CN104857521A - 一种葡萄糖响应性生物基大分子囊泡的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种葡萄糖响应性生物基大分子囊泡的制备方法，属于功能材料领域。本发明以生物基大分子，聚谷氨酸(γPGA)和壳寡糖(CS)为主要原料，用功能基团修饰大分子合成氨基苯硼酸-g-聚谷氨酸接枝共聚物(APBA-g-γPGA)及乳糖酸-g-壳寡糖接枝共聚物(GC)；以二氧化硅纳米粒子为模板，通过层层自组装，制备多层生物基大分子微球；再去除模板，制备糖响应性生物基大分子囊泡。所制得的生物基囊泡具有高稳定性、独特的空心结构和优良的生物相容性，在药物负载、控制释放等领域有着潜在的应用价值。

Description

一种葡萄糖响应性生物基大分子囊泡的制备方法
技术领域
一种葡萄糖响应性生物基大分子囊泡的制备方法，属于功能材料领域。
背景技术
生物基高分子成为生物医药的助推剂，生物医药高分子要求其具有医药功能，并且无毒，有着优良的生物相容性。壳聚糖(CS)因其分子结构中含有游离氨基，能结合酸分子，是天然多糖中的唯一碱性多糖，因而使得壳聚糖具有许多特殊的物理化学性质和生理、药理功能。作为自然界中第二大有机自然资源，壳聚糖自身具有生理适应性、生物相容性、可完全分解性、多功能反应性、立体结构、可再生性与亲水性等多种优异性能，使得壳聚糖的研究与应用越来越受到世界范围内的广泛关注，引起了工业、农业、环保等不同领域的广大科技工作者和生产技术人员的极大研究和开发兴趣。
聚谷氨酸(Polyglutamic acid,PGA)是一种具有良好的生物相容性及生物可降解性的高分子材料，可以通过化学的方法(多肽合成法)或生物的方法(微生物发酵法)来合成。PGA的主链上存在大量肽键，受环境中酶的作用，可降解生成无毒的短肽小分子和氨基酸单体，因而具有优良的生物相容性和生物可降解性。在生物体内，PGA生物相容性良好，可以被用作生物医用材料。
苯硼酸及其衍生物可以与二元醇，如葡萄糖等形成可逆的共价复合物(图1)。
苯硼酸单元与葡萄糖复合后其溶解性由原来的疏水性转变成亲水性，这种变化可使含有苯硼酸的聚合物发生相转变，从而实现被包埋药物如胰岛素的可控释放。目前已有较多的研究将设计制备了含有苯硼酸的共聚物，苯硼酸与氨基葡萄糖形成可逆的脂键实现释放胰岛素。但是，在已有的研究报道中，所用的材料为不可降解或部分不可降解或生物相容性较差的聚合物，从而限制了它们的进一步应用。
本发明利用3-氨基苯硼酸对聚谷氨酸(γPGA)进行接枝改性，同时用乳糖酸对壳寡糖(CS)进行接枝改性；再以二氧化硅为模板，利用聚谷氨酸去质子化后形成-COO﹣负离子和壳寡糖质子化后形成-NH3 ﹢正离子间的静电相互作用，通过层层自组装技术构筑了核壳结构粒子；用HF/NH4F缓冲液移除二氧化硅后形成生物基大分子囊泡。功能基团3-氨基苯硼酸(APBA)和葡萄糖之间可形成可逆酯键，赋予了囊泡葡萄糖响应性，囊泡的粒径和结构能够对外界葡萄糖刺激进行智能相应，使得在药物负载、控制释放等领域有广阔的应用前景。
发明内容
本发明旨在以二氧化硅为模板利用功能化的生物基电解质间静电相互作用制备具有葡萄糖响应性的生物基囊泡。
本发明的技术方案：基于聚谷氨酸(γPGA)和壳寡糖(CS)生物基大分子，选用具有糖响应性的3-氨基苯硼酸(APBA)对聚谷氨酸(γPGA)进行接枝改性，并将乳糖酸接入壳寡糖(CS)侧链；再以二氧化硅纳米粒子为模板，利用聚谷氨酸和壳寡糖间的静电相互作用，通过层层自组装技术构筑多层核壳结构微球；进而，用HF/NH4F缓冲液移除二氧化硅模板，得到生物基大分子囊泡。
