KR102126781B1 - 메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서 - Google Patents

메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 과산화수소 검출용 산화세륨은 기존의 산화세륨에 비하여 큰 기공 크기를 가져 글루코오스 산화효소와 같은 과산화수소를 생성하는 반응을 하는 효소 분자들을 용이하게 담지할 수 있으며, 입자 크기가 작아 물질 전달에 유리하다. 또한 작은 결정질 크기로 인하여 발색 작용에 관여하는 세륨 3가 이온의 비율이 높아 기존의 산화세륨에 비해 과산화수소에 대한 높은 활성을 보이며, 비약적으로 향상된 발색을 나타낸다. 또한 다른 유기 효소들에 비해 안정성이 뛰어나고 저렴하며, 발색 기질이 필요 없으므로, 이를 이용하여 경제적이고 효율적으로 발색 바이오센서를 제조할 수 있다.

Description

메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서{Cerium oxide for detecting hydrogen peroxide having a mesoporous structure, a method for producing the same, and a biosensor for detecting hydrogen peroxide comprising the same}
본 발명은 메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
발색을 이용한 바이오센싱 기법은 목표 물질을 특수한 장비나 복잡한 과정 없이 빠르게 시각적으로 검출할 수 있다는 장점 때문에 널리 사용되고 있다. 발색 바이오센서의 검출에 있어서 색 변화는 맨 눈으로도 확인할 수 있기 때문에 간단하고 실용적이며 저렴하다는 장점을 지니고 있다. 현재 핵산, 단백질부터 작은 분자, 이온, 세포까지 검출할 수 있는 다양한 종류의 발색 바이오센서들이 개발되고 있는데, 이러한 검출을 위해선 생물학적인 현상을 확인 가능한 색 변화로 바꾸는 것이 매우 중요하다.
이러한 과정에는 겨자무과산화효소나 알칼리성 인산가수 분해효소 같은 천연 유기효소들이 전통적으로 발색 바이오센서에 사용되고 있다. 이러한 유기효소들은 타겟 물질의 존재 하에 높은 민감도로 다양한 발색 반응을 촉진시켜 시중에 판매되는 발색 바이오센서들이나 면역측정법에 필수 요소로 사용되고 있다. 하지만 이러한 유기효소들은 안정성이 떨어져 장시간 이용을 하거나 저장하기에 적합하지 않고, 가격이 비싸다는 본질적인 단점을 가지고 있다.
이러한 자연의 유기효소들의 한계를 극복하기 위해 발색 반응을 일으키는 나노 구조의 물질들이 활발하게 연구되어 보고되고 있다. 대표적으로, 금 나노 입자는 DNA, 단백질, 이온, 세포 등과 같은 다양한 종류의 타겟 물질의 발색을 이용한 검출에 이용되고 있다.
다양한 종류의 생체분자들을 검출하기 위한 새로운 전략을 개발하기 위해 폴리시오프렌이나 폴리다이아세틸렌을 포함한 고분자 물질들 역시 연구되었다. 이러한 접근법은 발색 기질이나 염료를 추가하지 않고도 타겟 물질에 대해 빠르고 민감한 반응을 나타내지만, 일반적으로 실험 환경(염분 농도, pH 등)이 달라짐에 따라 잘못된 결과를 초래할 수 있다는 단점을 가지고 있다.
한편, 효소의 특성을 유사하게 보여주는 나노 소재들이 보고되었는데, 기존의 유기 효소에 비해 우수한 견고성, 장기적 안정성을 가지고 있으며, 적은 비용으로 생산할 수 있으며, 대량 생산할 수 있어 기존의 발색 센서에서 유기 효소의 대안으로 사용될 수 있다.
다양한 화학 공정에서 효율적인 촉매로 활용된 산화세륨 나노입자는 과산화수소 같이 산화제 없이 유기 기질의 발색 반응을 일으키는 산화 효소의 특성을 가지고 있다. 또한 추가적으로 과산화수소가 존재할 경우 산화세륨의 세륨이 3가 이온 상태에서 4가 이온 상태로 변화하며 표면에 과산화물이 생성되며 특이한 색 변화를 나타내게 된다. 이러한 색 변화는 다른 발색 기질이나 염료가 없이 과산화수소가 있을 때만 일어나고, 며칠이 지나거나 적당한 열처리 가해줄 경우 1 시간 안에 세륨의 가수가 원래대로 변하면서 재사용 가능한 상태로 변하기 때문에 재사용이 가능하다. 이런 점들을 활용하여 글루코오스를 글루코오스 산화효소를 이용하여 분해시키며 나오는 과산화수소를 산화세륨 나노 입자를 이용하여 검출하는 연구가 보고되기도 했다.
