CN106497911B - 固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法 - Google Patents

固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定过氧化氢酶的明胶‑二氧化硅杂化微球的方法。该方法以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括：制备含过氧化氢酶浓度为0.1‑2毫克/升的明胶/过氧化氢酶溶液；制备含有司班‑80质量浓度为0.25‑4.0%的液体石蜡油；将明胶/过氧化氢酶溶液与液体石蜡油混合制粗乳液；粗乳液以压力反复透过微孔膜，得到多级乳化的W/O型乳液；将多级乳化的W/O型乳液滴加入正硅酸乙酯水解液中，经过仿生矿化反应、固化、洗涤后得到用于固定化酶的明胶‑二氧化硅杂化微球。本发明的优点：制备条件温和，工艺简单易行，制得微球粒度均一，用于固定过氧化氢酶的能力强，耐受酸碱性好，储存稳定。

Description

固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法
技术领域
本发明涉及一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法，属于固定化酶的杂化微球技术领域。
背景技术
明胶微球是一种常用的固定化酶载体，其优点在于包埋条件温和，生物相容性好，有利于维持酶的结构完整性，进而提高酶的活性维持率。明胶微球固定化酶通常存在的问题是载体的孔径较大，酶分子容易泄露。微球易溶胀，机械强度差，循环使用稳定性和储存稳定性不高。解决问题的方法通常是在明胶微球中填充无机组分、或者在明胶微球外表面构造无机壳层，制备有机-无机杂化微球，以提高微球的机械性能，同时抑制酶分子的泄露，提高酶对温度、pH 变化的耐受性，同时提高储存和循环使用稳定性。
二氧化硅是有机-无机杂化材料中常见的无机组分，可用于制备杂化微球。Materials Science and Engineering C 62 (2016) 678–685公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法，其过程包括：将明胶溶解于乙醇/水混合体系中，并加入交联剂3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，得到明胶溶液；将正硅酸乙酯、氯化钙和磷酸三乙酯混合，得到硅前驱体溶液；将明胶溶液与硅前驱体溶液混合，并倒入植物油中进行搅拌乳化，得到w/o型乳液；将乳液在-70℃下冷冻固化成型，并依次利用乙醇和丙酮进行洗涤，得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球的中位粒径D50值在124-276微米范围内。
仿生硅化为二氧化硅材料的制备提供了一条新途径，仿生硅化避免了酸碱催化的使用，制备简单，所用原料均具有很好的生物相容性，适用范围广。Colloids and SurfacesB: Biointerfaces 35 (2004) 53–58公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法，其过程包括：将明胶固体溶解于pH5.0的去离子水中，得到明胶质量分数0.5-30%的明胶溶液；将硅酸钠固体溶解于去离子水中，得到硅酸钠质量分数为0.1-1.0%的硅酸钠溶液；在37℃下将明胶溶液与硅酸钠溶液混合，搅拌1小时，在20℃水浴中静置一天，得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球粒径在50-350纳米范围内。
利用明胶仿生硅化过程制备明胶-二氧化硅杂化载体用于固定化酶具有良好的应用前景。发明专利CN201310425486.9公开了一种包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶及制备方法。该包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶，粒径为 3-4mm，在明胶核上包覆有氧化硅壳层。其制备方法过程包括：配制明胶及含有醇脱氢酶混合溶液；配制硅酸钠及戊二醛溶液前驱体混合溶液；将明胶及醇脱氢酶的混合溶液逐滴加入到 0~4℃ 的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，再经搅拌孵化得到包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶。
发明内容
本发明的目的在于通过将仿生矿化过程与膜乳化过程结合，提供一种以微孔膜渗透乳化制备固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法。以该方法所制得的明胶-二氧化硅杂化微球粒度均一、大小可控，用于固定过氧化氢酶，过氧化氢酶的泄漏率低，且耐酸碱环境能力强，储存稳定性好。
本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置，以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的，其特征在于包括以下步骤：
1）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液，再向其中加入溶解过氧化氢酶，使过氧化氢酶浓度保持为0.1-2毫克/升，制得水相明胶/过氧化氢酶溶液；
2）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，配制成含有司班-80质量浓度为0.25-4.0% 的液体石蜡油，称为油相；
3）按步骤1）制的水相明胶/过氧化氢酶溶液与步骤2）制的油相液体石蜡油的体积比为1:（2~15），在温度40℃-70℃及200-1200rpm速度下搅拌下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，得到粗乳液；
4）将步骤3）制的粗乳液加入装配有膜孔径为3.5-10.2微米的微孔膜的膜乳化装置内，以20kPa-50kPa压力使粗乳液通过微孔膜腔,进入收集器后，再回加入膜乳化器中，如此循环2-10次，得到多级乳化的W/O型乳液；
5）以正硅酸乙酯与去离子水按摩尔比为1:（0.05-0.4）混合，并向该混合中，按催化剂盐酸与正硅酸乙酯摩尔比为（0.005-0.02）:1加入盐酸，然后在室温下超声振荡直至得到澄清透明的溶液，再用去离子水稀释溶液至浓度20-150mM，并且用NaOH将稀释溶液的pH值调至6.0-8.0，得到正硅酸乙酯水解液；
6）在400rpm速度搅拌下，以步骤5）制得的正硅酸乙酯水解液与步骤4）制得的多级乳化W/O型乳液按体积比为1:（1.0-4.0），将多级乳化W/O型乳液加入正硅酸乙酯水解液中，加毕后在温度0℃-8℃冰水浴中，交联固化0.5-4小时后，再分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至去除油相为止，然后在空气中自然干燥得到用于固定化酶的明胶-二氧化硅杂化微球。
本发明提出的制备方法的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，明胶微球粒度均一，二氧化硅含量及壳层厚度可控，并且所得明胶-二氧化硅杂化微球对过氧化氢酶具有很好的固定能力，固定化过氧化氢酶的对酸碱耐受性能强，储存稳定性好。
附图说明
图1为实施例1制得的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。
图2为对比例1制备的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。
图3为实施例1制备的明胶-二氧化硅杂化微球与对比例1制备的明胶微球的热重分析曲线图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是为了帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
膜乳化法制备固定化过氧化氢酶的明胶二氧化硅杂化微球：
向200转/分钟磁力搅拌、55℃的2毫升水中加入0.2克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶0.2毫克，溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂0.3g司班-80加入到12毫升的液体石蜡中，以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相。
将3毫升正硅酸乙酯与0.7毫升去离子水混合。加入0.2毫升0.1摩尔/升的盐酸为催化剂，然后用超声波清洗器在室温下超声直至得到澄清透明的溶液，然后用去离子水将上述溶液稀释至50mM，并且用0.5摩尔/升的NaOH溶液将pH值调至7.0，从而得到正硅酸乙酯水解液。
预乳化过程：按水相明胶/过氧化氢酶溶液与油相液体石蜡油的体积比为1:6，在温度550℃下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，1600rpm速度下磁力搅拌得到粗乳液。
膜乳化过程：采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直径为1厘米，长度为2厘米，膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至55℃的液体石蜡中30分钟，然后将微孔膜装入膜乳化装置中，膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的粗乳液加入膜乳化装置，通入氮气，在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器。将收集容器中过膜一次的乳液再次加入膜乳化器中，在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器。重复上述过程，直至过膜三次，得到多级乳化的W/O型乳液。
仿生矿化过程：将多级乳化的W/O型乳液，逐滴加入到18mL、浓度为50mM的正硅酸乙酯水解液中，期间保持磁力搅拌速度为400转/分钟，全部滴加完后，迅速置于4℃冰水浴中，交联固化2小时。结束后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除，然后在空气中自然干燥得到固定化酶的明胶微球。微球的平均粒径采用激光粒度仪进行测量，二氧化硅含量采用热重分析仪进行测量，二氧化硅壳层厚度采用透射电镜进行分析。明胶-二氧化硅杂化微球粒径、分布、二氧化硅含量见表1。
对上述过程制得的明胶-二氧化硅杂化微球固定过氧化氢酶在不同pH下的相对酶活力进行测定：
将30％过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释，配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液，加入对本对比例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球，在25℃，搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应，用紫外－可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力，并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值，将最适pH值下相对酶活力定义为100％。
