CN107630067A - 基于dna折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点的方法，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化及信号采集位点。该方法通过利用一种三角形DNA折纸做为介质，同时连接荧光分子和酶，通过折纸所携带荧光分子与催化生成的产物荧光分子的共定位，进而确定酶催化位点及信号采集位点。利用折纸可寻址的特点，将酶与荧光指示位点集中在局限的尺寸中，进而固定在界面上，便于观测。利用折纸荧光与产物荧光的共定位，确定酶催化的位点，简化了确定荧光信号的步骤，便于快速锁定荧光信号收集位点。

Description

基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点

技术领域

本发明涉及一种进行单分子观测时确定酶催化位点的方法，具体涉及一种基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，以三角形DNA折纸为介质，同时连接荧光分子和酶，进而确定酶催化位点及信号采集位点的方法。本发明属于单分子化学领域。

背景技术

酶可以特异的增强催化反应的速率，传统的酶学研究可以测定酶的反应常数，是一种整体平均的测定方法。然而对于酶催化过程中酶构象的变化，特别是酶与底物作用的相互过程，传统的方法很难测定。单分子荧光显微技术的出现极大的弥补了这一缺陷，通过实时记录单个酶分子催化的荧光信号的变化，可以反映酶与底物作用过程的差异及其所处微纳环境的相互作用，得到隐藏在整体水平下单个酶分子的催化动态。采用单分子荧光的方法主要观测反应过程荧光信号强度的变化，然而在待观测物修饰到界面时，往往引入大量杂质，与溶液中许多分子在较强激光照射下会产生荧光，虽然在这些荧光可以很快淬灭，但在在一定程度上对所需观测的信号产生较强的干扰，需要对荧光进行筛选，花费大量精力（Nature），因此急需一种较为简单快速的方法对酶的催化位置进行确定。

DNA折纸是一种近些年受到广泛关注的DNA组装方式，它利用一条长的单链M13DNA与数百条与之互补较短的单链通过退火的方式在高盐浓度下组合成特定的图形，具有形状大小可控，位置可寻址，易于修饰的优点。将DNA折纸应用于构建研究单分子酶催化的定位将提高荧光信号的识别能力，快速酶的催化位点，具有较强的研究和应用价值。

发明内容

本发明针对现有单分子实验中确定酶催化位点时存在的问题，提供一种基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，提出利用DNA折纸开发一种快速确定酶催化的位点及所需荧光信号方法。

本发明原理是：通过将酶与荧光分子共同修饰在同一DNA折纸上，通过荧光分子与产物荧光的共定位，可确定酶的催化位点。

在本发明的技术方案中，一种基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，将酶与荧光分子同时修饰在DNA折纸上，并利用DNA折纸作为媒介固定在玻片上，追踪不同通道下荧光分子确定酶的位点，同时追踪信号位点，当二者可以共定位时，即确定酶催化位点及催化信号采集位点，包括以下步骤：

（1）酶与DNA进行连接：将酶与连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）以一定比例混合25℃孵育2hr后，超滤洗去过量的SPDP；随后SPDP修饰的酶的与巯基修饰的DNA 1以一定比例均匀25℃孵育过夜，后采用超滤洗去过量的DNA，得到酶与DNA 1的复合物；

（2）折纸合成：将带有荧光链的替换链DNA 2，生物素修饰的替换链DNA 4~6，与DNA 1部分互补的替换链DNA 3与原有DNA订书钉链以等量的比例混合均匀，并随后以一定比例与M13单链在1×TAE-Mg²⁺溶液体系中通过PCR退火，形成DNA折纸结构，形成的折纸结构采用超滤洗去过量订书钉链；

（3）酶与折纸的组装：将酶-DNA稀释，以一定比例在与DNA折纸混合均匀，于PCR仪中缓慢退火形成，形成酶-折纸组装体；

（4）玻片上固定：酶-折纸组装体稀释至一定浓度后，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间后，缓冲液冲洗干净过量复合物；

（5）利用单分子荧光显微镜确定催化及信号采集位点：在玻片上滴加100 μL反应液，反应液包括一定浓度的过氧化氢及Amplex Red；首先激光激发折纸上所带荧光，随后更换激光通路，激发催化产物荧光，通过二者共定位确酶催化的位点及信号采集的位点。

所采用的缓冲液为本领域常规缓冲溶液，酶修饰DNA及催化反应时优选的缓冲溶为pH=7.4、100 mM KCl、10 mM 1×PBS磷酸盐缓冲液，折纸合成及与酶组装时优选的缓冲液为pH=8.0、40 mM Tris-乙酸、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl₂ 1×TAE-Mg²⁺溶液。

