CN109943558A - 一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：步骤1：甲氧基聚乙二醇‑脲酶共聚物颗粒制备；步骤2：含目标酶双水相体系制备；配置质量百分浓度为0.1～0.4 wt%的酶溶液；将葡聚糖和聚乙二醇加入到酶溶液中充分混合即得所需含目标酶双水相体系；步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙制备；在含目标酶双水相体系加入甲氧基聚乙二醇‑脲酶共聚物颗粒充分混合得到混合溶液A；制备尿素和氯化钙的混合溶液B；将混合溶液A与混合溶液B混合充分反应，离心后即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙；本发明制备得到的固定化酶的方解石型碳酸钙机械强度好，抗剪切力性能好，包封率高，且酶活力保留率高。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法。
背景技术
酶的固定化促进酶、底物和产物的分离，实现酶的重复利用，并且降低了操作成本。目前固定化酶的方式主要包括交联法、包埋法和载体结合法。交联法是使用有机交联剂将酶分子交联后形成固定化酶颗粒，然而，有机交联剂常导致酶构象的改变引起酶失活；包埋法是把酶包埋到凝胶微球的网格内，但凝胶遇水易溶胀导致酶的渗漏。载体结合法是将酶与载体通过共价化学键或物理吸附或离子吸附作用结合在一起，其中共价结合易使酶失活，而吸附结合存在吸附平衡导致固载量低且吸附作用力弱，在使用过程中酶易从载体上脱落。酶固载量高、操作条件温和且循环反应中酶不易流失的固定化方法是生物化工领域持续追求的目标。
碳酸钙是一种常见的生物矿化材料，具有比表面积大，机械性能强等优势，常被用于生物医药、食品和固定化酶领域。目前常用的碳酸钙材料固定化酶方法是吸附法、相转变法和油水乳液模板法。然而吸附法存在吸附平衡导致包封率低，且使用过程中酶易从载体上脱落(Zheng Lu,et al.Biomimetic mineralization of calcium carbonate/carboxymethylcellulose microspheres for lysozyme immobilization[J].MaterialsScience and Engineering:C,2012,32(7):1982-1987.)。相转变法在碳酸钙由球霰石转变方解石晶型过程中将目标酶固载住，耗时长达96-140h，且对酶包封率低仅为38％(Masahiro Fujiwara,et al.Encapsulation of proteins into CaCO3by phasetransition from vaterite to calcite[J].Crystal Growth&Design,2010,10(9):4030-4037.)。油水乳液模板法因使用小分子表面活性剂和油相溶剂等易使酶失活变性(Masahiro Fujiwara,et al.Calcium carbonate microcapsules encapsulatingbiomacromolecules[J].Chemical Engineering Journal,2008,137:14-22.)。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提出一种包封率高、生物相容性好、不易使酶失活，酶活力保留率高的基于双水相体系仿生矿化过程生成方解石型碳酸钙晶体固定化酶的方法。
本发明采用的技术方案是：一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
甲氧基聚乙二醇乙醛和脲酶按照质量比为1:1加入水中，形成混合物水溶液；充分反应后真空干燥即得甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒；
步骤2：含目标酶双水相体系
配置质量百分浓度为0.1～0.4wt％的酶溶液；将葡聚糖和聚乙二醇加入到酶溶液中充分混合即得所需含目标酶双水相体系；含目标酶双水相体系中葡聚糖质量百分浓度为8wt％，聚乙二醇质量百分浓度为8.5wt％；
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
在步骤2制备得到的含目标酶双水相体系加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒充分混合得到混合溶液A；其中甲氧基聚乙二醇乙醛与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100，脲酶与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100；
