; Carrubicin hydrochlor
  • anticancer drugs include, but are not limited to, 20-epi-1, 25 dihydroxyvitamin D3; 5-ethynyluracil; Abiraterone; Aclarubicin; Acylpulbene; Adesiphenol; Adozelesin; Aldesleukin; ALL-TK antagonists; Altretamine; Ambamustine; Amidox; Amifostine; Aminolevulinic acid; Amrubicin; Amsacrine; Anagrelide; Anastrozole; Andrographolide; Angiogenesis inhibitors; Antagonist D; Antagonist G; Antarelix; Anti-spine-generating protein-1; Anti-androgens, prostate carcinoma; Antiestrogens; Antineoplasmon; Antisense oligonucleotides; Apidicholine glycinate; Apoptosis gene modulators; Apoptosis regulators; apurinic acid; ara-CDP-DL-PTBA; Arginine deaminase; As
  • a particular route of administration used for a particular active ingredient will vary depending on the active ingredient itself (eg, whether or not it can be administered orally without degradation before it is introduced into the bloodstream) and the disease being treated.
  • treatment of tumors on the skin or exposed mucosal tissue is more effective when one or both active ingredients are administered via topical, transdermal or mucosal (eg, by nose, sublingual, buccal, rectal or vaginal).
  • Treatment of tumors in the body, or prevention of cancer that can spread from one part of the body to another may be more effective when oral or parenteral administration of one or both active ingredients.
  • parenteral administration may be desirable for acute treatment of the disease, while the transdermal or subcutaneous route of administration may be used for the chronic treatment or prevention of the disease.
  • Block DNA was designed to have seven zinc finger binding sites. Restriction enzyme treatment and ligation were used to efficiently construct 251 bp, 437 bp, and 809 bp length DNA having SEQ ID NOs: 1 to 3 having 2, 4, and 8 repeated block DNAs, respectively.
  • light blue represents seven zinc finger binding sites (underlined, nine nucleotide sequences) as shown in FIG. 1B and four random nucleotide sequences are distributed between each zinc finger binding site.
  • Red is NdeI restriction enzyme recognition sequence
  • Gray is the XhoI restriction enzyme recognition sequence
  • Yellow is SalI restriction enzyme recognition sequence
  • Blue indicates EcoRI restriction enzyme recognition sequence. Italics contain restriction enzyme recognition sequences (bold) for cloning into adapter sequences.
  • PCR was performed to synthesize a gene of the zinc finger protein (SEQ ID NO: 4) named QNK-QNK-RHR (SEQ ID NO: 5) to introduce an Nde I recognition sequence at the 5 'end and an Xho I recognition sequence at the 3' end. It was. In particular, an amino acid linker containing cysteine was introduced at the N-terminus.
  • the generated gene was cloned into the pET21a vector and transformed into heat shock by BL21 (DE3) transformed cells.
  • a single colony of cells transformed with the gene was inoculated in 10 mL of LB medium and incubated for at least 12 hours. The culture was further incubated for 3 hours. By the time the optical density in the 600nm wavelength band of the cell reached 0.6, IPTG and ZnSO 4 were added to 0.5mM and 0.2mM, respectively. Afterwards, the cells were further incubated at 18 ° C. for 20 hours, and finally, the cells were obtained at 6000 g intensity in a centrifuge.
  • the obtained cells were sonicated by releasing with 30 mL lysis buffer (20 mM Tris-Cl, 0.2 mM ZnSO 4 , and 2 mM ⁇ -mercaptoethanol, pH 7.5). After separating the supernatant with protein by centrifugation, the zinc finger protein with histidine-tag was purified on a nickel-fixed column (GE Healthcare, USA). 10-fold excess of maleimide-PEG2-biotin compared to protein after buffer exchange with 50 mM HEPES buffer (150 mM NaCl, 0.2 mM ZnSO 4 , and 2 mM TCEP) for subsequent N-terminal biotin modification Reacted. Biotin remaining without binding to the protein was removed by PD-10 column.
  • neutravidin-modified magnetic nanoparticles 15 nm of DSPE-PEG2000-methoxy and DSPE-PEG3400-biotin were coated in a 95: 5 ratio. Iron oxide magnetic nanoparticles were conjugated with neutravidin.
  • neutravidin Pulce Chemical
  • 50 mM borate buffer pH 8.3
  • filtered three times using a centrifugal filter having a molecular weight cutoff of 100 kD. Unreacted neutravidin was removed.
  • the protein conjugated to the magnetic nanoparticles was calculated by the Bradford assay method, and 200 nutravidin molecules were expected to be immobilized on the magnetic nanoparticles.
  • the prepared DNA template was used to have a length of 251bp, 437bp and 809bp, respectively.
  • images of NPCs were observed using transmission electron microscopy (TEM, JEOL JEM-2100F).
  • Figure 4 (b) is a histogram (histogram) representing the size distribution by analyzing more than 380 NPCs on a TEM image.
  • the peak of the distribution shifted to the right.
  • the analysis of the number of magnetic nanoparticles bound to a DNA template resulted in 2.9 ⁇ 0.9, 5.8 ⁇ 1.3 and 11.6 ⁇ 2.0 results from the shortest DNA template. This fits well with theoretically expected values of 3, 6 and 12, demonstrating that the method of preparing the NPCs can be manufactured to be well sized.
  • the T2 relaxation rate of the NPCs was measured and the results are shown in FIG. 4. At this time, NPCs made of a 809 bp long DNA template were used for the measurement.
  • Feridex is a result of measuring T2 relaxation as a control for comparison.
  • the T2 relaxation rate of NPCs showed a three times higher T2 relaxation rate than Feridex, indicating an improved contrast effect than Feridex.
  • the same result was shown in the T2-weighted image (the image image of FIG. 4).
  • the Fe concentration was measured at 0.18 mM, darker images could be observed in NPCs due to the enhanced contrast effect compared to Feridex.
