WO2017107486A1

WO2017107486A1 - 可还原降解超支化聚合物纳米胶束及其制备方法和应用

Info

Publication number: WO2017107486A1
Application number: PCT/CN2016/092187
Authority: WO
Inventors: 倪才华; 周亚敏; 张丽萍; 石刚
Original assignee: 江南大学
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-06-29
Also published as: US10576038B2; CN105395483A; US20180360753A1; CN105395483B

Abstract

一种可还原降解的超支化聚合物纳米胶束及其制备方法和应用。以胱胺与聚乙二醇二缩水甘油醚通过亲核加成机理进行聚合反应，一步合成得到胱胺与聚乙二醇结构单元交替出现的超支化聚合物，然后在透析的过程中通过自组装形成超支化纳米胶束。超支化聚合物链段中同时含有叔氨基及双硫键结构单元，具有pH和还原响应性，超支化三维空腔结构赋予纳米胶束载药性能。

Description

可还原降解超支化聚合物纳米胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术

纳米药物载体可以通过肿瘤组织的高渗透和滞留(EPR)效应实现药物对肿瘤组织的被动靶向性，这大大提高了药物利用率并降低了游离药物对正常组织的毒副作用。其中，聚合物纳米胶束作为药物载体又具有增溶疏水性药物、提高药物稳定性、缓释药物等优势。

为了达到使药物在肿瘤组织处靶向释放的目的，目前研究较多的是具有环境(如pH、还原电势、酶等)智能响应性的生物可降解载体。近年来，一研究者对具有环境智能响应性超支化聚合物有了较多的研究，经发现，此类超支化聚合物具有新颖的结构和独特的性能，如高溶解性、低粘度、内部具有空腔三维球形结构等，而结构中大量存在的空腔可以在疏水载药的过程中提高药物的载药量。而且，超支化聚合物本身在肿瘤细胞环境内受酸或还原性刺激会被降解为无毒性的小分子并释放出药物。

然而，目前文献报导的此类具有环境响应性超支化聚合物的合成方法通常需要多步来完成，且需要用到大量有机溶剂，因而使得此类材料在生物医用应用方面受到诸多限制。此外，目前报道的多数超支化聚合物纳米胶束不具有还原响应性，不可避免地会在体内残留。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束及其制备方法和应用，该制备方法通过在水相中一步合成超支化聚合物纳米胶束，该超支化聚合物纳米胶束具有良好的生物相容性，且在体内可完全降解，无残留。

在一方面，本发明提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束，形成由聚乙二醇和二硫键交替出现的多核-壳结构。为了制得外围基团以氨基为主的超支化聚合物，优选将反应物胱胺的摩尔数调整为聚乙二醇二缩水甘油醚摩尔数的两倍或以上，以保证氨基过量。聚合物超支化结构及交替出现的聚乙二醇和二硫键具有各自的功能作用：(1)超支化三维空腔结构可以有效提高对疏水性药物的载药率；(2)聚乙二醇段具有优异的生物相容性且柔韧性及亲水性良好，可以作为多核-壳结构胶束的亲水段；(3)胱胺结构单元可以作为多核-壳胶束的疏水段来包载疏水性药物；(4)二硫键在正常细胞非还原性环境中稳定，但在肿瘤还原性环境中发生断裂，使胶束具有还原响应性。

为了有效平衡超支化聚合物的亲水性和可成胶束性，本发明中采用分子量为218～482的聚乙二醇二缩水甘油醚作为反应物。

在另一方面，本发明还提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：

(1)用碱中和胱胺二盐酸盐，得到胱胺；

(2)将聚乙二醇二缩水甘油醚和胱胺在溶剂中发生亲核加成反应，得到超支化聚合物；

(3)透析步骤(2)得到的超支化聚合物，得到可还原降解超支化聚合物纳米胶束。

进一步地，在步骤(1)中，碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、四乙基氢氧化铵、三乙胺中的一种或几种。

