ES2463420T3 - Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento - Google Patents

Abstract

Un kit para detectar un analito de ácido no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento, que comprende: (i) un primer contenedor que contiene un anticuerpo de captura unido a un soporte solido con un puente de ácido nucleico que consta de dos hebras de acido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de las cuales esta unida a un soporte sólido; (ii) un segundo contenedor que tiene un conjugado del mismo anticuerpo o de un anticuerpo diferente y una molecula de marcador de acido nucleico; y (iii) un tercer contenedor que contiene un ácido nucleico desplazador que tiene una secuencia por lo menos parcialmente complementaria a una de las hebras del puente de acido nucleico.

Description

AlVIBITO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a kits para generar una serial en respuesta a un analito presente en una muestra. Especificamente, la invencion se refiere a kits que emplean deteccion por amplificacion de serial de un marcador de acido nucleico. Esta invencion tambien se refiere a kits para etiquetar anticuerpos u otras proteinas con ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Existe un inmuno ensayo tipico conocido como Ensayo Inmunoenzimatico Enlazado a Enzimas (ELISA). El antigen° que va a ser detectado se elimina de la solucion mediante una adsorcion no especifica a una superficie solida, como por ejemplo el interior de un pocillo de placa de microtitulacion. Despues de lavar para eliminar el exceso de antigen° y bloquear los puntos restantes de la placa, el antigen° inmovilizado es contactado con un anticuerpo primario para formar un complejo inmune en el soporte solid°. El exceso de anticuerpo puede extraerse lavando la placa. El anticuerpo primario se detecta a traves de una enzima, que puede conjugarse directamente al anticuerpo primario (ELISA directo) o a un segundo anti-anticuerpo, que posteriormente se pone en contacto con la placa (ELISA indirecto). La actividad enzimatica asociada con la superficie solida es proporcional a la cantidad de antigen° unido presente y puede medirse, por ejemplo utilizando un sustrato cromogenico para la enzima.

El Inmuno-PCR es similar al ELISA indirecto, pero utiliza una secuencia de ADN en lugar de una enzima como molecula de detecci6n (ver, por ejemplo, Sano et al., Science, 1992, 258 : 120-22). Sano etal.,demostraron la eficacia de este metodo con un antigen° de albumina de suero bovino (BSA) y un anticuerpo primario anti

BSA. El ADN plasmido biotinilado se acoplo con el anticuerpo primario via la proteina A-avidina. La amplificacion del ADN asociado al antigeno por medio de 30 ciclos de reacciOn en cadena de polimerasa (PCR) permiti6 la detestaciOn mediante tintura con bromuro de etidio seguida de electroforesis de gel. Los autores informaron de una mejora en la sensibilidad de deteccion de aproximadamente cinco ordenes de magnitud en comparacion con la detecci6n de ELISA. En teoria, una etiqueta de ADN puede detectarse con una sensibilidad extraordinaria (potencialmente hasta una copia sencilla) cuando es amplificada mediante PCR o mediante cualquier otra tecnica de amplificacion de acido nucleico exponencial. Sin embargo, la adicion secuencial de cada componente del ensayo requiere un lavado extensivo con el fin de reducir el material unido no especificamente.

El Inmuno-PCR tambien puede realizarse en un formato de inmunoensayo en sandwich. Un inmunoensayo en sandwich tipico utiliza dos anticuerpos que reconocen el antigen° que va a ser detectado. Se utiliza un anticuerpo de "captura" para revestir la superficie de un soporte solid°, como por ejemplo un pocillo, una gota o una particula de microtitulo. Se etiqueta un anticuerpo "informador" con una molecula de detecci6n, como por ejemplo un is6topo radioactivo, un fluoroforo o una enzima. En algunos casos, puede utilizarse el mismo anticuerpo tanto para la captura como para el informe. Habitualmente, el antigen° entra en contact° en primer lugar con el anticuerpo informador en solucion o con el anticuerpo de captura en el soporte solid°, seguido de la adicion del anticuerpo restante. El complejo inmune especifico resultante se une a la superficie del soporte solid° y consiste en el antigeno combinado con dos anticuerpos. El antigeno y los anticuerpos sobrantes son eliminados lavando de forma repetida el soporte. Es de gran importancia mantener la integridad del complejo inmune inmovilizado durante la fase de lavado con el fin de maximizar la intensidad de la serial,

a la vez que se mejora la eliminacion del anticuerpo informador no unido, minimizando

de esta manera el fondo. Despues de los lavados, el anticuerpo informador unido es medido a troves de la molecula de detecciOn, como indicacion de la cantidad de antigeno presente.

El anticuerpo informador puede ser etiquetado directamente mediante una modificacion covalente del anticuerpo, o indirectamente a traves del enlace de un segundo anticuerpo o proteina que posea una etiqueta detectable. La adhesion indirecta puede conseguirse, por ejemplo, etiquetando el anticuerpo informado con biotina y adhiriendo la molecula de deteccion a la avidina. Cuando el sistema de deteccion es lo suficientemente sensible, el limite inferior del ensayo quedara determinado normalmente por el grado de fondo producido por el enlace no especifico del anticuerpo informador no unido.

Tambien se han indicado ejemplos de inmuno-PCR sandwich en la literatura (ver, por ejemplo, Joerger et al., Clin Chem, 1995,41: 1371-77; Hendrickson et al., Nucleic Acids Res, 1995, 23: 522-529). Los limites de deteccion para el formato de ensayo de Inmuno-PCR exceden los de los inmunoensayos de enzimas convencionales. Sin embargo, es necesario realizar una limpieza astringente, utilizando por ejemplo una solucion detergente, para eliminar los anticuerpos informadores con etiqueta ADN no especificamente unidos.

EP 1 249 500 se refiere a un metodo para la deteccion de un analito, en que un soporte solid° 5 se acopla con una primera secuencia de acido nucleico y una segunda secuencia complementaria se acopla a un anticuerpo por medio de una interaccion de biotina—avidina utilizando una secuencia de acid° nucleico biotinilado y un anticuerpo adherido a la avidina. Tambien explica la union de un acido nucleico

marcador detectable por PCR a un segundo anticuerpo de analito especifico por medio

de interacciones de biotina—avidina.

El formato de sandwich del Inmuno-PCR tambien ha sido utilizado para demostrar la detecci6n de mUltiples antigenos ("multiplexing") (ver, por ejemplo, U.S. Pat. No. 5,985,548). Las etiquetas de ADN de diferente longitud fueron adheridas cada una de ellas con anticuerpos informadores que reconocen diferentes antigenos que utilizan un ester de 5' N-hidroxisuccinimida (NHS). Los conjugados de ADN de anticuerpo informador — ADN se vincularon a un soporte solid° revestido con los diferentes antigenos. Las multiples etiquetas de ADN fueron detectadas de forma simultanea en el ensayo en base a los tamafios de los productos de amplificacion de PCR respectivos, que habian sido diseriados para permitir la resolucion de cada uno de los otros por electroforesis de gel.

El Inmuno-PCR ofrece una mejora real en sensibilidad sobre los inmunoensayos actuales, pero presenta un gran ninnero de oportunidades por lo que se refiere a generar fondo. El fondo puede generarse a partir del enlace no especifico de cualquier componente, incluyendo el conjugado de anticuerpo—ADN informador, la proteina quimerica u otro componente de etiquetado secundario. Dado que las moleculas individuales de acid° nucleic° pueden ser detectadas por el PCR, si se deja de eliminar todas las moleculas de ADN modelo no especificamente unidas, ello provoca un fondo significativo, e interfiere con la capacidad de detect& cantidades minitsculas de analito. Los lavados astringentes, numerosos o prolongados para reducir los productos no especificos han sido utilizados para reducir el fondo, pero pueden tener como resultado una serial reducida debido a la elucion o la disociacion de complejos de antigenos/anticuerpos. De la misma manera, el Inmuno-PCR esti, limitado por la ya conocida no-linealidad del PCR, que puede frustrar los intentos de evaluar las

cantidades proporcionadas de analito presentes. Estas diferencias practicas han

impedido que las tecnicas de Inmuno-PCR consigan una aceptaciOn y una utilidad globales en este campo.