  • NPCs Another application of NPCs has been cell experiments for delivery via intracellular targeting. To this end, 1% DSPE-PEG5000-folate was added to the coating of magnetic nanoparticles used to fabricate NPCs. Folate was used for targeting specific cells. In addition, the YOYO-1 staining agent, which is a staining agent for DNA template, was used to observe intracellular delivery of NPCs.
  • NPCs exposed to folic acid enter well into HeLa cells.
  • the green fluorescence of YOYO-1 was observed in the cells.
  • green fluorescence was not seen in cells treated with control NPCs not exposed to folic acid, indicating no intracellular delivery.
  • cells treated with nothing could observe any fluorescence.
  • the nanoparticle cluster can be applied to various nanoparticles and applied to various fields including disease and diagnosis treatment and imaging. Can be.

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Abstract

본 발명은 크기 조절이 가능한 자성 나노입자 클러스터(NPCs)의 제작방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 제1 결합물질이 수식되어 있는 징크핑거 단백질에 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형을 결합시켜 징크핑거-DNA 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 징크핑거-DNA 복합체와 제2 결합물질로 수식된 나노입자를 결합시켜 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 형성시키는 단계를 포함하는 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터의 제작방법 및 상기 방법으로 제작된 나노입자 클러스터에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 나노입자 클러스터의 제작에 화학적 방법 대신 징크핑거 단백질을 이용하여 DNA 주형의 길이에 따라 크기를 조절할 수 있으므로, 다양한 나노입자에 적용 가능하고 질병·진단 치료와 이미징을 비롯한 다양한 분야에 응용할 수 있다.

Description

DNA 결합 단백질을 이용한 나노입자 클러스터 제작방법
본 발명은 크기 조절이 가능한 자성 나노입자 클러스터(NPCs)의 제작방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 제1 결합물질이 수식되어 있는 징크핑거 단백질에 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형을 결합시켜 징크핑거-DNA 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 징크핑거-DNA 복합체와 제2 결합물질로 수식된 나노입자를 결합시켜 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 형성시키는 단계를 포함하는 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터의 제작방법 및 상기 방법으로 제작된 나노입자 클러스터에 관한 것이다.
자성 나노입자, 금 나노입자, 양자 점과 같은 나노입자들이 모여서 이루는 클러스터 구조체는 그것이 단일 나노입자와는 다른 독특한 집단적 특성을 가진다는 점에서 주목을 받고 있다. 나노입자 클러스터는 구체적으로 coupled-plasmon absorbance, 입자간 에너지 전달, 전자 전달 및 전도성과 같은 광학적이거나 물리적인 성질의 변화를 보인다. 이러한 특성의 변화는 nanoelectronic 또는 nanoplasmonic 기기에 응용될 수 있다. 또한 1차원적 혹은 그와 관련된 나노입자의 집합체는 점도 감소와 같은 특이한 기계적 성질을 보이기도 하며, ionic solids 또는 ionic liquids와 같은 supra-crystal을 형성하기도 한다. 생물학적 센서나 생의학적 이미징의 경우, 금 나노입자와 자성 나노입자의 클러스터 현상을 이용하는 예가 있다. 금 나노입자는 클러스터를 이루는 경우 입자 간 연계된 플라스몬 흡광도가 단일 나노입자보다 낮은 에너지 수준으로 옮겨가는 현상을 보인다. 자성입자는 외부 자기장의 존재 하에서 인접한 물 분자의 양자(proton)의 횡축 이완 시간(transverse relaxation time)을 크게 단축시킨다. 이러한 횡축 이완 속도는 자성 물질의 단면적과 비례하기 때문에 유효 단면적이 큰 자성 나노입자의 다중체(multimer)나 자기조립체(self-assembly)와 같은 클러스터는 횡축 이완 속도가 훨씬 크고, 따라서 횡축 이완 시간의 단축 정도도 현저하게 짧아진다. 단일 입자 상태로 존재하거나 클러스터를 형성할 시 각각의 일어나는 현상 변화를 이용하여 센싱하려는 물질 존재 유무 또는 양을 분석하거나 자성 나노입자 클러스터는 보다 향상된 MRI 조영제로서도 이용하려는 연구가 있다.
다양한 특성 변화로 인해 응용 가능 범위가 넓은 나노입자 클러스터는 그 특성을 더욱 잘 나타내기 위해 제작에 있어 명확하고 잘 조절된 구성이 매우 요구된다. 나노입자 클러스터를 크기와 모양이 조절될 수 있게 하는 많은 시도들이 보고된 바 있다(Nat. Commun. 2010, 1, 87; Acc. Chem. Res. 2014, 47, 1881~1890; ACS Nano 2014, 8, 3272~3284; Langmuir 2014, 30, 7313~7318). 특히 DNA를 이용하여 만든 나노입자 클러스터가 큰 주목을 받고 있다. 이에 대한 방법으로는 크게 음성을 띄는 DNA 인산염 백본(phosphate backbone)으로의 정전기적 결합, 화학적으로 수식화된 DNA로의 결합, 그리고 단일가닥 DNA로의 염기상보결합(base complementation) 등이 있다. 그러나 이런 방법 들은 금속 이온의 화학적 환원이나 DNA 구조의 변형 등을 필요로 하며, 분자를 붙이는 등의 추가적인 수식을 위해 필요로 하는 나노입자의 표면 수식이 어려운 문제를 가지고 있다.