制备尿素和氯化钙的混合溶液B；其中氯化钙浓度≥0.5g/mL，尿素浓度小于氯化钙浓度；
将混合溶液A与混合溶液B按照体积比为1:0.2～0.4混合充分反应，离心后即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
进一步的，所述步骤1中反应在25℃条件下，静置反应100h。
进一步的，所述步骤2中溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述步骤2在旋转分散器中在转速为40转/分的条件下分散2小时混合。
进一步的，所述步骤3中在旋涡混合器中转速2800转/分的条件下，震荡1min得混合溶液A。
进一步的，所述步骤3中混合溶液A和混合溶液B反应60～100min，离心2～3次即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
进一步的，所述步骤3中混合溶液B溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述目标酶为过氧化氢酶。
进一步的，所述葡聚糖分子量为500kDa，聚乙二醇分子量为8kDa。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法制备简单、包封率高达80％以上、整个过程生物相容性好、酶活性保留率高达70％；
(2)本发明得到的固定化酶用鼓泡或搅拌混合方式可使其均匀分散于溶液中用于酶催化反应，且放置水中一年以上没有明显溶胀；固定化酶机械强度好，不易渗漏、抗剪切力性能好；
(3)本发明能够为生物医药、食品行业，酶工程领域构建高封装，稳定性好，不易渗漏、强机械度，易回收的酶颗粒固载体系。
附图说明
图1为本发明机理示意图。
图2为本发明实施例1中催化过氧化氢产生氢气示意图。
图3为本发明实施例2中固定化FITC过氧化氢酶的荧光包封情况明场(a)与暗场(b)图。
图4为本发明实施例1中固定化过氧化氢酶的方解石型碳酸钙全貌扫描电镜(SEM)图；b为a框中局部放大图。
图5为本发明实施例1中固定化过氧化氢酶的方解石型碳酸钙载体的X射线衍射图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
甲氧基聚乙二醇乙醛和脲酶按照质量比为1:1加入去离子水(pH＝5)中，形成混合物水溶液；在25℃条件下，静置100h充分反应后真空干燥即得甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒；甲氧基聚乙二醇乙醛分子量为5～10kDa，脲酶分子量为540kDa。
步骤2：含目标酶双水相体系
配置质量百分浓度为0.1～0.4wt％的酶溶液；溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)；
将葡聚糖和聚乙二醇加入到酶溶液中充分混合即得所需含目标酶双水相体系；含目标酶双水相体系中葡聚糖质量百分浓度为8wt％，聚乙二醇质量百分浓度为8.5wt％；
葡聚糖分子量为500kDa，聚乙二醇分子量为8kDa，旋转分散器中在转速为40转/分的条件下分散2小时混合。
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
在步骤2制备得到的含目标酶双水相体系加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒在旋涡混合器中转速2800转/分的条件下，震荡1min得混合溶液A；其中甲氧基聚乙二醇乙醛与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100，脲酶与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100；
制备尿素和氯化钙的混合溶液B；其中氯化钙浓度≥0.5g/mL，尿素浓度小于氯化钙浓度；混合溶液B溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)；
将混合溶液A与混合溶液B按照体积比为1:0.2～0.4混合充分反应，离心后即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙；用移液枪吸取混合溶液A于离心管中，加入混合溶液B，反应60～100min；加入去离子水，离心机离心3min，转速1000转/分，去除上清液；重复离心2～3次，即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