Se ha sugerido una gran variedad de metodos para reducir el fondo en metodos tanto de inmunoensayo standard como de Inmuno-PCR. Ishikawa et al. (U. S. Pat. No. 5,888,834) han propuesto la tecnica de inmunoensayo de transferencia de complejos inmunes, en la cual un complejo inmune sandwich es liberado del soporte de captura y recapturado sobre una superficie nueva. Los componentes informadores no especificamente unidos quedan en el soporte solid° inicial. La sensibilidad del ensayo de hibridacion del acido nucleico tambien ha experimentado una mejora, mediante la elucion quimica del ADN hibridizado desde un soporte solid°, dejando atras las sondas de ADN informador no especificamente unidas (verMorrissey, etal.,AnalBiochem 1989, 181: 345-359). El ADN objetivo fue hibridizado con una sonda de captura de cola dA y una sonda informadora etiquetada. Id. El complejo fue capturado en gotas paramagneticas revestidas con oligo dT. Id. Despues de lavarlo, el complejo fue liberado mediante elucion con una solucion de tiocianato de guanidinio y recapturado en un soporte nuevo revestido con poli dT. Id. Los complejos tambien han sido liberados mediante el uso de homopolimeros, como por ejemplo 200-400 mediante poli (rU), en combinacion con el lavado en sales de tetraalquilamonio (Collins et al. , Patente No. US 5,702,896).

Desde un punto de vista conceptual, el Inmuno-PCR posee una sensibilidad teOrica extraordinaria. Sin embargo, esta tecnica no ha sido explotada comercialmente debido al problema de la etiqueta de ADN modelo no especificamente unido, que oscurece la serial del analito real. Ello lleva a la generaciOn de resultados positivos falsos y a la irreproducibilidad cuando se intenta detectar los analitos presentes en

niveles bajos. Algunos investigadores han llegado a la conclusion de que el Inmuno-

PCR no es mas sensible que el ELISA a la hora de detectar IgG debido a la union no especifica (McKie, et al., J. Inmunol. Meth., 2002, 261:167175). La destacable sensibilidad conseguida por Sano et al. quedo demostrada con un sistema puro que utilizaba un formato engorroso multi-fase, que resultaba poco practico para aplicaciones medicas.

En el campo de los diagnosticos y las biociencias existe la necesidad de una prueba solida que detecte los analitos presentes en niveles o concentraciones muy escasos. Esta necesidad sera mas patente a continuaci6n de la secuenciaci6n y el analisis del genoma humano. Este esfuerzo masivo de secuenciaciOn ha tenido como resultado el descubrimiento de proteinas no descubiertas con anterioridad, que deben ser analizadas y caracterizadas. Muchas de estas proteinas pueden encontrarse presentes en cantidades no detectables por la tecnologia actual. La promesa por parte del Inmuno-PCR de proporcionar metodos de alta sensibilidad para la deteccion de analitos solamente se ha cumplido en parte. De esta manera, existe una necesidad de proporcionar metodos para el Inmuno-PCR que tengan una alta sensibilidad y un fondo bajo.

RESUMEN DE LA INVENCION

En su sentido mas amplio, la invencion se refiere a kits tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

La descripcion se refiere a un proceso por el cual un anticuerpo de captura para un inmunoensayo de sandwich es etiquetado con una molecula especifica de ADN de doble hebra en que la hebra complementaria a la hebra fijada al anticuerpo de captura es modificada con un ligando de alta afinidad. La utilizaciOn del ligando permite que la

hebra de ADN complementaria quede fijada a un soporte solid°. A continuacion, el

anticuerpo de captura/ADN de doble hebra es inmovilizado en una fase solida que comprende la proteina de la union del ligando de alta afinidad correspondiente con el puente de acid° nucleico que enlaza el anticuerpo de captura a la fase solida. En realizaciones preferentes, se utiliza un par de union de biotina/avidina, pero tambien pueden emplearse otras combinaciones de ligandos y aglomerantes. La fase solida puede servir como medio para capturar complejos inmunes de anticuerpos de antigenos

o de informadores de antigenos. La hebra de ADN puede ser modificada con propiedades que permitan la liberaciOn del complejo inmune del medio de captura con el fin de mejorar la sensibilidad de deteccion.

Aunque la invenciOn se describe en el presente documento mediante la utilizaciOn como ejemplo de moleculas de ADN como un puente, acidos nucleicos desplazadores y acidos nucleicos marcadores, en otras realizaciones tambien pueden utilizarse acidos nucleicos distintos del ADN, como por ejemplo ARN o acid° nucleico peptido (PNA) para una hebra, para ambas hebras o para partes de una o de ambas hebras.

Los kits de diagnostic° para realizar dichos metodos pueden construirse para que incluyan un primer contenedor que contenga el anticuerpo de captura enlazado a un soporte solid° con un puente de acid° nucleico; un segtindo contenedor que contenga un conjugado del mismo anticuerpo o de un anticuerpo distinto, y una molecula de ADN marcador; y un tercer contenedor que comprende un acid° nucleico desplazador. El kit de diagnostic° tambien puede incluir una notificacion de autorizaci6n de uso de FDA e instrucciones para ello. Una persona con conocimientos en la tecnica puede reconocer con facilidad que los anticuerpos distintos a los descritos en la presente invencion

pueden ser incorporados sin problemas a uno de los formatos de kit establecidos que

son bien conocidos en el estado de la tecnica.

Esta descripcion tambien se refiere al proceso de etiquetado de anticuerpos (u otras proteinas) con una molecula de ADN de una secuencia predeterminada. La molecula de ADN puede ser posteriormente detectada con gran sensibilidad por parte del PCR o de cualquier tecnica de amplificacion de acido nucleico. Como alternativa, la molecula de ADN puede ser utilizada como puente para el anticuerpo o la proteina hacia un soporte solido. La molecula de ADN puede ser adherida directamente al anticuerpo activando quimicamente el ADN en primer lugar, y a continuacion permitiendo que la molecula de ADN enlace con el anticuerpo. Una proteina que une el ligando tambien puede ser etiquetada con ADN activado quimicamente, y a continuacion permitir que forme un complejo con el anticuerpo informador derivado con el ligando correspondiente para la proteina de union. De esta manera, el anticuerpo informador, el anticuerpo de captura u otra proteina pueden ser adheridos a una molecula de ADN mediante una union covalente directa.

Los kits para llevar a cabo dichos metodos pueden estar constituidos para incluir un contenedor que contenga un acido nucleico de una secuencia predeterminada activada para estar preparada para enlazar con una proteina seleccionada.