所述的酶为催化Amplex Red生成荧光产物试卤灵（resorufin）的生物酶和G-四联体DNA酶，其中生物酶优选的为本领域常规的辣根过氧化物酶HRP，DNA酶为G-四联体DNA序列，优选的为DNA序列表中序列DNA 8；

所述的生物酶与SPDP的孵育比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为1:20；

所述的SPDP修饰的生物酶与巯基DNA 1的连接比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为1:10。

在上述方案基础上，所述的Amplex Red 浓度范围控制在100-200 nM，优选的浓度为100 nM。

所述的DNA折纸可以为本领域常规的不同形状的DNA折纸，更佳的为三角形DNA折纸，最佳的边长为130 nm；

所述的长链单链DNA可以为本领域常规的长链，较佳的为M13mp18单链DNA；

所述的较佳的折纸组装方式包括以下步骤：将单链M13mp18与所述订书钉链DNA混合于1×TAE-Mg²⁺缓冲溶液中，在PCR仪中从90℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s；

所述的DNA折纸序列可以为本领域常规的序列，优选的为2010年2月17日发表在J. AM.Chem. Soc. 第132卷第10期第3248-3249页的题为Gold nanoparticle self-similarchain structure organized by DNA origami的论文的Supporting Online Infromation中的S11-S16页所记载的从A01至Loo的DNA序列；

荧光分子链为DNA 2，与DNA 2 互补的替换链DNA 3为的A36的5’末端延长的碱基，生物素替换链DNA 4~6为序列A62、B62、C62的5’ 末端修饰的碱基，与DNA 1部分互补的替换链DNA 7为序列B59的5’末端延长的碱基；优选的DNA序列见DNA序列表。

所述的超滤方法可以为本领域常规的方法，其中超滤过量SPDP及巯基DNA采用Thermo公司0.5 mL 30 KD超滤管，超滤折纸过量DNA采用Thermo公司0.5 mL 100 KD超滤管，优选的超滤条件为，将所述与SPDP孵育的酶溶液、与巯基DNA孵育的SPDP-酶复合物机及折纸溶液在放入超滤管内槽，4℃3000g超滤 10分后，弃去多余废液，重新补足缓冲液后，重复以上超滤过程3次，最后1000g超滤10分钟回收纯化的酶-SPDP复合物、酶-DNA复合物及DNA折纸。

所述的酶-DNA1的复合物与DNA折纸的孵育比例5:1-20:1，优选的浓度为10:1；二者组装的方式优选的为2013年3月13日发表在J. AM. Chem. Soc. 第134卷第12期第5516-5519页的题为Interenzyme substrate diffusion for an enzyme cascade organizedon spatially addressable DNA nanostructures的论文的Supporting OnlineInfromation中的S2-S3页所记载的退火方法。

所述的酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的玻片的孵育浓度可以为10^-10 ~10^-12，优选的浓度为为10^-11；

所述的链霉亲和素修饰的盖玻片步骤参考2008年5月29日发表在Nature Methods第5期第6卷第507-516页的题为A practical guide to single-molecule FRET的论文Supporting Online Information中的S6所记载的修饰方法；

所述的酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的盖玻片的孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为10 min。

所述的单分子荧光显微镜为本领域常规显微镜，优选的为全内反射荧光显微镜。所述的单分子荧光显微镜成像参数可以为本领域常规的参数，较佳的488、561 nm激光控制在5 %左右，较佳的曝光时间控制在30-50 ms。所述的单分子荧光显微镜成像条件可以为本领域常规的条件，较佳的成像温度控制在20 ℃左右，所述成像的湿度控制在50 %以下。

所述的确定催化位点时，首先利用atto-488荧光分子确定酶所在的位置，之后更改激光在561 nm处激发产物荧光，利用显微镜将二者共定位，即可初步判定酶催化生成的产物位置，确定荧光信号采集。

该方法利用一种三角形DNA折纸做为介质，同时连接荧光分子和酶，通过折纸所携带荧光分子与催化生成的产物荧光分子的共定位，进而确定酶催化位点及信号采集位点。利用折纸可寻址的特点，将酶与荧光指示位点集中在局限的尺寸中，进而固定在界面上，便于观测。利用折纸荧光与产物荧光的共定位，确定酶催化的位点，简化了确定荧光信号的步骤，便于快速锁定荧光信号收集位点。