本发明利用分散在高粘度双水相体系(粘度大于或等于200mPa·s)中甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒为结晶位点，并催化尿素生成碳酸根，和溶液中的高浓度氯化钙(质量浓度大于或等于0.5g/mL)反应，在仿生矿化生成方解石型碳酸钙的同时将分散在双水相体系中的目标酶固定。生成的方解石型碳酸钙载体，粒径为5～40μm，用鼓泡或搅拌混合方式可使其均匀分散于溶液中用于酶催化反应；放置水中一年以上没有明显的溶胀。
实施例1
一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
称取16mg的甲氧基聚乙二醇乙醛，分子量为5kDa，称取16mg的脲酶，分子量为540kDa均放置于螺口瓶中；加入1mL的去离子水(pH＝5)，形成混合物水溶液；混合物水溶液静置反应100h，真空干燥机(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)中在压强小于0.01MPa条件下干燥即形成甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒。
步骤2：含目标酶双水相体系
配制10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4；称取10mg过氧化氢酶，分子量为250kDa，加入到6.68mL的Tris-HCl缓冲液中，完全溶解即可得到酶溶液。
然后称取0.64g的葡聚糖Dex，分子量为500kDa；称取0.68g的聚乙二醇PEG，分子量为8kDa；将其加入到酶溶液中，在旋转分散器中分散2h，转速为40转/分，即可得到含目标酶双水相体系。
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
分别称取0.55g尿素和2.5g氯化钙，溶解于5mL步骤2配制得到的Tris-HCl缓冲液中得到混合溶液B。
在步骤2得到的含目标酶双水相体系溶液中加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒，在旋涡混合器(VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)中震荡1min，转速为2800转/分得到混合溶液A。
用移液枪吸取500μL的混合溶液A于离心管中，加入100μL的混合溶液B，反应1h；加入去离子水，离心机离心3min，转速1000转/分，除去上清液(C溶液)；加入3mL强碱溶液，离心机离心3min，转速1000转/分，除去上清液，重复加入强碱溶液离心洗涤2～3次，得到沉淀即为所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
取上述固定化目标酶的方解石型碳酸钙于离心管中，加入30％(W/V)过氧化氢溶液，避光反应，10min后离心管中有大量气泡产生(如图2所示)。说明本发明方法制备得到的固定化过氧化氢酶具有酶活力。
取部分沉淀于5×5mm玻璃片上，烘干；对烘干的碳酸钙载体进行扫描电镜拍照(JSM-7001F)如图4a和4b所示；其中图4a为碳酸钙载体烘干后的扫描电镜全图，微球直径约35μm；图4b为图4a框中部分局部放大图。图5为碳酸钙载体的X射线衍射图(XL-30,PhilipsX’Pert Pro)；通过在20～80°检测，表明位于2θ＝29.3°、35.966°、39.402°、43.146°、48.514°等处(C峰)有强方解石特征峰。
取C溶液1mL，利用考马斯亮蓝法，紫外可见分光光度计(UV-1100)测定样品中总蛋白的吸光度，扣除空白脲酶蛋白吸光度，与过氧化氢酶吸光度标准曲线比较，计算得过氧化氢酶的包封率为83％。
取C溶液1mL，利用考马斯亮蓝法，紫外可见分光光度计(UV-1100)测定样品中总蛋白的吸光度，扣除空白脲酶蛋白吸光度，与过氧化氢酶吸光度标准曲线比较，计算得过包进0.34mg过氧化氢酶。
实施例2
一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
