CN102732248A

CN102732248A - 一种核壳型氧化锌－二氧化硅纳米粒子及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102732248A
Application number: CN2012101996627A
Authority: CN
Inventors: 张华娟; 熊焕明; 任庆广
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，具体为一种核壳型氧化锌－二氧化硅纳米粒子及其制备方法和应用。氢氧化锂、甲基丙烯酸锌室温水解生成发光的ZnO纳米粒子，然后加入含双键的硅氧烷单体和偶氮二异丁腈，加热引发聚合，表面形成了有机硅单层，再加入其它硅氧烷和氨水，室温水解形成二氧化硅层，得到核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子，其内核为单个氧化锌发光量子点，直径为2.7-4.6nm，外壳为二氧化硅薄层，安全无毒、量子效率高，在细胞中，持续紫外激发下能稳定发光，可用于制备生物细胞荧光标记物，特别用于制备宫颈癌细胞荧光标记物。

Description

一种核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属纳米材料技术领域，具体为一种核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

自从20世纪90年代，科学家们认识到半导体发光量子点作为生物荧光标记的应用前景，特别是发光纳米晶体和生物医学交叉领域的研究更引起了科学家们的极大兴趣，并取得了显著的成果。

半导体发光量子点在生物荧光标记应用方面具有有机染料无可比拟的优势，如量子点的荧光颜色可通过控制其组成和粒径大小进行调节；量子点的激发峰宽，发射峰窄，呈对称高斯分布，重叠小，因此可用同一激发光同时激发多种量子点进行多荧光颜色标记，而有机染料的激发峰窄，发射峰宽而不对称，严重拖尾或者重叠，容易相互干扰；量子点的量子产率较高，光化学稳定性较好，可进行长时间的荧光标记观察，而有机染料易被光漂泊，稳定性较差；量子点通过配体化学作用进行生物交联，多个生物分子连接在一个量子点上，关于标记诱导效应的信息较少，而有机染料常常是多个染料分子连接在单个生物分子上，许多常用染料的光谱性质有标记诱导效应。

目前研究比较多也比较成熟的是CdSe、CdTe等量子点，随着研究的深入，科学家们发现纳米材料的潜在毒性不容忽视。CdSe、CdTe等量子点中的Cd元素是剧毒的，无论是在研究生产过程，还是在实际应用过程中，都会对环境，生物和人体造成威胁。为了得到低毒的量子点，科学家们尝试对CdSe、CdTe等量子点进行无机材料（如ZnS，SiO₂等）或者有机聚合物包覆，然后再进行生物分子修饰。包覆修饰后的量子点与裸露的量子点相比，其发光稳定性和生物相容性都得到提高。然而，目前还没有一种包覆方法可以完全阻止CdSe、CdTe等量子点的Cd离子释放。此外，将CdSe、CdTe等量子点应用于体内研究时，由于生物体内的复杂环境，更加速了Cd离子释放，从而造成实验动物的死亡。因此科学家们积极的寻找CdSe、CdTe的替代材料。

ZnO是一种廉价的，环境友好型和生物相容性材料，美国食品和药物监督局将其列为安全物质，因此用光致发光的ZnO量子点替代CdSe、CdTe量子点应用于生物医学荧光标记具有可行性。但是由于ZnO的可见发射机理为表面缺陷发光，容易受到外界环境的影响，水，弱酸，弱碱等都会使其发生荧光淬灭，而用传统方法合成的ZnO量子点的量子产率一般低于10%，使其生物荧光标记应用受到限制。研究工作者尝试调节各种条件来提高ZnO的量子产率，如替换反应原料锌盐或碱等，或者采用不同的包覆方法来保护其表面缺陷，如选用聚合物，有机硅等进行包覆保护，但是迄今为止，研究得到的产物仍未令人满意，如包覆保护作用不显著，包覆过程导致ZnO量子点的量子产率显著降低，或者得到的产物粒径太大，为壳层包覆的多核结构等等。

量子点在生物医学的应用，要求量子点必须具备较好的水溶性，良好的发光性能，合适的粒径大小，较好的生物相容性和可进行生物交联。

发明内容

本发明的目的是提供一种发光性能优良，生物相容性好的核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子及其制备方法和应用。