具体地，用氢氧化钠溶液在冰浴下中和胱胺二盐酸盐。

更具体地，在步骤(1)中，还包括对产物进行萃取的步骤，萃取剂为乙醚和四氢呋喃的混合溶剂。

进一步地，在步骤(2)中，优选分子量为218～482的聚乙二醇二缩水甘油醚作为反应物，可以有效平衡超支化聚合物的亲水性和可成胶束性，更优选分子量为350的聚乙二醇二缩水甘油醚。

进一步地，在步骤(2)中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为0.5～3:1，优选2～3:1。胱胺过量可以制得外围以氨基为主的超支化聚合物。

在一些具体实施例中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为3:1、2:1、2:2或2:3，优选3:1或2:1。

进一步地，在步骤(2)中，亲核加成反应温度为60～70℃，优选60～65℃。

进一步地，亲核加成反应的时间为20～30h。

优选地，亲核反应在60℃油浴锅中进行24h。

进一步地，在步骤(2)中，所述溶剂选自水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、四氢呋喃、1,4二氧六环、二甲亚砜中的一种或几种。

优选地，上述水为去离子水或蒸馏水。

进一步地，在步骤(3)中，使用截留分子量为3500～7000的透析袋进行透析，透析时间为48～72小时。透析袋的目的在于除去未反应的小分子和低聚物，因为分子量太低的聚合物不易形成胶束，透析袋有各种规格，选择截留分子量大于3500的透析袋可达到目的。

进一步地，透析使用的溶剂为水，优选超纯水、去离子水或蒸馏水。

优选地，选用截留分子量为3500的透析袋在超纯水中透析超支化聚合物不少于48小时。

胱胺分子中含两个端氨基，而聚乙二醇二缩水甘油醚分子中含两个端环氧基团，氨基和环氧基团可以发生典型的亲核加成反应。当参与聚合反应的氨基基团摩尔数大过量时，可以得到外围为氨基封端的超支化聚合物。因此本发明中，胱胺的摩尔数优选是聚乙二醇二缩水甘油醚摩尔数的两倍或以上，该超支化聚合物链段中同时含有伯胺、仲胺和叔胺和二硫键结构单元。

本发明还提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束在制备化疗药物载体中的应用。谷胱甘肽是一种含巯基的还原性三肽，其在肿瘤细胞内的浓度比在体液和正常细胞内高100到1000倍。载药纳米胶束进入肿瘤细胞内，在谷胱甘肽的还原作用下，聚合物中的双硫键快速断裂，聚合物发生降解，释放出药物；同时肿瘤细胞内呈弱酸性环境，该纳米胶束含大量的伯胺、仲胺和叔胺，因此该纳米胶束同时具有pH和还原敏感性，在肿瘤细胞内环境刺激下胶束结构遭到破坏，促使药物释放。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.由于该共聚物链段中同时含有伯胺、仲胺、叔胺和二硫键等结构单元，因而具有灵敏的pH和还原响应性，在肿瘤细胞内部的弱酸性和还原性环境中，胶束结构遭到破坏，实现药物在病灶处释放。

2.二硫键位于超支化聚合物骨架中，纳米胶束进入肿瘤细胞后，在细胞内高浓度谷胱甘肽的作用，二硫键断裂，使该纳米胶束在体内完全降解为小分子，小分子可轻易被肾脏排除出体外，因此作为抗癌药物载体具有实际的应用价值。

3.纳米胶束无细胞毒性，满足人体使用的安全性标准。

4.利用亲核加成水相中一步合成高聚物，方法简便、条件温和，不需要任何催化剂和其他有机溶剂，无副产物产生，反应完全，产物纯净。

5.超支化聚合物独特的三维空腔结构，有利于提高胶束的载药量。

附图说明

图1为本发明中胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的反应路线示意图。

图2为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束的扫描电镜照片，其中a、b、c、d分别代表胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚摩尔比为3:1，2:1，2:2和2:3时所得到的可还原降解超支化聚合物纳米胶束。

图3为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束在pH 7.4下的临界胶束浓度，其中C为聚合物胶束浓度，单位：mg/mL，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2:1。

图4为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束在10mM的谷胱甘肽溶液中不同时间下的粒径变化，其中胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2:1。

