CN105061608B

CN105061608B - 荧光淀粉纳米晶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105061608B
Application number: CN201510470674.2A
Authority: CN
Inventors: 田耀旗; 蔡灿欣; 魏本喜; 金征宇; 王金鹏; 徐学明; 杨哪; 胡秀婷
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN105061608A

Abstract

本发明公开了一种荧光淀粉纳米晶及其制备方法与应用。本发明主要是基于淀粉纳米晶表面具有活性基团羟基这一特性，通过硅烷偶联、荧光素亲电加成的两步表面化学改性方法，将异硫氰酸荧光素以稳定共价键连接的方式引入淀粉纳米晶表面，制备出具有荧光性质的淀粉纳米晶。本发明的制备工艺简单易操作，原料廉价易得，成本低廉，可使自身无荧光性能的淀粉纳米晶产生明显荧光性质，且对淀粉纳米晶本身性质无影响，拓展了淀粉的应用，而且所获荧光淀粉纳米晶具有显著的荧光性质，生物相容性好，且生物可降解，在生物传感器的制备、生物成像标记、荧光分析检测等领域具有应用前景，并可进一步制备成一种以有机纳米粒子为基质的新型纳米荧光探针。

Description

荧光淀粉纳米晶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种荧光纳米晶材料，特别涉及一种荧光淀粉纳米晶及其制备方法与应用，属于变性淀粉加工技术领域。

背景技术

淀粉纳米晶是淀粉无定形区经酸水解后剩余对酸有抗性的结晶部分，属于有机纳米颗粒，具有如下优点，例如：其一、相对无机纳米粒子具有成本低、来源广、生物可再生、生物可降解、生物相容性好、无毒的特点，可广泛应用于食品、生物、医药等生命科学领域；其二、保留了自身的结晶性，具有较高的力学强度。

然而淀粉纳米晶本身无法发荧光，使其在生物成像标记、生物传感器的制备、体内外荧光成像、DNA自动测序等领域的应用受到了限制，限制了淀粉纳米晶应用的进一步拓展。

异硫氰酸荧光素无法直接与淀粉纳米晶反应，仅可微量或无法吸附于淀粉纳米晶。若将荧光基团引入淀粉纳米晶表面，须借助“桥联剂”引入活性基团使其与荧光素实现化学反应。硅烷偶联剂其分子中同时具有两种不同反应性官能团，可在淀粉纳米晶表面吸附、缩合继而发生偶联反应，将活性基团氨基引入淀粉纳米晶表面。相比于其他的中间体“桥联剂”，其反应简单、连接效率高，提高了引入表面的氨基量，使得其可有效地进一步异硫氰酸荧光素反应，实现荧光淀粉纳米晶的制备。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种荧光淀粉纳米晶及其制备方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

在一些实施方案之中提供了一种荧光淀粉纳米晶，其包括淀粉纳米晶以及通过共价键修饰于所述淀粉纳米晶表面的荧光基团，所述荧光基团包括来源于异硫氰酸荧光素的荧光基团。

在一些实施方案之中还提供了一种荧光淀粉纳米晶的制备方法，其包括：采用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷通过硅烷偶联反应对淀粉纳米晶进行表面化学偶联改性，之后通过硅烷偶联改性的淀粉纳米晶表面的氨基与异硫氰酸荧光素的异硫氰基团之间的反应而将来源于异硫氰酸荧光素的荧光基团共价修饰于所述淀粉纳米晶表面，从而获得所述荧光淀粉纳米晶。

在一较为优选的实施方案之中，所述的荧光淀粉纳米晶制备方法包括：

(1)将淀粉纳米晶加入pH值＝8.0～11.0的碱性溶液中，且使所获混合体系中淀粉纳米晶的浓度为1w/v％～8w/v％，持续搅拌反应2～6h后，获得碱活化的淀粉纳米晶；

(2)将过氧化苯甲酰加入乙醇-水混合溶液中，使所获混合体系中过氧化苯甲酰的浓度为0.1w/v％～0.8w/v％，在室温下以100～400rpm的速度持续搅拌至过氧化苯甲酰全部溶解，之后加入γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，使所获混合体系中γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的浓度为1v/v％～5v/v％，水解0.5～6h，获得硅烷水解液；