本发明提出的核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子，其制备方法分别采用溶胶－凝胶化学反应，自由基引发的聚合反应及氨水催化的缩聚反应。产物的分离提纯方法是非溶剂沉淀法。整个过程不使用任何有毒的试剂，完全是绿色化学的，没有环境污染问题。从原料的角度来说，主要的反应物是甲基丙烯酸锌、氢氧化锂、无水乙醇、去离子水、偶氮二异丁腈引发剂、乙烯基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯基三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、氨水等，所有这些药品都是无毒无害的，不会造成环境污染。从合成方法上来讲，溶胶－凝胶化学反应是把氢氧化锂的乙醇溶液加入到甲基丙烯酸锌的乙醇溶液中，室温下使之发生水解反应生成发光的ZnO纳米粒子。然后加入含双键的硅氧烷单体（乙烯基三乙氧基硅烷）和偶氮二异丁腈引发剂，加热引发聚合，这样就在ZnO纳米粒子表面形成了有机硅单层，再加入其它硅氧烷（如正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯基三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷）和氨水，室温下水解形成二氧化硅层。整个合成的反应条件十分温和，接近于室温，而且不产生有毒有害的副产品。从分离提纯的角度来说，非溶剂沉淀法是常规的操作，只需要消耗较多的有机溶剂，在室温下就能顺利进行。

本发明提供的核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子的制备方法，具体步骤为：

（1）制备氧化锌纳米粒子乙醇溶液

将甲基丙烯锌乙醇溶液、氢氧化锂乙醇溶液混合，室温搅拌 24小时-20天，蒸出部分溶剂，分离、提纯，得到固体，再用乙醇溶解，得到氧化锌纳米粒子的乙醇溶液，其中所述甲基丙烯锌和一水合氢氧化锂的摩尔比为 1：（1.5-3 ）；

（2）制备有机硅单层包覆氧化锌纳米粒子溶液

将上述步骤（1）得到的氧化锌纳米粒子的乙醇溶液，加入含双键的硅氧烷单体（乙烯基三乙氧基硅烷）和偶氮二异丁腈，加热至60℃-80℃，搅拌30-60分钟，蒸出部分溶剂，分离、提纯，得到固体，再用乙醇溶解，得到有机硅单层包覆的氧化锌粒子的乙醇溶液，其中所述氧化锌纳米粒子、乙烯基三乙氧基硅烷和偶氮二异丁腈的质量比为（0.08-0.1）：（0.221-0.663）：（0.032-0.15）；

（3）制备核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子

在上述步骤（2）得到的溶液中，加入正硅酸乙酯和氨水，使 pH= 7-8 ，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌，蒸出部分溶剂，分离、提纯，得到核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子，其中有机硅单层包覆氧化锌纳米粒子、正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为（0.04-0.06）：（0.1-0.2）：（0.01-0.05）。

本发明提出制备方法不仅是绿色化学的，而且成本低廉、操作方便。

根据上述制备方法得到的核壳型氧化硅锌-二氧化硅纳米粒子，其内核为单个氧化锌发光量子点，直径在2.7~4.6纳米之间，外壳为二氧化硅层，内核与外壳通过共价键相连，表面带有亲水基团，可与生物分子交联。

本发明得到的核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子，其发光性能表现为：从蓝光到黄光可以调节，水溶液的量子效率在33-53%，激发波长在330～360nm之间，并能在水，磷酸缓冲液和RPMI 1640 培养基中稳定发光。

本发明得到的核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子，其细胞毒性表现为对人类子宫颈癌细胞的半致死浓度在0.2~0.3mg/L，比通常CdSe、CdTe纳米粒子的相应数据要高出3个数量级以上，这样即使ZnO纳米材料的发光性能不如CdSe和CdTe，在较高浓度下的操作仍然获得了色彩鲜明的细胞图像。

本发明得到的核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子，其细胞结合部位在细胞质，在细胞核中不明显，所以用该纳米粒子标记的癌细胞，能够非常清楚地观察到它们的细胞核分裂，细胞生长的过程。

本发明得到的核壳型“氧化锌－二氧化硅”纳米粒子安全无毒、量子效率高，在细胞中，持续紫外激发下能稳定发光，其可用于制备生物细胞荧光标记物，特别是用于制备宫颈癌细胞荧光标记物。

