JP2020504600A - 標識化核酸イメージング剤を使用した多重イメージングのための改善された方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、接触させることと、
(4)任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
(5)1つまたは2つのステップのいずれかで、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、試料を、ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(8)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、任意に、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(7)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む。
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる。
(1)標識と、
(2)第1の核酸ドメイン、第2の核酸ドメイン、及び第3の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、1〜9ヌクレオチド長である、核酸ドメインと、
(3)第1の核酸ドメイン及び第2の核酸ドメインを結び付ける第1の結合部分と、
(4)第2の核酸ドメイン及び第3の核酸ドメインを結び付ける第2の結合部分と、を含み、
両方の結合部分は、(a)無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、(b)核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、(c)非天然ヌクレオチド、または(d)制限部位またはニッキング部位から独立して選択される。
本出願は、1つ以上の標的特異的結合パートナーを用いて、1つ以上の標的の存在に関して試験するための改善された方法及び組成物に関する。
顕微鏡法において、シグナル増幅は、標的の存在量が低い場合、許容可能な曝露時間が短い場合、及び/またはイメージング機器の感度が低い場合などの多くの状況において望ましい。シグナル増幅は、DNA交換免疫蛍光において利点を提供する。従来のシングルプレックス免疫蛍光(1つの標的のみが分析される)において、多くの場合、非共役一次抗体及び蛍光標識化二次抗体を使用する。二次抗体は多くの場合、ポリクローナルであるため、二次抗体の複数の分子が一次抗体の1つの分子に結合することができ、シグナルの増幅をもたらす。しかしながら、DNA交換免疫蛍光において、いくつかの実施形態では、ユーザは、DNAドッキング鎖を一次抗体に直接標識化し、したがってポリクローナル二次抗体を使用することによって得られたそのようなシグナル増幅ステップを排除する。結果として、場合によっては、DNA交換免疫蛍光は、従来の免疫蛍光と比較してより低いシグナル強度を有する可能性がある。
デコード可能な増幅産物。デコード可能な増幅産物は、増幅産物がドッキング鎖である場合を含む。一実施形態では、ドッキング鎖は、観察可能な標識を含有しない。一実施形態では、ドッキング鎖は、観察可能な標識のためのバーコード(またはイメージャー鎖)として機能する。最初に、ドッキング鎖またはドッキング部位が、シグナル増幅反応中に標的に導入され得(図1b〜c)、これにより複数のドッキング鎖が1つの標的分子に付着することに留意されたい。限定しないが、これを達成する少なくとも2つの戦略が存在する。(戦略1)骨格に付着し、次いで標的認識部分に付着する複数のドッキング部位を作り出すこと(図1b)、及び(戦略2)標的認識部分に付着した1つの長い一本鎖DNA上に複数の結合部位を作り出すこと(図1c)。
非線形DNA鋳型は、環状増幅鎖としてシグナル増幅のために用いられ得る。ドッキング鎖に対して相補性を有する環状オリゴは、増幅法とは別に生成され得る。例えば、実験施設内ライゲーションは、DNAの環状鎖を形成するために鋳型DNA鎖上で実施され得る。環状鎖は、試料と接触する前に、標的特異的結合パートナーに付着したドッキング鎖にハイブリダイズされ得る。あるいは、標的特異的結合パートナーが試料を染色するために最初に使用され得、次いで後に続いて、環状鎖が試料に導入されて、標的特異的結合パートナー上のドッキング鎖とハイブリダイズし得る。環状鎖が標的特異的結合パートナーに結び付けられたドッキング鎖に付着した複合体の形成後に、ローリングサークル増幅(RCA)が実施され得る。この方法は、非効率的な原位置ライゲーションステップでの問題を回避するために使用され得るため、ある特定の利点をもたらす。
異なる時点で増幅ステップを使用してシグナルを増幅させ、複数の標的のイメージングまたは単一の標的の再検索を可能にするためにステップを反復するための選択肢を含む、多重化イメージングに取り組む様々な方法が存在する。方法はまた任意に、様々な時点でシグナル伝達画像を消失させることを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、(4)試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、(7)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。場合によっては、ステップ(4)の後、及び任意にステップ(5)を実施した後に、方法は、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ドッキング鎖の数を増加させた後に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することをさらに含む。したがって、いくつかの様式では、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることは、試料を、増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる。増幅鎖とは、増幅の産物を意味する(ローリングサークル増幅が用いられる場合、増幅産物またはRCA産物とも呼ばれる場合がある)。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、(3)試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、(4)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと(増幅がイメージャー鎖の存在下で起こる)、(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、(7)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。