En un aspecto, la invencion consiste en un kit para realizar inmunoensayos de deteccion de acido nucleico que comprende moleculas de ADN activadas para etiquetar al informador y/o para capturar anticuerpos cuando el anticuerpo informador va a ser etiquetado con una hebra de un puente de acido nucleico. El kit tambien comprende hebras complementarias a las moleculas de ADN mencionadas mas arriba, en que el ADN complementario en parte o en su totalidad con la hebra de ADN del puente de

acido nucleico mencionada anteriormente es biotinilado, y una hebra desplazadora que

es complementaria en parte o en su totalidad a la hebra de ADN anteriormente mencionada del puente de acido nucleico, pero que no es biotinilada. El kit tambien puede comprender cebador(es) de amplificacion, micro-particulas paramagneticas avidiniladas, amortiguadores de union y lavado, reactivos de PCR, y un tinte para detectar el producto de amplificacion, como por ejemplo Verde SYBR.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1: la Figura 1A muestra una secuencia de ADN, adherida a un anticuerpo, e hibridizada para la secuencia anclada al soporte solido a traves de una region hibridizada de 22 bases. La molecula desplazadora se hibridiza para anclar la secuencia en el soporte solid° mediante una estructura rica en GC de 7 bases y procede a desplazar la secuencia de captura a lo largo de las 20 bases siguientes, dejando un hibrido de AT en el extremo de uniOn del anticuerpo, que es inestable. La Figura 1B muestra un experimento en el cual, en lugar de un anticuerpo de captura, la fosfatasa alcalina se conjuga con una molecula de acido nucleico, y a continuacion sirve como puente hacia un soporte solid°. La Figura 1C muestra una primera captura, seguida de un desplazamiento, seguida de una recaptura.

Figura 2: Serial de fondo obtenida por el desplazamiento del complejo inmune de las microparticulas paramagneticas.

Figura 3: Estabilidad del Hibrido de Captura/Anclaje. La Figura 3 muestra que el hibrido de captura/anclaje es estable bajo las condiciones de salinidad del amortiguador utilizado. El conjugado de anticuerpo/ADN biotinilado permanece unido al pocillo, asi como los controles.

Figura 4: Desplazamiento y Concentraci6n de sal de PNA. La Figura 4

muestra el efecto del desplazamiento de PNA en el conjugado de anticuerpo/ADN biotinilado unido. Con una resistencia ionica baja, el desplazamiento de PNA es muy efectivo, eliminando el anticuerpo en unos pocos minutos. No resulta tan eficaz con una

concentracion de sal alta.

Figura 5: Desplazamiento de ADN y Concentraci6n de Sal. La Figura 5 muestra el desplazamiento por ADN. Resulta muy efectivo en una concentraci6n de sal alta, e ineficaz en ausencia de sal.

Figura 6: La Figura 6 muestra el resultado de un experimento de PCR en tiempo real. La Figura 6A muestra la serial de fluorescencia en tiempo real obtenida a partir de una serie de diluciones standard de conjugados de anti-PSA rMAb-DNA. La Figura 6B muestra el umbral de ciclo como funcion del ntimero inicial de moleculas de rMAb-DNA a partir de (A).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

El termino "analito" tal como se utiliza en este documento se refiere a cualquier sustancia que pueda ser detectada en un ensayo, y que pueda encontrarse presente en una muestra. El analito puede ser, sin limitacion, cualquier sustancia, y prefeiiblemente comprende una sustancia para la cual existe un anticumpo que se produce de forma natural o para la cual puede prepararse un anticuerpo. El analito puede ser, por ejemplo, una proteina, un polipeptido, un hapteno, un carbohidrato, un lipido, una celula o cualquier otra de una variedad de moleculas o complejos biologicos

o no biologicos, o una combinacion de los mismos. En las realizaciones preferentes de

la invenciOn, los analitos no contienen acidos nucleicos.

El termino "analito de ficido no nucleico" se refiere en general a un analito que no contiene un acid° nucleico que interfiere con los metodos de detecci6n de

Inmuno-PCR de la invencion. Los analitos de acid° no nucleico de la invencion no consisten imicamente de moleculas de un acid° nucleico, y habitualmente, el analito ae acid° no nucleico no contiene acidos nucleicos. En realizaciones preferentes, en analito puede comprender un peptido, una proteina, un carbohidrato, un lipid°, una celula o cualquier material antigenic°. Los analitos de la invencion pueden comprender un componente de acid° nucleico, pero la union del analito que va a ser detectado no depende de la hibridaciOn complementaria entre cualquier secuencia de acid° nucleico en el analito y una secuencia de acid° nucleico en el receptor proporcionado por la invencion.

El termino "muestra" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una parte alicuota de material, con frecuencia una solucion acuosa o una suspensiOn acuosa derivada de material biologic°. Las muestras que van a experimentar el ensayo para determinar la presencia de un analito mediante los metodos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, celulas, tejidos, homogeneatos, lisatos, extractos y proteinas purificadas o parcialmente purificadas y otras moleculas biologicas y mezclas de las mismas. Los ejemplos sin limitacion de las muestras que se utilizan tipicamente en los metodos de la invencion incluyen fluidos humanos y animales como por ejemplo, sangre, suero, plasma, fluido cerebro-espinal, esputos, limpieza bronquial, aspiraciones bronquiales, orina, fluidos linfaticos y diversas secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lagrimas, saliva, leche, globulos blancos sanguineos, mielomas y similares; fluidos biologicos como sobrenadantes de cultivo de

celulas; especimenes de tejido que pueden estar o no estar fijados. Las muestras utilizadas en los metodos de la presente invencion variaran en funcion del formato del ensayo y de la naturaleza de los tejidos, celulas, extractos u otros materiales, especialmente materiales biologicos, que vayan a experimentar el ensayo. Los metodos para preparar extractos de proteinas a partir de las celulas o de muestras son bien conocidos en el sector, y pueden ser adaptados con facilidad para obtener una muestra que sea compatible con los metodos de la invencion.

El terrain° "contactar" tal como se utiliza en el presente documento se refiere en general a proporcionar acceso de un componente, reactivo, analito o muestra a otro. Por ejemplo, contactar puede implicar mezclar una solucion que comprenda un receptor de acido no nucleico con una muestra. La solucion que comprende un componente, reactivo, analito o muestra puede comprender tambien otro componente o reactivo, como sulfoxido de dimetil (DMSO) o un detergente, que facilita la mezcla, la interacci6n, la absorcion u otro fenomeno fisico o quimico que resulte ventajoso para el contacto entre componentes, reactivos, analitos y/o muestras. En una realizacion de la invenciOn, contactar implica ariadir una solucion que comprende un receptor de acid° no nucleico a una muestra utilizando un aparato de distribucion, como por ejemplo un dispositivo basado en una pipeta, o un dispositivo basado en una jeringa.

Los terminos "receptor de ficido no nucleico" o "receptor" tal como se utilizan en el presente documento se refieren a una molecula de acid° no nucleico que es capaz de unir de forma especifica otra molecula. En una realizacion, el receptor es un anticuerpo. En un aspecto preferente de esta realizacion, el receptor es un anticuerpo informador. En otras realizaciones de la invencion, los receptores pueden incluir, sin limitacion: moleculas de receptor biologic°, como un receptor de insulina, ligandos para receptores, como la insulina, y otras moleculas biologicas que tienen afinidad por otra

molecula, como biotina o avidina. Los receptores de la presente invencion no tienen que

comprender una molecula que se produzca de forma completamente natural, sino que pueden consistir imicamente de una parte, fragmento o subunidad de una molecula que se produzca de forma natural, como por ejemplo el fragmento Fab de un anticuerpo. Los receptores pueden ser generados por cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden encontrarse en un suero preparado a partir de un fluido ascitico o sobrenadante de cultivo de tejido de hibridoma, o pueden derivarse de un sistema de expresiOn recombinante, tal como es bien conocido en el estado de la tecnica. Los fragmentos, partes o subunidades de, por ejemplo, un anticuerpo u otro receptor, pueden ser generados por medios quimicos, enzimaticos u otros, produciendo moleculas, ya sean conocidas (por ejemplo, Fab, o Fab') o nuevas. La presente invencion tambien contempla los receptores que pueden incluir moleculas recombinantes, quimericas o hibridas, tales como los anticuerpos humanizados o primatizados, asi como otras formas de anticuerpo que no se produzcan de forma natural. Las personas con conocimientos en el tema reconoceran que los ejemplos no limitadores que se proporcionan mas arriba, y que describen diferentes formas de anticuerpos tambien pueden ser extendidos a otros receptores de manera que las formas recombinantes, quimericas, hibridas, truncadas, etc. de receptores no de anticuerpo pueden ser utilizadas en los metodos de la presente invencion.