한편, 징크핑거 단백질은 DNA에 결합하는 단백질의 일종으로 구조상으로 2개의 시스테인과 히스티딘 잔기에 아연 이온을 가지고 있으며, 특이적으로 인식하는 서열을 갖고 있다. 징크핑거는 일반적으로 2~3개 이상의 핑거로 이루어진 tandem array로 구성되어 있으며 하나의 핑거는 이중가닥 DNA의 3 염기쌍을 인식하여 결합한다. 징크핑거의 핑거 개수 변화와 핑거 사이의 링커(linker)의 최적화를 통해 징크핑거의 서열 특이성과 결합력이 쉽게 조절 될 수 있다. 이러한 징크핑거의 특성을 이용한 나노입자 클러스터의 제작은 보다 생체 친화적인 방법으로 조절 가능한 제작 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명자들은 크기 조절이 가능한 나노입자 클러스터를 제작하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 징크핑거 단백질이 DNA에 결합하는 성질을 이용하여, 복수개의 징크핑거 결합 부위를 가지도록 디자인된 주형 DNA와 징크핑거 단배질을 결합시킨 징크핑거-DNA 복합체에 나노입자를 결합시키는 경우, 크기 조절이 가능한 나노입자 클러스터를 제작할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 크기조절이 가능한 나노입자 클러스터의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되고, 크기조절이 가능한 나노입자 클러스터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자 클러스터를 함유하는 조영제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자 클러스터를 함유하는 세포표적용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 제1 결합물질이 수식되어 있는 징크핑거 단백질에 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형을 결합시켜 징크핑거-DNA 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 징크핑거-DNA 복합체와 제2 결합물질로 수식된 나노입자를 결합시켜 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 형성시키는 단계를 포함하는 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터의 제작방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 징크핑거 단백질과 특이적으로 결합하는 서열을 포함하고, DNA 주형과 징크핑거 단백질이 결합된 징크핑거-DNA 복합체와 나노입자가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자 클러스터를 함유하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자 클러스터에 세포표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 세포표적용 나노입자 클러스터를 제공한다.
본 발명은 또한, 세포표적용 나노입자 클러스터를 함유하는 세포표적용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자 클러스터에 암세포 표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 나노입자 클러스터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 암 진단용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자 클러스터에 암세포 표적치료물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 암 치료용 나노입자 클러스터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 암 치료용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
도 1은 DNA 결합 징크핑거 단백질을 이용한 나노입자 클러스터의 형성(A)과 세 가지 길이 별 DNA 주형 디자인(B)을 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 글리세롤 밀도 구배 방법을 이용한 NPCs의 정제를 보여주는 전자투과현미경 사진과 DLS 분석 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 의한 자성 나노입자 클러스터의 크기 별 형성을 보여주는 전자투과현미경 사진과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 이실시예에 의한 자성 나노입자 클러스터와 Feridex의 T2 이완률 비교를 보여주는 그래프와 T2 강조 영상 이미지이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명에서는 징크핑거 단백질이 특정 서열의 DNA에 결합하는 능력을 이용하여, 징크핑거와 결합하는 DNA 주형의 길이를 조절할 수 있는 징크핑거-DNA 복합체를 제조하고, 상기 징크핑거-DNA 복합체와 나노입자를 결합시켜 결과적으로 크기조절이 가능한 나노입자 클러스터를 제조하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 (a) 제1 결합물질이 수식되어 있는 징크핑거 단백질에 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형을 결합시켜 징크핑거-DNA 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 징크핑거-DNA 복합체와 제2 결합물질로 수식된 나노입자를 결합시켜 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 형성시키는 단계를 포함하는 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터의 제작방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 주형은 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하며, 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하는 DNA 블록이 제한효소 인식부위를 가지는 링커로 2개 이상 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 징크핑거 단백질은 DNA 결합능을 가지는 징크핑거 단백질이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 사용할 수 있는 징크핑거 단백질의 예로는 QNK-QNK-RHR을 포함한 Cys2His2, Gag 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 징크 리본, Zn2/Cys6, TAZ2 도메인양(TAZ2 domain like) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 징크핑거 단백질로는 QNK-QNK-RHR을 사용하였으며, 상기 징크핑거 단백질 QNK-QNK-RHR이 특이적으로 결합하는 DNA 서열은 "GAGGCAGAA"이다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 주형은 다양한 형태의 DNA 오리가미(origami)를 포함하는 DNA 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 Fe2O3, Fe3O4, Zn2+ 및 Mn2+으로 구성된 군에서 선택되는 자성입자가 도핑된 나노입자, 금 나노입자, 양자점 및 이들의 조합 등을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 결합물질과 제2결합물질은 서로 결합할 수 있는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방, 또는 탄수화물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제1 결합물질은 바이오틴이고, 제2 결합물질은 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 및 캡트아비딘(captavidin)으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 것을 특징으로 할 수 있으며, 제1 결합물질은 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 및 캡트아비딘(captavidin)으로 구성되는 군에서 선택되고, 제2 결합물질은 바이오틴인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 징크핑거 단백질과 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형과 징크핑거 단백질이 결합된 징크핑거-DNA 복합체와 나노입자가 결합되어 있는 나노입자 클러스터에 관한 것이다.
본 발명의 DNA 결합 징크핑거 단백질을 이용한 자성 NPCs 제작 방법의 일 양태를 도 1에 도시하였다. 도 1 및 실시예에서 상기 제1생체분자는 바이오틴, 제2생체분자는 뉴트라비딘(neutravidin), 상기 징크핑거는 F1-F2-F3(finger1-finger2-finger3)의 세 개의 핑거로 이루어진 징크핑거인 QNK-QNK-RHR에 해당한다. 자성 나노입자의 neutravidin은 징크핑거의 N 말단에 수식화된 biotin과 특이 결합에 의해 자성 나노입자 클러스터를 형성한다. 도 1에서 3가지 다른 길이의 디자인된 DNA 주형의 경우, 각각 2, 4, 8개의 블록(block)으로 구성되어 있는데 한 블록에는 7개의 징크핑거 결합 자리가 존재한다. 따라서, 징크핑거와 DNA 간의 특이적 결합으로 인하여 DNA 주형의 길이에 따라 만들어지는 자성 나노입자 클러스터의 크기가 조절될 수 있다.