場合によっては、ステップ(4)の後、及び任意にステップ(5)を実施した後に、方法は、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ドッキング鎖の数を増加させた後に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された試料を試験するための方法は、(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸鎖が、(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、(4)試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであり、標識化イメージャー鎖が液体培地または緩衝溶液中に提供される、接触させることと、(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(6)任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、(7)第1の支持体と平行に第2の光学的に透明な材料を取り付けることと、(8)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。
いくつかの実施形態では、ユーザは、同じ標的に対する試料を複数回再検索することを望む場合がある。再検索が望ましい場合、多重イメージングは、同じイメージャー鎖を用いたイメージングの別の回を実施することによって実施される。したがって、ユーザが異なる標的をイメージングすることを望む場合、イメージャー鎖は、全ての他のイメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する。ユーザが同じ標的を複数回イメージングすることを望む場合、反復されるステップは、全ての他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有しないが、代わりにすでに用いられたイメージャー鎖と同じ配列を有するイメージャー鎖を使用する。
交換イメージングにおいて多重化を生じさせる2つの主な方法、スペクトル多重化及び連続多重化が存在する。スペクトル多重化は、単回のイメージングにおいて異なる標識(異なるフルオロフォアなど)を使用する能力を指す。スペクトル多重化は、第2の標識を見る前に第1の標識からシグナルを消失させる必要はない。例えば、フルオロフォアの場合、異なるフルオロフォアを個々に励起するために光の異なる波長励起が使用され得る。これは、イメージングの別々の回を必要としない。連続多重化は、イメージングの第2の回の前にイメージングの第1の回からシグナルを消失させることによって、複数回のイメージングにおいて同じ標識(同じフルオロフォアなど)を使用する能力を指す。スペクトル多重化及び連続多重化は、単独でまたは互いと連結してのいずれかで使用され得る。しかしながら、多重化の2つ以上の技術を使用することはユーザが特定の実験中に視覚化することができる標識の数を有意に増加させることができる。
いくつかの実施形態では、イメージングで使用される相補的な薬剤のうちの少なくとも一部が、互いに安定的に結合しており、他の実施形態では、イメージングで使用される全ての相補的な薬剤が、互いに安定的に結合している。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、ドッキング鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。
いくつかの実施形態では、ユーザは、安定した結合を伴う近接イメージングを用いてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、(a)半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第1の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、(b)半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第2の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート((a)及び(b)の安定ドメインは、互いに相補的であり、(a)及び(b)の半ドッキングドメインは、線形に組み合わされて完全ドッキングドメインを形成することができる)と、(c)5’ドメイン、3’ドメイン、及び5’ドメインと3’ドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、少なくとも1つの標識化イメージャー鎖または中間鎖(5’ドメインは、(a)の半ドッキングドメインに相補的であり、3’ドメインは、(b)の半ドッキングドメインに相補的であり、標識化イメージャー鎖または中間鎖は、完全ドッキングドメインに安定的に結合することが可能であり、中間鎖が使用される場合、標識化イメージャー鎖も提供する)とを含む。あるいは、中間鎖が使用され得、ドッキング鎖及びイメージャー鎖の両方に相補的であり得る。増幅もまた用いられ得る。表2に記載される安定性基準もこれに関して適用される。
対照実験及びバックグラウンド除去が、1つ以上の標的の存在に関して試料を試験する方法の結果をさらに改善するために用いられ得る。これらの態様のいずれも有用な実験のために必要ではないが、両方とも多重化の品質を改善し、単独で、または互いと併せて使用され得る。
対照測定が、多重化プロセスの複数の時点で追加され得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法は、(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、(4)試料を、直接または中間鎖を通すなど間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、(7)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、(8)試料を、ドッキング鎖または中間鎖(すなわち、仮想の中間鎖ではなく、使用される場合、方法において実際に存在するもの)に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖と接触させることによって、対照ステップを実施することと、(9)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(10)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、(11)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。
