CN109485845B - 一种疏水改性聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用 - Google Patents

一种疏水改性聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种疏水改性γ‑聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用；将γ‑聚谷氨酸在1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的作用下，与R‑NH2反应；将反应液透析后，旋蒸浓缩后冻干得到产物γ‑PGA‑R。本发明的疏水改性γ‑聚谷氨酸促进海藻糖载入细胞；可以促进海藻糖载入细胞的γ‑聚谷氨酸改性物，在细胞冻存时，配合海藻糖使用，从而提高细胞的冷冻存活率。改性γ‑PGA‑R产物可以有效地促进海藻糖载入细胞内，使细胞的冷冻存活率达到80％以上。应用于生物医用材料领域。

Description

一种疏水改性聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞 的应用
技术领域
本发明涉及一种疏水改性γ-聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用，属于生物医用材料领域。
背景技术
天然产物γ-聚谷氨酸(γ-PGA)由于其生物降解性、无毒、无免疫原性等特性，可应用于生物医药领域。通过改性，γ-PGA可应用在疫苗佐剂以及药物载体领域。Akagi课题组通过在侧基上接枝聚乳酸、苯丙氨酸乙酯等对γ-PGA进行改性，改性产物在水溶液中能够形成纳米粒子，作为药物和蛋白质载体使用(Y.Zhu,T.Akagi,M.Akashi.Self-assembling stereocomplex nanoparticles by enantiomeric poly(γ-glutamicacid)-poly(lactide)graft copolymers as a protein deliverycarrier.Macromolecular Bioscience,2014,14(4):576-587；H.Shen,T.Akagi,M.Akashi.Polyampholyte nanoparticles prepared by self-complexation ofcationized poly(γ-glutamic acid)for protein carriers.MacromolecularBioscience,2012,12(8):1100-1105)。Gonzalo等用聚乙二醇改性聚谷氨酸，改性后的产物用于药物载体(T.Gonzalo,G.Lollo,M.Garciafuentes,et al.A new potential nano-oncological therapy based on polyamino acid nanocapsules.Journal ofControlled Release,2013,169(1-2):10-16)。
海藻糖是葡萄糖的二聚体，是一种非还原性二糖，化学性质稳定，无毒副作用，在低温、干燥状态下对生物材料有保护作用，能稳定生物膜，被用作低温生物领域的保护剂。研究证明，细胞内外同时含有海藻糖的情况下，海藻糖才能最大限度的发挥保护作用。由于海藻糖的非膜渗透性，需采用特殊办法将之载入红细胞内。通过调控渗透压、电穿孔等方法将海藻糖载入红细胞，但是，细胞内的海藻糖载入量不理想，难以形成有效地保护。Slater课题组合成了一种pH响应性聚合物，可以与红细胞膜作用促进海藻糖载入细胞内，使红细胞的冻存存活率得到有效提高(A.L.Lynch,R.Chen,N.K.H.Slater.pH-responsivepolymers for trehalose loading and desiccation protection of human red bloodcells.Biomaterials,2011,32:4443-4449)。
发明内容
本发明制备了一种疏水改性的γ-聚谷氨酸，具有生物相容性和生物降解性。使用苯乙胺、二甲氧基苯乙胺对γ-聚谷氨酸进行疏水改性，改性后的产物γ-PGA-R与细胞膜的作用是可逆的，从而不会对细胞膜造成损伤，可用于红细胞以及干细胞等有核细胞的冻干保护使用。这种通过疏水改性的γ-聚谷氨酸促进海藻糖载入细胞内的方法尚未见报道。
本发明的技术方案如下：
一种疏水改性γ-聚谷氨酸，结构式为：
Figure BDA0001798540710000021
改性γ-聚谷氨酸合成反应方程式为：
Figure BDA0001798540710000022
改性γ-聚谷氨酸名称缩写为γ-PGA-R；x取值0.05≤x≤0.50。
R为芳香基团，可列举如下：
Figure BDA0001798540710000023
本发明的γ-聚谷氨酸的制备方法；其特征是包括如下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下，与R-NH2反应；
(2)将反应液透析后，旋蒸浓缩后冻干得到产物γ-PGA-R。
所述γ-聚谷氨酸(γ-PGA)分子量为10～1000kDa；优选分子量10～100kDa。
所述步骤(1)中将γ-聚谷氨酸中的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比为1:1～2:1～2溶于0.01～0.1M浓度的NaHCO3水溶液，向其中加入溶有R-NH2的二甲基亚砜溶液；其中溶有R-NH2的二甲基亚砜溶液与NaHCO3水溶液体积相等；体系中γ-聚谷氨酸中的羧基的终浓度为12～300mM，在低温搅拌0.5～2h，之后再在室温反应2～48h。
所述步骤(2)是将反应液装入透析袋透析3天以上，去除水溶性小分子，旋蒸浓缩后冻干24h以上。
本发明γ-PGA-R应用于促进海藻糖载入细胞。
应用方法是：浓度为0.025～1mg/mL的γ-PGA-R在pH为6.0～7.4的PBS水溶液中组装成尺寸为1～100nm的纳米粒子，疏水性侧基与细胞膜相作用，使得海藻糖载入细胞内，从而提高细胞内海藻糖的浓度，提高细胞的冷冻存活率。细胞的冷冻存活率达到80％以上。
本发明公开一种疏水改性γ-聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用；将γ-聚谷氨酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下，与苯乙胺、二甲氧基苯乙胺反应，对γ-聚谷氨酸进行疏水改性，得到接枝率在5～50％之间水溶性的改性产物γ-PGA-R。γ-PGA-R可以在PBS缓冲水溶液中自组装成1～100nm的纳米粒子，能够与细胞膜相互作用，可以促进海藻糖载入细胞的γ-聚谷氨酸改性物，在细胞冻存时，配合海藻糖使用，从而提高细胞的冷冻存活率。改性γ-PGA-R产物可以有效地促进海藻糖载入细胞内，使细胞的冷冻存活率达到80％以上，最好效果达到90％左右。
附图说明
图1：用苯乙胺(PEA)改性γ-聚谷氨酸得到的产物PGA-g-PEA的核磁氢谱图(对应实施例3)；
图2：用二甲氧基苯乙胺(DA)改性γ-聚谷氨酸得到的产物PGA-g-DA的核磁氢谱图(对应实施例16)。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述,以下实施案例是对本发明的进一步说明,并不限制本发明的适用范围。
(1)γ-PGA-R的制备