하기 실시예 및 도 1에서는 자성 나노입자 클러스터 형성의 매개체로서 징크핑거 단백질 중 하나인 QNK-QNK-RHR을 모델로 설명하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 모든 종에서 얻어질 수 있는 모든 종류의 징크핑거 단백질 역시 동일한 원리로 사용이 가능하다. 이에 따라 DNA 서열이나 형태 역시 특정 징크핑거와의 특이 결합이 가능한 것이라면 어느 서열이나 서열이 포함된 어느 구조나 형태라도 사용이 가능하며 이에 한정되는 것이 아님은 당연하다.
상기 제1생체분자는 제2생체분자와 특이결합에 의해 자성 나노입자의 클러스터를 형성할 수 있는 것이라면 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물 중 어느 것이라도 무방하다. 제1생체분자가 DNA/RNA인 경우 제2생체분자는 제1생체분자 또는 그 단편과 상보적인 서열을 갖는 DNA/RNA일 수 있다. 마찬가지로 제1생체분자가 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물이라면 이와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 제2생체분자로 사용할 수 있다. 예를 들어 제1생체분자가 본 발명의 실시예에서처럼 바이오틴이라면, 제2생체분자는 바이오틴과 특이결합을 할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 무방하며, 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡트아비딘(captavidin)을 사용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
상기 자성 나노입자는 수~수십 나노미터의 크기를 갖는 자성 재료로서 종래 알려진 Fe2O3, Fe3O4 이나 이후 개발되는 어떠한 것을 적용하여도 무방하다. 상기 나노입자는 자성 나노입자 뿐만 아니라 동일한 나노 범위 크기의 입자라면 금 나노입자, 은 나노입자, 양자 점 등 어느 것이라도 무방하다.
NPCs는 징크핑거 N 말단에 위치한 제1생체분자와 자성 나노입자 표면의 제2생체분자의 특이결합에 의해 형성되므로 제작 과정에서 복수개의 제2생체분자로 인해 NPCs의 크로스링킹(crosslinking)이 일어날 확률이 높다. 이를 방지하기 위해 본 발명의 실시예에서 NPCs를 형성 시 DNA-징크핑거 복합체 대비 자성 나노입자의 결합 비율을 200으로 맞춰주었다. 200배 과량의 자성 나노입자를 반응했을 때 클러스터 들 간의 크로스링킹은 관찰할 수 없었고 이는 나노입자 분석기(DLS)를 통해 입증되었다(도 2). 이 결과는 NPCs를 크로스링킹 없이 효과적으로 만들기 위해서는 200 배 이상의 자성 나노입자를 반응하는 것이 필요하다는 것을 보여준다.
밀도 기울기(density gradient)를 이용한 NPCs의 정제 과정에서 NPCs의 침강 속도(sedimentation velocity)는 나노입자의 종류에 따라 달라질 것이다. NPCs의 정제 순도는 이 후 응용에 크게 영향을 미칠 것이므로 순도 높은 NPCs를 얻는 것이 중요하다. 본 발명의 실시예에서는 제작한 자성 나노입자 클러스터의 순도 높은 정제에 최적화된 조건을 구축하였고 이는 전자 투과 현미경(TEM)과 나노입자 분석기를 통해 증명되었다(도 2). 필요한 응용에 따른 최적의 NPCs에서 나노입자의 평균 수 또는 NPCs의 크기와 모양은 사용한 나노입자의 종류와 크기와 조성, DNA 주형의 형태와 크기에 따라 달라질 것이다. 이에 대한 최적의 조건을 선정하는 것은 당업자에게 용이할 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 나노입자 클러스터를 함유하는 조영제 조성물 및 상기 나노입자 클러스터의 조영제 용도에 관한 것이다.
본 발명의 자성 나노입자 클러스터 제조방법으로 제작된 자성 나노 클러스터는 더 나아가 MRI의 T2 강조 영상(T2-weighted image) 조영제로의 응용과 특이적 세포내 전달과 이미징에 이용할 수 있다. 하기 실시예에서 제작된 NPCs를 사용하여 기존 MRI 조영제인 Feridex와의 T2 이완율 (r2) 비교를 수행하였다(도 4). 본 발명에 의해 제작된 NPCs의 r2는 315.1mM-1s-1로써 Feridex(108.2mM-1s-1)의 약 3배 높은 조영 효과에 해당하는 수치를 보여주었다.