本出願全体を通して考察される実施形態のいずれにおいても、方法は、バックグラウンド除去を用い得る。いくつかの実施形態では、方法は、試料をイメージングして、バックグラウンドシグナルを検出及び/または測定することと、試料の画像からバックグラウンドシグナルを除去して、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。そのようなバックグラウンドシグナルは、自家蛍光、及び/または結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを不完全に消失させることと関連した残留蛍光を含んでもよい。いくつかの態様では、バックグラウンドシグナルは、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の前に測定される。他の態様では、バックグラウンドシグナルは、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の後に測定される。
結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させるために様々な方法が使用され得、これは、同じタイプの検出可能な部分(フルオロフォアなど)が複数のイメージャー鎖上で使用され得、これにより実験がスペクトル的に制限されないようにするために、望ましくあり得る。
多くの酵素が、核酸分子内の共有結合を破壊することができる。例えば、一部のグリコシラーゼは、ヌクレオチドの糖部分から塩基を除去することができ、エンドヌクレアーゼは、核酸分子の内側のホスホジエステル架橋内の結合を切断することができ、一方で、エキソヌクレアーゼは、連続的に核酸分子の5’または3’末端においてホスホジエステル架橋を同様に破壊することができる。別の例は、DNAzymeまたはデオキシリボザイム、核酸分子中のホスホジエステル結合を開裂することが可能な触媒活性を有するオリゴヌクレオチドを含む。これらの全てのタイプの酵素が、イメージャー鎖除去のために操作され得(図5)、標識化イメージャー鎖核酸を酵素的に開裂、修飾、または分解することをもたらす。
1.試料のタイプ
様々なタイプの試料が、これらの方法を使用してイメージングされ得る。いくつかの実施形態では、試料は、固定試料である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞、細胞溶解物、組織、組織溶解物、及び/または全生物である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞もしくは組織試料、細胞もしくは組織解物、または体液である。いくつかの実施形態では、試料は、組織であり、イメージングは、免疫染色のための組織中の多重化を含む。
いくつかの実施形態では、試料を標的特異的結合パートナーで染色することは、特異的な条件を必要とし、全ての標的特異的結合パートナーが同じ条件下でそれらの抗原に結合するわけではない。これは、それらの標的抗原が同じ条件下で利用可能ではないためであり得る。
したがって、いくつかの実施形態では、1つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、(1)試料を処理して、1つ以上の前に利用不可能な標的を曝露することと、(2)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、(3)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、(4)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、(5)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、(6)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、(7)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、(8)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、(9)任意に、ステップ(1)〜(8)を反復することであって、毎回、(a)前に利用不可能な標的の異なるセットを曝露し、(b)1つ以上の異なる標的特異的結合パートナーを使用し、(c)少なくとも1つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖を使用する、反復することとを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、バイオマーカーを同定するのに有用である。場合によっては、試料がイメージングされ、データ分析がそれらの試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、複数の標的が、各標的に対して対応する標的特異的結合パートナーの使用について試験される。場合によっては、異なる標的間の関係が評価され得、例えば、ユーザは、病状に対する複数のマーカーの関係を決定し、疾病試料がそのバイオマーカー分布を有しない健康な組織と比較して、Aのレベルの上昇、Bのレベルの低下、及びある特定の範囲内のCのレベルを有すると結論付けようとし得る。
1.フローセルなどのイメージングチャンバ
いくつかの実施形態では、イメージングチャンバが用いられ得る。場合によっては、イメージングチャンバは、入口も出口もない固定チャンバである。いくつかの実施形態では、イメージングチャンバは、単一の入口/出口の組み合わせを有する。他の場合では、イメージングチャンバは、流動を可能にし、フローセルに指定される。フローセルは、フローセルに頂部及び底部表面ならびにそれらの間の流体流動を提供するために、第2の光学的に透明な材料(ガラスまたはプラスチックのカバースリップなど)と組み合わせた第1の光学的に透明な支持体からなってもよい。第1及び第2の光学的に透明な材料が使用される場合、それらは、互いに平行に配置され得る。平行とは、完全に平行である幾何学的配列、ならびに最大1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、または10°平行から外れる配列を含む。いくつかの実施形態では、第2の光学的に透明な材料は、約5ミクロン〜5mm、50ミクロン〜500ミクロン、または500ミクロン〜5mmなど、第1の光学的に透明な材料のすぐ近くにある。