(3)将步骤(1)最终所获活化的淀粉纳米晶加入步骤(2)所获硅烷水解液中，使所获混合体系中活化的淀粉纳米晶的浓度为1w/v％～8w/v％，持续搅拌反应2～6h后，进行旋蒸，再烘干，洗涤，过60～100目筛，获得改性淀粉纳米晶；

(4)将步骤(3)所获改性淀粉纳米晶加入含0.1w/v％～1.5w/v％异硫氰酸荧光素的甲醇-水混合溶液中，至所获混合体系中改性淀粉纳米晶的浓度为0.1w/v％～2.0w/v％，在室温下避光反应12～36h后，获得目标产物。

较为优选的，步骤(1)包括：将淀粉纳米晶加入强碱溶液中并持续搅拌反应后，分离出碱活化的淀粉纳米晶，再以乙醇与水的混合溶液洗涤。

较为优选的，步骤(2)中所述乙醇-水混合溶液所含乙醇的浓度为60v/v％～95v/v％。

较为优选的，步骤(3)包括：

将所述活化的淀粉纳米晶与硅烷水解液持续搅拌反应后，在真空度为-0.1～-0.06Mpa，温度为50～55℃的条件下进行旋蒸，再在40～55℃烘干3～12d，之后以水洗涤至重新分散的样品液pH值恒定，而后在40～55℃烘干，过60～100目筛，获得改性淀粉纳米晶；

较为优选的，步骤(4)中所述甲醇-水混合溶液所含甲醇的浓度为55v/v％～90v/v％。

由前述任一种方法制备的荧光淀粉纳米晶，其能够在紫外灯下发出黄绿色荧光，在490nm处有紫外-可见光谱的特征吸收峰，且在激发波长为495nm时，于520nm处具有荧光发射。

进一步的，所述荧光淀粉纳米晶的粒径为30～120nm。

进一步的，所述荧光淀粉纳米晶的光化学稳定性增强，用汞灯连续照射75min，异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度仅保留至22％～34％，而荧光淀粉纳米晶的荧光强度保留至62％～85％。

进一步的，所述的荧光淀粉纳米晶表面含有新元素Si、N、S，经XPS分析，荧光淀粉纳米晶表面新生成C-N，Si-O-C，N-C＝S化学基团。

在一些实施方案之中还提供了一种荧光检测试剂或装置，其包含所述的荧光淀粉纳米晶。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)藉由本发明的制备方法，使得自身无荧光性能的淀粉纳米晶产生了明显荧光性质，且对淀粉纳米晶本身性质无影响，拓展了淀粉的应用，而且工艺简单易操作，原料(例如作为表面改性剂的硅烷偶联剂KH-550)廉价易得，成本低廉；

(2)本发明的荧光淀粉纳米晶具有显著的荧光性质，并且相比于普通的异硫氰酸荧光素，不易降解，具有更强的光化学稳定性。用汞灯连续照射75min，异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度仅保留至22％～34％，而荧光淀粉纳米晶的荧光强度保留至62％～85％。

(3)本发明的荧光淀粉纳米晶的荧光生物相容性好，生物可降解，在生物传感器的制备、生物成像标记、荧光分析检测等领域具有应用前景，并可进一步制备成一种以有机纳米粒子为基质的新型纳米荧光探针。

(4)采用硅烷偶联剂(KH-550)作为反应中间体“桥联剂”，通过吸附、缩合、化学偶联，用一步反应法就可将活性基团氨基引入淀粉纳米晶表面，无需另外添加其他中间体“桥联剂”，反应简单，连接效率高，提高了引入表面的氨基量，使得其可有效地进一步与微量吸附甚至不能吸附在淀粉纳米晶表面的异硫氰酸荧光素反应，实现荧光淀粉纳米晶的制备。

具体实施方式

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

如前所述，鉴于现有技术的诸多不足，本案发明人经过长期而深入的研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，详见下文。