附图说明

图1是实施例1的高分辨透射电子显微镜照片和粒径分布图。

图2是实施例2的高分辨透射电子显微镜照片和粒径分布图。

图3是实施例3的高分辨透射电子显微镜照片和粒径分布图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体的实施例和附图来进一步说明本发明。

实施例1

（1）氧化锌纳米粒子乙醇溶液的制备

将2.35克甲基丙烯酸锌溶于100毫升无水乙醇，搅拌加热到80 ^oC，回流1小时；将1.26克一水合氢氧化锂溶于100毫升的无水乙醇，用超声帮助溶解。然后将甲基丙烯酸锌的乙醇溶液和氢氧化锂的乙醇溶液混合，室温搅拌反应24小时，然后40 ^oC旋蒸浓缩，加入乙酸乙酯沉淀，5000转离心5分钟，弃上清液，用200毫升无水乙醇溶解沉淀（沉淀质量 0.32-0.4 g）。得到的乙醇溶液记作ZnO-A。

（2）有机硅单层包覆氧化锌纳米粒子乙醇溶液的制备

取ZnO-A溶液50毫升(氧化锌纳米粒子 0.08-0.1 g) 加入50毫升的无水乙醇，70 ^oC搅拌加热10分钟，然后加入0.2毫升的乙烯基三乙氧基硅烷（VTES）和0.032g的偶氮异丁氰（AIBN），于60 ^oC-80 ^oC加热搅拌30min后，40 ^oC旋转蒸发浓缩，加入乙酸乙酯沉淀，静置，吸弃上清液，用100毫升无水乙醇溶解，该溶液记作ZnO-AVTES。

（3）核壳型“氧化锌-二氧化硅”纳米粒子的制备

取该溶液20毫升(含有机硅单层包覆氧化锌纳米粒子 0.04-0.06 g)，用20毫升无水乙醇稀释，然后加入含有0.1毫升正硅酸乙酯的无水乙醇溶液20毫升，搅拌均匀。将0.05毫升，浓度为25%的氨水，0.2毫升去离子水和20毫升的无水乙醇混合，缓慢加入到含有ZnO-AVTES和正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室温搅拌20小时，然后加入0.05毫升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，继续反应10小时。将反应液40 ^oC旋转蒸发浓缩，加入乙酸乙酯沉淀，10000转离心5分钟，弃上清，用60毫升无水乙醇溶解沉淀，然后80 ^oC加热15分钟，室温放置24小时，再在40 ^oC旋转蒸发浓缩，加入乙酸乙酯沉淀，10000 rpm离心5分钟，弃上清，将沉淀溶于去离子水中，记作ZnO-ASiO₂。ZnO粒子尺寸大小通过高分辨透射电镜观察，平均直径为2.7纳米（附图1），发光光谱的测量结果表明样品的发射波长在488纳米左右，样品在磷酸缓冲液和细胞培养基中都能稳定发光，量子效率的测定采用溶解在乙醇中的罗单明B（量子效率95％）作为基准，结果保持在53％以上。

（4）核壳型氧化锌-二氧化硅纳米颗粒的细胞学毒性测试

将人类子宫颈癌细胞Hela，1×10⁵/cm²的密度接种于96孔细胞板中，每孔加入0.1mLRPMI 1640培养基(含10%小牛血清)，37 ^oC，5% CO₂培养箱中培养24小时后，更换新鲜的培养基，每孔按照不同的终浓度梯度加入ZnO-SiO₂纳米粒子溶液，37 ^oC，5% CO₂培养箱中培养24小时后，去掉反应液，加入0.1mL含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，10 μL 5mg/mL的MTT溶液，37 ^oC，5%CO₂培养箱中培养4小时，去掉反应液，每孔加入100μL二甲基亚砜，振荡使MTT甲瓒结晶全部溶解，酶标仪上490nm处读取每孔的吸光度值。细胞学毒性测试结果表明，ZnO纳米颗粒对人类宫颈癌细胞Hela细胞的半致死浓度在0.3mg/mL左右。