いくつかの実施形態では、全ての流体交換ステップは、電子、及び/または空気、及び/または油圧、及び/または電子流体アクチュエータ及びシステムを含む流体システムを使用して実施される。ある特定の状況において、流体システムは、ソフトウェアによって制御される。いくつかの実施形態では、流体システムは、ステップ(1(試料を標的特異的結合パートナーと接触させること)、及び/または2(任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去すること)、及び/または3(ドッキング鎖の数を増加させること、もしくは増幅)、及び/または4(試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させること)、及び/または5(任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去すること)、及び/または7(任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去すること)をイメージングステップ(6)と同期化するソフトウェアによって自動的に制御される。
いくつかの実施形態では、組成物は、(1)ドッキング鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナー(異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なるドッキング鎖に結び付けられる)、標識化イメージャー鎖、緩衝液、増幅試薬、及び/または結合したイメージャー鎖を除去するための試薬が挙げられるが、これらに限定されない1つ以上の試薬(複数可)と、(2)全ての流体交換ステップを実施するための流体システム、流体システム及び時間を制御し、及び/または流体ステップをイメージングステップと同期化するためのソフトウェアと、(3)少なくとも1つの光学的に透明な側面を対象となる試料に付けて、試料のイメージングを可能にするためのイメージングチャンバ(フローセルなど)とを含む。いくつかの実施形態では、イメージングチャンバ(フローセルなど)は、使い捨てである。
A.標的特異的結合パートナー
標的認識部分は、標的分子を検出するために使用され得る抗体及び抗体様分子を指す。抗体は、標的分子を特異的に認識することができる任意の種からの任意の免疫グロブリンを指す。抗体様分子は、(クラスA)Fab、Fab’、F(ab’)2、単一重鎖、ダイアボディなどの抗体の任意の操作された変異またはフラグメント(抗体の抗原結合フラグメント)、(クラスB)標的分子の任意の既知の結合パートナー及びそのような結合パートナーの操作された変異体、(クラスC)指向性進化を介して操作された標的分子の任意の結合パートナー(例えば、ペプチド及びアプタマー)、ならびに(クラスD)標的との共有結合(複数可)を選択的に形成する任意の分子(例えば、対象となる酵素の自殺基質)を指す。
いくつかの実施形態では、ドッキング部分またはドッキング鎖は、核酸、タンパク質、ペプチド、または化学化合物である。多くのタンパク質及びタンパク質のドメインは、他のタンパク質、ドメイン、またはペプチドと相互作用することが既知である。最も知られているドメインのいくつかとしては、SH2、SH3、及びWD40ドメインが挙げられる。多くの場合、これらのタンパク質及びドメインの結合パートナーが既知であり、望ましい親和性を有するように操作され得る。例えば、ビオチン及びアビジン/ストレプトアビジンは、十分な特異的で相互作用する。ジゴキシゲニン、フルオレセイン、タクロリムス、及びラパマイシンなどの多くの他の化学化合物もまた、周知の結合パートナーを有する。
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、核酸鎖であってもよい。そのような場合、観察可能な部分または標識は、ドッキング鎖に相補的である核酸鎖であってもよいイメージャー部分に共役してもよい。換言すれば、イメージャー鎖は、ドッキング鎖に特異的に結合する。そのような場合、標識は、約5〜20ヌクレオチド長、約8〜15、または約10〜12ヌクレオチド長であってもよいイメージャー部分に共役し得る。いくつかの実施形態では、イメージャー部分は、約5、8、9、10、11、12、13、14、15、18、または20ヌクレオチド長である。
場合によっては、標的特異的結合パートナーは、プライマーを通してなど間接的にドッキング鎖に結び付けられる。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸を含む場合、核酸を含むプライマー鎖は、(ドッキング鎖がプライマー鎖に相補的な領域を有する場合)ドッキング鎖のための結合位置として使用され得るか、またはそれは、例えば、ローリングサークル増幅を通して核酸合成のためのプライマーとして使用され得る。プライマー鎖はまた、ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅における一連の結合事象を開始するために使用され得る。プライマーが増幅(ローリングサークル増幅、ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅など)のための位置として機能する場合、プライマーは、必ずしもドッキング鎖に相補的ではない。代わりに、それは、増幅のための鋳型として機能し、ドッキング鎖が増幅プロセスを通して含まれる。
場合によっては、ドッキング鎖は、中間部分(または中間鎖)を通してイメージャー鎖に結合する。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸を含む場合、核酸を含む中間鎖は、それがドッキング鎖に相補的な第1の領域と、イメージャー鎖に相補的な第2の領域とを有する限り、使用され得る。そのような実施形態では、ドッキング鎖がイメージャー部分に相補的である必要はない。
本明細書に記載の線形核酸のいずれも、任意に、ヘアピン形式で提供され得る。これは、イメージャー鎖、ドッキング鎖、プライマー鎖、及び中間鎖を含む。ヘアピン形式では、ヘアピンステム領域の末端における少なくとも1〜5個のヌクレオチドの領域が、任意に、G’及びC’のみを含み得る。このG/C領域は、クランプとして既知である。G/C領域は、ヘアピンの末端におけるフレイングを防止または低減して、直鎖DNAへの開放を防止する。
観察可能な部分としても既知の様々な標識が、イメージャー鎖に結合され得る。これらの標識または観察可能な部分は、結合したイメージャー鎖の検出を可能にすることによってユーザを補助する。本出願が結合した標識化イメージャー鎖を検出することを指す場合、本出願は、イメージャー鎖に結合した標識または観察可能な部分によって発生したシグナルを検出することに言及する。
