CN105505910A - 一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法 - Google Patents

一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，该方法包括以下步骤：（1）向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；（2）？将上步得到的粗乳液在5~？30kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4oC下交联0.5～4h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子。本发明的制备工艺简单，条件温和，酶活回收率在50%以上。重复使用10次后，酶活还可达到初始酶活的45%左右。同游离酶相比，储藏稳定性也更好。

Description

一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法
技术领域
本发明属于固定化酶领域，特别是一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法。
背景技术
与传统的化学催化相比，酶催化具有温和的转化条件、高的反应速率、优异的选择性等优点，催化过程具有能耗低、物耗少、环境友好等优点。在大力倡导流程工业绿色化、节能减排的新形势下，酶催化将在大宗化学品、精细化学品的工艺取代以及环境化学等方面发挥日益重要的作用。但由于以下方面的约束，限制了酶催化更广泛的应用：(1)脱离了细胞内的微环境，酶在细胞外对温度和pH耐受范围窄、适应性差、易失活等；(2)酶提取纯化的费用较高，而在应用过程中重复利用率低、操作稳定性差、造成酶催化成本较高；(3)对非天然底物的催化活性低。因此，如何最大限度地提高酶在胞外环境中的活性和稳定性、使其更有效的适应非生理催化环境、实现高效催化是新一代工业生物催化技术发展的重要课题。其中采用新颖的固定化酶技术、改造和发展高效固定化酶催化剂是解决以上问题的重要途径。
球化酶(Spherezyme)技术是一种无载体固定化酶技术。首先将含有酶的水相分散在含有活性剂的油相当中进行，形成了油包水的乳液，这个过程称为乳化；然后加入交联剂，使得蛋白分子之间通过交联剂连接稳定成球，经过交联的过程得到球化酶，如图1所示。由于这种技术是在交联酶聚集体技术的基础上发展而来，在具备交联酶聚集体技术的所有优势的同时，也在一定程度上克服了其粒径不可控，机械强度差等缺点，具有较高的比酶活。球化酶在水油两相中形成，可以在一定程度上影响酶的方向，有利于酶在两相界面上定位。球化酶技术形成的是粒径可控的球状结构，有利于固定化酶在反应体系中的分散，且球状结构拥有较大的比表面积更利于固定化酶与底物接触反应。同时，球化酶的制备过程简单，成本低廉。Brady等采用的球化酶技术，是将乳化法与交联酶聚集体技术结合制备出0.5-10μm的脂肪酶微球，此微球可进一步团聚形成100μm左右的团聚体，在一定程度上实现了无载体固定化酶的可控制备，但由于该方法采用的是传统的乳化技术，乳液液滴和固定化酶微球可控制备性差。因此本发明采用新的乳化方法---膜乳化技术，以此为基础，利用球化酶技术对腈水合酶进行固定化。
腈水合酶(Nitrilehydratase，EC4.2.1.84)是一种可以将腈类物质转化为酰胺类物质的酶，例如：在全细胞或者游离的腈水合酶的催化作用下，丙烯腈可以转化为丙烯酰胺；3-腈基吡啶可以转化为烟酰胺。酰胺类物质在有机合成、医药、农药等方面有着十分重要的应用。同全细胞相比，游离的腈水合酶更受青睐，因为它具有严格的化学、区域和对映选择性及底物专一性。但是，游离酶的使用通常会因为价格昂贵，温度、pH和操作稳定性低，难以回收利用等因素受到限制。将游离酶进行固定化可以在一定程度上提高酶的耐受性，并且能够循环使用，方便下游过程的操作。目前报道的腈水合酶固定化技术主要包括交联酶聚集体技术、溶胶-凝胶包埋技术等。同交联酶聚集体技术相比，球化酶可控性更强，分散性更好；同有载体固定化酶方法相比，球化酶技术成本低廉。
发明内容
本发明的目的是针对当前技术的不足，提供一种操作简单、成本低廉的固定化腈水合酶的方法。该方法以膜乳化为基础，采用球化酶技术对腈水合酶进行固定化。膜乳化是在一定的压力下，将分散相通过微孔膜分散到连续相中，由膜孔径来控制而呈单分散性，和传统乳化方法相比，具有能耗低、制备条件温和、粒径大小及分布可控、制备的乳液稳定性和重复性好等优点。另外，膜乳化的设备工艺简单易行，易于规模化，因而近年来被广泛关注。对于球化酶而言，粒径均一、粒度可控是保证其得到很好应用的前提。该方法固定化酶制备工艺简单，酶活损失小，且固定化效率较高。
本发明的技术方案是：
一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，包括以下步骤：
(1)向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.1～0.5g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的1％～3％；span-80的质量为正己烷质量的1％～5％；体积比为水相：油相＝1：3～9；
(2)将上步得到的粗乳液在5～30kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4℃下交联0.5～4h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子；
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：60～90。
本发明的有益效果是：
1.本发明针对传统乳化法制备球化酶可控制备性差的缺点，将膜乳化技术应用到球化酶的制备过程中，实现粒径均一的球化酶的可控制备。球形腈水合酶粒径分布在8-20μm的范围内，呈现规则球状结构，分散性也比较好，如图3所示。
2.本发明的制备工艺简单，条件温和，酶活回收率在50％以上。重复使用10次后，酶活还可达到初始酶活的45％左右。同游离酶相比，储藏稳定性也更好。
附图说明
图1为球化酶的制备过程示意图。
图2为膜乳化法制备球形腈水合酶的示意图。
图3为实施例2中球形腈水合酶的扫描电镜图。
具体实施方式
本发明所述的球化酶的制备过程如图1所示：
首先将含有酶的水相分散在含有活性剂的油相当中进行，形成了油包水的乳液，这个过程称为乳化；然后加入交联剂，使得蛋白分子之间通过交联剂连接稳定成球，经过交联的过程得到球化酶。