以3-氨基苯硼酸为功能基团，通过酰胺化反应接枝改性聚谷氨酸，3-氨基苯硼酸与聚谷氨酸的摩尔配比为10：1～8，3-氨基苯硼酸的接枝率为2％～40％，所得接枝聚合物的结构为：
表示成APBA-g-γPGA。
以乳糖酸为功能基，通过酰胺化反应修饰壳寡糖，乳糖酸与壳寡糖的摩尔配比为10：1～5，乳糖酸的接枝率为2％～35％，所得聚合物的结构为：
表示成GL-g-CS。
以200nm的二氧化硅纳米粒子为模板，并用硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行胺基化；进而，将制备得到表面胺基化的二氧化硅纳米粒子分散于pH＝5的缓冲溶液中，并相继滴加入pH＝5的APBA-g-γPGA和GL-g-CS的溶液中，通过层层自组装技术多次重复，组装形成多层核壳结构微球；APBA-g-γPGA和GL-g-CS的组装层数为4～8层，多层核壳结构微球的粒径为220～260nm；最后，用HF/NH4F缓冲液移除二氧化硅模板，得到生物基大分子囊泡。
本发明的有益效果：本发明分别选用带有阴离子和阳离子的生物基大分子聚谷氨酸和壳寡糖为聚电解质，通过酰胺化反应分别接入对葡萄糖响应的苯硼酸和可与葡萄糖形成竞争反应的乳糖酸功能基团；通过调节大分子与功能基团间的配比，可以很好的控制功能基团的接入量，从而控制对糖的响应速度。以二氧化硅纳米粒子为模板，利用生物基聚合物电解质聚谷氨酸和壳寡糖之间的静电相互作用，构筑了层层自组装核壳结构粒子，用HF/NH4F缓冲液移除二氧化硅后形成囊泡。本发明中，所得囊泡具有高稳定性、独特的空心结构和优良的生物相容性，在药物负载、控制释放等领域有潜在的应用价值。
附图说明
图1APBA-g-γPGA的核磁共振谱图
图2GL-g-CS的核磁共振谱图
图3SiO2微球(a)、SiO2(APBA-g-γPGA/GL-g-CS)5核壳微球(b)和(APBA-g-γPGA/GL-g-CS)5中空囊泡(c)的透射电镜图片
具体实施方式
实施例1、二氧化硅模板的制备
二氧化硅纳米粒子：将70ml乙醇和10ml的去离子水加入250ml的圆底烧瓶中，加入5mlNH3·H2O后在1000rpm/min下搅拌0.5h混合均匀，记为混合液(一)。另取5ml正硅酸四乙酯(TEOS)和30ml乙醇，加入250ml的圆底烧瓶中在1000rpm/min下搅拌0.5h混合均匀，记为混合液(二)。然后向混合溶液(一)中加入混合液体(二)，调节转速至600rpm/min，在30℃条件下反应2h，离心分离洗涤三次后真空干燥，制备纳米二氧化硅。
氨基化二氧化硅纳米粒子：取1g纳米二氧化硅样品分散在100ml无水甲苯中，大力搅拌下缓慢滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)5ml，在110℃下冷凝回流12h。静置一段时间后，除去上层清液，用甲苯、乙醇交替离心洗涤3次，真空干燥24h。
实施例2、GL-g-CS的制备
取1.790g乳糖酸(5mmol)溶于120ml去离子水，加入共催化剂1.725gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS，15mmol)和0.960g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，5mmol)，磁力搅拌下活化0.5h。然后向溶液中加入LA等物质量的壳寡糖(5mmol)，在25℃下反应72h后，将样品透析一周，冷冻干燥。
实施例3、APBA-g-γPGA的制备