増幅には複数のアプローチが存在する。この実施例は、HRPコンジュゲートを使用した酵素増幅(図7A〜C)、ローリングサークル増幅(図7D〜E)、及びハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)(図7F〜G)を含む3つのアプローチの使用を実証する。
アッセイを実施する前に非線形DNA鎖を作製した。非線形DNA鎖を使用することは、特に使用されるシグナル増幅法がローリングサークル増幅と同様である場合に、シグナル増幅の効率性を高めることができるという利点を提供する(図8)。この実施例では、ライゲーションステップを介して環状DNA鎖を作製した。ライゲーションステップで使用されるDNA配列を環状オリゴと称し、これは、イメージャー鎖配列と同等(すなわち、ドッキング鎖に相補的)であるドメインを含む。
この実施例は、試料中の標的を再検索するために交換イメージングを使用する能力を実証する。シグナルを消失させる酵素的方法が、試料の染色に影響を及ぼさず、修飾せず、または分解しないことも示す。
ThunderLinkキット(Innova Biosciences)を使用して、一対の近接プローブ(PL及びPR)を抗マウス抗体に共役させた。培養されたHeLa細胞を、温かい3%パラホルムアルデヒド及び0.1%グルタルアルデヒドで固定し、0.1%水素化ホウ素ナトリウムで還元し、3%ウシ血清アルブミン及び0.2% Triton−X 100でブロック及び透過処理し、次いで、アルファ−チューブリンに対するマウス一次抗体で染色した。次いで、固定細胞をPL及びPR共役二次抗体の混合物で染色し、洗浄していかなる非結合材料も除去した。試料中の抗アルファ−チューブリン抗体の大部分は、PL共役二次抗体の少なくとも1つの分子及びPR共役抗体の少なくとも1つの分子を受容するはずである。近接シグナルを検出するために、DAPI及び100nMのイメージャー鎖を試料に付加し、試料を、LED光源を有する20倍の広視野蛍光顕微鏡でイメージングした(図10A(上のパネル))。
非相補的イメージャー鎖配列への曝露の前及び後の試料のシグナル強度を測定することによって、標的外イメージャーとドッキング鎖との間の交差反応性を評価した。
この実施例は、酵素活性を使用して標的からシグナルを消失させる能力を実証する。この実施例では、ドッキング鎖(D1)は、二次抗体ヤギ抗マウスに共役した。D1に相補的なイメージャー鎖I1Uを、蛍光色素(ATTO647N)で標識化した。イメージャー鎖I1Uは、特異的酵素活性によって開裂され得るいくつかのウラシルヌクレオ塩基を含有し、二本鎖イメージャー/ドッキング鎖を不安定化し、蛍光シグナルの除去をもたらす。
図14に示されるように、シグナルが消失し得る程度は、イメージャー鎖の構造及び/または配列設計によって決まり得る。この実施例では、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片を脱ろうし、抗原賦活化し、ブロックし、ドッキング鎖D1に共役した抗CD3抗体で染色した。試料に結合したD1ドッキング鎖の数をRCAによって増幅させ、D1に相補的で、フルオロフォアに結び付けられたドメインを含有するイメージャー鎖で標識化した。イメージャー鎖は、いくつかのウラシルヌクレオ塩基(図14A及びC)、またはいくつかのウラシルヌクレオ塩基及び非塩基部位(図14B及びD)のいずれかを含有した。蛍光顕微鏡を使用して画像を収集して、標識化イメージャー鎖によって結合した標的の存在を検出した(図14A〜B)。
この実施例は、異なるスペクトル的に分離されたフルオロフォアで官能化されたイメージャー鎖のセットを使用して、複数の標的を検出するために交換イメージングを使用する能力を実証する。
以下の番号付き項目は、本明細書の実施形態及びそれらが互いにどのように関連し合うのかのさらなる説明を提供する。
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(6)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、(1)の核酸鎖が、プライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかであり、核酸鎖がプライマー鎖である場合、ドッキング鎖に結び付けられる、接触させることと、
(4)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(5)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出し、増幅(ステップ(7))が必要とされるかを判定することと、
(6)任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
(7)任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(7)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、接触させることと、
(4)任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
(5)1つまたは2つのステップのいずれかで、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、試料を、ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(8)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、任意に、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(7)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、
(7)第1の支持体に平行に第2の光学的に透明な材料を取り付けることと、
(8)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、を含む、方法。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、
(7)第1の支持体に平行に第2の光学的に透明な材料を取り付けることと、
(8)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、を含む、方法。