具体实验中的膜乳化法制备球形腈水合酶的示意图则如图2所示。
配制一定浓度的腈水合酶溶液，加入适量的保护剂和表面活性剂，取一定量的上述溶液加入到适量的油相中，机械搅拌，制备乳化液；将制备的乳化液在一定的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，得到粒径均一的W/O型乳液；向此乳液中加入一定量的交联剂，搅拌一定时间，静置；离心分离，洗涤，最终得到球形腈水合酶。
本发明所使用的腈水合酶ES-NHT-118(初始酶活为5U/mg左右)，购买自浙江宝赛生物科技有限公司。
本发明所使用的PLL(多聚赖氨酸)、正己烷、span-80、戊二醛均购买自天津金海华兴科技发展有限公司。
本发明使用的SPG玻璃膜以及SPG膜乳化装置购买自日本SPGTechnology公司。
实施例1：
1向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.2g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的1％；span-80的质量为正己烷质量的2％；体积比为水相：油相＝1：6。
2将上步得到的粗乳液在10kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4℃下交联0.5h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子，酶活回收率达47％。
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：90。
酶活定义：在30℃条件下，每分钟催化生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量为1U。
酶活测定：将反应液过滤后，用高效液相色谱对反应液进行检测。检测条件为：使用C18柱(4.6×100mm，3.5μm)进行分离，流动相为水：乙腈(70：30，v/v)，在室温下以1mL/min的流速流动，使用DAD检测器在230nm条件下检测。
酶活回收率定义：测定腈水合酶固定化前后的酶活，通过以下公式计算：
A c t i v i t y r e cov e r y ( % ) = O b s e r v e d a c t i v i t y o f C L E A s S t a r t i n g a c t i v i t y o f f r e e N H a s e
实施例2：
1向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.1g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的2％；span-80的质量为正己烷质量的3％；体积比为水相：油相＝1：4。
2将上步得到的粗乳液在20kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4℃下交联2h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子，酶活回收率达58％(测定方法同实施例1)。
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：70。
将此制备好的腈水合酶粒子利用扫描电子显微镜(SEMZeissDSM-950)检测其形貌，得到如图3所示的球形腈水合酶扫描电镜图。从图中可以看出，球形腈水合酶粒径分布在8-20μm的范围内，呈现规则球状结构，分散性也比较好
实施例3：
1向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.3g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的3％；span-80的质量为正己烷质量的5％；体积比为水相：油相＝1：3。
2将上步得到的粗乳液在15kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4℃下交联3h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子，酶活回收率达51％(测定方法同实施例1)。
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：60。
实施例4：
1向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.5g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的1％；span-80的质量为正己烷质量的1％；体积比为水相：油相＝1：5。
2将上步得到的粗乳液在30kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4℃下交联1h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子，酶活回收率达54％(测定方法同实施例1)。
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：80。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (1)

1.一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，其特征为包括以下步骤：
（1）向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的浓度为0.1~0.5g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的1%~3%；span-80的质量为正己烷质量的1%~5%；体积比为水相：油相＝1：3～9；
（2）将上步得到的粗乳液在5~30kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，在4oC下交联0.5～4h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子；
其中，体积比戊二醛：W/O型乳液＝1：60～90。
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