CN107630066A - 一种单分子条件下研究级联反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单分子条件下研究级联反应的方法，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点。本发明的优点在于利用折纸可寻址的特点，将级联酶固定在局限的尺寸中，调控中间距离，进而固定在界面上，便于观测。体系中只含有一种酶时，不会观测到荧光产物的产生，从而确保每一次荧光闪烁是由级联反应产生。

Description

一种单分子条件下研究级联反应的方法

技术领域

本发明属于单分子化学领域。具体涉及一种单分子条件下研究级联反应的方法，利用DNA折纸技术构建级联酶反应体系，研究其催化单个荧光产物的方法。

背景技术

在复杂的生物体内，重要的生化代谢反应总是有序的排列着。生物体内似乎存在着天然的选择方法来精确地调控酶分子的位置，使酶包裹在不同的细胞内进行不同的生理反应，减少细胞内不同的反应竞争造成的物质浪费并且保持各个代谢途径有效进行。生物体内的这种有序排列所导致的级联酶活性的显著增强引起科研人员的强烈兴趣，许多工作采用不同方法将级联反应的酶连在一起，并发现当两个酶距离相近时，级联反应速率显著升高。然而在这些工作并没有去除溶液中未连接的酶，所测到的是一个整体的数据，并不能反应出级联的酶的真实反应情况。

针对以上问题，本发明提出一种单分子条件下研究级联反应的方法。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种单分子条件下研究级联反应的方法，利用DNA折纸构建研究级联酶的反应体系，并通过观测其在单分子条件下催化荧光产物的生成可得到级联酶催化的真实反应速率。

在本发明的技术方案中，将酶修饰DNA后，连接在折纸的固定位点，随后利用折纸作为固定介质从而将酶连接在玻璃表面，通过观测酶级联后生成的荧光产物，得到级联酶催化的反应速率，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点，其中，

（1）所述的酶与DNA进行连接是级联酶与巯基修饰的DNA进行连接，将二种级联酶分别与连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）在PBS缓冲液中以一定比例混合25℃孵育2hr，超滤洗去过量的SPDP，随后SPDP修饰的两种酶分别与过量的巯基修饰的DNA1、DNA2在缓冲液中以一定比例混合均匀25℃孵育过夜后，后采用超滤洗去过量的DNA，得到二种酶-DNA复合物Ⅰ、Ⅱ；

（2）所述的折纸合成是将带有荧光链的替换链DNA3，生物素修饰的替换链DNA 4～6，与DNA 1～2分别部分互补的替换链DNA7～8、DNA9～10与原有DNA订书钉链以等量的比例混合均匀，并随后以一定比例与长链单链DNAM13单链在1×TAE-Mg²⁺溶液体系中通过PCR退火，形成DNA折纸结构，形成的折纸结构采用超滤洗去过量订书钉链；

（3）所述的酶与折纸的组装：是将级联酶-DNA复合物稀释，以一定比例再与DNA折纸混合均匀，级联酶-DNA复合物与DNA折纸的孵育比例为5:1-20:1，于PCR仪中缓慢退火形成，形成级联酶-折纸组装体；

（4）所述的玻片上固定：是将级联酶-折纸组装体至一定浓度后，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间，孵育浓度为10^-10 ~10^-12，然后缓冲液冲洗干净过量复合物；

（5）所述的利用单分子荧光显微镜确定催化位点：是在上述玻片上滴加100 μL反应溶液，首先激光激发折纸上所带荧光，随后更换激光通路，激发催化产物荧光，通过二者共定位确定酶催化的位点及信号采集的位点。

本发明的原理是：利用DNA折纸易于寻址的特点，将其作为反应容器，连接级联酶，调控级联酶的间距，当级联的酶间距较近时，共同连接在纳米结构上的效率受到两酶间的位阻效应大大降低，因而在一些折纸上可能只连接有一个酶分子。而当只含有一种酶时，不会观测到荧光产物的产生，从而确保每一次荧光闪烁是级联反应产生的。