Los "anticuerpos policlonales" son poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antigen°, o un derivado funcional antigenic° de los mismos. Para la produccion de anticuerpos policlonales, pueden inmunizarse animales huesped como conejos, ratones y cabras mediante la inyeccion de un antigen° o un conjugado portador de hapteno suplementado de forma opcional con adyuvantes.

Los "anticuerpos monoclonales", que son poblaciones homogeneas de

anticuerpos para un antigeno determinado, y pueden obtenerse mediante cualquier tecnica que porporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por lineas de celulas continuas en cultivo. Entre ellas se incluyen, sin limitaciOn, la tecnica de hibridoma de Kohler y Milstein, Nature, 256:495-7 (1975); y Patente No. US 4,376,110), la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kosbor, et al., Inmunology Today, 4:72 (1983); Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-30 (1983)), y la tecnica del hibridoma EBV (Cole, et al., en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 77-96 (1985)). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier otra subclase de los mismos. El hibridoma que produce el mAb de esta invencion puede ser cultivado in vitro o in vivo. La produccion de titulos altos de rnAbs in vivo lo convierte en un metodo de produccion preferido en la actualidad.

Asimismo, pueden utilizarse tecnicas desarrolladas para la producciOn de "anticuerpos quimericos" (Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Takeda, et al., Nature, 314:452-54 (1985)) empalmando los genes de una molecula de anticuerpo de rat& de la especificidad de molecula de anticuerpo apropiada junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de la actividad biologica apropiada. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la cual diferentes partes se derivan de diferentes especies animales, como los que tienen una regi6n variable derivada de un mAb murino y una regi6n constante de inmunoglobulina humana.

Como alternativa, pueden adaptarse tecnicas descritas para la producciOn de anticuerpos de una sola cadena (Patente No. US 4,946,778; Bird, Science 242:423-26 (1988); Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83 (1988); y Ward, et al.,

Nature, 334:544-46 (1989)) para producir anticuerpos de gen de una sola cadena. Habitualmente, los anticuerpos de una sola cadena se forman enlazando los fragmentos de cadena pesados y ligeros de la regiOn Fv via un puente de aminoacido, lo cual tiene como resultado un polipeptido de una sola cadena.

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen los epitopos especificos pueden ser generados mediante tecnicas ya conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen sin limitacion: los fragmentos de F(ab1)2 que pueden ser producidos por digestion de pepsina de la molecula del anticuerpo y los fragmentos de Fab que pueden ser generados reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab')2. Como alternativa, pueden crearse estudios de expresion de Fab (Huse, et al., Science, 246: 1275-81 (1989)) para permitir una identificaciOn rapida y sencilla de los fragmentos de Fab monoclonal con la especificidad deseada.

Mediante los terminos "unir especificamente" y "union especifica" tal como se utilizan en el presente documento, se indica que un anticuerpo u otra molecula, especialmente un receptor de la invencion, se une con un objetivo, como por ejemplo un antigeno, un ligando o un analito, con mayor afinidad que cuando se une con otras moleculas bajo las condiciones especificadas de la presente invencion. Los anticuerpos

o los fragmentos de anticuerpos, tal como se conocen en el estado de la tecnica, son moleculas polipeptidas que contienen regiones que pueden unir otras moleculas, como por ejemplo antigenos. En diferentes realizaciones de la invenciOn, "unir especificamente" puede significar que un anticuerpo u otra molecula biologica se une a una molecula objetivo con una afinidad por lo menos 106 veces superior aproximadamente, preferiblemente una afinidad 107 veces superior aproximadamente, mas preferiblemente una afinidad aproximadamente 108 veces superior, y todavia mas preferiblemente una afinidad 109 veces superior de la que enlaza moleculas no

relacionadas con la molecula objetivo. Habitualmente, la union especffica se refiere a

afinidades en torn° a entre 106 y 109 veces superiores a la union no especffica. En algunas realizaciones, la uniOn especifica puede caracterizarse por afinidades 109 veces superiores a la union no especifica.

Los terminos "polinucleetido" y "(molecula de) acid° nucleico" se

utilizan de manera intercambiable para referirse a formas polimericas de nucleOtidos de cualquier longitud. Los polinucleotidos pueden contener desoxirribonucleOtidos, ribonucleOtidos y/o sus analogos. Los nucleotidos pueden tener cualquier estructura en tres dimensiones, y pueden realizar cualquier funcion, conocida o no conocida. El termino "polinucleotido" incluye moleculas de hebra sencilla o doble y de triple Mice. "Oligonucleotido" se refiere a polinucleotidos de entre 5 y aproximadamente 100 nucleotidos de acid° nucleico de hebra sencilla o doble, habitualmente ADN. Los oligonucleotidos tambien se conocen como oligomeros u oligos, y pueden ser aislados de los genes o sintetizados quimicamente a traves de metodos conocidos en el estado de la tecnica. Un "cebador" se refiere a un oligonucleotido, normalmente de hebra sencilla, que proporciona un extremo de hidroxil 3' para la iniciaciOn de la sintesis de acid° nucleico mediante enzima. A continuaciOn se indican una serie de realizaciones de polinucleotidos, sin limitacion: un gen o un fragment° de gen, exones, intrones, mARN, tARN, rARN, ribozimas, cADN, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos con ramificaciones, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de acid° nucleico. Una molecula de acid° nucleico tambien puede comprender moleculas de acid° nucleico modificadas, como por ejemplo moleculas de acid° nucleico metilado y analogos de moleculas de acid° nucleico. Los analogos de purinas y pirimidinas son conocidos en el estado de la tecnica, e incluyen, sin limitacion, aciridinicitosina, 4

acetilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracil, 5

carboximetil-aminometiluracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, pseudouracilo, 5pentilniluracilo y 2,6-diaminopurina. La utilizacion de uracilo como sustancia para timina en un acido desoxirribonucleico tambien se considera como una forma analoga de pirimidina.

El termino "marcador de acid° nucleico" se refiere a una molecula de acid° nucleico que producird un producto de detecci6n de un tamario previsto u otras caracteristicas seleccionadas cuando se utilice con cebadores de oligonucleotidos debidamente designados en una reaccion de amplificacion de acid° nucleico, como por ejemplo una reaccion de PCR. Los expertos en la materia estaran familiarizados con el diserio de cebadores de oligonucleotidos adecuados para PCR, y en Internet se encuentran disponibles programas para facilitar este aspecto de la invenciOn (ver, por ejemplo, la pagina http: bibiserv.techfak.unibielefeld.de/ genefisher). Un marcador de acid° nucleico puede ser lineal o circular. En realizaciones preferentes el marcador de acid° nucleico comprendera una secuencia de acido nucleico lineal predeterminada con puntos de union para cebadores seleccionados localizados en cada uno de los extremos,

o cerca de los mismos. En una molecula de acido nucleico de ADN circular, los cebadores se encontraran en el interior, mas que en los extremos, y puede utilizarse un cebador sencillo, por ejemplo, para Amplificacion de Circulo Giratorio. El ADN amplificado puede ser detectado utilizando cualquier metodo disponible, incluyendo, sin