称取16mg的甲氧基聚乙二醇乙醛，分子量为5kDa，称取16mg的脲酶，分子量为540kDa，均放置于螺口瓶中；加入1mL的去离子水(pH＝5)，形成混合物水溶液；混合物水溶液静置反应100h，真空干燥机(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)中在压强小于0.01MPa条件下干燥即形成甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒。
步骤2：含目标酶双水相体系
配制10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4；称取100mg过氧化氢酶，分子量为250kDa；溶解于10mL的Tris-HCl缓冲液中，完全溶解即可得到酶溶液。
称取5mg的FITC溶解在0.5mL的二甲基亚砜(DMSO)溶液中；将该溶液缓慢加入到酶溶液中，4℃条件下避光，轻微磁力搅拌，过夜反应，得到反应液。将反应液在Tris-HCl缓冲液中透析72h，透析袋截留分子量5kDa，期间换液多次。透析结束后，透析袋中剩余荧光黄色溶液，即FITC-过氧化氢酶溶液。
然后称取0.64g的葡聚糖Dex，分子量为500kDa；称取0.68g的聚乙二醇PEG，分子量为8kDa；将其加入6.68mL的Tris-HCl缓冲液，在旋转分散器中分散2h，转速为40转/分，得双水相溶液；吸取FITC-过氧化氢酶溶液500μL到双水相溶液中，在旋涡混合器分散1min，转速2800转/分，得到含目标酶双水相体系。
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
分别称取0.55g尿素和2.5g氯化钙，溶解于5mL步骤2配制得到的Tris-HCl缓冲液中得到混合溶液B。
在步骤2得到的含目标酶双水相体系溶液中加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒，在旋涡混合器(VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)中震荡1min，转速为2800转/分得到混合溶液A。
用移液枪吸取500μL的混合溶液A于离心管中，加入100μL的混合溶液B，反应1h；加入去离子水，离心机离心3min，转速1000转/分，除去上清液；加入3mL强碱溶液，离心机离心3min，转速1000转/分，除去上清液，重复加入强碱溶液离心洗涤2～3次，得到沉淀即为固载过氧化氢酶的方解石型碳酸钙。
取上述制备得到的固载过氧化氢酶的方解石型碳酸钙，稍加入去离子水形成溶液；吸取该溶液置于载玻片上，于荧光显微镜(Th4-200)495nm激发波长下观测；其包封情况如图3a和图3b所示。说明FITC-过氧化氢酶被碳酸钙载体固载。
实施例3
一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
称取16mg的甲氧基聚乙二醇乙醛，分子量为5kDa，称取16mg的脲酶，分子量为540kDa均放置于螺口瓶中；加入1mL的去离子水(pH＝5)，形成混合物水溶液；混合物水溶液静置反应100h，真空干燥机(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)中在压强小于0.01MPa条件下干燥即形成甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒。
步骤2：含目标酶双水相体系
配制10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4；称取10mg过氧化氢酶，分子量为250kDa，加入到6.68mL的Tris-HCl缓冲液中，完全溶解即可得到酶溶液。
然后称取0.64g的葡聚糖Dex，分子量为500kDa；称取0.68g的聚乙二醇PEG，分子量为8kDa；将其加入到酶溶液中，在旋转分散器中分散2h，转速为40转/分，即可得到含目标酶双水相体系。
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
分别称取0.55g尿素和2.5g氯化钙，溶解于5mL步骤2配制得到的Tris-HCl缓冲液中得到混合溶液B。
在步骤2得到的含目标酶双水相体系溶液中加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒，在旋涡混合器(VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)中震荡1min，转速为2800转/分得到混合溶液A。
用移液枪吸取500μL的混合溶液A于离心管中，加入100μL的混合溶液B，反应1h；加入去离子水，离心机离心3min，转速1000转/分，除去上清液后；加入去离子水洗涤，离心，重复4～5次，得含有过氧化氢酶的方解石型碳酸钙。