图5为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束溶液的酸碱滴定曲线图。

图6为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束直径随pH变化图，其中胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2:1。

图7为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束的细胞毒性柱状图，其中胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2:1。

图8为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束所载药物甲氨蝶呤的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。应理解的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

实施例1

(1)制备胱胺

称取12.15g粉末状胱胺二盐酸盐溶于16mL去离子水，再加入60mL乙醚和24mL四氢呋喃，搅拌均匀得到混合液。冰浴下将40％NaOH溶液(66.7mL)逐滴滴入上述混合液中，磁力搅拌1h后萃取分离，取上层有机相。再用50mL乙醚及18mL四氢呋喃的混合溶剂萃取下层水相。合并有机相，称取4g NaOH干燥2h，过滤后真空旋蒸除去易挥发的乙醚和四氢呋喃，最终得到6.2g无色油状胱胺，产率为75.5％。

(2)制备超支化聚合物

将304mg胱胺溶于8mL超纯水中，磁力搅拌使其完全溶解，向其中滴加聚乙二醇二缩水甘油醚350mg的水溶液(8mL)，在60℃下磁力搅拌反应24h，得到超支化聚合物CP21溶液。胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的合成路线如图1所示。

按照上述步骤，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚在水溶液中以不同摩尔比制得4种超支化聚合物CP31、CP21、CP22和CP23，如表1所示。

表1

(3)制备可还原降解超支化聚合物纳米胶束

将步骤(2)得到的超支化聚合物溶液倒入透析袋(MWCO 3500)中，在超纯水中透析3天，每隔4h换一次透析液，最终得到超支化聚合物纳米胶束。透析袋的截留分子量根据具体使用过程可相应调整，通常不低于3500。图2展示了可还原降解超支化聚合物纳米胶束的扫描电镜照片，其中a-d分别对应表1中CP31、CP21、CP22、CP23这4种聚合物，可见该纳米胶束形貌基本为球形，粒径分布比较均一。

将纳米胶束溶液冷冻干燥，可制得相应可还原降解超支化聚合物干粉。

根据注射剂型纳米胶束不同尺寸的应用需要，可以调节胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比，以得到不同粒径的纳米胶束。胱胺、聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2：1的情况下，纳米胶束的粒径较为中等且形貌规整，具有代表性，且不同粒径下纳米胶束的化学性质较为一致，因此，本发明后续提到的纳米胶束，在未特殊说明的情况下，均指该比例下的纳米胶束。

可还原降解超支化聚合物纳米胶束临界胶束浓度的测量

将实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21纳米胶束配制不同浓度溶液。移取超支化聚合物纳米胶束溶液4mL，分别加入30μL浓度为1.622×l0^-5g/mL芘的丙酮溶液，振荡数次使溶液均匀，待丙酮全部挥发完用荧光分光光度计测定发射光谱，激发波长设为330nm，激发和发射的狭缝宽度都为5nm，扫描范围λ＝350～500nm。通过测定一系列不同浓度纳米粒子溶液的两个峰的荧光强度，并以浓度对数为X轴，I₁/I₃为Y轴作图，结果见图3。由图3可以看出，聚合物胶束CP21的CMC值很低，仅为3.98mg/L，故其具有很强的抗稀释能力。

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的还原敏感性

将实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21纳米胶束置于浓度为10mmol/L的谷胱甘肽溶液中，其中纳米胶束中胱胺：聚乙二醇二缩水甘油醚为2:1，在不同时间用激光光散射仪测试纳米胶束的粒径变化，观察还原响应性；结果如图4所示。纳米胶束在10mmol/L的谷胱甘肽(GSH)溶液中，6小时后粒径变小，说明大部分二硫键断裂，胶束结构遭到破坏。

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的pH敏感性

(1)取50mg实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21干粉溶于5mL 150mmol/L NaCl溶液中，缓慢滴加1.0mol/L HCl溶液调节pH至2.0，接着用0.1mol/LNaOH溶液滴定溶液，绘制滴定曲线，其中，5mL 150mmol/LNaCl溶液作为对照组。结果如图5所示，NaCl溶液无缓冲平台，故其几乎无pH缓冲能力；而超支化聚合物溶液的酸碱滴定曲线在pH由7.4降至5.0期间呈平缓下降，且随着胱胺用量的增加，这种缓冲能力得到明显提升，在图5 上表现为曲线坡度更为平缓。因此，超支化聚合物具有很好的pH响应能力。