tecnicas como PCR en tiempo real, tintura en Verde SYBR o tintura con bromuro de etidio. En otras realizaciones de la invencion, los puntos de union para los cebadores de amplificacion rodean una secuencia de ADN no definida de una longitud

definida o que comprende otra caracteristica identificable, como por ejemplo una

secuencia detectable, ademas de secuencias no definidas. En algunas realizaciones, los marcadores de acido nucleico se distinguen por el tamario o la masa de las secuencias amplificadas, de esta manera la secuencia de ADN entre los cebadores no necesita ser definida en relacion con la secuencia exacta, sino unicamente por lo que se refiere al nlimero de bases. Como alternativa, no es necesario definir el tamailo y/o la secuencia de todo el marcador de acido nucleico siempre que se proporcione un punto de union para un modelo molecular (ver Inas abajo). En otras realizaciones, la secuencia de ADN localizada entre los puntos de union del cebador comprende una "secuencia de identificacion caracteristica" capaz de ser detectada durante la reaccion de PCR. La generacion de serial fluorescente puede, por ejemplo, ser de secuencia especifica (Modelos Moleculares, Taq Man, cebadores fluorogenicos, como por ejemplo los cebadores LUX (Invitrogen (Carlsbad, CA.)) o dependientes de la masa (Verde SYBR, Bromuro de Etidio). Los ejemplos proporcionados no tienen como objetivo ser una lista exhaustiva de posibles esquemas de deteccion de acido nucleico, ya que aquellas personas expertas en el tema tendran conocimiento de los marcadores alternativos adecuados para su utilizacion en los metodos de la presente invencion.

El termino "secuencia de identificacion caracteristica" se refiere a una secuencia de acido nucleico que puede ser detectada especificamente por medio de la hibridacion a oligonucleotido u otro acido nucleico que ha sido etiquetado con un marcador detectable como por ejemplo un radiois6topo, una tintura (como por ejemplo una tintura fluorescente), u otras especies que son conocidas en el estado de la tecnica. En realizaciones preferentes, la secuencia de identificacion caracteristica es capaz de unir una sonda de "modelo molecular". El termino "modelo molecular" se refiere a oligonucleotidos como los que comercializan Operon Technologies (Alameda, CA) y

Synthetic Genetics (San Diego, CA). (Ver tambien, Tyagi and Kramer, Nat Biotechnol, 1996,14 : 303-308; y Tyagi et al., Nat Biotechnol, 2000,18: 1191-96.). Tal como se ha indicado en el presente documento, puede generarse una serial utilizando una variedad de tecnicas y reactivos.

El termino "complejo informador dependiente de analito" se refiere al complejo formado por un receptor que ha sido etiquetado con un marcador de acido nucleico y unido a un analito de acido no nucleico. En una realizacion preferente, el complejo es especifico, estable y tiene un alto grado de especificidad.

El termini° "soporte solido" se refiere a cualquier fase solida que pueda utilizarse para inmovilizar, por ejemplo, un analito, un anticuerpo o un complejo. Los soportes solidos adecuados serán bien conocidos en el estado de la tecnica, e incluyen las paredes de los pocillos de una bandeja de reaccion, como por ejemplo una placa de microtitulacion, las paredes de tubos de ensayo, gotas de poliestireno, gotas paramagneticas o no magneticas, membranas de nitrocelulosa, membranas de nylon, microparticulas como por ejemplo particulas de latex, y celulas de globulos rojos de oveja (o de otro animal). Los materiales habituales para los soportes solidos incluyen, sin limitaciOn, cloruro de polivinilo (PVC), poliestireno, celulosa, nylon, latex y derivados de los mismos. Asimismo, el soporte solid° puede ser recubierto, derivado o modificado de alguna otra forma para facilitar la adhesion de las moleculas deseadas (por ejemplo, analitos) y/o para impedir en union no deseada u otras interacciones no deseadas. Normalmente, la eleccion de una "fase solida" especifica no resulta critica, y puede ser seleccionada por una persona con conocimientos en la materia, en funcion del ensayo empleado. De esta manera, las particulas de latex, las microparticulas, las gotas paramagneticas o no magneticas, las membranas, los tubos de plastico, las paredes de los pocillos de microtitulacion, los chips de cristal o de silicona, y las celulas de

globulos rojos son todos ellos soportes sOlidos adecuados. El soporte solido puede ser

seleccionado de manera conveniente con el fin de abarcar diferentes metodos de detecciOn. Por ejemplo, pueden utilizarse placas de 96 o de 384 pocillos para ensayos que seran realizados de forma automatizada, por ejemplo por estaciones de trabajo robOticas y/o aquellos que seran detectados utilizando, por ejemplo, un lector de placas. Para aquellos metodos de la presente invencion que pueden implicar una fase de deteccion autoradiografica o quimiluminiscente utilizando una visualizacion basada en una pelicula, el soporte sOlido puede ser una membrana fina, como por ejemplo una membrana de nitrocelulosa o nylon. De acuerdo con una realizacion de la invencion en la cual se realizan inmunoensayos en sandwich, normalmente se emplean las paredes de los pocillos de una bandeja de reaccion. En realizaciones alternativas de la presente invencion pueden utilizarse gotas paramagneticas como soporte sOlido. Los metodos adecuados para inmovilizar moleculas en fases sOlidas incluyen interacciones iOnicas, hidrofobicas o covalentes y similares, asi como combinaciones de las mismas. Sin embargo, normalmente el metodo de inmovilizacion no es importante, y puede implicar mecanismos de adsorciOn no caracterizados. De esta manera, un "soporte sOlido" tal como se utiliza en el presente documento puede referirse a cualquier material que es no soluble, o que puede convertirse en no soluble mediante una reacci6n posterior. El soporte sOlido puede ser elegido por su capacidad intrinseca para atraer e inmovilizar un reactivo de captura. Como alternativa, la fase solida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar un reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia que este cargada de forma opuesta en relaciOn con el propio reactivo de captura, o con una sustancia cargada conjugada al reactivo de captura. En otra realizaciOn de la invencion, una molecula de receptor adicional puede ser cualquier miembro de una union especifica que este inmovilizado en (adherido a) la

fase solida, y que tenga la capacidad de inmovilizar un reactivo de captura a tray& de

una reaccion de uniOn especifica. La molecula de receptor adicional permite la inmovilizacion indirecta del reactivo de captura a una fase solida antes o durante la realizacion del ensayo. De esta manera, la fase solida puede ser tin plastic°, un plastic° derivado, un metal paramagnetic° o no magnetic°, la superficie de cristal o silicona de tin tubo de ensayo, un pocillo de microtitulacion, una lamina, una gota, una microparticula, un chip u otras configuraciones conocidas para aquellas personas que tienen conocimientos ordinarios sobre la materia.