将其他pH值下的酶活力与最适pH值下的酶活力对比，得到最适pH值为6.0，pH6.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比，pH3.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为60.6%；pH4.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为64.6%；pH5.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为67.7%；pH7.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为70.2%； pH8.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为76.7%；pH9.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为79.4%；pH10.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为55.9%。
对上述过程制得的明胶-二氧化硅杂化微球固定过氧化氢酶的储存稳定性进行测定：
将30％过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释，配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液，加入本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球，在25℃，搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应，用紫外－可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力，并以此酶活力为初始相对酶活力，定义为100％。
将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球存放一天后，重复上述反应过程，得到固定化过过氧化氢酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为95.4％。将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球存放存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重复上述反应过程，得到储存三天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为89.7％；储存六天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为87.0％；储存十天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为68.8％；储存十五天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为56.8％；储存二十一天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为51.7％。
实施例2
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将采用的膜孔径为3.5微米的微孔膜改用膜孔径为10.2微米的微孔膜，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例3
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在制备过程中的温度由55℃改为40℃，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例4
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在制备过程中的温度由55℃改为70℃，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例5
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将采用的50kPa的操作压力改变为20kPa的操作压力，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例6
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为20mM，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例7
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为90mM，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例8
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为150mM，制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
对比例1
按照中国发明专利CN201510209087.8中实施例1所述方法，通过膜乳化法制备固定化过氧化氢酶的明胶微球：
向200转/分钟磁力搅拌、55℃的10毫升水中加入1克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶1毫克，溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂1.5g司班-80加入到60毫升的液体石蜡中，以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相。
膜乳化过程：采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直径为1厘米，长度为2厘米，膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至60℃的液体石蜡中30分钟，然后将微孔膜装入膜乳化装置中，膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的水相明胶/过氧化氢酶溶液加入膜乳化装置，通入氮气，在5kPa压力下使水相溶液通过微孔膜进入磁力搅拌的60℃油相中，得到液滴均匀的W/O型乳液，搅拌速度为400转/分钟。将所得乳液继续在400转/分钟下磁力搅拌15分钟后，迅速置于4℃冰水浴中，加入交联剂戊二醛1mL，交联固化2小时。结束后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除，然后在空气中自然干燥得到固定化酶的明胶微球。
对上述过程制得的明胶微球固定过氧化氢酶在不同pH下的相对酶活力进行测定：
将30％过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释，配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液，加入对本对比例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球，在25℃，搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应，用紫外－可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力，并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值，将最适pH值下相对酶活力定义为100％。
将其他pH值下的酶活力与最适pH值下的酶活力对比，得到最适pH值为7.0，pH7.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比， pH4.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为12.3%；pH5.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为67.7%；pH6.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为95.8%； pH8.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为90.8%；pH9.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为26.1%；pH10.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为0。
将30％过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释，配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液，加入本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球，在25℃，搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应，用紫外－可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力，并以此酶活力为初始相对酶活力，定义为100％。
将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶微球存放一天后，重复上述反应过程，得到固定化过过氧化氢酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为85.3％。将新鲜的游离过氧化氢酶溶液存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重复上述反应过程，得到储存三天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为69.0％；储存六天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为40.5％；储存十天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为24.3％；储存十五天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为3.5％；储存二十一天及二十八天的游离过氧化氢酶的相对酶活力完全丧失，为0%。
表1所示为实施例1-8测定的明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小及分布、二氧化硅含量的对比结果。
示例 微球粒径D50（μm） SPAN值 二氧化硅含量（%）
实施例1 11.8 1.27 46.5
实施例2 21.3 1.22 34.1
实施例3 17.6 1.41 29.9
实施例4 10.2 1.31 51.8
实施例5 15.7 1.12 35.6
实施例6 32.5 1.52 13.8
实施例7 7.4 1.18 59.3
实施例8 1.9 1.07 72.5