将γ-聚谷氨酸中的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比为1:1～2:1～2溶于0.01～0.1M浓度的NaHCO3水溶液，向其中加入溶有R-NH2的二甲基亚砜溶液。其中溶有R-NH2的二甲基亚砜溶液与NaHCO3水溶液体积相等。体系中γ-聚谷氨酸中的羧基的终浓度为12～300mM，在低温搅拌0.5～2h，之后再在室温反应2～48h。
将反应液装入透析袋透析3天以上，去除水溶性小分子，旋蒸浓缩后冻干24h，得到白色絮状固体。
(2)γ-PGA-R核磁氢谱测定
将γ-PGA-R溶于D2O，采用Varian Inova 500MHz核磁共振波谱仪表征合成产物。
(3)γ-PGA-R在缓冲液中粒径大小的测定
将γ-PGA-R溶于pH为6.0～7.4的等渗PBS缓冲液中，使γ-PGA-R浓度为0.025～1mg/mL，在室温放置48h以上，使用粒度电位仪测定其粒径大小。
(4)红细胞冷冻存活率测定
使用100μL绵羊红细胞，0.5mL的γ-PGA-R水溶液，0.5mL的不同pH值的PBS等渗溶液的0.72M海藻糖溶液。以对应pH值的0.5mL海藻糖PBS溶液为阴对照，以1mL去离子水为全溶血阳对照。将冻存管在37℃水浴中孵化7h，之后放入液氮中冷冻过夜。将冻存管从液氮中取出，在37℃水浴中快速解冻，离心后取上层液测其OD值。红细胞的冷冻存活率按下面公式计算，冷冻存活率大于80％。
Figure BDA0001798540710000041
实施例1：γ-聚谷氨酸-接枝-苯乙胺(PGA-g-PEA)的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.11g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析四天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为12％，缩写为PGA-g-PEA12，结构式为：
Figure BDA0001798540710000042
其中x＝0.12；R为：
Figure BDA0001798540710000043
实施例2：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的0.1mg/mL PGA-g-PEA12的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～30nm范围内。在该pH值下用PGA-g-PEA12促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为87％。
实施例3：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.01M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.18g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌1h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干36h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为20％，缩写为PGA-g-PEA20，结构式为：
Figure BDA0001798540710000044
其中x＝0.20。R为：
Figure BDA0001798540710000045
PGA-g-PEA20的核磁氢谱图如图1所示，特征峰为a、b、c、d、e、f。
实施例4：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的1mg/mL PGA-g-PEA20的PBS溶液，静置50h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～30nm范围内。在该pH值下用PGA-g-PEA20促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为87％。
实施例5：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.44g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为50％，缩写为PGA-g-PEA50，结构式为：
Figure BDA0001798540710000051
其中x＝0.50。R为：
Figure BDA0001798540710000052
实施例6：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的0.5mg/mL的PGA-g-PEA50的PBS溶液，静置60h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-PEA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％～90％之间。
实施例7：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.6的0.7mg/mL的PGA-g-PEA50的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-PEA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％～90％之间。
实施例8：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为7.0的1mg/mL的PGA-g-PEA50的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-PEA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％～90％之间。
实施例9：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为7.4的1mg/mL的PGA-g-PEA50的PBS溶液，静置55h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-PEA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％～90％之间。
实施例10：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.05M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入1.17g EDC和0.7g NHS，向其中加入50mL溶有0.15g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌0.5h，室温反应2h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析四天，旋蒸浓缩后冻干30h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为5％，缩写为PGA-g-PEA5，结构式为：
Figure BDA0001798540710000061
其中x＝0.05。R为：
Figure BDA0001798540710000062