El termino "puente de acid° nucleico" se refiere a una fraccion de acid° nucleico parcial o totalmente de doble hebra que funciona para conectar los receptores de acid° no nucleico de la invencion con un soporte solid°. Habitualmente, el puente de acid° nucleico consta de dos moleculas de acid° nucleico, una de las cuales esta adherida a un soporte solid° de la invencion, mientras que la otra está adherida al receptor de acid° no nucleico. Estas dos moleculas de acido nucleico se hibridizan entre si por sus regiones complementarias, conectando de esta manera el receptor de acid° no nucleico al soporte sOlido. En algunas realizaciones de la invenciOn, el ADN se utiliza como puente de acido nucleico. En otras realizaciones, pueden utilizarse acidos nucleicos distintos del ADN, como ARN o acido nucleico peptido (PNA), para una hebra, para ambas hebras o para partes de una o de ambas hebras. En realizaciones preferentes de la presente invencion, la parte de doble hebra del puente de acid° nucleico es completamente complementaria. Sin embargo, en otras realizaciones, la parte de doble hebra del puente de acid° nucleico es sustancialmente complementaria. Mediante el termino "sustancialmente complementario" se indica que dos secuencias de acido nucleico tienen por lo menos aproximadamente tin 80% o mas de complementariedad de acid° nucleico, preferiblemente por lo menos un 90% o mas de

complementariedad de acid° nucleico, mas preferiblemente por to menos un 95% o mas de complementariedad de acid° nucleico, y to mas preferible es que tenga por to menos un 99% o mas de complementariedad de acid° nucleico. La complementariedad describe la capacidad de las bases de nucleotido de una hebra de acid° nucleico para unirse a una base opuesta en otra hebra de acid° nucleico. Tat como es bien conocido en el estado de la tecnica, las bases de adenina del ADN se unen con timidina, mientras que la citosina y la guanina forman un par complementario. La complementariedad se mide dividiendo el numero de pares de bases complementarias en dos secuencias de acid° nucleico por el numero total de bases y multiplicand° el producto por 100. De esta manera, los complementos exactos presentan un 100% de complementariedad a lo largo de toda su longitud, mientras que las secuencias que son menos similares y tienen, por ejemplo, bases sin encajar, poseen un grado de complementariedad mas bajo. En realizaciones habituates de esta invencion, la complementariedad es suficiente para mantener la union de doble hebra del puente de acid° nucleico antes de la utilizacion del acid° nucleico desplazador, bajo las condiciones empleadas.

En realizaciones preferentes, la hebra del puente de acid° nucleico adherida at receptor de acid° no nucleico se une de forma covalente mediante un grupo de enlace en su extremo 5'. En realizaciones preferentes, la hebra del puente de acido nucleic° adherida al soporte sOlido es adherida at mismo mediante un puente de biotina/avidina en que la biotina es adherida de forma covalente at extremo 5' de esta molecula de puente de acid° nucleico, y la biotina se une a un receptor de biotina como la avidina, adherida at soporte solid°. En realizaciones preferentes, el puente de acid° nucleico adherido at soporte solid° es adherido de forma covalente al soporte solid° mediante un grupo de enlace en el extremo 5' de la molecula de acid° nucleico. En otras realizaciones preferentes, la secuencia de la molecula de acid° nucleico adherida at

soporte solid° se selecciona a partir del grupo formado por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:

4, y SEQ ID NO:7. En otras realizaciones, la hebra parcialmente complementaria que esta adherida a un receptor de acid() no nucleico de captura (o de una enzima informadora, como la fosfatasa alcalina) se selecciona a partir del grupo formado por SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:5. En realizaciones adicionales, el receptor de acido no nucleico es un anticuerpo. Estas realizaciones son unicamente a modo de ejemplo, y pueden utilizarse otras secuencias de acido nucleico, tal como resultara aparente para una persona con conocimientos en la materia. Asimismo, pueden utilizarse otros medios para adherir el puente de acid° nucleico al soporte solido.

El termino "detectar" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier metodo para verificar la presencia de una molecula determinada. Las tecnicas utilizadas para conseguirlo pueden incluir, sin limitacion, PCR, secuenciacion, secuenciaci6n de PCR, tecnologia de modelo molecular, hibridacion e hibridacion seguida de PCR. Los ejemplos de reactivos que pueden ser utilizados para la detecci6n incluyen, sin limitacion sondas radioetiquetadas, sondas etiquetadas enzimaticas (peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina), y sondas etiquetadas de afinidad (biotina, avidina, o estreptavidina).

El termino "eluido" o "eluir" se refiere a extraer, disociar o eliminar un material unido o adsorbido de un adsorbente por medio de una molecula, bider o solvente de forma controlada. En una realizacion, la elucion utiliza una molecula seleccionada para evitar, disociar o desestabilizar el enlace con el soporte sOlido sin cambiar de forma significativa el amortiguador u otras condiciones. En un aspecto de esta realizaciOn, la molecula seleccionada compite con el material unido o adsorbido para unirse con el adsorbente. En una realizacion preferente, la molecula seleccionada es una molecula de acid° nucleico que comprende una region de complementatiedad de

secuencia con la hebra de acid° nucleic° de un puente de acid° nucleico de doble hebra

adherido al soporte solid°. En otras realizaciones, la elucion puede conseguirse utilizando enzimas o endonucleasas de restriccion, que son ampliamente conocidas en el estado de la tecnica. Los ejemplos de enzimas de restriccion conocidas incluyen, sin limitacion Eco RI, Hind III y Nco I.

El termino "acid° nucleico desplazador" se refiere a un acid° nucleico de una secuencia predeterminada que se utiliza para eluir un complejo informador dependiente del analito de un soporte solid°. En realizaciones preferentes de la invencion, la secuencia se selecciona a partir del grupo que consta de SEQ ID NO:3, y SEQ ID NO:6.

En una realizacion de la invencion, el acid° nucleico desplazador es una molecula de ADN. En otras realizaciones, el acid° nucleico desplazador es una molecula de ARN. En otras realizaciones distintas, el acid° nucleico desplazador es una molecula de PNA. En otras realizaciones el acid° nucleico desplazador es una molecula de fosforotioato.

El termino "composicien de replicacion de acido nucleico" se refiere a composiciones que proporcionan un medio para replicar una secuencia de acid° nucleic°. Habitualmente, la composicion consistira en dichos componentes como amortiguador, sales, cofactores, enzimas, cebadores y/u otros reactivos necesarios para replicar un acid° nucleico. La replicacion puede ser por cualquier medio disponible para replicar la secuencia de acid° nucleico objetivo, y el experto en la materia reconocera que se halla disponible una amplia variedad de metodos. En realizaciones preferentes de la invencion, el medio para replicar el ADN es la reaccion en cadena de polimerasa (ver, por ejemplo Sambrook and Russell, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd

ed., 2001). En otras realizaciones no limitadores de la invencion, la amplificacion se

lleva a cabo por medio de las tecnicas de (1) amplificacion isotermica del ADN (ver, por ejemplo, Solicitud Internacional de PCT No. WO 00/41524); (2) Amplificacion de Desplazamiento de Hebra de una Sola Temperatura (SDA) (ver, por ejemplo., Patente No. US 5,270,184); (3) Amplificacion por Medio de TranscripciOn (TMA) (Patente No. US 5,766,849); o ReacciOn en Cadena de Ligasa (LCR) (ver,porejemplo,Wu & Wallace, 1989, Genomics 4:560).

El termino "hapteno" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigenic° con poca proteina o sin proteina que es capaz de ser reconocido por un anticuerpo. Habitualmente, los haptenos no consiguen la formacion de anticuerpos en un animal, a menos que forme parte de una especie mayor. Por ejemplos, los haptenos de peptidos pequeflos a menudo se acoplan a una proteina transportadora como por ejemplo la hemocianina de lapa californiana para generar una respuesta de anticuerpo anti-hapteno. Los "antigenos" son macromoleculas capaces de generar una respuesta de anticuerpo en un animal y ser reconocidas por el anticuerpo resultante. Tanto los antigenos como los haptenos comprenden por lo menos un determinante antigenic° o "epitopo", que es la regiOn del antigen° o hapteno que se une al anticuerpo. Habitualmente, el epitopo de un hapteno es toda la molecula.