所述的缓冲液为本领域常规缓冲溶液，酶修饰DNA及催化反应时优选的缓冲溶为pH=7.4、100 mM KCl、10 mM 磷酸盐缓冲液；折纸合成及与酶组装时优选的缓冲液为pH=8.0、40 mM Tris-乙酸、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl₂ 1×TAE-Mg²⁺溶液。

所述的单分子荧光显微镜为本领域常规显微镜，优选的为全内反射荧光显微镜。所述的单分子荧光显微镜成像参数可以为本领域常规的参数，较佳的488、561 nm激光控制在5 %左右，较佳的曝光时间控制在30-50 ms。所述的单分子荧光显微镜成像条件可以为本领域常规的条件，较佳的成像温度控制在20 ℃左右，所述成像的湿度控制在50 %以下。

所述的级联酶最后的酶为催化Amplex Red生成荧光产物试卤灵（resorufin）的生物酶，其中，级联酶优选的为本领域常规的葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）。

所述的生物酶与SPDP的孵育比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为1:20；所述的SPDP修饰的生物酶与巯基DNA 的连接比例为本领域常规的比例，优选的比例为1:10。

所述的DNA折纸为本领域常规的不同形状的DNA折纸，更佳的为三角形DNA折纸，最佳的边长为130 nm。

所述的长链单链DNA可以为本领域常规的长链，较佳的为M13mp18单链DNA；

所述的较佳的折纸组装方式包括以下步骤：将单链M13mp18与所述订书钉链DNA混合于1×TAE-Mg²⁺缓冲溶液中，在PCR仪中从90℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s。

所述的DNA折纸序列为本领域常规的序列，优选的为2010年2月17日发表在J. AM.Chem. Soc. 第132卷第10期第3248-3249页的题为Gold nanoparticle self-similarchain structure organized by DNA origami的论文的Supporting Online Infromation中的S11-S16页所记载的从A01至Loo的DNA序列；荧光分子链DNA 2为序列B36的5’ 末端修饰的碱基，生物素替换链DNA 4~6为序列A62、B62、C62的5’ 末端修饰的碱基，与DNA 1部分互补的替换链DNA 7~8为序列B61、B59的5’末端延长的碱基，与DNA 2部分互补的替换链DNA9~10为序列B56、B53的5’末端延长的碱基。优选的DNA序列见DNA序列表。

所述的超滤方法为本领域常规的方法，其中超滤过量SPDP及巯基DNA采用Thermo公司0.5 mL 30 KD超滤管，超滤折纸过量DNA采用Thermo公司0.5 mL 100 KD超滤管，优选的超滤条件为，将所述与SPDP孵育的酶溶液、与巯基DNA孵育的SPDP-酶复合物机及折纸溶液在放入超滤管内槽，4℃3000g超滤 10分后，弃去多余废液，重新补足缓冲液后，重复以上超滤过程3次，最后1000g超滤10分钟回收纯化的酶-SPDP复合物、酶-DNA复合物及DNA折纸。

所述的级联酶-DNA复合物与DNA折纸的孵育比例5:1-20:1，优选的浓度为10:1，二者组装的方式优选的为2013年3月13日发表在J. AM. Chem. Soc. 第134卷第12期第5516-5519页的题为Interenzyme substrate diffusion for an enzyme cascade organizedon spatially addressable DNA nanostructures的论文的Supporting OnlineInfromation中的S2-S3页所记载的退火方法。

所述的级联酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的玻片的孵育浓度可以为10^-10 ~10^-12，优选的浓度为为10^-11。

所述的链霉亲和素修饰的盖玻片步骤参考2008年5月29日发表在Nature Methods第5期第6卷第507-516页的题为A practical guide to single-molecule FRET的论文Supporting Online Information中的S6所记载的修饰方法。

所述的级联酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的盖玻片的孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为10 min。

所述的Amplex Red 浓度范围控制在100-200 nM，优选的浓度为100 nM。

在确定催化位点时，首先利用Cy5荧光分子确定酶所在的位置，之后更改激光在561 nm处激发产物荧光，利用显微镜将二者共定位，即可初步判定酶催化生成的产物位置，确定荧光信号采集。