（5）ZnO纳米颗粒的细胞内紫外激发荧光共聚焦成像

将人类宫颈癌细胞Hela细胞以1×10⁵/cm²的密度接种于玻底培养皿中，每孔加入2mL RPMI 1640培养基（含10%小牛血清），37 ^oC，5% CO₂培养箱中培养24小时，去掉培养基，用不含血清的RPMI 1640培养基洗三遍，然后加入2mL不含血清的RPMI 1640培养基和终浓度为0.05mg/mL 的ZnO-SiO₂纳米粒子溶液，置于激光共聚焦显微镜下观察紫外激发（激发波长为365nm）下的荧光图象以及记录紫外连续激发下的荧光强度变化。该ZnO量子点都能够进入细胞质，但是在细胞核中不明显，实验结果表明，本项发明中的ZnO纳米颗粒量子点具有良好的细胞相容性，且在细胞中，紫外连续激发下能稳定发光。

实施例2

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，在这种条件下锌盐的水解速度变慢，最终得到ZnO平均直径为3.8纳米(附图2)，其水溶液记作ZnO-BSiO₂。它的发光波长在513纳米附近，量子效率是48％左右，它在磷酸缓冲液和RPMI 1640 培养基中的都能稳定发光。

细胞的培养和测试过程和实施例1相同。对人类子宫颈癌细胞Hela的半致死浓度在0.3mg/mL左右，该ZnO量子点都能够进入细胞质，但是在细胞核中不明显，实验结果表明，本项发明中的ZnO纳米颗粒量子点具有良好的细胞相容性，且在细胞中，紫外连续激发下能稳定发光。

实施例3

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，步骤（1）中甲基丙烯酸锌和氢氧化锂乙醇溶液混合后室温搅拌的时间为20天。在这种条件下最终得到ZnO平均直径为4.6纳米（附图3），其水溶液记作ZnO-CSiO₂。它的发光波长在550纳米附近，量子效率是33％左右，它在磷酸缓冲液和RPMI 1640 培养基中的都能稳定发光。

细胞的培养和测试过程同实施例1，对人类子宫颈癌细胞Hela的半致死浓度在0.2mg/mL左右，该ZnO量子点都能够进入细胞质，但是在细胞核中不明显，实验结果表明，本项发明中的ZnO纳米颗粒量子点具有良好的细胞相容性，且在细胞中，紫外连续激发下能稳定发光。

对比实施例1

制备方法和实施例1相同，但是步骤（3）中省去加入0.1毫升正硅酸乙酯的无水乙醇溶液20毫升，而是直接加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，用氨水进行催化水解。最终得到的ZnO纳米颗粒几乎没有荧光。

细胞的培养和测试过程以及测试结果和实施例1基本相同。由于发光效率极低，不适合细胞成像。

对比实施例2

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，但是步骤（3）中省去加入0.1毫升正硅酸乙酯的无水乙醇溶液20毫升，而是直接加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，用氨水进行催化水解。最终得到的ZnO纳米颗粒几乎没有荧光。

对比实施例3

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，步骤（1）中甲基丙烯酸锌和氢氧化锂乙醇溶液混合后室温搅拌的时间为20天，步骤（3）中省去加0.1毫升正硅酸乙酯的无水乙醇溶液20毫升，而是直接加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，用氨水进行催化水解。最终得到的ZnO纳米颗粒几乎没有荧光。

对比实施例4

制备方法和实施例1相同，但是在步骤（3）不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。最终得到的ZnO纳米颗粒发射波长在480纳米附近，但外层二氧化硅层发生团聚。

细胞的培养和测试过程以及测试结果和实施例1基本相同。由于产物为团聚体，不适合细胞成像。

对比实施例5

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，步骤（3）中不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。最终得到的ZnO纳米颗粒发射波长在510纳米附近，但外层二氧化硅层发生团聚。

对比实施例6

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，甲基丙烯酸锌和氢氧化锂乙醇溶液混合后室温搅拌的时间为20天，步骤（3）中不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。最终得到的ZnO纳米颗粒发射波长在550纳米附近，但外层二氧化硅层发生团聚。

对比实施例7

制备方法和实施例1相同，但步骤（3）中不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的3-巯丙基三乙氧基硅烷。得到的ZnO纳米颗粒发射波长在488纳米附近，但荧光较弱。