하지만 이러한 연구는 글루코오스 진단으로의 가능성을 보여주었지만, 색 변화가 제한적이었고, 다른 효소 이용 시스템에 비해 효율적인 장점을 보이진 못했다.
Dewyani Patil, Nguyen Quoc Dung, Hyuck Jung, Se Yong Ahn, Dong Mi Jang, Dojin Kim, Biosens. Bioelectron. 31, 176-181.
상술한 문제점과 한계점을 해결하기 위해, 기존의 산화세륨에 비해 과산화수소에 대한 활성이 비약적으로 높여 발색이 향상되고, 안정적이고 반복적인 과산화수소 검출이 가능한 산화세륨을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 메조 다공성 구조를 갖는 과산화수소 검출용 산화세륨 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 상기 과산화수소 검출용 산화세륨을 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서를 제공하고자 한다.
상기 목적을 이루기 위한 본 발명의 일 측면은 복수의 산화세륨 입자를 포함하고, 상기 복수의 산화세륨 입자는 메조 다공성 구조를 형성하며, 직경이 2 내지 30 ㎚인 기공을 포함하고, 상기 기공의 평균 직경이 15 내지 19 ㎚이고, 최대 분포의 기공 직경이 14 내지 18 ㎚인 과산화수소 검출용 산화세륨을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 과산화수소 검출용 산화세륨을 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 1) 산화세륨의 전구체 및 메조 다공성 구조 유도체의 혼합물을 제조하는 단계; 2) 상기 혼합물을 건조하여 건조물을 제조하는 단계; 3) 상기 건조물을 내열성 용기에 넣고 탄화시켜 탄화물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 탄화물 내에 존재하는 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 과산화수소 검출용 산화세륨은 기존의 산화세륨에 비하여 큰 기공 크기를 가져 글루코오스 산화효소와 같은 효소 분자들을 용이하게 담지할 수 있으며, 입자 크기가 작아 물질 전달에 유리하다. 또한 작은 결정질 크기로 인하여 발색 작용에 관여하는 세륨 3가 이온의 비율이 높아 기존의 산화세륨에 비해 과산화수소에 대한 높은 활성을 보이며, 비약적으로 향상된 발색을 나타낸다. 또한 다른 유기 효소들에 비해 안정성이 뛰어나고 저렴하며, 발색 기질이 필요 없으므로, 이를 이용하여 경제적이고 효율적으로 발색 바이오센서를 제조할 수 있다.
도 1a는 실시예 1 및 비교예 1의 BET 표면 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 상기 도 1a의 BET 표면 분석 결과로부터 도출한 실시예 1 및 비교예 1의 기공 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 실시예 1의 TEM 분석 결과를 나타내는 이미지이다.
도 1d는 상기 도 1c를 확대한 이미지이다.
도 2a는 세륨 3가 이온이 과산화수소와 반응하여 세륨 4가 이온이 되며 오렌지색을 띄게 되는 과정을 표현한 개념도이다.
도 2b는 비교예 1의 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 실시예 1의 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 비교예 1의 과산화수소 반응 후 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2e는 실시예 1의 과산화수소 반응 후 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 실시예 1의 pH 및 완충용액용액에 따른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 완충용액(sodium acetate) 농도에 따른 실시예의 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 실시예 1의 농도에 다른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3d는 실시예 1의 글루코오스 산화효소의 농도에 따른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 비교예 1의 글루코오스 농도에 따른 용량 반응 곡선 및 실제 사진이다.
도 4b는 비교예 1의 글루코오스 농도에 따른 선형 눈금 측정 평면도이다.
도 4c는 실시예 1의 글루코오스 농도에 따른 용량 반응 곡선 및 실제 사진이다.
도 4d는 실시예 1의 글루코오스 농도에 따른 선형 눈금 측정 평면도이다.
도 5a는 글루코오스를 포함하는 다른 당에 대한 검출 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 실시예 1의 30 회 글루코오스 검출 반복 실험 결과를 나타내는 그래프 및 실제 사진이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명이 일 측면은 복수의 산화세륨 입자를 포함하고, 상기 복수의 산화세륨 입자는 메조 다공성 구조를 형성하며, 직경이 2 내지 30 ㎚인 기공을 포함하고, 상기 기공의 평균 직경이 15 내지 19 ㎚이고, 최대 분포의 기공 직경이 14 내지 18 ㎚인 과산화수소 검출용 산화세륨을 제공한다.
산화세륨은 과산화수소와 반응하여 발색반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 과산화수소 검출용 산화세륨은 기존의 산화세륨 나노입자와 달리 큰 기공 크기(>10 ㎚)로 인해 반응하여 과산화수소를 생성시키는 효소 분자들을 쉽게 많은 양을 담지할 수 있으며, 과산화수소와의 활성이 크게 향상되어 발색이 비약적으로 향상된다. 따라서 제한적인 색변화를 갖는 기존 산화세륨의 문제점을 해결하고 과산화수소가 발생하는 반응을 이용하는 바이오센서로 활용될 수 있다.