本发明的优点在于：

（1）利用折纸可寻址的特点，将级联酶固定在在局限的尺寸中，调控中间距离，进而固定在界面上，便于观测。

（2）体系中只含有一种酶时，不会观测到荧光产物的产生，从而确保每一次荧光闪烁是由级联反应产生。

附图说明

图1为实施案例1中级联酶的催化位点荧光成像图；

图2为实施案例1中级联酶生成产物的荧光成像图；

图3为实施案例1中HRP酶的催化位点与荧光产物的共定位成像图；

图4为实施案例2中级联酶催化的荧光产物随时间变化轨迹图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1

GOx、HRP与巯基DNA 1连接：100 μl GOx、HRP（2 μM）与SPDP以1:20比例在1 × PBS缓冲液中室温孵育2 hr。过量的SPDP用30 kD超滤管离心洗涤（3000g，10 min）三次后，1000g 超滤10分钟回收溶液，紫外定量。SPDP-修饰的GOx、HRP分别与10倍过量的巯基-DNA 1、2在1× PBS缓冲液中室温孵育过夜。通过测定343 nm处吸光值的变化进行定量GOx、HRP与DNA的连接比例。最后多余的DNA通过离心超滤的方法去除（3000g，10 min，三次），1000g 超滤10分钟回收溶液，得到GOx-DNA复合物Ⅰ与HRP-DNA复合物Ⅱ。

DNA折纸合成：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~10）混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 8) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸。

酶与折纸的组装：HRP-DNA与折纸以浓度比10:1的比例在1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液中混匀，随后混合液在PCR仪中从37℃退火至4℃，得到级联酶与折纸组装体复合Ⅲ。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂ 吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

级联酶-折纸组装体固定：链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，将50 μL级复合Ⅲ稀释至10 pM，25 ℃孵育10 min后（注意避光），1×PBS缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（100 nM 葡萄糖，100 nMAmplex Red，1 μM H₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，647 nm、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用647 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

图1为实施案例1在647 nm激光激发下的荧光成像图，由图1可以推断单个级联酶所在的催化位置。图2为实施案例1在561 nm激光激发下的荧光成像图，由图2可以潜在观测产物生成的位置。图3为实施案例1中HRP酶的催化位点与荧光产物的荧光共定位成像图，箭头代表可发生共定位的位点，由图3可初步判定产物的位置，排除溶液中一些随机荧光分子的干扰。图4是级联酶反应生成的荧光信号随时间变化轨迹图。

实施例2

GOx、HRP与巯基DNA 1连接：100 μl GOx、HRP（2 μM）与SPDP以1:20比例在1 × PBS缓冲液中室温孵育2 hr。过量的SPDP用30 kD超滤管离心洗涤（3000g，10 min）三次后，1000g 超滤10分钟回收溶液，紫外定量。SPDP-修饰的GOx、HRP分别与10倍过量的巯基-DNA 1、2在1× PBS缓冲液中室温孵育过夜。通过测定343 nm处吸光值的变化进行定量GOx、HRP与DNA的连接比例。最后多余的DNA通过离心超滤的方法去除（3000g，10 min，三次），1000g 超滤10分钟回收溶液，得到GOx-DNA复合物Ⅰ与HRP-DNA复合物Ⅱ。

DNA折纸合成：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~10）混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 8) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸。

酶与折纸的组装：HRP-DNA与折纸以浓度比10:1的比例在1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液中混匀，随后混合液在PCR仪中从37℃退火至4℃，得到级联酶与折纸组装体复合Ⅲ。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂ 吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

级联酶-折纸组装体固定：链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，将50 μL级复合Ⅲ稀释至10 pM，25 ℃孵育10 min后（注意避光），1×PBS缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（500 nM 葡萄糖，100 nMAmplex Red，1 μM H₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，647 nm、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用647 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