细胞的培养和测试过程以及测试结果和实施例1基本相同。由于发光效率较低，不适合细胞成像。

对比实施例8

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，步骤（3）中不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的3-巯丙基三乙氧基硅烷。得到的ZnO纳米颗粒发射波长在513纳米左右，但荧光较弱。

对比实施例9

制备方法和实施例1相同，但是步骤（1）中使用的一水合氢氧化锂为0.63g，甲基丙烯酸锌和氢氧化锂乙醇溶液混合后室温搅拌的时间为20天，步骤（3）不是加入0.05毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷，而是加入0.05毫升的3-巯丙基三乙氧基硅烷。得到的ZnO纳米颗粒发射波长在550纳米左右，但荧光较弱。

上述实施例可以总结为一个表格：

实施例

锌盐与碱的反应时间

碱的用量

硅氧烷种类

粒子直径(nm)

发光波长(nm)

量子效率(%)

1

24小时

[Zn^2＋]/[LiOH]＝1：3

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， 3-氨丙基三乙氧基硅烷

2.7

488

53

2

24小时

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯，3-氨丙基三乙氧基硅烷

3.8

513

48

3

20天

[Zn^2＋]/[LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， 3-氨丙基三乙氧基硅烷

4.6

550

33

对比1

24小时

[Zn^2＋]/[LiOH]＝1：3

乙烯基三乙氧基硅烷， 3-氨丙基三乙氧基硅烷

团聚

无荧光

对比2

24小时

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷， 3-氨丙基三乙氧基硅烷

团聚

无荧光

对比3

20天

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷， 3-氨丙基三乙氧基硅烷

团聚

无荧光

对比4

24小时

[Zn^2＋]/[LiOH]＝1：3

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷

团聚

488

42

对比5

24小时

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

团聚

513

30

对比6

20天

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

团聚

550

12

对比7

24小时

[Zn^2＋]/[LiOH]＝1：3

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， 3-巯丙基三乙氧基硅烷

2.5

480

45

对比8

24小时

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， 3-巯丙基三乙氧基硅烷

3.7

510

31

对比9

20天

[Zn^2＋]/[ [LiOH]＝1：1.5

乙烯基三乙氧基硅烷，正硅酸乙酯， 3-巯丙基三乙氧基硅烷

4.4

550

17

从表中可以看出，合成原料的配比对产物的发光特征影响显著，有机硅种类的选择对产物的发光特征和外层二氧化硅层影响显著。锌盐与碱的反应时间对产物的发光特征影响显著。

Claims

1.一种核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备氧化锌纳米粒子乙醇溶液

将甲基丙烯锌乙醇溶液、氢氧化锂乙醇溶液混合，室温搅拌 24小时-20天，蒸出部分溶剂，分离、提纯、得到固体用乙醇溶解，得到氧化锌纳米粒子的乙醇溶液，其中所述甲基丙烯锌和一水合氢氧化锂的摩尔比为 1：（1.5-3）；

（2）制备有机硅单层包覆氧化锌纳米粒子溶液

将上述步骤（1）得到的氧化锌纳米粒子的乙醇溶液，加入含双键的硅氧烷单体乙烯基三乙氧基硅烷和偶氮二异丁腈，加热至60℃-80℃，搅拌30-60分钟，蒸出部分溶剂，分离、提纯，得到的固体用乙醇溶解，得到有机硅单层包覆氧化锌粒子的乙醇溶液，其中所述氧化锌纳米粒子、乙烯基三乙氧基硅烷和偶氮二异丁腈的质量比为（ 0.08-0.1）：（0.221-0.663）：（0.032-0.15）；

（3）制备核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子

2.根据权利要求1所述的制备方法得到的核壳型氧化锌-二氧化硅纳米粒子，其特征在于，内核为单个氧化锌发光量子点，直径为2.7-4.6nm，外壳为二氧化硅薄层，内核与外壳通过共价键相连，表面带有可与生物分子交联的亲水基团。

3.根据权利要求2所述的纳米粒子在生物细胞荧光标记中的应用。

4.根据权利要求2所述的纳米粒子在宫颈癌细胞荧光标记中的应用。