또 다른 관점에서 본 발명은 상기 나노입자 클러스터에 세포표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 세포표적용 나노입자 클러스터 및 상기 세포표적용 나노입자 클러스터를 함유하는 세포표적용 조성물, 상기 나노입자 클러스의 세포표적용 용도 및 상기 나노입자 클러스터를 이용한 세포표적방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포표적물질은 특정세포를 인식하기 위한 세포표적 물질이라면 어떤 것이든 제한없이 사용할 수 있으며, 특정 세포가 가진 수용체의 리간드 등을 일예로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 엽산(folate)이 노출되게 만든 NPCs에 DNA에 삽입(intercalation)되는 염색제를 탑재하여 엽산 수용체(receptor)가 과발현 된 세포주인 HeLa 세포내에 특이적으로 전달이 가능함을 이미징을 통해 수행하였다(도 5). 아무것도 처리하지 않은 세포와 엽산이 노출되어 있지 않은 NPCs를 처리했을 때는 세포에 형광 신호가 전혀 보이지 않으나 엽산이 노출된 NPCs를 처리했을 때에 세포에 DNA 삽입 염색제의 녹색 형광 신호가 진하게 보였다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 나노입자 클러스터에 암세포 표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 나노입자 클러스터 및 상기 암 진단용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 진단용 조성물, 상기 나노입자 클러스의 암 진단용도 및 상기 암 진단용 나노입자 클러스터를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 암세포 표적물질은 암세포에서 특이적으로 발현되는 수용체와 결합할 수 있는 물질을 사용할 수 있으며, 기존에 암진단에 사용되는 표적물질을 사용할 수 있으며, 항체, 안티센스, PNA, 암세포 특이 수용체에 대한 리간드 물질 등이 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 나노입자 클러스터에 암세포 표적물질이 수식되어 있고, 암 치료제가 결합하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 나노입자 클러스터 및 상기 암 치료용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 치료용 조성물, 상기 나노입자 클러스터의 암 치료용도 및 상기 암 치료용 나노입자 클러스터를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 암세포 치료물질은 암세포에서 특이적으로 결합하여 치료할 수 있는 물질을 사용할 수 있으며, 기존에 암치료에 사용되는 표적치료물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 및 투여형 및 키트를 포함하여, 본 발명의 다양한 실시태양들에 사용될 수 있는 암치료물질의 예로는 비 제한적으로 액시비신; 아클라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비스안트렌 하이드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 듀라조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 하이드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스유리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로소잔트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 매이탄신; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 메제스트롤 아세테이트; 멜렌제스트롤아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨;메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 하이드로클로라이드; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 패클리탁셀; 페가스파르가세; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피록산트론 하이드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 퓨로마이신; 퓨로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핑골; 사핑골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨;스파르소마이신; 스피로제르마늄 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴;스트렙토니그린; 스트렙토조신; 설포페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔록산트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴, 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드가 있다. 다른 항암 약물로는 비 제한적으로 20-에피-1, 25 디하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항물질; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 억제제; 길항물질 D; 길항물질 G; 안타렐릭스; 항-척추 발생 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 세포소멸 유전자 조절제; 세포소멸조절제;아푸린산;아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항물질; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루트아미드; 비산트렌; 비사지리디닐스페르민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭스이민;칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카복스아미드-아미노-트리아졸; 카복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골조직 유도된 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나제 억제제(ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로를른스; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜동족체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 동족체; 코나제닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 큐라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 사이페마이신; 사이타라빈 옥포스페이트; 세포분해 인자; 사이토스타틴; 대클릭시맵; 데시타빈; 데하이드로디뎀닌 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스페르
민; 디하이드로-5-아자시티딘; 디하이드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 듀오카마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맵; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 동족체; 에스트로겐 작용물질; 에스트로겐 길항물질; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 하이페리신; 이반드론산;이다루비신; 요오독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩티드; 인슐린 형 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 작용물질; 인터페론; 인터류킨; 요오벤구안; 요오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키노리드; 카할랄리드F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸;백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 동족체; 친치성 디사카라이드 펩티드; 친지성 백금 화합물; 리소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신;로메트렉솔;로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 분해성 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제;메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 잘못 짝지워진 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 동족체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론성 항체, 인간 융모막 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A +마이오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제인자 1-기재 요법; 머스타드 항암제; 마이카페록사이드 B; 마이코박테리움 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손 + 펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라시팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화 질소 조절제; 니트록사이드 산화방지제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 시토킨 유도인자; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사유노마이신; 패클리탁셀; 패클리탁셀 동족체; 패클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 페르플루브론; 페르포스파미드; 페릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성인자 억제제; 백금 착체; 백금 화합물; 백금-트리아민 착체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 억제제; 단백질 A-기재 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 미크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 공액물; raf 길항물질; 랄티트렉시드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핑골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 유사물질; 세무스틴; 노화 유도된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 억제제; 신호 전달 조절제; 단일쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포식산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 간세포 억제제; 간-세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 설피노신; 과활성 혈관작용 장 펩티드 길항물질; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코스아미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로메라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 유사물질; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용물질; 티모트리난;갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포텐트 간세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸유리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나제 억제제; 트리포스틴; UBC 억제제; 유베니멕스; 비뇨생식기 강-유래된 성장 억제 인자;유로키나제 수용체 길항물질; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레졸; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머가 있다. 바람직한 추가의 항암 약물은 5-플루오로우라실 및 류코보린이다.
특정 유효 성분에 사용되는 특정한 투여 경로의 적합성은 유효 성분 자체(예를 들어 상기를, 혈류에 도입되기 전에 분해되지 않고 경구 투여할 수 있는가의 여부) 및 치료되는 질병에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 피부 또는 노출된 점막조직 상의 종양의 치료는 하나 또는 2 개의 유효 성분 모두를 국소, 경피 또는 점막을 통해(예를 들어 코, 설하, 볼, 직장 또는 질에 의해) 투여하는 경우 보다 효과적일 수 있다. 체 내에서의 종양의 치료, 또는 몸의 한 부분에서 또 다른 부분으로 확산될 수 있는 암의 예방은 하나 또는 2 개의 유효 성분 모두를 경구 또는 비경구 투여하는 경우 보다 효과적일 수 있다. 유사하게, 비경구 투여는 질병의 급성 치료에 바람직할 수 있는 반면, 경피 또는 피하 투여 경로는 질병의 만성적인 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자성 나노입자 클러스터의 제조
1) 길이 별 DNA 주형 제작
세 가지 다른 길이의 DNA 주형 제작을 위하여, 먼저 기본 단위가 되는 약 100bp 길이의 block DNA를 합성하였다. Block DNA는 7개의 징크핑거 결합 사이트(zinc finger binding site)를 갖도록 디자인 하였다. 각각 2, 4, 8개의 반복된 block DNA를 가지는 서열번호 1~3의 251bp, 437bp 및 809bp 길이의 DNA를 효율적으로 제작하기 위해 제한효소 처리와 라이게이션(ligation)을 이용하였다.
상기 DNA 서열에 대한 부가 설명으로, 도 1b에 나타낸 바와 같이 하늘색은 7개 징크핑거 결합 위치 (밑줄 표시, 9개 염기 서열)를 나타내며 4개의 무작위 염기 서열이 각 징크 핑거 결합 위치 사이에 분포한다. 빨간색은 NdeI 제한 효소 인식 서열; 회색은 XhoI 제한 효소 인식 서열; 노란색은 SalI 제한 효소 인식 서열; 파란색은 EcoRI 제한 효소 인식 서열을 나타낸다. 이탤릭체는 어댑터 서열로 클로닝에 필요한 제한 효소 인식 서열 (볼드체) 이 포함되어 있다.