取含有过氧化氢酶的方解石型碳酸钙，加入1mL的Tris-HCl缓冲液，加入2.5mL(用Tris-HCl缓冲液配制的浓度为10mmol/L)的过氧化氢溶液，质量百分比浓度为30wt％；反应1min，迅速加入2mL强碱溶液，停止反应；利用紫外可见分光光度法测定吸光度值。
用Tris-HCl缓冲液配置浓度为0.34mg/mL的游离过氧化氢酶溶液，取1mL该酶溶液，加入2.5mL(用Tris-HCl缓冲液配制的浓度为10mmol/L)的过氧化氢溶液；质量百分比浓度为30wt％；反应1min，迅速加入2mL强碱溶液，停止反应；利用紫外可见分光光度法测定吸光度值。
根据上述吸光光度值计算得固定化酶活力为游离酶酶活的72％。
下面对包封率和酶活力保留率测定方法进行说明。
包封率是指固定在载体上的过氧化氢酶量与制备过程中初始加入的过氧化氢酶量的比例。固定化酶的酶活力保留率是指固定化过氧化氢酶的酶活力与固定化酶包封量相等的游离酶的酶活力的比值。本发明中用考马斯亮蓝(G250)试剂，通过Bradford方法测定固化过氧化氢酶的包封率；使用紫外分光光度计，在240nm下测定固定化过氧化氢酶的酶活力保留率。
其中考马斯亮蓝试剂的配制如下：称取100mg考马斯亮蓝(G-250)固体粉末，溶于50mL的90％乙醇中；超声分散30min，使其充分溶解。向其中加入100mL，85％(V/V)的市售磷酸溶液，随后转移至1000mL的容量瓶中，用去离子水定容，过滤后即可得考马斯亮蓝溶液。
固定过氧化氢酶包封率测定过程如下：
配制8mL的聚乙二醇/葡聚糖双水相体系，加入质量百分浓度为0.4wt％的甲氧基聚乙二醇-脲酶颗粒，旋涡混合器分散均匀后备用。分别取500μL双水相溶液于1号和2号离心管中备用。向上述分散有甲氧基聚乙二醇-脲酶颗粒的双水相体系中加入10mg的过氧化氢酶；旋涡混合器分散均匀后，分别取500μL于3号和4号离心管中备用。向2号和4号离心管中各加入100μL的底物(0.55g尿素，2.5g氯化钙，5mL的Tris-HCl缓冲液)，反应1h。
用Bradford方法测定：分别将1号、3号离心管中溶液稀释至8mL，分散均匀后各取1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，反应3min，在595nm下测得吸光度值分别为A1(空白对照)和A3。分别将反应后的2号、4号离心管中溶液稀释至5mL，离心后各取1mL上清，加入5mL考马斯亮蓝溶液，反应3min，在595nm下测得吸光度值分别为A2(空白对照)和A4。因而固定化过氧化氢酶的包封率计算公式如下：
其中：A1为反应体系中脲酶共聚物颗粒的吸光度值，A2为包封后上清液中脲酶共聚物颗粒的吸光度值，A3为反应体系中脲酶共聚物颗粒与过氧化氢酶的总蛋白量的吸光度值，A4为包封后上清液中未被包封的脲酶共聚物颗粒和过氧化氢酶总量的吸光度值。
分别制备3个样本，进行固定化过氧化氢酶的包封率测试，其结果如表1所示，可以看出固定化过氧化氢酶方法的包封率达80％以上。
表1.固定化过氧化氢酶的包封率表
固定化过氧化氢酶的酶活力保留率测定
过氧化氢酶活性单位为U(μmol/mL·min)，定义为每分钟消耗1μmol过氧化氢所需要的酶量。
测定过程如下：
取固定化酶(如实施例1制备得到的固定化过氧化氢酶)配成1mL的酶液，加入到2.5mL(用10mmol/L，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液配制的10mmol/L的)过氧化氢溶液中，加热至37℃反应1min，加2mL强碱停止反应，测240nm下的吸光度值为Ar。作为对照，测2.5mL过氧化氢溶液和2mL强碱的混合物在0min时的吸光度值为As；为了消除蛋白溶液本身的吸光度，测量由2.5mL缓冲液，1mL固定化酶液和2mL强碱组成的混合物的吸光度值为At。
固定化过氧化氢酶的酶活力基于以下公式计算：
酶活力吸光度A＝(As+At)-Ar
取等量游离过氧化氢酶于1mL缓冲液中，按照上述步骤测定吸光度值，分别得As1、At1、Ar1。
游离过氧化氢酶的酶活力计算基于以下公式：
酶活力吸光度A1＝(As1+At1)-Ar1
式中：Vt或Vt1为总反应体积，Ve或Ve1为样品体积，ε为过氧化氢的比吸光系数，t或t1为反应时间。
所以固定化酶的酶活力保留率(％)计算公式为：
上式中：Vt＝Vt1，Ve＝Ve1，t＝t1，所以可以简化为以下公式：
分别制备3个样本，进行固定化过氧化氢酶的酶活力保留率进行测试，其结果如表2所示，可以看出固定化过氧化氢酶方法的酶活力保留率达70％以上。