取APBA(4mmol)150mlDMSO中，加入共催化剂2.070g NHS(18mmol)和1.152g EDC(6mmol)，磁力搅拌下活化0.5h。然后向溶液中加入γPGA(6mmol)，在25℃下反应72h后，将样品透析3天后向去离子水中加入适量的NaHCO3透析一段时间将γPGA钠化，然后再透析4天，冷冻干燥。
实施例4、SiO2(APBA-g-γPGA/GL-g-CS)5的制备
将APBA-g-γPGA、GL-g-CS配制成pH＝5浓度为2mg/ml的溶液，SiO2-NH2配制成pH＝5浓度为2mg/ml的悬浮液，超声处理30min分散均匀。取20ml配制好的SiO2-NH2悬浮液先缓慢滴加到20mlγAPBA-g-γPGA溶液中，反应30min后离心分离，用pH＝5的水溶液洗涤3次后将纳米粒子再分散到pH＝5的水溶液中(20ml)，完成第一层组装。将第一层组装悬浮液滴加到20mlGL-g-CS溶液中，反应30min后离心分离，用pH＝5的水溶液洗涤3次后将纳米粒子再分散到pH＝5的水溶液中(20ml)，完成第二层组装。第三层、第四层、第五层组装方法参照第一层和第二层。第五层组装完成后，用pH＝5的水溶液离心分离洗涤3次后常温保存。
实施例5、生物基大分子囊泡的制备
取SiO2(APBA-g-γPGA/GL-g-CS)5样品40mg，加入100ml pH＝5的NH4F/HF溶液，超声分散一定时间后置于室温搅拌刻蚀12h，用去离子水离心洗涤3次，真空干燥，得到囊泡。

Claims (5)

1.一种葡萄糖响应性生物基大分子囊泡的制备方法，其特征是基于聚谷氨酸(γPGA)和壳寡糖(CS)生物基大分子，选用具有糖响应性的3-氨基苯硼酸(APBA)对聚谷氨酸(γPGA)进行接枝改性，并将乳糖酸接入壳寡糖(CS)侧链；再以二氧化硅纳米粒子为模板，利用聚谷氨酸和壳寡糖间的静电相互作用，通过层层自组装技术构筑多层核壳结构微球；进而，用HF/NH4F缓冲液移除二氧化硅模板，得到生物基大分子囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是以3-氨基苯硼酸为功能基团，通过酰胺化反应接枝改性聚谷氨酸，3-氨基苯硼酸与聚谷氨酸的摩尔配比为10：1～8，3-氨基苯硼酸的接枝率为2％～40％，所得接枝聚合物的结构为：
表示成APBA-g-γPGA。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是以乳糖酸为功能基，通过酰胺化反应修饰壳寡糖，乳糖酸与壳寡糖的摩尔配比为10：1～5，乳糖酸的接枝率为2％～35％，所得聚合物的结构为：
表示成GL-g-CS。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是模板剂为二氧化硅纳米粒子，其粒径为200nm，并用硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行胺基化；进而，将制备得到表面胺基化的二氧化硅纳米粒子分散于pH＝5的缓冲溶液中，并相继滴加入pH＝5的APBA-g-γPGA和GL-g-CS的溶液中，多次重复，组装形成多层核壳结构微球；APBA-g-γPGA和GL-g-CS的组装层数为4～8层，多层核壳结构微球的粒径为220～260nm。
5.根据权利要求1所述的制备方法得到的生物基大分子囊泡，其特征是3-氨基苯硼酸(APBA)和葡萄糖之间可形成可逆酯键，使该囊泡具有葡萄糖响应性；通过控制大分子与功能基团的配比，可以控制功能基团大分子中的接入量，从而实现控制对糖的响应速度；且囊泡具有高稳定性、独特的空心结构和优良的生物相容性，在药物负载、控制释放等领域有潜在的应用价值。
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