상기 범위 미만의 평균 직경 및 최대 분포의 기공 직경을 갖는 경우, 다량의 효소 분자들을 담지하기 위한 구조를 형성하지 못하게 되는 문제가 있으며, 상기 범위를 초과하는 평균 직경 및 최대 분포의 기공 직경을 갖는 경우, 비표면적이 감소하여 산화세륨의 발색 반응 활성이 감소할 수 있다는 점에서 바람직하지 못하다.
상기 효소 분자의 예로 글루코오스 산화효소가 있다. 글루코오스는 글루코오스 산화효소와 반응하여 글루코노락톤(gluconolactone)과 과산화수소(H2O2)를 생성하는데, 산화세륨은 여기서 발생하는 과산화수소와 발색반응을 일으킴으로써 글루코오스를 검출할 수 있다. 상기한 바와 같이 글루코오스 검출을 위하여 사용되는 경우, 유기 효소들 보다 안정성이 뛰어나고 저렴하며, 글루코오스 검출을 위한 발색 기질이 필요 없다는 점에서 효율적이다.
본 발명에서 “메조 다공성 구조(mesoporous)”란 미세공(micropore)과 거대공(macroscopic pore) 사이의 중간 크기를 가지는 기공(pore)를 갖는 것을 의미한다. 구체적으로 2 ㎚와 50 ㎚ 사이의 평균 직경을 가지는 기공을 포함하는 것을 의미한다.
기공의 직경은 기공의 길이방향에서 단면을 관찰할 시, 원상당의 직경을 의미한다. 상기 평균 직경은 상기 직경의 크기의 합을 기공 수로 나눈 것을 의미하며, 상기 최대 분포의 기공 직경은, 기공 직경 크기 분포 중 가장 많이 존재하는 기공의 직경 크기를 의미한다. 기공의 직경이 너무 작을 경우, 글루코오스 산화효소와 같은 효소분자를 담지 시키기 어려우며, 기공의 직경이 너무 큰 경우 목적하는 비표면적을 얻기 어려울 수 있기 때문에, 상기 범위의 평균 및 최대 분포의 직경을 갖는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, 상기 메조 다공성 구조는 KIT-6, SBA-3, SBA-15, SBA-16, MSU-H, MCM-41, MCM-48 또는 MSU-F로 이루어진 군으로부터 선택된 메조 다공성 구조 유도체를 주형으로 하여 형성된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 메조 다공성 구조 유도체는 규칙적인 메조 다공성 실리카를 사용할 수 있다. 상기 KIT-6는, 바람직하게 요구되는 메조 기공 구조인 15 내지 19 ㎚의 평균 기공 크기 및 최대 분포의 기공 직경이 14 내지 18 ㎚를 갖는 메조 기공 구조를 형성하기 위한 조작이 용이하다는 점에서 바람직하다.
다른 구현예에 따르면, BET 표면 분석 결과 비표면적은 130 내지 200 ㎡/g일 수 있다. 이는 기존의 산화세륨 나노 입자의 비표면적(약 50 ㎡/g)에 비해 2 배 이상 높은 것으로, 비표면적인 낮은 경우, 과산화수소 검출을 위한 발색 활성이 낮아지고, 검출 한계가 저하되는 문제가 발생한다. 비표면적이 더 높아지더라도, 발색 활성이나 검출 한계에 영향을 미치지 않으므로, 적절한 수준으로 상한을 한정하였다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 과산화수소 검출용 산화세륨은, XPS 분석 결과, Ce4+ 이온의 수 대비 Ce3+ 이온 수의 비율이 20 내지 30%이고, 과량의 과산화수소(H2O2)와 반응 후 XPS 분석 결과, Ce4+ 이온의 수 대비 Ce3+ 이온 수의 비율이 6 내지 7%일 수 있다.