表2.固定化过氧化氢酶酶活力保留率
通过本发明方法制备得到的固定化酶方解石型碳酸钙，粒径为5～40μm，同时具有较高的包封率(＞80％)及酶活力保留率(＞70％)。
本发明利用分散在双水相体系中的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒为结晶位点，催化尿素生成碳酸根后与溶液中的高浓度氯化钙反应，在仿生矿化生成方解石型碳酸钙的同时将分散在双水相体系中的目标酶固定。
由于双水相体系粘度高的特性使分散在矿化位点周围的目标固载酶不易在矿化结晶过程中扩散出去，进而使得固定化过程对目标酶有较高的包封率。与现有的碳酸钙微球吸附法固定化酶技术相比，由于是在碳酸钙仿生矿化过程中将酶同时固定在微球内部，所以酶包封率高(80％以上)。由于溶液的高离子浓度环境，在矿化时直接生成了方解石型碳酸钙结构，耗时仅为60～100min，且避免了多步操作过程，提高了固定化酶包封率。
方解石型碳酸钙热力学特性稳定，不易溶胀，酶不易被洗脱。与现有的其他固定化酶技术相比，该方法生物相容性好，不易使酶失活，酶活力保留率高(70％以上)。同时由于有碳酸钙载体的保护，固定化酶耐受剪切力的能力得到提高，酶活力损失小，使用批次长。本发明方法在生物医药、食品工业、日用化学品工业中具有广阔的应用前景。
所用的双水相体系粘度大于或等于200mPa·s，制备得到的固载酶的方解石型碳酸钙载体，用鼓泡或搅拌混合方式使其均匀分散于用于酶催化反应。且放置水中一年以上没有明显溶胀。
Claims (10)
1.一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒
甲氧基聚乙二醇乙醛和脲酶按照质量比为1:1加入水中，形成混合物水溶液；充分反应后真空干燥即得甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒；
步骤2：含目标酶双水相体系
配置质量百分浓度为0.1～0.4wt％的酶溶液；将葡聚糖和聚乙二醇加入到酶溶液中充分混合即得所需含目标酶双水相体系；含目标酶双水相体系中葡聚糖质量百分浓度为8wt％，聚乙二醇质量百分浓度为8.5wt％；
步骤3：固定化目标酶的方解石型碳酸钙
在步骤2制备得到的含目标酶双水相体系加入步骤1得到的甲氧基聚乙二醇-脲酶共聚物颗粒充分混合得到混合溶液A；其中甲氧基聚乙二醇乙醛与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100，脲酶与混合溶液A的质量比为0.1～0.5：100；
制备尿素和氯化钙的混合溶液B；其中氯化钙浓度≥0.5g/mL，尿素浓度小于氯化钙浓度；
将混合溶液A与混合溶液B按照体积比为1:0.2～0.4混合充分反应，离心后即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
2.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤1中反应在25℃条件下，静置反应100h。
3.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤2酶溶液中溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤2在旋转分散器中在转速为40转/分的条件下分散2小时混合。
5.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤3中在旋涡混合器中转速2800转/分的条件下，震荡1min得混合溶液A。
6.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤3中混合溶液A和混合溶液B反应60～100min，离心2～3次即得所需固定化目标酶的方解石型碳酸钙。
7.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤3中混合溶液B溶剂为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述目标酶为过氧化氢酶。
9.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述葡聚糖分子量为500kDa，聚乙二醇分子量为8kDa。
10.根据权利要求1所述的一种基于双水相体系仿生矿化过程固定化酶的方法，其特征在于，所述双水相体系粘度大于或等于200mPa·s。
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