附图说明

图1为实施案例1中HRP酶的催化位点荧光成像图；

图2为实施案例1中HRP酶生成产物的荧光成像图；

图3为实施案例1中HRP酶的催化位点与荧光产物的共定位成像图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1

HRP与巯基DNA 1连接：100 μl HRP（2 μM）与SPDP以1:20比例在1 × PBS缓冲液中室温孵育2 hr。过量的SPDP用30 kD超滤管离心洗涤（3000g，10 min）三次后，1000g 超滤10分钟回收溶液，紫外定量。SPDP-修饰的HRP与10倍过量的巯基-DNA在1 × PBS缓冲液中室温孵育过夜。通过测定343 nm处吸光值的变化进行定量HRP与DNA的连接比例。最后多余的DNA通过离心超滤的方法去除（3000g，10 min，三次），1000g 超滤10分钟回收溶液，得到复合物Ⅰ。

DNA折纸合成：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~7）混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 8) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸。

酶与折纸的组装：HRP-DNA与折纸以浓度比10:1的比例在1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液中混匀，随后混合液在PCR仪中从37℃退火至4℃，得到酶与折纸组装体。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂ 吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

复合物Ⅱ固定：链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，将50 μ复合物Ⅱ稀释至10 pM，25 ℃孵育10 min后（注意避光），1×PBS缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（100 nM Amplex Red，1 μMH₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，488、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用488 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

图1为实施案例1在488 nm激光激发下的荧光成像图，由图1可以推断单个HRP酶所在的催化位置。图2为实施案例1在561 nm激光激发下的荧光成像图，由图2可以潜在观测产物生成的位置。图3为实施案例1中HRP酶的催化位点与荧光产物的荧光共定位成像图，箭头代表可发生共定位的位点，由图3可初步判定产物的位置，排除溶液中一些随机荧光分子的干扰。

实施例2

HRP与巯基DNA 1连接：100 μl HRP（2 μM）与SPDP以1:20比例在1 × PBS缓冲液中室温孵育2 hr。过量的SPDP用30 kD超滤管离心洗涤（3000g，10 min）三次后，1000g 超滤10分钟回收溶液，紫外定量。SPDP-修饰的HRP与10倍过量的巯基-DNA在1 × PBS缓冲液中室温孵育过夜。通过测定343 nm处吸光值的变化进行定量HRP与DNA的连接比例。最后多余的DNA通过离心超滤的方法去除（3000g，10 min，三次），1000g 超滤10分钟回收溶液，得到复合物Ⅰ。

DNA折纸合成：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~7）混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 7.3) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸。

酶与折纸的组装：HRP-DNA与折纸以浓度比10:1的比例在1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液中混匀，随后混合液在PCR仪中从37℃退火至4℃，得到酶-折纸复合物。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂ 吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

复合物Ⅱ固定：链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，将50 μL复合物Ⅱ稀释至10 pM，25 ℃孵育10 min后（注意避光），1×PBS缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（200 nM Amplex Red，1 μMH₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，488、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用488 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

实施例3

一步法完成DNA酶与折纸共修饰：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~7）及10倍过量含有DNA酶的单链DNA 6混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 7.3) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸，得到复合物3。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

将50 μL复合物Ⅲ稀释至50 pM，与50 pM血晶素（hemin）以1:1的比例混合均匀，25℃孵育20 min，得到复合物Ⅳ。链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，之将100μL复合物Ⅳ滴加在样品池中，25 ℃孵育10 min后（注意避光），缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（200 nM Amplex Red，1 μMH₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，488、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用488 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点

<160>8

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<222>28

<223>3'端巯基修饰

<400>tttttttttt tttttttttt tttttttt

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<222>28

<223>3'端修饰atto-488荧光分子

<400>tacgagttga gaatcctgaa tgcgtttt

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

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<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

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<223>5'端生物素修饰

<400>tttcagctaa aaaaggtaaa gtaatt

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>5'端生物素修饰

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>5'端生物素修饰

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<212>DNA

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<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>tttttttttt tttttttttt ttttttttgg gtagggcggg ttggga

Claims (10)

1.基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，将酶与荧光分子同时修饰在DNA折纸上，并利用DNA折纸作为媒介固定在玻片上，追踪不同通道下荧光分子确定酶的位点，同时追踪信号位点，当二者可以共定位时，即确定酶催化位点及催化信号采集位点，包括下述步骤：

（1）酶与DNA进行连接：将酶与连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）以一定比例混合25℃孵育2hr后，超滤洗去过量的SPDP；随后SPDP修饰的酶的与巯基修饰的DNA 1以一定比例均匀25℃孵育过夜，后采用超滤洗去过量的DNA，得到酶与DNA 1复合物；