산화세륨에 존재하는 세륨 이온 중 3가 이온(Ce3+)은 과산화수소와 반응하여 4가 이온(Ce4+)이 되면서 오렌지색으로 색이 변화하는 발색반응을 일으킨다. 도 2a에는 세륨 3가 이온이 과산화수소와 반응하여 세륨 4가 이온이 되며 발색반응을 일으키는 과정을 표현한 개념도를 나타내었다. 본 발명의 산화세륨은 작은 결정질 크기로 인해 세륨 4가 이온의 수 대비 세륨 3가 이온 수의 비율(20 내지 30%)이 기존의 산화세륨(약 12%)에 비하여 월등히 높아, 과산화수소와 반응 시 더욱 선명한 색 변화를 일으킬 수 있다. 또한, 과산화수소와 반응 후 XPS 분석에서 세륨 3가 이온의 비율은 큰 폭으로 감소(6 내지 7%)하여 기존의 산화세륨(약 8%)보다도 낮아지는 것이 확인되어, 현저하게 높은 비율로 세륨 3가 이온이 반응에 참여함을 알 수 있다. 이처럼 높은 비율의 세륨 3가 이온의 반응 참여에 의해 기존의 산화세륨에 비해 발색이 비약적으로 향상될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 과산화수소 검출용 산화세륨의 입자 크기는 100 내지 150 ㎚일 수 있다. 본 발명의 과산화수소 검출용 산화세륨은 기존의 산화세륨 나노입자에 비하여 기공의 크기는 크나, 입자의 크기는 작다. 작은 입자의 크기는 제조과정에서 메조 다공성 구조를 형성하는 과정에서 적용된 특유의 열처리 방법에 의해 형성된 것인데, 작은 입자 크기로 인해 물질 전달에 이점이 있어 과산화수소 검출에 활용되기에 적합하다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 과산화수소 검출용 산화세륨은 글루코오스 산화효소, 아세틸콜린 가수분해효소, 콜린 산화효소 및 콜레스테롤 산화효소로 중에서 선택되는 어느 하나 이상이 담지될 수 있다. 상기 효소들은 글루코오스, 콜린, 콜레스테롤 등과 반응하여 과산화수소를 발생시킨다. 여기서 발생하는 과산화수소와 산화세륨이 발색 반응을 일으킴으로 인하여, 글루코오스, 콜린, 콜레스테롤 등의 유무 및 농도 등을 유추할 수 있다. 상대적으로 큰 기공을 갖도록 제조된 본 발명의 산화세륨는 쉽게 많은 양의 효소들을 담지하여 사용될 수 있으며, 이로 인해 높은 과산화수소 활성을 가질 수 있고, 검출한계가 개선될 수 있으며, 발색이 비약적으로 향상될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 과산화수소 검출용 산화세륨의 발색반응을 이용하는 과산화수소 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 과산화수소 검출용 산화세륨을 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서를 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 바이오센서는 글루코오스의 산화반응에 의해 생성되는 과산화수소, 콜린 산화반응에 의해 생성되는 과산화수소 및 콜레스테롤 산화반응에 의해 생성되는 과산화수소 중에서 선택되는 어느 하나를 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 기재는 예시에 불과하며, 본 발명의 바이오센서는 과산화수소가 존재 혹은 생성되는 경우라면 제한 없이 사용될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 바이오센서는 완충용액 및 글루코오스 산화효소를 더 포함할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 과산화수소 검출용 산화세륨이 5 내지 30 mg/mL 포함되며, 상기 완충용액은 소듐아세테이트이고, 상기 완충용액의 농도는 50 내지 250 mM이고, 상기 글루코오스 산화효소가 상기 과산화수소 검출용 산화세륨의 질량 대비 15 내지 30% 질량으로 담지될 수 있다.
상기 완충용액은 기존에 당업계에 널리 알려진 완충용액인 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline), 인산나트륨 등이 사용될 수 있으나, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소듐아세테이트를 사용할 경우 가장 강한 색변화를 보인다는 점에서 바람직하다.
또한 사용되는 소듐아세테이트 농도에 따라 색변화의 강도가 달라지는데, 5 mM 이상일 경우 사용될 수 있으나, 50 내지 250 mM일 경우 현저히 강한 색변화를 보인다는 점에서 바람직하다.
상기 과산화수소 검출용 산화세륨이 완충용액에 5 내지 30 mg/mL 포함될 경우, 다른 범위의 농도에 비해 강한 색변화를 보인다는 점에서 바람직하다.
또 다른 구현예에 따르면, 글루코오스 최소 검출한계가 10 내지 20 μM일 수 있다. 이는 현재까지 보고된 글루코오스 최소 검출한계 가운데 가장 우수한 값에 해당하며, 본 발명의 산화세륨을 포함하는 과산화수소 검출용 바이오센서는 매우 작은 농도의 글루코오스에서 생성되는 과산화수소 검출에도 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 1) 산화세륨의 전구체 및 메조 다공성 구조 유도체의 혼합물을 제조하는 단계; 2) 상기 혼합물을 건조하여 건조물을 제조하는 단계; 3) 상기 건조물을 내열성 용기에 넣고 탄화시켜 탄화물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 탄화물 내에 존재하는 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 메조 다공성 구조 유도체를 주형으로 하여, 산화세륨을 주형의 메조 다공성 구조를 갖도록 합성하는 방법을 제공한다. 먼저, 상기 메조 다공성 유도체 내부에 산화세륨 전구체가 삽입시킨 혼합물을 제조한다. 상기 혼합물을 건조하여 건조물을 제조한 뒤, 건조된 건조물을 탄화시켜 상기 메조 다공성 유도체 내부에 존재하는 산화세륨 전구체를 산화세륨으로 산화시킨다. 마지막으로 상기 메조 다공성 유도체를 제거하여 메조 다공성 구조를 가지는 산화세륨을 수득한다.