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び数を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)ステップ(3)〜(6)または(3)〜(7)を反復することであって、標識化イメージャー鎖が任意に、全ての他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することと、を含む、方法。
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる、組成物。
(a)ドッキング鎖、または
(b)ドッキング鎖及び任意の中間鎖
が、80個以下のヌクレオチド、70、60、50、40、または30個以下のヌクレオチドである、項目27〜28のいずれか1つに記載の組成物。
(a)半ドッキングドメインを用いる組成物であって、(i)半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第1の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、(ii)半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第2の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート((a)(i)及び(a)(ii)の安定ドメインが、互いに相補的であり、(a)(i)及び(a)(ii)の半ドッキングドメインが、線形に組み合わされて完全ドッキングドメインを形成することができる)と、(iii)5’ドメイン、3’ドメイン、及び5’ドメインと3’ドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、少なくとも1つの標識化イメージャー鎖または中間鎖(5’ドメインが、(a)(i)の半ドッキングドメインに相補的であり、3’ドメインが、(a)(ii)の半ドッキングドメインに相補的であり、標識化イメージャー鎖または中間鎖が、完全ドッキングドメインに安定的に結合し、中間鎖が使用される場合、標識化イメージャー鎖も提供する)とを含む、組成物、または
(b)半プライマードメインを用いる組成物であって、(i)半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第1の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、(ii)半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも1つの第2の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート((b)(i)及び(b)(ii)の安定ドメインが、互いに相補的であり、(b)(i)及び(b)(ii)の半プライマードメインが、線形に組み合わされて完全プライマードメインを形成することができる)と、(iii)完全プライマードメインに安定的に結合することが可能な少なくとも1つのドッキング鎖と、(iv)ドッキング鎖に安定的に結合することが可能な少なくとも1つの標識化イメージャー鎖またはドッキング鎖に安定的に結合することが可能な中間鎖、及び中間鎖に安定的に結合することが可能な標識化イメージャー鎖とを含む、組成物、を含む、組成物。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、使用される場合、間接結合が、中間鎖を通して起こることが可能である、接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)試料を、ドッキング鎖に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖、または使用される場合、中間鎖と接触させることと、
(9)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(10)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(11)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、を含む、方法。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、ドッキング鎖に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖、または使用される場合、任意の中間鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び/または数を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、使用される場合、間接結合が、中間鎖を通して起こることが可能である、接触させることと、
(9)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(10)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び/または数を検出することと、
(11)任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、を含む、方法。
(1)標識と、
(2)第1の核酸ドメイン、第2の核酸ドメイン、及び第3の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、1〜9ヌクレオチド長である、核酸ドメインと、
(3)第1の核酸ドメイン及び第2の核酸ドメインを結び付ける第1の結合部分と、
(4)第2の核酸ドメイン及び第3の核酸ドメインを結び付ける第2の結合部分と、を含み、
両方の結合部分が、(a)無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、(b)核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、(c)非天然ヌクレオチド、または(d)制限部位またはニッキング部位から独立して選択される、組成物。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、標識化イメージャー鎖が、項目34〜41のいずれか1つに記載の組成物を含む、接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することであって、標識化イメージャー鎖が、標識化イメージャー核酸を酵素的に開裂、修飾、または分解することによってドッキング鎖から除去される、除去することと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(7)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