보다 구체적으로, 각각 5' 혹은 3' 말단에 Nde I 효소 인식 서열을 가진 두 DNA block을 PCR로 합성한 뒤 Nde I 효소 처리하였다. 처리한 두 DNA block은 라이게이션을 통해 서로 결합되었으며 원하는 크기의 결합된 DNA는 아가로즈 젤(agarose gel)을 통해 확인한 뒤 젤에서 추출하였다. 추출된 DNA는 각각 5' 말단에 Nco I과 3' 말단에 BamH I 인식 서열을 갖게 PCR한 뒤 pBEL118N 파지미드(phagemid)에 클로닝하였다. 최종적으로 251bp 길이의 DNA 주형은 만들어진 파지미드를 주형으로 하는 PCR을 통해 얻어졌다. 다음으로, 437bp 길이의 DNA 주형은 251bp를 주형으로 동일한 과정을 위와 같이 거쳐서 얻었다. 이때는, Xho I 인식 서열을 ligation에 이용하였다. 809bp 길이의 DNA 주형 또한 437bp DNA를 주형으로 사용하여 위와 동일한 과정을 거쳤으며 Sal I 인식 서열을 도입하였다.
2) N 말단에 biotin이 수식화된 징크핑거 단백질의 발현과 정제
QNK-QNK-RHR로 명명되는 징크핑거 단백질(서열번호 4)의 유전자(서열번호 5)를 합성하여 5' 말단에 Nde I 인식 서열을, 3' 말단에 Xho I 인식 서열을 도입하는 PCR을 진행하였다. 특히, N 말단에는 시스테인이 들어있는 아미노산 링커를 도입하였다. 만들어진 유전자는 pET21a 벡터(vector)에 클로닝하였으며 BL21(DE3) 형질전환 세포(competent cell)에 heat shock 방법으로 transformation하였다.
징크핑거 단백질의 발현을 위해 유전자가 transformed된 세포의 단일 콜로니(single colony)를 10mL의 LB 배지에 접종하여 12시간 이상 배양하고, 배양한 세포를 1L 배지에 1/100의 비율로 다시 접종하여 37 ℃에서 3시간을 더 배양하였다. 세포의 600nm 파장대에서의 광학밀도(optical density)가 0.6에 도달할 때 쯤, IPTG와 ZnSO4를 각각 0.5mM과 0.2mM이 되게끔 추가적으로 넣어주었다. 이 후, 18℃에서 20시간 더 배양해주었고 최종적으로 세포는 원심분리기에서 6000g 세기로 얻어졌다. 얻어진 세포는 30mL lysis 완충액 (20mM Tris-Cl, 0.2 mM ZnSO4, 및 2mM β-mercaptoethanol, pH 7.5)으로 풀어주어 음파처리(sonication)하였다. 원심분리를 통해 단백질이 존재하는 상등액을 분리한 뒤, 니켈이 고정된 컬럼(GE Healthcare, USA)으로 히스티딘 택(histidine-tag)이 달린 징크핑거 단백질을 정제하였다. 추후 N 말단의 바이오틴 수식화를 위해 50 mM HEPES 완충액 (150mM NaCl, 0.2mM ZnSO4, 및 2mM TCEP)으로 완충액 교환을 해준 뒤 말레이미드-펙-바이오틴(maleimide-PEG2-biotin)을 단백질 대비 10배 과량 반응시켜주었다. 단백질에 결합하지 않고 남아있는 바이오틴은 PD-10 컬럼으로 제거해주었다.
최종적으로 얻어진 단백질의 분석은 폴리아크릴아미드겔전기영동(PAGE)으로 하였고, 바이오틴 결합 에세이(biotin binding assay, HABA; Sigma-Aldrich) 결과 단백질에 바이오틴 분자가 약 1:1 비율로 결합한 것을 확인하였다. 정제된 단백질은 사용하기 전 -70℃에 보관하였다.
3) 표면에 neutravidin이 수식된 자성 나노입자의 제조
뉴트라비딘이 수식된 자성 나노입자의 합성을 위하여, 15 nm의 DSPE-펙-메톡시(DSPE-PEG2000-methoxy)와 DSPE-펙-바이오틴(DSPE-PEG3400-biotin)이 95:5 비율로 코팅된 iron oxide 자성 나노입자를 뉴트라비딘으로 컨쥬게이션 시켰다.
먼저 15nm 크기의 초상자성(superparamagnetic) iron oxide 나노입자는 종래기술에 따라 합성하였다(J. Cheon, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 1234~1238).
자성 나노입자 대비 200배의 neutravidin(Pierce Chemical)을 50 mM borate 완충액(pH 8.3)에 1시간 동안 가하고 분자량 컷오프(cut-off)가 100kD인 원심분리용 필터(centrifugal filter)를 이용하여 3회 여과하여 반응하지 않은 뉴트라비딘를 제거하였다. 브레드포트 정량 방법(Bradfordassay method)에 의해 자성 나노입자에 컨쥬게이션된 단백질을 계산한 결과, 200 개의 뉴트라비딘 분자가 자성 나노입자에 고정화된 것으로 예상되었다.
4) NPCs의 제조
자성 NPCs를 제조하기 위하여, 20nM 농도의 DNA 주형에 징크핑거 결합 사이트 개수 대비 10배 과량의 바이오틴 표지화된 징크핑거를 반응시켰다. 징크핑거-DNA 복합체의 안정성을 위하여 BSA를 최종 농도 0.01mg/ml로 반응에 첨가하였다. 30분 상온에서 반응 후, 복합체를 이루지 않은 징크핑거는 분자량 컷오프(cut-off)가 30kD인 원심분리용 필터(centrifugal filter)를 이용하여 제거하였다. 얻어진 복합체를 다시 200nM 농도의 뉴트라비딘 코팅된 자성 나노입자와 4℃에서 12시간 이상 컨쥬게이션 하였다.