일 구현예에 따르면, 상기 메조 다공성 구조 유도체는 KIT-6, SBA-15, SBA-16, MCM-41, MCM-48, HMS, AMS-8, AMS-10, FDU-1, FDU-2 및 FDU-12로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 메조 다공성 구조 유도체는 상술한 바와 마찬가지로 규칙적인 메조 다공성 실리카를 사용할 수 있다. 상기 KIT-6는, 바람직하게 요구되는 메조 기공 구조인 15 내지 19 ㎚의 평균 기공 크기 및 최대 분포의 기공 직경이 14 내지 18 ㎚를 갖는 메조 기공 구조를 형성하기 위한 조작이 용이하다는 점에서 바람직하다.
다른 구현예에 따르면, 상기 메조 다공성 구조 유도체는 플루로닉(Pluronic)계 상용 블록공중합체(P123), 증류수, 염산을 혼합하고 교반하여 혼합용액을 제조하는 단계; 상기 혼합용액에 부틸알코올(1-butanol) 및 테트라에틸오소실리케이트(Tetraethyl silicate)를 첨가하고 반응시켜 복합체를 제조하는 단계; 상기 복합체를 건조한 후 세척하는 단계; 상기 건조 및 세척한 복합체를 열처리하는 단계;를 포함하여 제조되는 KIT-6일 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 산화세륨 전구체는 세륨 나이트레이트 헥사하이드레이트(Ce(NO3)3·6H2O) 및 세륨 클로라이드 헵타하이드레이트(CeCl3·7H2O) 중 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 1) 단계의 혼합물의 용매는 에탄올이고, 상기 혼합물을 제조하는 단계는 40 내지 70 ℃의 온도에서 50 내지 300 rpm의 속도로 교반할 수 있다. 상기 에탄올은 상기 산화세륨 전구체 및 상기 메조 다공성 구조 유도체를 모두 용해할 수 있으며, 강한 휘발성을 가져 다공성 구조 내부에 스며든 잔여 에탄올을 쉽게 건조시킬 수 있다는 점에서 바람직하다. 또한, 상기 온도 범위와 교반 속도를 유지하는 것이 산화세륨 전구체가 상기 메조 다공성 구조 유도체의 다공성 구조 내부에 균일하게 삽입될 수 있으므로, 상기 온도 범위 및 교반 속도 범위에서 혼합물을 제조하는 것이 중요하다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 3) 단계의 탄화물을 제조하는 단계는, 상기 내열성 용기를 개방한 상태에서, 3-1) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 300 내지 400 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계; 3-2) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 500 내지 600 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이 탄화물을 제조하는 단계는 300 내지 400 ℃까지 승온하는 단계와 500 내지 600 ℃까지 승온하는 단계를 포함하는 2단계의 열처리를 거치게 되며, 이 과정은 모두 내열성 용기를 개방한 상태에서 이루어질 수 있다. 이러한 방법으로 탄화물을 제조할 경우, 더욱 바람직한 평균 기공 직경인 10 ㎚이상의 기공 직경을 형성할 수 있으며, 보다 넓은 비표면적을 갖도록 한다. 또한, 기존의 산화세륨보다 큰 기공 직경과 넓은 비표면적을 가짐과 동시에, 60 내지 100 ㎚의 작은 입자 크기를 갖는 산화세륨이 제조될 수 있었다. 내열성 용기를 폐쇄한 상태에서 한번에 500 내지 600 ℃까지 승온하는 경우, 평균 기공의 크기가 15 ㎚보다 작게 형성되고, 비표면적이 100 ㎡/g보다 작으며, 100 ㎚이상의 입자 크기를 갖는 산화세륨이 제조되어 바람직하지 못하다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 4) 단계의 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계는, 상기 탄화물을 NaOH 수용액에 넣고 교반하는 것일 수 있다.
NaOH 수용액은 메조 다공성 구조 유도체를 따라 형성된 산화세륨의 구조를 유지시키며 메조 다공성 구조체만 선택적으로 제거할 수 있다는 점에서 바람직하다. NaOH 수용액에 탄화물을 넣고 교반한 후, 교반이 완료된 용액을 원심분리하여 상기 메조 다공성 구조를 갖는 산화세륨을 수득할 수 있다. 상기 과정을 여러 번 반복하고, 수득한 산화세륨을 물로 세척하여 잔여 NaOH를 제거하여 더욱 순도 높은 산화세륨을 수득할 수 있다.