"Peptido" se refiere generalmente a una cadena corta de aminoacidos enlazados por uniones de peptidos. Habitualmente, los peptidos comprenden cadenas de aminoacidos de unos 2 a 100 aminoacidos, mas tipicamente entre 4 y 50 aminoacidos, y lo mas comfm, entre 6 y 20 aminoacidos. "Polipeptido" se refiere generalmente a las secuencias de aminoacidos individuales rectas o de cadena con ramificaciones que habitualmente son mas largas que los peptidos. "Polipeptidos" comprende habitualmente por lo menos entre 100 y 1000 aminoacidos de longitud, mas

habitualmente por lo menos entre unos 150 y 600 aminoacidos, y con frecuencia por lo

menos entre unos 200 y 500 aminoacidos. Las "proteinas" incluyen polipeptidos simples, asi como complejos de cadenas multiples de polipeptidos, que pueden ser el mismo o uno distinto. Las cadenas multiples en una proteina pueden estar caracterizadas por estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias, asi como la estructura de la secuencia primaria de aminoacido, y pueden estar adheridas, por ejemplo, por uniones de disulfuro, y pueden incluir modificaciones post-sinteticas, como por ejemplo, sin limitacion, glicosilacion, fosforilaciOn, truncamientos u otros procesos. Los anticuerpos como las proteinas de IgG, por ejemplo, consisten habitualmente en cuatro cadenas de polipeptidos (es decir, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) que estan unidas por uniones de disulfuro. Asimismo, las proteinas pueden incluir componentes adicionales, como por ejemplo metales asociados (por ejemplo, hierro, cobre y azufre), u otras fracciones. Las definiciones de peptidos, polipeptidos y proteinas incluyen, sin limitacion, formas biologicamente activas o no activas, formas naturales y desnaturalizadas, asi como variantes, y formas modificadas, truncadas, hibridas y quimericas de las mismas. Los peptidos, polipeptidos y proteinas de la presente invenciOn pueden ser derivados de cualquier fuente o por medio de cualquier metodo, incluyendo, sin limitacion, la extracciOn de tejidos producidos de forma natural u otros materiales; produccion recombinante en organismos huesped, como por ejemplo celulas de bacterias, hongos, plantas, insectos o animales; y sintesis quimica utilizando metodos que seran bien conocidos por un experto en la materia.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "distinguible" se refiere a una capacidad de distinguir experimentalmente entre los dos marcadores o especies diferentes. En realizaciones en las cuales se utiliza un ensayo para detectar multiples analitos, ninguna de las moleculas marcadoras de ADN consistird en

secuencias identicas tanto en longitud como en secuencia. Dos marcadores pueden

comprender la misma secuencia nuclear, pero los marcadores podran distinguirse en funcion del tamatio y/o de las secuencias diferentes. En realizaciones preferentes, los productos PCR seran de una longitud distinta. En otras realizaciones, los marcadores tendran secuencias que se unen con sondas especfficas de secuencia diferente.

El termino "conjugado" tal como se utiliza en el presente documento se

refiere a dos moleculas que han sido adheridas de forma covalente, o enlazadas de alguna otra forma. En una realizacion, un conjugado de acid° nucleico se genera enlazando de forma covalente el acid° nucleico con un polipeptido. En una realizaciOn preferente de la invencion, un receptor de acid° no nucleico, como el que se utiliza en este caso, y un polipeptido, se unen de forma covalente a traves de un grupo de enlace para formar un conjugado.

Un "kit" para detectar la presencia de un analito seleccionado en una muestra por los metodos de la invencion comprende por lo menos un medio contenedor donde se ha dispuesto el anticuerpo enlazado con el soporte solid° del kit por parte de un puente de acid° nucleico. El kit tambien puede comprender un medio contenedor donde se ha dispuesto el anticuerpo informador, o un medio contenedor donde se ha dispuesto el acido nucleico desplazador. El kit puede comprender tambien otros contenedores que comprendan uno o mas de los siguientes elementos: reactivos de lavado, reactivos capaces de amplificar los reactivos de sonda de acido nucleico unido, y agentes capaces de detectar la presencia de sondas de acido nucleico unido despues de la amplificaciOn. Preferiblemente, el kit tambien comprende instrucciones de uso. El kit, si va a ser utilizado para uso diagnostic°, tambien puede incluir la notificacion de aprobaci6n de uso de FDA e instrucciones para ello.

Especificamente, un kit compartimentado incluye cualquier kit en el cual los

reactivos estan contenidos en contenedores separados. Dichos contenedores incluyen pequerios contenedores de cristal, contenedores de plastic° o tiras de plastic° o papel. Dichos contenedores permiten la transferencia efectiva de reactivos de un compartimento a otro compartimento de manera que las muestras y los reactivos no experimentan contaminaciOn cruzada, y los agentes o soluciones de cada contenedor pueden ser ariadidos de forma cuantitativa de un compartimento a otro. Dichos contenedores incluiran un contenedor que aceptara la muestra de prueba, un contenedor que contiene la sonda o los cebadores utilizados en el ensayo, contenedores que contienen reactivos de lavado (como por ejemplo una solucion sauna amortiguadora de fosfatos, amortiguadores Tris, y similares), y contenedores que contienen los reactivos utilizados para detectar el acid° nucleic° marcador, el producto amplificado o similares. Una persona experta en la materia reconocera sin problemas que los anticuerpos etiquetados con moleculas de acido nucleico descritas en la presente invencion pueden ser incorporadas sin problemas en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en el estado de la tecnica.

Un kit para acoplar el ADN con un anticuerpo u otra proteina por el metodo de la invencion comprende por lo menos un medio contenedor donde se ha dispuesto el ADN activado liofilizado. El kit puede comprender tambien otros contenedores que comprendan uno o mas de los siguientes elementos: reactivos de lavado y agentes capaces de detectar la presencia de sondas de acido nucleico despues de la reacciOn. Preferiblemente, el kit tambien comprende instrucciones de uso. Una persona experta en la materia reconocera sin problemas que los acidos nucleicos activados descritos en la presente invencion pueden ser incorporados sin problemas en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en el estado de la tecnica.

Inmuno-PCR Sandwich por Desplazamiento

La presente descripci6n proporciona metodos para detectar analitos de interes en diferentes campos, incluyendo el diagnostic° clinic° y las ciencias biologicas. El metodo de Inmuno-PCR Sandwich por Desplazamiento del presente documento utiliza un anticuerpo informador directamente etiquetado con 1 o 2 moleculas de oligonucleOtido que utilizan quimica de reticulado de proteinas. Las 1 o 2 moleculas de oligonucleOtidos adheridas al anticuerpo informador pueden ser de hebra sencilla o de hebra doble. La descripcion tambien se refiere al proceso de deteccion de un antigen° (Ag) en una muestra utilizando uno o mas anticuerpos etiquetados. La descripcion tambien se refiere a un proceso por el cual un anticuerpo de captura o un anticuerpo informador, u otra proteina, es etiquetado con una secuencia de ADN especifica.

De acuerdo con un metodo de la descripcion, un analito de acid° no nucleico presente en la muestra es detectado mediante:

(i)

contactar una muestra que comprenda un analito de acid° no nucleico con un conjugado informador, en que el conjugado informador comprende un primer receptor capaz de unir de forma especifica el analito, y un marcador de acido nucleico;

(ii)

permitir la union del analito al conjugado informador, formando de esta manera un complejo informador dependiente del analito;

(iii) contactar el complejo informador dependiente del analito con un segundo receptor para el analito, en que el segundo receptor es adherido a un soporte solid° a traves de un puente de acid° nucleico de una secuencia predeterminada;

(iv)

permitir la uniOn del segundo receptor al complejo informador dependiente del analito, formando de esta manera un complejo informador dependiente del analito/segundo receptor adherido al soporte solido;

(v)

eluir el complejo informador dependiente del analito/segundo receptor del soporte solid° con un acido nucleico desplazador; y

(vi)

detectar especificamente la presencia del marcador de acido nucleico en el complejo informador dependiente del analito/segundo receptor, en que la detecciOn del marcador de acid° nucleico indica la presencia del analito en la muestra.