实施例3

GOx、HRP与巯基DNA 1连接：100 μl GOx、HRP（2 μM）与SPDP以1:20比例在1 × PBS缓冲液中室温孵育2 hr。过量的SPDP用30 kD超滤管离心洗涤（3000g，10 min）三次后，1000g 超滤10分钟回收溶液，紫外定量。SPDP-修饰的GOx、HRP分别与10倍过量的巯基-DNA 1、2在1× PBS缓冲液中室温孵育过夜。通过测定343 nm处吸光值的变化进行定量GOx、HRP与DNA的连接比例。最后多余的DNA通过离心超滤的方法去除（3000g，10 min，三次），1000g 超滤10分钟回收溶液，得到GOx-DNA复合物Ⅰ与HRP-DNA复合物Ⅱ。

DNA折纸合成：20 nM的单链M13mp18 DNA与10倍过量的订书钉链（含有DNA 3~10）混合均匀，PCR退火，采用1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液(pH 8) 及100 kD 500 μL超滤管离心洗涤三次（3000 g离心，1000 g回收）洗去多余的单链DNA通过，并1000g超滤10分钟回收纯化后DNA折纸。

酶与折纸的组装：HRP-DNA与折纸以浓度比10:1的比例在1 × TAE-Mg²⁺ 缓冲液中混匀，随后混合液在PCR仪中从37℃退火至4℃，得到级联酶与折纸组装体复合Ⅲ。

链霉亲和素修饰玻片：玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液（浓硫酸：30% H₂O₂=3:1）、1 M K OH溶液中超声30 min后每一步超声后需超纯水洗净，氮气吹干。火焰灯灼烧玻片（几秒即可），以去除玻片上残留的荧光有机分子。将玻片放入新鲜配置的含有1 % 硅烷化试剂（APTES）的无水乙醇溶液中，震荡孵育1 hr，随后玻片用乙醇彻底洗涤并用超纯水冲洗，N₂ 吹干备用。0.2 mg 生物素修饰的聚乙二醇（biotin-PEG）及8 mg 聚乙二醇（mPEG）溶解于新鲜配置的0.1 M 碳酸氢纳 （Na HCO₃，pH 8.5）溶液中，随后将混合液孵育在玻片上过夜（湿盒中）。将玻片用超纯水彻底清洗，N₂吹干。将0.2 mg/mL的连酶亲和素滴加在生物素修饰的玻片上，在湿盒中孵育10 min后，用超纯水彻底冲洗干净，N₂吹干待用。

级联酶-折纸组装体固定：链霉亲和素修饰的玻片上贴上围栏后，构建样品池，将50 μL级复合Ⅲ稀释至10 pM，25 ℃孵育10 min后（注意避光），1×PBS缓冲液冲洗干净过量复合物。

观测：将玻片置于显微镜操作台上，滴加100 μL反应液（1 mM 葡萄糖，100 nMAmplex Red，1 μM H₂O₂，1×PBS缓冲液），调整单分子荧光显微镜参数，647 nm、561 nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30 ms，首先利用647 nm激发折纸所携带的荧光，确定酶的位置，之后更改561 nm激发所生产产物的荧光，二者能够共定位后可确定信号采集位置。

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种单分子条件下研究级联反应的方法

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc feature

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<223>3'端巯基修饰

<400>tttttttttt tttttttttt tttttttt

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>3'端巯基修饰

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<213>人工序列

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<223>5'端Cy5修饰

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<212>DNA

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Claims (10)

1.一种单分子条件下研究级联反应的方法，将酶修饰DNA后，连接在DNA折纸的固定位点，随后利用DNA折纸作为固定介质从而将酶连接在玻璃表面，通过观测酶级联后生成的荧光产物，得到级联酶催化的反应速率，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点，其中，

所述的酶与DNA进行连接是级联酶与巯基修饰的DNA进行连接，将二种级联酶分别与连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）在PBS缓冲液中混合25℃孵育2hr，超滤洗去过量的SPDP，随后SPDP修饰的两种酶分别与过量的巯基修饰的DNA1、DNA2在缓冲液中混合均匀25℃孵育过夜后，采用超滤洗去过量的DNA，得到二种级联酶-DNA复合物Ⅰ、Ⅱ；