(1)試料を処理して、1つ以上の前に利用不可能な標的を曝露することと、
(2)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(3)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(4)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(5)試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(6)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(7)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(8)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(9)任意に、ステップ(1)〜(8)を反復することであって、毎回、(a)前に利用不可能な標的の異なるセットを曝露し、(b)1つ以上の異なる標的特異的結合パートナーを使用し、(c)少なくとも1つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖を使用する、反復することと、を含む、方法。
(1)試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
(4)イメージングチャンバ(フローセルなど)において、試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び/または数を検出することと、
(7)結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)ステップ(4)〜(6)または(4)〜(7)を反復することであって、少なくとも一度、標識化イメージャー鎖が任意に、少なくとも1つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することと、を含む、方法。
(1)核酸鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナー(異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる)、標識化イメージャー鎖、緩衝液、増幅試薬、及び/または結合したイメージャー鎖を除去するための試薬が挙げられるが、これらに限定されない1つ以上の試薬(複数可)(核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、またはプライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる)と、
(2)全ての流体交換ステップを実施するための流体システム、
流体システム及び時間を制御し、及び/または流体ステップをイメージングステップと同期化するためのソフトウェアと、
(3)少なくとも1つの光学的に透明な側面を対象となる試料に付けて、試料のイメージングを可能にするためのフローセルと、を備える、キット。
上記の書面による明細は、当業者が本実施形態を実施することを可能にするのに十分である。上記の説明及び実施例がある特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良のモードを記載する。しかしながら、上記が文中でどれほど詳細に表示されようと、実施形態が多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
Claims (30)
- 1つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
(1)1つ以上の標的の存在に関して試験される試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)前記試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、前記核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、前記接触させることと、
(4)任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
(5)1つまたは2つのステップのいずれかで、前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、前記試料を、前記ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(6)前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)前記結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(8)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。 - ポリメラーゼがローリングサークル増幅のために使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記非線形アンプリファイアー鎖が、前記試料と接触させる前に、核酸鎖に結び付けられた前記標的特異的結合パートナーと組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと同じステップで起こり、前記イメージャー鎖が、前記イメージャー鎖の増幅を防止するために3’修飾を任意に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イメージャー鎖が、ローリングサークル増幅のための環状イメージャー鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記イメージャー鎖またはアンプリファイアー鎖が、前記ドッキング鎖に相補的である少なくとも2つの領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標識化イメージャー鎖が、直鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記非線形アンプリファイアー鎖が、環状鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記非線形アンプリファイアー鎖が、ライゲーション後に環状になる、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