（2）折纸合成：将带有荧光链的替换链DNA 2，生物素修饰的替换链DNA 4~6，与DNA 1部分互补的替换链DNA 3与原有DNA订书钉链以等量的比例混合均匀，并随后以一定比例与长链单链DNA M13单链在1×TAE-Mg²⁺溶液体系中通过PCR退火，形成DNA折纸结构，形成的折纸结构采用超滤洗去过量订书钉链；

（3）酶与折纸的组装：将酶-DNA1稀释，以一定比例再与DNA折纸混合均匀，所述的酶-DNA复合与DNA折纸的孵育比例5:1-20:1，于PCR仪中缓慢退火形成，形成酶-折纸组装体；

（4）玻片上固定：酶-折纸组装体稀释至一定浓度后，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间后，酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的玻片的孵育浓度为10^-10 ~10^-12，缓冲液冲洗干净过量复合物；

（5）利用单分子荧光显微镜确定催化及信号采集位点：在玻片上滴加100 μL反应液，反应液包括一定浓度的过氧化氢及Amplex Red；首先激光激发折纸上所带荧光，随后更换激光通路，激发催化产物荧光，通过二者共定位确酶催化的位点及信号采集的位点。

2.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于，酶修饰DNA及催化反应时优选的缓冲溶为pH=7.4、100 mM KCl、10 mM 1×PBS磷酸盐缓冲液；折纸合成，及酶与折纸组装时优选的缓冲液为pH=8.0、40 mM Tris-乙酸、1 mMEDTA、12.5 mM MgCl₂ 1×TAE-Mg²⁺溶液。

3.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于所述的酶为催化Amplex Red生成荧光产物试卤灵（resorufin）的生物酶和G-四联体DNA酶，所述的Amplex Red 浓度范围控制在100-200 nM，其中，生物酶优选的为辣根过氧化物酶HRP，G-四联体DNA酶为序列表中序列DNA 8；

所述的生物酶与SPDP的孵育比例优选的为1:20；

所述的SPDP修饰的生物酶与巯基DNA 1的连接比例优选的为1:10。

4.根据权利要求3所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于，所述的Amplex Red 浓度优选的为100 nM。

5.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于，所述的折纸合成中，所述的DNA折纸优选的为三角形DNA折纸，最佳的边长为130 nm；

所述的长链单链DNA优选的为M13mp18单链DNA；

优选的折纸组装方式包括以下步骤：将M13mp18单链DNA与所述订书钉链DNA混合于1×TAE-Mg²⁺缓冲溶液中，在PCR仪中从90℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s；

荧光分子链为DNA 2，与DNA 2 互补的替换链DNA 3为的A36的5’末端延长的碱基，生物素替换链DNA 4~6为序列A62、B62、C62的5’ 末端修饰的碱基，与DNA 1部分互补的替换链DNA 7为序列B59的5’末端延长的碱基；优选的DNA序列见DNA序列表。

6.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于，超滤过量SPDP及巯基DNA采用Thermo公司0.5 mL 30 KD超滤管；超滤折纸过量DNA采用Thermo公司0.5 mL 100 KD超滤管，优选的超滤条件为，将所述与SPDP孵育的酶溶液、与巯基DNA孵育的SPDP-酶复合物机及折纸溶液在放入超滤管内槽，4℃3000g超滤 10分钟后，弃去多余废液，重新补足缓冲液后，重复以上超滤过程3次，最后1000g超滤10分钟回收纯化酶-SPDP复合物、酶-DNA复合物及DNA折纸。

7.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于，所述的酶-DNA1复合物与DNA折纸的孵育比例优选的浓度比为10:1。

8.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于所述的酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的玻片的孵育浓度优选的浓度为10^-11；孵育时间优选的为10 min。

9.根据权利要求1所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于所述的单分子荧光显微镜优选的为全内反射荧光显微镜，其成像参数优选的488、561nm激光控制在5 %左右，曝光时间控制在30-50 ms，成像温度控制在20 ℃左右，所述成像的湿度控制在50 %以下。

10.根据权利要求1或9所述的基于DNA折纸的单分子荧光观测下确定信号采集位点，其特征在于所述的确定催化位点时，首先利用atto-488荧光分子确定酶所在的位置，之后更改激光在561 nm处激发产物荧光，利用显微镜将二者共定位，即可初步判定酶催化生成的产物位置，确定荧光信号采集。