하기 실시예 또는 비교예 등에는 명시적으로 기재하지는 않았지만, 본 발명에 따른 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법에 있어서, 제조방법의 여러 조건을 달리하여 제조된 과산화수소 검출용 산화세륨에 대하여 100 회 이상의 반복 검출 실험을 수행하여, 그 안정성을 확인하였으며 TEM 분석을 통해 구조를 분석하였다.
그 결과, 다른 조건 및 수치 범위에서와는 달리, 아래 조건이 모두 만족하였을 때, 100 회 이상의 글루코오스 검출 실험 후에도 안정적으로 글루코오스를 검출할 수 있음을 확인하였으며, TEM 분석을 통해 규칙적인 메조 다공성 구조가 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
(ⅰ) 상기 메조 다공성 구조 유도체는 KIT-6, (ⅱ) 상기 산화세륨 전구체는 세륨 나이트레이트 헥사하이드레이트(Ce(NO3)3·6H2O), (ⅲ) 상기 1) 단계의 혼합물의 용매는 에탄올이고, 상기 혼합물을 제조하는 단계는 40 내지 70 ℃의 온도에서 50 내지 300 rpm의 속도로 교반하는 것, (ⅳ) 상기 3) 단계의 탄화물을 제조하는 단계는, 상기 내열성 용기를 개방한 상태에서, 3-1) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 300 내지 400 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계; 3-2) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 500 내지 600 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계;를 포함, (ⅴ) 상기 4) 단계의 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계는, 상기 탄화물을 NaOH 수용액에 넣고 교반하는 것.
다만, 상기 조건 중 어느 하나라도 충족되지 않는 경우에는 산화세륨을 이용한 글루코오스 검출 반복 실험을 위해, 과산화수소와 반응 후 산화세륨을 재생시키기 위한 열처리 과정에서 안정성이 떨어져 글루코오스 검출 실험을 30 회 내외 반복하였을 경우, 색 변화 강도를 육안 상 확인할 수 없었다. 또한 TEM 분석 결과 규칙적인 메조 다공성 구조가 다수 무너지는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않고, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1. 메조 다공성 구조 산화세륨의 제조
KIT-6의 합성
500 mL PP 보틀에 P123 12 g, 증류수 434 mL, 35% HCl 19.66 mL를 교반기와 함께 넣고 35 ℃에서 교반하였다. 부틸알코올(1-butanol) 14.82 mL를 추가하고 35 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 테트라에틸오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate) 27.64 mL를 빠르게 추가하고 35 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후 상기 PP 보틀을 뚜껑이 잘 닫힌 채로 100 ℃ 오븐에 24 시간 동안 넣어두었다. 상기 용액을 여과(filtering)한 후 에탄올 200 mL와 35% HCl 5 mL의 혼합용액으로 워싱하였다. 1 ℃/min의 승온 속도로 550 ℃까지 승온하고, 550 ℃에서 4 시간 유지한 후 상온까지 식혀 KIT-6를 수득하였다.
메조 다공성 구조 산화세륨의 합성
100 mL 비커에 상기 KIT-6 1 g과 세륨 나이트레이트 헥사하이드레이트(cerium nitrate hexahydrate) 2 g을 넣고 15 mL 에탄올에 녹였다. 교반기를 넣어주고 100 rpm, 50 ℃의 조건으로 교반하였고, 완전히 건조될 때까지 두었다. 진공 오븐(vacuum oven)에 투입하고 50 ℃의 온도에서 6 시간 동안 진공을 유지하였다. 도가니에 샘플을 넣고 뚜껑을 닫지 않은 채로 1 ℃/min의 승온 속도로 350 ℃까지 가열하고, 350 ℃에서 6 시간 동안 유지한 후, 1 ℃/min의 승온 속도로 550 ℃까지 가열하고, 550 ℃에서 6 시간 동안 유지한 후 상온까지 식혔다. 2 M의 NaOH 200 mL에 스터링바와 함께 넣고, 300 rpm의 속도로 2 시간 동안 교반하여 KIT-6를 제거하였다. 제거가 완료된 후, 원심분리기로 6000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하여 침전물만 분리하였다. 분리된 침전물을 NaOH와 상기 조건과 동일하게 2 시간 동안 교반하고, 원심분리기로 원심분리하고 나서, 마지막으로 분리된 침전물을 NaOH에 섞고 6 시간 동안 교반한 후 원심분리기로 원심분리하였다. 침전물을 pH가 7이 될 때까지 물로 세척하였고, 진공오븐에서 건조하여, 최종적으로 메조 다공성 구조를 갖는 산화세륨을 수득하였다.