本发明的一个方面提供了一种荧光淀粉纳米晶的制备方法，其原理是：基于淀粉纳米晶表面具有活性基团羟基这一特性，以氨基硅烷偶联剂作为反应中间体“桥联剂”，通过硅烷偶联、荧光素亲电加成的两步表面化学改性方法，将微量吸附甚至不能吸附的异硫氰酸荧光素以稳定共价键连接的方式引入淀粉纳米晶表面，制备出具有荧光性质的淀粉纳米晶。

进一步的讲，本发明主要是以淀粉纳米晶为原料，采用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(KH-550)通过硅烷偶联反应对淀粉纳米晶进行表面化学偶联改性；进而以其作为桥联剂，通过亲电加成反应，将淀粉纳米晶与异硫氰酸荧光素(FITC)在甲醇水溶液中发生亲电加成反应，使氨基与异硫氰酸荧光素(FITC)的异硫氰基团(N＝C＝S)反应形成稳定的共价键连接，从而将荧光性质引入淀粉纳米晶，制备出一种生物兼容性好、生物可降解的新型荧光淀粉纳米晶。

在一较为具体的实施案例之中，所述制备方法包括如下具体步骤：

(1)淀粉纳米晶的碱活化

将1％～8％(w/v)的淀粉纳米晶加入pH＝8.0～11.0的NaOH溶液中，搅拌2～6h后用乙醇水溶液离心洗涤碱活化好的淀粉纳米晶后取出备用。

(2)硅烷偶联剂(KH-550)的水解

将0.1％～0.8％(w/v)过氧化苯甲酰加入60％～95％(v/v)乙醇水溶液中。在室温下以100～400rpm搅拌至过氧化苯甲酰全部溶解后，将1％～5％(v/v)KH-550加入反应液中水解0.5～6h。

(3)硅烷偶联剂(KH-550)对淀粉纳米晶的表面改性将步骤(1)活化的淀粉纳米晶(1％～5％，w/v)加入步骤(2)制备的硅烷水解液中，搅拌2～6h后取出旋蒸(真空度-0.1～-0.06Mpa，水浴温度50～55℃)。旋蒸完成后将样品转移至表面皿，在40～55℃烘箱中烘干3～12d。样品烘干后取出以去离子水离心洗涤样品，直至重新分散的样品液的pH值恒定。样品在40～55℃烘箱内烘干过60～100目筛。

(4)异硫氰酸荧光素(FITC)对淀粉纳米晶的表面改性

取0.1％～2.0％(w/v)的步骤(3)制备的改性淀粉纳米晶加入含有0.1％～1.5％(w/v)异硫氰酸荧光素(FITC)的200mL的55％～90％(v/v)甲醇水溶液中，在室温下避光反应12～36h后取出。用去离子水离心洗涤样品，离心后上清液用紫外-可见吸收光谱扫描，直至扫描光谱未出现特征吸收峰认定为洗涤完成。之后可取出样品在40℃烘箱内避光烘干过60～100目筛，避光储藏于4℃冰箱。

本发明的另一个方面提供了一种荧光淀粉纳米晶，其荧光性质包括：在紫外灯下发出黄绿色荧光；在490nm处可检测到紫外-可见光谱的特征吸收峰；以495nm为激发波长，2.5nm为激发狭缝波长，可在520nm处检测到与异硫氰酸荧光素相应的荧光发射光谱特征峰。

相比于异硫氰酸荧光素，本发明的荧光淀粉纳米晶具有更强的光化学稳定性。用汞灯连续照射75min，异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度仅保留至22％～34％，而荧光淀粉纳米晶的荧光强度保留至62％～85％。

进一步的，经检测，荧光淀粉纳米晶表面含有新元素N、Si、S，经XPS分析，荧光淀粉纳米晶含有新生成的C-N，Si-O-C，N-C＝S基团，证明硅烷偶联剂(KH-550)和异硫氰酸荧光素(FITC)与淀粉纳米晶形成了稳定的共价键连接。