높은 순도의 자성 나노입자 클러스터를 정제하기 위하여, 밀도 구배 원심분리를 이용하였다. 보다 구체적으로, gradient maker를 이용하여 30~60% 농도 구간을 가지는 글리세롤(glycerol)을 만들어 자성 나노입자 기준 400nM 농도의 자성 NPCs를 로딩하였다. 원심분리는 초원심분리기(Beckman Coulter XL-100 ultracentrifuge, SW 55 Ti rotor)로 5000rpm에서 12시간 진행하였다. pellet 형태로 얻어진 NPCs는 징크핑거 보관 완충액으로 다시 풀어주었고 수용액 상의 글리세롤은 투석을 통해 제거되었다.
5) DNA 주형 길이에 따른 크기 조절된 NPCs의 형성 확인
상기 실시예에서 제조된 DNA 주형 길이에 따른 크기 조절된 NPCs의 분석을 위하여 상기 실시예에서와 같이 세 가지 다른 길이의 DNA 주형을 사용하였다. 제작된 DNA 주형은 길이가 각각 251bp, 437bp 및 809bp인 것을 사용하였다. 분석은 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM, JEOL JEM-2100F)을 사용하여 NPCs의 이미지를 관측하였다.
300 메쉬 carbon-coated grid위에 DNA 길이 별 NPCs의 각 용액을 떨어드리고 상온에서 60분간 건조한 후 TEM image를 얻어 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3의 (a)에서 확인할 수 있듯이 NPCs의 형성이 명확하게 관측되었으며 그 크기와 형태는 DNA 주형의 길이에 따라 잘 조절되어 만들어짐을 알 수 있었다. 도 4의 (b)는 380개 이상의 NPCs를 TEM 이미지 상에서 분석하여 크기 분포도를 표현한 히스토그램(histogram)이다. DNA 주형의 길이가 251bp에서 809bp로 증가할수록 분포도의 최고점(peak)이 오른쪽으로 옮겨 감을 관찰하였다. 평균적으로 DNA 주형에 결합한 자성 나노입자의 개수를 분석한 결과, 가장 짧은 길이의 DNA 주형에서부터 2.9±0.9개, 5.8±1.3개 및 11.6±2.0개의 결과가 나왔다. 이는 이론적으로 예상되는 수치인 3, 6 및 12와 잘 맞았으며 이를 통해 상기 NPCs의 제조 방법이 크기가 잘 조절되게 제조할 수 있는 방법임이 증명되었다.
실시예 2: 제작된 NPCs의 초기 단계 응용
1) 자성 NPCs의 MR 조영 효과 측정
상기 실시예에서 제조된 NPCs의 T2 강조영상 MRI 조영제로의 응용 가능성을 확인하기 위하여, NPCs의 T2 이완율을 측정하고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 이 때, 809bp 길이의 DNA 주형으로 만든 NPCs를 측정에 사용하였다.
T2 relaxation time을 측정하기 위하여, 12-채널 헤드 매트릭스 리시버 코일(12-channel head matrix receiver coil)의 3T MRI (Siemens Magnetom Verio, Germany)로 하기 변수를 사용하여 MR 이미징 실험을 실시하여 NPCs 샘플의 T2-강조 MR 이미지(T2-weighted MR image)를 측정하였다; spin echo mode; section thickness = 10mm; echo time (TE) = 7.8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 70, 100ms; repetition time (TR) = 5,000 ms; number of average = 1.
도 4에서 Feridex는 비교를 위하여 대조군으로서 T2 relaxation을 측정한 결과이다. 도 4에서 확인할 수 있듯이 NPCs의 T2 relaxation rate은 Feridex에 비해 3배 높은 T2 이완률을 보여 Feridex보다 향상된 조영효과의 성질을 나타냄을 보여주었다. 이는 T2 강조 영상(도 4의 영상 이미지)에서도 동일한 결과를 나타내었다. Fe 농도가 0.18 mM에서 측정하였을 때, Feridex에 비해 향상된 조영효과로 인해 NPCs에서는 보다 어두운 영상을 관찰 할 수 있었다.
2) 자성 NPCs의 세포 표적화 및 세포 내 전달 확인
NPCs의 또 다른 응용으로 세포내 표적화를 통한 전달을 위한 세포 실험이 진행되었다. 이를 위해 NPCs를 제작하는데 사용되는 자성 나노입자의 코팅에 DSPE-PEG5000-folate을 1%로 추가하였다. 엽산(folate)은 특정세포의 표적화를 위해 사용되었다. 또한 NPCs의 세포내 전달을 관찰하기 위하여 DNA 주형에 끼어들어가는 염색제인 YOYO-1 염색제를 사용하였다.
엽산 수용체가 과발현된 HeLa 세포 10,000 마리를 24시간 배양한 뒤, 세포에 0.1nM의 염색제 표지된 자성 NPCs를 4시간 처리하였다. 처리 뒤, DPBS 완충액으로 3번 씻어주고 DAPI로 핵염색을 시도하였다. Fix된 세포는 LSM 780 confocal microscope system (Zeiss, Germany) 현미경 장비로 400배 비율로 관찰하였다(도 5).