(1)前記試料を1つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
(2)任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
(3)前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、任意に、2つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることと、
(4)前記試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
(5)任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
(6)前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
(7)任意に、前記結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
(8)任意に、ステップ(1)〜(7)またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。 - ステップ(6)の後、及び任意にステップ(7)を実施した後に、前記方法が、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、ステップ(4)、任意に(5)、(6)、及び任意に(7)を反復することと、をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記方法が、ステップ(3)において、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることか、または2つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることを含む、請求項11に記載の方法。
- 各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数の前記増加が、酵素を使用して達成され、前記酵素が任意に、ポリメラーゼである、請求項11に記載の方法。
- 非結合標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することが、酵素を使用することによって達成され、前記酵素が任意に、グリコシラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、RNase、及び非天然ヌクレオチドにおいて開裂する酵素である、請求項11に記載の方法。
- 2つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含む、組成物であって、各結合パートナーが、核酸鎖、及び直接または間接的に標識化イメージャー鎖に安定的に結合した少なくとも1つのドッキング鎖に結合し、前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸が、
(a)ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
(b)プライマー鎖である場合、2つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させる、前記組成物。 - 直接または間接的に標識化イメージャー鎖に結合した前記ドッキング鎖が、30分間少なくとも90%の結合を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記
(a)ドッキング鎖、または
(b)ドッキング鎖及び任意の中間鎖
が、80個以下のヌクレオチド、70、60、50、40、または30個以下のヌクレオチドである、請求項16に記載の組成物。 - 前記イメージャー鎖が、60個以下のヌクレオチドである、請求項16に記載の組成物。
- (1)標識と、
(2)第1の核酸ドメイン、第2の核酸ドメイン、及び第3の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、1〜9ヌクレオチド長である、前記核酸ドメインと、
(3)前記第1の核酸ドメイン及び前記第2の核酸ドメインを結び付ける第1の結合部分と、
(4)前記第2の核酸ドメイン及び前記第3の核酸ドメインを結び付ける第2の結合部分と、を含む、組成物であって、
両方の結合部分が、(a)無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、(b)核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、(c)非天然ヌクレオチド、または(d)制限部位またはニッキング部位から独立して選択される、前記組成物。 - 追加の核酸ドメインが、追加の結合部分によって結び付けられる、請求項20に記載の組成物。
- 少なくとも1つの結合部分が、無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位(アピリミジン)である、請求項20に記載の組成物。
- 少なくとも1つの結合部分が、エンドヌクレアーゼVIIIからの開裂を起こしやすい、請求項20に記載の組成物。
- 前記核酸ドメインが、DNAを含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記核酸ドメインが、RNAを含む、請求項20に記載の組成物。
- 少なくとも1つの結合部分が、少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記イメージャー鎖及び/または前記中間鎖が、USERによる開裂が可能な少なくとも1つのUを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イメージャー鎖及び/または中間鎖が、少なくとも1つの非塩基部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも2つの標的が、同じイメージングステップで少なくとも2つの標識を使用してイメージングされる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも2つの標的が、少なくとも2つの標識を使用してイメージングされ、前記シグナルが消失され、次いで少なくともさらに1つの標識が、同じ標識のうちの少なくとも1つを使用してイメージングされ、前記イメージングステップが、いずれかの順序で実施され得る、請求項1に記載の方法。
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