以下将结合若干实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1将1％(w/v)的淀粉纳米晶加入pH＝8.0的NaOH溶液中，搅拌2h后用乙醇水溶液离心洗涤碱活化好的淀粉纳米晶后取出备用。将0.1％(w/v)过氧化苯甲酰加入60％(v/v)乙醇水溶液中。在室温下以100rpm搅拌至过氧化苯甲酰全部溶解后，将1％(v/v)KH-550加入反应液中水解0.5h后加入碱活化处理后的1％(w/v)淀粉纳米晶搅拌2h后取出旋蒸(真空度-0.06Mpa，水浴温度50℃)。旋蒸完成后在40℃烘箱中烘干3d。烘干完成后以去离子水离心洗涤样品，直至重新分散的样品液的pH值恒定。样品在40℃烘箱内烘干过60目筛后取0.1％(w/v)的样品加入含有0.1％(w/v)异硫氰酸荧光素(FITC)的200mL的55％(v/v)甲醇水溶液中，在室温下避光反应12h后取出。用去离子水离心洗涤样品，离心后上清液用紫外-可见吸收光谱扫描，直至扫描光谱未出现特征吸收峰。取出样品在40℃烘箱内避光烘干过60目筛，避光储藏于4℃冰箱，制备得到荧光淀粉纳米晶。

经高分比率TEM观察，所述荧光淀粉纳米晶的粒径分布范围约30～120nm，但主要集中在50nm以下。

配制0.05％(w/v)的荧光淀粉纳米晶水溶液，以495nm为激发波长，2.5nm为激发狭缝宽度测定荧光发射光谱，在547nm出可测得特征峰，其峰值的荧光强度为1.62×10⁷，在紫外灯照射下可发出黄绿色荧光。

用汞灯连续照射75min，所述荧光淀粉纳米晶的荧光强度保留约85％，而异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度仅保留约23％。同时，所述荧光淀粉纳米晶的表面含有新元素Si、N、S，经XPS分析，是荧光淀粉纳米晶表面新生成C-N，Si-O-C，N-C＝S化学基团。

实施例2将8％(w/v)的淀粉纳米晶加入pH＝11.0的NaOH溶液中，搅拌6h后用乙醇水溶液离心洗涤碱活化好的淀粉纳米晶后取出备用。将0.8％(w/v)过氧化苯甲酰加入95％(v/v)乙醇水溶液中。在室温下以400rpm搅拌至过氧化苯甲酰全部溶解后，将5％(v/v)KH-550加入反应液中水解6h后加入碱活化处理后的8％(w/v)淀粉纳米晶搅拌6h后取出旋蒸(真空度-0.1Mpa，水浴温度55℃)。旋蒸完成后在55℃烘箱中烘干12d。烘干完成后以去离子水离心洗涤样品，直至重新分散的样品液的pH值恒定。样品在55℃烘箱内烘干过100目筛后取2.0％(w/v)的样品加入含有1.5％(w/v)异硫氰酸荧光素(FITC)的200mL的90％(v/v)甲醇水溶液中，在室温下避光反应36h后取出。用去离子水离心洗涤样品，离心后上清液用紫外-可见吸收光谱扫描，直至扫描光谱未出现特征吸收峰。取出样品在40℃烘箱内避光烘干过60～100目筛，避光储藏于4℃冰箱，制备得到荧光淀粉纳米晶。同时，所述荧光淀粉纳米晶的表面含有新元素Si、N、S。配制0.05％(w/v)的荧光淀粉纳米晶水溶液，以495nm为激发波长，2.5nm为激发狭缝宽度测定荧光发射光谱，在547nm出可测得特征峰，其峰值的荧光强度为1.73×10⁷，在紫外灯照射下可发出黄绿色荧光。