Claims (1)

1.一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）向200转/分钟磁力搅拌、55℃的2毫升水中加入0.2克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升；向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶0.2毫克，溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升；以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相；
2）将油溶性乳化剂0.3g司班-80加入到12毫升的液体石蜡中，以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相；
3）将3毫升正硅酸乙酯与0.7毫升去离子水混合，加入0.2毫升0.1摩尔/升的盐酸为催化剂，然后用超声波清洗器在室温下超声直至得到澄清透明的溶液，然后用去离子水将上述溶液稀释至50mM，并且用0.5摩尔/升的NaOH溶液将pH值调至7.0，从而得到正硅酸乙酯水解液；
4）预乳化过程：按水相明胶/过氧化氢酶溶液与油相液体石蜡油的体积比为1:6，在温度550℃下，将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中，1600rpm速度下磁力搅拌得到粗乳液；
5）膜乳化过程：采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜，膜管直径为1厘米，长度为2厘米，膜孔径为3.5微米；使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至55℃的液体石蜡中30分钟，然后将微孔膜装入膜乳化装置中，快速将上述制备好的粗乳液加入膜乳化装置，通入氮气，在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器；将收集容器中过膜一次的乳液再次加入膜乳化器中，在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器；重复上述过程，直至过膜三次，得到多级乳化的W/O型乳液；
6）仿生矿化过程：将多级乳化的W/O型乳液，逐滴加入到18mL、浓度为50mM的正硅酸乙酯水解液中，期间保持磁力搅拌速度为400转/分钟，全部滴加完后，迅速置于4℃冰水浴中，交联固化2小时，结束后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除，然后在空气中自然干燥得到固定化酶的明胶微球。
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