实施例11：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的1mg/mL PGA-g-PEA5的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～10nm范围内。在该pH值下用PGA-g-PEA5促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％。
实施例12：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.7M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入1.8g EDC和1.1g NHS，向其中加入50mL溶有0.21g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌1.3h，室温反应48h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为18％，缩写为PGA-g-PEA18，结构式为：
Figure BDA0001798540710000063
其中x＝0.18。R为：
Figure BDA0001798540710000064
实施例13：PGA-g-PEA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的1mg/mL PGA-g-PEA18的PBS溶液，静置55h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～30nm范围内。在该pH值下用PGA-g-PEA18促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为85％。
实施例14：γ-聚谷氨酸接枝二甲氧基苯乙胺(PGA-g-DA)的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4gNHS，向其中加入50mL溶有0.22g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌0.5h，室温反应48h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干30h。
得到的PGA-g-DA接枝率为15％，缩写为PGA-g-DA15，结构式为：
Figure BDA0001798540710000071
其中x＝0.15。R为：
Figure BDA0001798540710000072
实施例15：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的0.5mg/mL的PGA-g-DA15的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～30nm范围内。在该pH值下用PGA-g-DA15促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率在80～85％之间。
实施例16：PGA-g-DA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.33g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌1h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-DA接枝率为20％，缩写为PGA-g-DA20，结构式为：
Figure BDA0001798540710000073
其中x＝0.20。R为：
Figure BDA0001798540710000074
PGA-g-DA20的核磁氢谱图如图2所示，特征峰为a、b、c、d、e、f、g。
实施例17：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的0.25mg/mL的PGA-g-DA20的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～30nm范围内。在该pH值下用PGA-g-DA20促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率大于80％。
实施例18：PGA-g-DA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.88g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应20h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-DA接枝率为50％，缩写为PGA-g-DA50，结构式为：
Figure BDA0001798540710000081
其中x＝0.50。R为：
Figure BDA0001798540710000082
实施例19：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的1mg/mL的PGA-g-DA50的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-DA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率都在80％～90％之间。
实施例20：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.6的0.7mg/mL的PGA-g-DA50的PBS溶液，静置60h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-DA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率都在80％～90％之间。
实施例21：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为7.0的1mg/mL的PGA-g-DA50的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-DA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率都在80％～90％之间。
实施例22：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为7.4的0.5mg/mL的PGA-g-DA50的PBS溶液，静置55h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在100nm左右。在该pH值下用PGA-g-DA50促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率都在80％～90％之间。
实施例23：PGA-g-DA的合成
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.09M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入2.34g EDC和1.4g NHS，向其中加入50mL溶有0.11g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应2h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析四天，旋蒸浓缩后冻干30h。