实施例3将2％(w/v)的淀粉纳米晶加入pH＝9.5的NaOH溶液中，搅拌4h后用乙醇水溶液离心洗涤碱活化好的淀粉纳米晶后取出备用。将0.2％(w/v)过氧化苯甲酰加入90％(v/v)乙醇水溶液中。在室温下以150rpm搅拌至过氧化苯甲酰全部溶解后，将3％(v/v)KH-550加入反应液中水解1h后加入碱活化处理后的2％(w/v)淀粉纳米晶搅拌3h后取出旋蒸(真空度-0.1Mpa，水浴温度53℃)。旋蒸完成后在55℃烘箱中烘干9d。烘干完成后以去离子水离心洗涤样品，直至重新分散的样品液的pH值恒定。样品在55℃烘箱内烘干过60～100目筛后取0.3％(w/v)的样品加入含有0.3％(w/v)异硫氰酸荧光素(FITC)的200mL的80％(v/v)甲醇水溶液中，在室温下避光反应24h后取出。用去离子水离心洗涤样品，离心后上清液用紫外-可见吸收光谱扫描，直至扫描光谱未出现特征吸收峰。取出样品在40℃烘箱内避光烘干过60～100目筛，避光储藏于4℃冰箱，制备得到荧光淀粉纳米晶。同时，所述的荧光淀粉纳米晶，其表面含有新元素Si、N、S。配制0.05％(w/v)的荧光淀粉纳米晶水溶液，以495nm为激发波长，2.5nm为激发狭缝宽度测定荧光发射光谱，在547nm出可测得特征峰，其峰值的荧光强度为1.67×10⁷，在紫外灯照射下可发出黄绿色荧光。

本发明以有机纳米粒子淀粉纳米晶作为原料进行两步表面改性，使淀粉纳米晶具有荧光性质，进而获得了一种新型生物可降解、生物兼容性好的荧光淀粉纳米晶，拓宽了淀粉的应用范围。

以上所述仅是本发明的优选实例之一，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干细节变化，这些细节变化也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于包括：将淀粉纳米晶于碱性环境中进行碱活化处理，然后采用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷通过硅烷偶联反应对活化的淀粉纳米晶进行表面化学偶联改性，之后通过硅烷偶联改性的淀粉纳米晶表面的氨基与异硫氰酸荧光素的异硫氰基团之间的反应而将来源于异硫氰酸荧光素的荧光基团共价修饰于所述淀粉纳米晶表面，从而获得所述荧光淀粉纳米晶；其中，所述异硫氰酸荧光素的浓度为0.1w/v％～1.5w/v％。

2.根据权利要求1所述的荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于包括：

(3)将步骤(1)最终所获活化的淀粉纳米晶加入步骤(2)所获硅烷水解液中，使所获混合体系中活化的淀粉纳米晶的浓度为1w/v％～8w/v％，持续搅拌反应2～6h后，进行旋蒸，烘干，洗涤，过60～100目筛，获得改性淀粉纳米晶；

3.根据权利要求2所述的荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于步骤(1)包括：将淀粉纳米晶加入碱性溶液中并持续搅拌反应后，分离出碱活化的淀粉纳米晶，再以乙醇与水的混合溶液洗涤。

4.根据权利要求2所述的荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述乙醇-水混合溶液所含乙醇的浓度为60v/v％～95v/v％。

5.根据权利要求2所述的荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于步骤(3)包括：

将所述活化的淀粉纳米晶与硅烷水解液持续搅拌反应后，在真空度为-0.1～-0.06Mpa，温度为50～55℃的条件下进行旋蒸，再在40～55℃烘干3～12d，之后以水洗涤至重新分散的样品液pH值恒定，而后在40～55℃烘干，过60～100目筛，获得改性淀粉纳米晶。

6.根据权利要求2所述的荧光淀粉纳米晶的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述甲醇-水混合溶液所含甲醇的浓度为55v/v％～90v/v％。

7.由权利要求1-6中任一项所述方法制备的荧光淀粉纳米晶，其特征在于包括淀粉纳米晶以及通过共价键修饰于所述淀粉纳米晶表面的荧光基团，所述荧光基团包括来源于异硫氰酸荧光素的荧光基团，所述荧光淀粉纳米晶能够在紫外灯下发出黄绿色荧光，在490nm处有紫外-可见光谱的特征吸收峰，并且在激发波长为495nm时，于520nm处具有荧光发射。

8.根据权利要求7所述的荧光淀粉纳米晶，其特征在于所述纳米晶的粒径为30～120nm。

9.一种荧光检测试剂或装置，其特征在于包含权利要求7-8中任一项所述的荧光淀粉纳米晶。