비교예 1. 상용 산화세륨 나노입자
시그마 알드리치(Sigma-Aldrich) 사에서 입자 크기가 25 ㎚ 이하인 산화세륨을 구매하여 사용하였다.
시험예 1. BET표면 분석 및 TEM 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1의 표면을 BET(Brunauer-Emmett-Teller) 분석하였고, 전자주사현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM) 분석을 통해 표면을 분석하였다. 도 1a는 실시예 1 및 비교예 1의 BET 표면 분석 결과를 나타내는 그래프이며, 도 1b는 실시예 1 및 비교예 1의 기공 크기 분포를 나타낸 그래프이다. 도 1c는 실시예 1의 TEM 분석 결과를 나타내는 이미지이며, 도 1d는 상기 도 1c를 확대한 이미지이다.
상기 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 상기 BET 표면 분석 결과 실시예 1의 비표면적은 141 ㎡/g으로 비교예 1의 53 ㎡/g보다 2.6배 이상임을 확인하였다. 또한 실시예 1의 평균 기공 크기는 17.6 ㎚로, 비교예 1의 10 ㎚에 비해 큰 기공을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 1c 및 도 1d의 TEM 분석에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 산화세륨은 입자 크기가 100 ㎚보다 작고, 잘 형성된 메조다공성 구조를 가졌다.
시험예 2. XPS(X-ray Photoelectron spectroscopy) 분석
산화세륨에 존재하는 세륨 3가 이온은 과산화수소와 반응하여 4가 이온이 되어 오렌지색을 띄게 되므로, 세륨 3가 이온의 비율이 높으면 더욱 선명한 색 변화를 일으킨다고 알려져 있다. 도 2a는 세륨 3가 이온이 과산화수소와 반응하여 세륨 4가 이온이 되며 오렌지색을 띄게 되는 과정을 표현한 개념도이다.
XPS 분석을 통해 실시예 1 및 비교예 1의 (세륨 3가 이온/ 세륨 4가 이온)의 비율을 분석하였다. 도 2b는 비교예 1의 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이고, 도 2c는 실시예 1의 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 (세륨 3가 이온/ 세륨 4가 이온)의 비율은 24.76%로 비교예 1의 12.04%에 비해 높음을 확인하였다.
또한, 과산화수소와 반응 후 (세륨 3가 이온/ 세륨 4가 이온)의 비율을 확인하기 위하여, 실시예 1 및 비교예 1의 산화세륨을 각각 1 mg/mL로 준비하고, 과산화수소와 과량으로 반응시킨 후 원심분리하여 수득한 산화세륨을 XPS 분석하였다.
도 2d는 비교예 1의 과산화수소 반응 후 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이고, 도 2e는 실시예 1의 과산화수소 반응 후 XPS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
상기 도 2d 및 도 2e에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 (세륨 3가 이온/ 세륨 4가 이온) 비율은 6.82%로 비교에 1의 8.00%와 비교하여 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3. 글루코오스 검출에 적용하기 위한 최적화 실험
상기 실시예 1의 산화세륨을 글루코오스 검출에 적용하기 위해 글루코오스 산화효소를 담지한 후 pH와 완충용액에 따른 최적화를 진행하였고, 그 이후에 버퍼의 농도에 대한 최적화, 실시예 1 및 글루코오스 산화효소(Glucose Oxidase, GOx)의 농도에 따른 최적화 실험을 진행하였다.
도 3a는 실시예 1의 pH 및 완충용액에 따른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 완충용액(sodium acetate) 농도에 따른 실시예의 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3c는 실시예 1의 농도에 다른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 실시예 1의 글루코오스 산화효소의 농도에 따른 최적화 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
상기 도 3b 내지 3e에 도시된 바와 같이, 2 내지 9의 모든 pH 범위에서 강한 색변화를 일으킴을 확인할 수 있었으며, 소듐 아세테이트를 완충용액으로 실시예 1의 산화세륨을 15 mg/mL, 글루코오스 산화효소 10 mg/mL가 글루코오스 검출에 적용하기 위한 최적의 조건임을 확인하였다.
시험예 4. 용량반응곡선 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1을 홈판(well plate)에 투입하고 상기 시험예 3에서 확보한 최적화 조건을 조성한 후, 글루코오스의 농도를 변화시켜 색 변화를 측정하였다.
도 4a는 비교예 1의 글루코오스 농도에 따른 용량 반응 곡선 및 실제 사진이고, 도 4b는 비교예 1의 글루코오스 농도에 따른 선형 눈금 측정 평면도이다. 도 4c는 실시예 1의 글루코오스 농도에 따른 용량 반응 곡선 및 실제 사진이고, 도 4d는 실시예 1의 글루코오스 농도에 따른 선형 눈금 측정 평면도이다.