得到的PGA-g-DA接枝率为5％，缩写为PGA-g-DA5，结构式为：
Figure BDA0001798540710000091
其中x＝0.05。R为：
Figure BDA0001798540710000092
实施例24：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为6.0的0.025mg/mL的PGA-g-DA5的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在1～10nm范围内。在该pH值下用PGA-g-DA5促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率约为80％。
实施例25：PGA-g-DA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于1gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入1.8g EDC和1.1gNHS，向其中加入50mL溶有0.66g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应2h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-DA接枝率为31％，缩写为PGA-g-DA31，结构式为：
Figure BDA0001798540710000093
其中x＝0.31。R为：
Figure BDA0001798540710000094
实施例26：PGA-g-DA促进海藻糖载入细胞的应用
配制pH值为7.4的0.7mg/mL的PGA-g-DA31的PBS溶液，静置48h后，使用粒度电位仪测定溶液中粒子的粒径在50nm左右。在该pH值下用PGA-g-DA31促进海藻糖载入红细胞，细胞冷冻存活率在80％～90％之间。
实施例27：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于0.2gγ-PGA的50mL 0.1M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入0.47g EDC和0.28g NHS，向其中加入50mL溶有0.02g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析四天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为6％，缩写为PGA-g-PEA6，结构式为：
Figure BDA0001798540710000101
其中x＝0.06。R为：
Figure BDA0001798540710000102
实施例28：PGA-g-PEA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于5gγ-PGA的50mL 0.09M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入11.7g EDC和7g NHS，向其中加入50mL溶有0.55g苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌2h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干36h。
得到的PGA-g-PEA接枝率为13％，缩写为PGA-g-PEA13，结构式为：
Figure BDA0001798540710000103
其中x＝0.13。R为：
Figure BDA0001798540710000104
实施例29：PGA-g-DA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于0.5gγ-PGA的50mL 0.05M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入1.17g EDC和0.7g NHS，向其中加入50mL溶有0.17g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌1h，室温反应24h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析四天，旋蒸浓缩后冻干24h。
得到的PGA-g-DA接枝率为19％，缩写为PGA-g-DA19，结构式为：
Figure BDA0001798540710000105
其中x＝0.19。R为：
Figure BDA0001798540710000106
实施例30：PGA-g-DA的制备
1.在250mL烧瓶中加入溶于3gγ-PGA的50mL 0.01M的NaHCO3水溶液，然后向其中加入7.02g EDC和4.2g NHS，向其中加入50mL溶有1.0g二甲氧基苯乙胺的二甲基亚砜溶液，在4℃搅拌1h，室温反应36h。
2.将反应液倒入10kDa透析袋透析三天，旋蒸浓缩后冻干36h。
得到的PGA-g-DA接枝率为21％，缩写为PGA-g-DA21，结构式为：
Figure BDA0001798540710000111
其中x＝0.21。R为：
Figure BDA0001798540710000112
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换，均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种疏水改性的γ-聚谷氨酸，其结构式为：
Figure FDA0002946801590000011
改性γ-聚谷氨酸名称缩写为γ-PGA-R，其分子量为10～1000kDa；x取值0.05≤x≤0.50，R为芳香基团,选择如下结构中的一种或多种：
Figure FDA0002946801590000012
2.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸的制备方法；其特征是将γ-聚谷氨酸中的羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比＝1:1～2:1～2溶于0.01～0.1M浓度的NaHCO3水溶液，向其中加入溶有R-NH2的二甲基亚砜溶液；其中溶有R-NH2的二甲基亚砜与水溶液体积相同；体系中γ-聚谷氨酸中的羧基终浓度为12～300mM；在低温搅拌0.5～2小时，之后再在室温下反应2～48小时；将反应液装入透析袋透析3天以上，旋蒸浓缩后冻干24h以上得到产物γ-PGA-R。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是γ-聚谷氨酸分子量为10～100kDa。
4.如权利要求1所述的疏水改性的γ-聚谷氨酸在促进海藻糖载入细胞中的应用。
5.如权利要求4的应用，其特征是浓度为0.025～1mg/ml的γ-PGA-R在pH为6.0～7.4的PBS水溶液中组装成尺寸为1～100nm的纳米粒子，疏水性侧基与细胞膜相作用，使得海藻糖载入红细胞内，从而提高红细胞内海藻糖的浓度，提高红细胞的冷冻存活率。
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