所述的折纸合成是将带有荧光链的替换链DNA3，生物素修饰的替换链DNA 4～6，与DNA1～2分别部分互补的替换链DNA7～8、DNA9～10与原有订书钉链DNA以等量的比例混合均匀，并随后与长链单链DNAM13单链在1×TAE-Mg²⁺溶液体系中通过PCR退火，形成DNA折纸结构，形成的折纸结构采用超滤洗去过量订书钉链；

所述的酶与折纸的组装是将级联酶-DNA复合物稀释，与DNA折纸混合均匀，级联酶-DNA复合物与DNA折纸的孵育比例5:1-20:1，于PCR仪中缓慢退火形成，形成级联酶-折纸组装体；

所述的玻片上固定是将级联酶-折纸组装体，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间，孵育浓度为10^-10 ~10^-12，然后缓冲液冲洗干净过量复合物；

所述的利用单分子荧光显微镜确定催化位点是在上述玻片上滴加100 μL反应溶液，首先激光激发折纸上所带荧光，随后更换激光通路，激发催化产物荧光，通过二者共定位确定酶催化的位点及信号采集的位点。

2.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的酶与DNA进行连接中，PBS缓冲液为pH=7.4、100 mM KCl、10 mM 磷酸盐缓冲液；1×TAE-Mg²⁺溶液体系为pH=8.0、40 mM Tris-乙酸、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl₂ 1×TAE-Mg²⁺溶液。

3.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的单分子荧光显微镜为全内反射荧光显微镜，成像参数488、561 nm激光控制在5 %左右，曝光时间控制在30-50 ms，成像温度控制在20 ℃左右，成像的湿度控制在50 %以下。

4.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，最后的酶为催化Amplex Red生成荧光产物试卤灵（resorufin）的生物酶，浓度范围控制在100-200 nM，其中，所述的级联酶优选的为葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）；所述的生物酶与SPDP的孵育比例为1:20；所述的SPDP修饰的生物酶与巯基DNA 的连接比例为1:10。

5.根据权利要求1或4所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的超滤过量SPDP及巯基DNA采用0.5 mL 30 KD超滤管；超滤折纸过量DNA采用Thermo公司0.5mL 100 KD超滤管，超滤条件为，将所述与SPDP孵育的酶溶液、与巯基DNA孵育的SPDP-酶复合物机及折纸溶液在放入超滤管内槽，4℃3000g超滤 10分钟后，弃去多余废液，重新补足缓冲液后，重复以上超滤过程3次，最后1000g超滤10分钟回收纯化的酶-SPDP复合物、酶-DNA复合物及DNA折纸。

6.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，

所述的折纸合成中，DNA折纸为三角形DNA折纸，最佳的边长为130 nm；所述的长链单链DNA为M13mp18单链DNA，其中，折纸组装方式包括：将M13mp18单链DNA与所述订书钉链DNA混合于1×TAE-Mg²⁺缓冲溶液中，在PCR仪中从90℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s。

7.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，荧光分子链DNA 2为序列B36的5’ 末端修饰的碱基，生物素替换链DNA 4~6为序列A62、B62、C62的5’ 末端修饰的碱基，与DNA1部分互补的替换链DNA 7~8为序列B61、B59的5’末端延长的碱基，与DNA2部分互补的替换链DNA 9~10为序列B56、B53的5’末端延长的碱基。

8.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的级联酶-DNA与DNA折纸的孵育比例优选的浓度为10:1；所述的级联酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的玻片的孵育浓度可以为10^-10 ~10^-12，优选的浓度为为10^-11。

9.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于所述的级联酶-折纸组装体与链霉亲和素修饰的盖玻片的孵育时间优选为10 min。

10.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，在确定催化位点时，首先利用Cy5荧光分子确定酶所在的位置，之后更改激光在561 nm处激发产物荧光，利用显微镜将二者共定位，即可初步判定酶催化生成的产物位置，确定荧光信号采集。