상기 도 4a 내지 4d에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 용량 반응 곡선 및 선형 눈금 측정 평면도가 정상적으로 그려짐을 확인하였다. 또한, 이를 바탕으로 글루코오스 검출 한계가 20 μM로 측정되어, 기존에 알려진 글루코오스 검출 한계 가운데 가장 우수함을 확인하였다.
시험예 5. 글루코오스를 포함하는 다른 당에 대한 검출 실험 결과 및 30 회 글루코오스 검출 반복 실험
실시예 1의 산화세륨이 자연 효소와 같이 기질에 대한 선택성을 갖는지 확인하기 위해 다른 당에 대해 실험을 실시하였다.
도 5a는 글루코오스를 포함하는 다른 당에 대한 검출 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 도 5a로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 산화세륨은 글루코오스에 대해서만 활성을 나타냄을 확인하였다.
또한, 실시예 1의 재사용 가능성과 안정성을 평가하기 위해 30 회의 글루코오스 검출 반복 실험을 실시하였다.
도 5b는 실시예 1의 30 회 글루코오스 검출 반복 실험 결과를 나타내는 그래프 및 실제 사진이다.
검출을 완료한 후 열처리를 통해 실시예 1을 재생하였다. 상기 도 5b로에서 확인할 수 있는 바와 같이, 30 회의 글루코오스 검출 반복 실험에도 색 변화가 줄어들지 않고, 안정적으로 글루코오스를 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
전술한 실시예 및 비교예는 본 발명을 설명하기 위한 예시로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양하게 변형하여 본 발명을 실시하는 것이 가능할 것이므로, 본 발명의 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (19)

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  13. 1) 산화세륨의 전구체 및 메조 다공성 구조 유도체의 혼합물을 제조하는 단계;
    2) 상기 혼합물을 건조하여 건조물을 제조하는 단계;
    3) 상기 건조물을 내열성 용기에 넣고 탄화시켜 탄화물을 제조하는 단계; 및
    4) 상기 탄화물 내에 존재하는 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계;를 포함하고,
    상기 3) 단계의 탄화물을 제조하는 단계는,
    상기 내열성 용기를 개방한 상태에서,
    3-1) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 300 내지 400 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계;
    3-2) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 500 내지 600 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    상기 산화세륨 전구체는 세륨 나이트레이트 헥사하이드레이트(Ce(NO3)3·6H2O) 및 세륨 클로라이드 헵타하이드레이트(CeCl3·7H2O) 중 선택되는 1종 이상인 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 1) 단계의 혼합물의 용매는 에탄올이고,
    상기 혼합물을 제조하는 단계는 40 내지 70 ℃의 온도에서 50 내지 300 rpm의 속도로 교반하는 것인 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 제13항에 있어서,
    상기 4) 단계의 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계는, 상기 탄화물을 NaOH 수용액에 넣고 교반하는 것인 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 메조 다공성 구조 유도체는 KIT-6이고,
    상기 산화세륨 전구체는 세륨 나이트레이트 헥사하이드레이트(Ce(NO3)3·6H2O)이고,
    상기 1) 단계의 혼합물을 제조하는 단계의 용매는 에탄올이고, 40 내지 70 ℃의 온도에서 50 내지 300 rpm의 속도로 교반하고,
    상기 3) 단계의 탄화물을 제조하는 단계는, 상기 내열성 용기를 개방한 상태에서, 3-1) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 300 내지 400 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계; 3-2) 0.1 내지 5 ℃/분의 승온속도로 500 내지 600 ℃까지 승온하여 1 내지 10 시간 동안 유지하는 단계;를 포함하고,
    상기 4) 단계의 메조 다공성 구조 유도체를 제거하는 단계는, 상기 탄화물을 NaOH 수용액에 넣고 교반하는 것인 과산화수소 검출용 산화세륨의 제조방법.
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KR20230029415A (ko) * 2021-08-24 2023-03-03 한국과학기술원 과산화효소 모방 다공성 산화세륨 나노자임, 이의 제조방법, 이를 포함하는 과산화수소 및 다중물질 검출용 다공성 산화세륨 나노자임/산화효소 복합체, 및 상기 다공성 산화세륨 나노자임/산화효소 복합체를 포함하는 과산화수소 및 다중물질 검출용 종이센서
KR102571534B1 (ko) 2021-08-24 2023-08-29 한국과학기술원 과산화효소 모방 다공성 산화세륨 나노자임, 이의 제조방법, 이를 포함하는 과산화수소 및 다중물질 검출용 다공성 산화세륨 나노자임/산화효소 복합체, 및 상기 다공성 산화세륨 나노자임/산화효소 복합체를 포함하는 과산화수소 및 다중물질 검출용 종이센서

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