(2)以实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21干粉为研究对象。分别采用0.1mol/L的HCl(aq)和0.1mol/L的NaOH(aq)调节pH在2-12的范围内，由DLS测定其粒径及粒径分布。其中纳米胶束中胱胺、聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2:1。如图6所示，聚合物在极碱和极酸条件下，粒径改变不大；而当聚合物由中性pH＝7.4进入到肿瘤处溶酶体pH＝5.0环境下，粒径由119nm增大至260.7nm，这是因为聚合物骨架结构中大量存在的叔胺、仲胺、伯胺基团在酸性条件下会大量吸附质子氢，整个聚合物高度正电性，内部的静电斥力使其体积膨胀粒径增大。

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的生物相容性

以实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21干粉为研究对象。用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基将3T3细胞和Hela细胞分别种植于96孔板上(1×10⁴cells/mL)，37℃下培养24h后弃去培养液，向孔中加入100μL不同浓度的未载药的空白胶束，每组设6个复孔，培养24h后弃去培养基，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h后，弃去培养板中的溶液，每孔加入150μL DMSO，摇匀，用酶标仪于570nm处测定吸光度，并计算细胞存活率。如图7所示，3T3和Hela两种细胞在不同浓度的纳米胶束溶液中的存活率在92％～110％之间，在相同条件下两种细胞的存活率数据比较接近；随着纳米胶束浓度的增加，细胞存活率虽有所下降，但是总体上均大于90％，符合生物相容性的标准。

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的载药性能

以实施例1中所得可还原降解超支化聚合物CP21纳米胶束为研究对象。

(1)制备载药胶束

取0.5mg/mL超支化聚合物CP21纳米胶束溶液20mL，向其中添加0.1mg/mL甲氨蝶呤溶液10mL，室温下避光磁力搅拌24h后转入透析袋(MWCO3500)透析24h，每隔3h换一次透析液，将载药胶束用0.45μm微孔滤膜避光过滤，所得产物为淡黄色载药聚合物胶束。

(2)超支化聚合物胶束的载药率

准确称取5.6mg经透析并冷冻干燥后的载药聚合物胶束溶解在DMSO中，超声1h，在容量瓶中定容至10mL，用紫外光度计在388nm处测其吸光度，通过甲氨蝶呤在标准曲线(如图8所示)的线性方程计算出药物在DMSO中的浓度，并通过下列公式计算出聚合物胶束的载药率。

载药率：

式中，W_D——载药胶束中药物的质量，mg；

W_S——载药胶束的质量，mg；

经计算，超支化聚合物CP21对甲氨蝶呤的载药率(LR)为10.32wt％。可见聚合物超支化三维空腔结构可以大大提高胶束的载药率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：

(1)用碱中和胱胺二盐酸盐，得到胱胺；

(2)胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚在溶剂中发生反应，得到超支化聚合物；

(3)透析步骤(2)得到的超支化聚合物，得到所述可还原降解超支化聚合物纳米胶束。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、四乙基氢氧化铵、三乙胺中的一种或几种。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，聚乙二醇二缩水甘油醚的分子量为218～482。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为0.5～3:1。
根据权利要求4所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为2～3:1。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，反应的温度为60～70℃。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述溶剂选自水、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、四氢呋喃、1,4二氧六环、二甲亚砜中的一种或几种。
根据权利要求7所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述水为去离子水或蒸馏水。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，使用截留分子量为3500～7000的透析袋透析超支化聚合物。
根据权利要求1所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，透析使用的溶剂为超纯水、去离子水或蒸馏水。
一种如权利要求1-9中任一项所述制备方法制得的可还原降解超支化聚合物纳米胶束。
如权利要求10所述的可还原降解超支化聚合物纳米胶束在制备化疗药物载体中的应用。