관찰 결과, 엽산이 노출되어있는 NPCs는 HeLa 세포에 잘 들어감을 확인하였다. YOYO-1의 녹색형광이 세포내에 잘 보임을 관찰 할 수 있었다. 그와는 반대로 엽산이 노출되어있지 않은 대조군 NPCs를 처리한 세포에는 녹색형광이 보이지 않는 것으로 보아 세포내 전달이 이루어지지 않은 것을 알 수 있었다. 마찬가지로 아무 것도 처리하지 않은 세포 역시 형광을 전혀 관찰할 수 없었다. 이 결과를 통해 엽산이 컨쥬게이션 된 NPCs가 수용체를 매개로 하는 특이적 세포내 전달이 이루어짐을 명확하게 증명하였다. 특히 기존 염색제의 화학적 결합이 아닌 DNA에 끼어들어가는 염색제를 대량으로 탑재하며 손쉽게 이용할 수 있다는 점에서 괄목할 만한 점이라 할 수 있다. 또한 이를 통해 NPCs를 이용한 세포의 MRI와 형광 이미징 두 가지가 동시에 가능함을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 의하면 나노입자 클러스터의 제작에 화학적 방법 대신 징크핑거 단백질을 이용하여 DNA 주형의 길이에 따라 크기를 조절할 수 있으므로, 다양한 나노입자에 적용 가능하고 질병·진단 치료와 이미징을 비롯한 다양한 분야에 응용할 수 있다.
전자 파일 첨부하였음.

Claims (28)

  1. 다음 단계를 포함하는 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터의 제작방법;
    (a) 제1 결합물질이 수식되어 있는 징크핑거 단백질에 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형을 결합시켜 징크핑거-DNA 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 징크핑거-DNA 복합체와 제2 결합물질로 수식된 나노입자를 결합시켜 나노입자에 징크핑거-복합체가 결합되어 있는 나노입자 클러스터를 형성시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 징크핑거-DNA 복합체는 하나 이상의 징크핑거 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하는 DNA 블록이 제한효소 인식부위를 가지는 링커로 2개 이상 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 Fe2O3, Fe3O4, Zn2+ 및 Mn2+으로 구성된 군에서 선택되는 자성입자가 도핑된 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자 및 양자점으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 징크핑거 단백질은 QNK-QNK-RHR, Cys2His2, Gag 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 징크 리본, Zn2/Cys6 및 TAZ2 도메인양(TAZ2 domain like)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 다양한 형태의 DNA 오리가미(origami)를 포함하는 DNA 구조체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 징크핑거 단백질은 QNK-QNK-RHR이고, 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열은 "GAGGCAGAA"인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 결합물질과 제2결합물질은 서로 결합할 수 있는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제1 결합물질은 바이오틴이고, 제2 결합물질은 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 및 캡트아비딘(captavidin)으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제1 결합물질은 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 및 캡트아비딘(captavidin)으로 구성되는 군에서 선택되는 것이고, 제2 결합물질은 바이오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 징크핑거 단백질과 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 DNA 주형과 징크핑거 단백질이 결합된 징크핑거-DNA 복합체와 나노입자가 결합되어 있는 나노입자 클러스터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 DNA는 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  14. 제12항에 있어서, 상기 징크핑거-DNA 복합체는 하나 이상의 징크핑거 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  15. 제12항에 있어서, 상기 DNA는 하나 이상의 징크핑거 결합 서열을 함유하는 DNA 블록이 제한효소 인식부위를 가지는 링커로 2개 이상 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  16. 제12항에 있어서, 상기 나노입자는 Fe2O3, Fe3O4, Zn2+ 및 Mn2+으로 구성된 군에서 선택되는 자성입자가 도핑된 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자 및 양자 점으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  17. 제12항에 있어서, 상기 징크핑거 단백질은 QNK-QNK-RHR, Cys2His2, Gag 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 징크 리본, Zn2/Cys6 및 TAZ2 도메인양(TAZ2 domain like)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  18. 제12항에 있어서, 상기 DNA는 다양한 형태의 DNA 오리가미(origami)를 포함하는 DNA 구조체인 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  19. 제12항에 있어서, 상기 징크핑거 단백질은 QNK-QNK-RHR이고, 상기 징크핑거 단백질에 특이적으로 결합하는 서열은 "GAGGCAGAA"인 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  20. 제12항에 있어서, 징크핑거-DNA 복합체에 자성나노입자사이의 결합은 아비딘-바이오틴 결합, 핵산-핵산의 상보적 결합, 단백질-단백질 결합 및 리간드-리셉터 결합으로 구성된 군에서 선택되는 결합으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노입자 클러스터.
  21. 제12항의 나노입자 클러스터를 함유하는 조영제 조성물.
  22. 제12항의 나노입자 클러스터에 세포표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 세포표적용 나노입자 클러스터.
  23. 제22항에 있어서, 세포표적물질은 엽산인 것을 특징으로 하는 세포표적용 나노입자 클러스터.
  24. 제23 항의 세포표적용 나노입자 클러스터를 함유하는 세포표적용 조성물.
  25. 제12항의 나노입자 클러스터에 암세포 표적물질이 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 나노입자 클러스터.
  26. 제25항의 암 진단용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 진단용 조성물.
  27. 제12항의 나노입자 클러스터에 암세포 표적물질이 수식되어 있고, 암 치료제가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 암 치료용 나노입자 클러스터.
  28. 제27항의 암 치료용 나노입자 클러스터를 함유하는 암 치료용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110085987A1 (en) * 2009-10-08 2011-04-14 Kaohsiung Medical University Folic acid-mediated magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110085987A1 (en) * 2009-10-08 2011-04-14 Kaohsiung Medical University Folic acid-mediated magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications
KR20110071336A (ko) * 2009-12-21 2011-06-29 고려대학교 산학협력단 금 나노입자 클러스터 및 그 제조 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDHARIYA, N. ET AL.: "Folic Acid Conjugated Magnetic Drug Delivery System for Conteolled Release of Doxorubicin", J. NANOPART. RES., vol. 15, 2013, pages 1 - 12 *
KATZ, E. ET AL.: "Integrated Nanoparticle-Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 34, 2004, pages 6042 - 6108 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107630067A (zh) * 2017-08-10 2018-01-26 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 基于dna折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点

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