Uno de los aspectos de este metodo es un proceso conocido comanmente como Inmuno-PCR, en que un anticuerpo (Ab), en particular un anticuerpo monoclonal (MAb) esta etiquetado con una secuencia especifica de acid° nucleico que es habitualmente ADN, con la finalidad de detectar la formacion de un complejo inmune supervisando la amplificacion enzimatica de, por ejemplo, el ADN. El complejo inmune puede formarse con un solo anticuerpo monoclonal informador etiquetado con ADN (rMAb), o en un formato de inmunoensayo de sandwich en concordancia con un anticuerpo monoclonal de captura (cMAb). Los anticuerpos policlonales tambien pueden emplearse cuando sea preciso. La etiqueta de acido nucleico puede ser detectada con una sensibilidad extraordinaria, de hasta una copia sencilla de la molecula, cuando es sometida a amplificacion por la ReacciOn en cadena de polimerasa (PCR), o cualquier otra tecnica de amplificacion exponencial de acido nucleico (por ejemplo (1) Tabor et al. (WO 00/41524); (2) Single Temperature Strand Displacement Amplification (SDA) (U.S. Pat. No. 5,270,184); (3) Transcription Mediated Amplification (TMA) (U.S. Pat. No. 5,766,849); o Ligase Chain Reaction (LCR) (Wu,

D. Y. & R. B. Wallace, 1989, Genomics 4, 560)).

Habitualmente, la amplfficacion nucleica se consigue mediante PCR

utilizando una polimerasa. Las polimerasas adecuadas son bien conocidas en el estado de la tecnica, y pueden incluir, sin limitacion, polimerasas de ADN, polimerasas de ARN, transcriptasas y polimerasas Q-beta. El experto en la materia reconocera que la eleccion de la polimerasa dependera del tipo de acido nucleico que se va a amplificar. De acuerdo con una realizacion de la invencion, se utiliza una composici6n de replicacion que comprenda reactivos y cebadores para llevar a cabo una reacci6n en cadena de polimerasa para la amplificacion de acido nucleico. Generalmente, la composicion comprendera el amortiguador, nucleotidos, sales, enzimas y otos componentes necesarios para realizar el PCR u otro procedimiento de amplificacion.

Algunos metodos de la presente descripci6n pueden tambien realizarse utilizando PCR en tiempo real, en los cuales una secuencia especifica de, por ejemplo, el ADN es cuantificada supervisando su coeficiente de amplificacion durante el termociclo en presencia de polimerasa Taq, cebadores adecuados y trifosfatos de nucleotido. (Para una breve explicaciOn sobre PCR en tiempo real, ver Walker, 2002, Sci 296: 557-58.).

De forma conveniente, los metodos de la presente descripcion pueden utilizarse para detectar multiples analitos presentes en una muestra sencilla (es decir, multiplicacion). Por ejemplo, una multiplicidad de diferentes analitos de acid° no nucleico presentes en una muestra sencilla pueden estar detectando simultaneamente, realizando las fases de:

(i) contactar una muestra que comprenda una multiplicidad de diferentes analitos de acid° no nucleico con una multiplicidad de conjugados informadores, en que cada conjugado informador comprende un primer receptor capaz de unir de forma

especifica uno de la multiplicidad de analitos de acid° no nucleico de la muestra, y un marcador de acid° nucleico, y en que cada conjugador informador se une especificamente a un analito diferente y comprende un acid° nucleic° que es distinguible de otros acidos nucleicos en la multiplicidad de conjugados informadores;

(ii) permitir la union de la multiplicidad de analitos de acid° no nucleico en la muestra a la multiplicidad de conjugados receptores, formando de esta manera una multiplicidad de complejos informadores dependientes del analito;

(iii) contactar con la multiplicidad de complejos informadores dependientes del analito con una multiplicidad de segundos receptores, en que la multiplicidad de los segundos receptores es capaz colectivamente de unirse con la multiplicidad de analitos en la muestra, y en que los segundos receptores estan adheridos a un soporte solid° a traves de un puente de acid° nucleico de una secuencia determinada;

(iv)

permitir el enlace de los segundos receptores a los complejos informadores dependientes del analito, formando de esta manera una multiplicidad de complejos de informador dependiente del analito/segundo receptor adheridos al soporte sOlido;

(v)

eludir la multiplicidad de complejos de informador dependiente del analito/segundo receptor del soporte solid° con por lo menos un kid° nucleico desplazador, y

(vi)

detectar especificamente la presencia de los marcadores de acid° nucleico en la multiplicidad eluida de los complejos de informador dependiente del analito/segundo receptor visualizando el marcador de acid° nucleico replicado mediante

tintura con bromuro de etidio, en que la deteccion de cada marcador de acid° nucleico

distinguible indica la presencia del analito correspondiente en la muestra.

Un ensayo tipico de acuerdo con este metodo podria emplear cuatro o mas receptores distintos, como por ejemplo anticuerpos, cada uno especifico para un analito distinto. Cuando los anticuerpos se utilizan como receptores, los analitos son antigenos

o haptenos, como por ejemplo componentes de suero. Puede resultar deseable, por ejemplo, medir de forma simultanea dos o mas componentes de dicho suero, como por ejemplo hormonas, enzimas y marcadores de enfermedad en la misma reaccion. De esta manera, se puede realizar un ensayo diseriado para medir el riesgo de enfermedad determinando la concentracion de suero de por ejemplo colesterol, insulina, PSA, CA 125 y otras especies relacionadas con enfermedades en la sangre. De acuerdo con este aspecto de la invencion, los marcadores de acid° nucleico estan diseriados de manera que cada uno puede distinguirse, por ejemplo, segun su tamano, Asi, para un ensayo de cuatro analitos, los marcadores de acid° nucleico pueden ser 50, 70, 90 y 110 nucleOtidos de longitud, respectivamente. Despues de la ampliacion, los productos de PCR pueden ser decididos y cuantificados utilizando tecnicas como por ejemplo la electroforesis de gel y la espectroscopia de masa.

Otro aspecto de la descripcion se refiere a la seleccion de anticuerpos para aplicaciones de diagnostic° y terapeuticas. Mas especificamente, la invencion proporciona metodos para etiquetar anticuerpos de prueba con una secuencia especifica de acid° nucleico. A continuacion puede detectarse la etiqueta de acid° nucleico con gran sensibilidad mediante PCR o cualquier tecnica de amplificacion de acid° nucleico. Por ejemplo, una etiqueta de ADN puede ser adherida directamente al anticuerpo utilizando ADN activado quimicamente. Como alternativa, puede etiquetarse una proteina de union con ADN activado quimicamente, y conectarse con un anticuerpo

informador derivado con el ligando correspondiente para la proteina de union, para

formar un complejo.

La presente descripcion tambien proporciona metodos para preparar ADN activado con un compuesto quimico de reticulado, y almacenar el ADN activado en formato de kit. De acuerdo con este metodo, se sintetiza un oligonucleotido (habitualmente entre aproximadamente 10 y 100 bases) que va a adherirse a un anticuerpo, peptido, polipeptido o proteina para contener un enlace amino 5' y se activa con el exceso de suberato. El intermedio queda rapidamente aislado y atiadido a una soluciOn concentrada de, por ejemplo, anticuerpo monoclonal (MAb). Como alternativa, el oligonucleOtido puede ser almacenado para su uso futuro. El conjugado oligonucleotido-MAb puede ser purificado por filtracion de gel y cromatografia de intercambio de aniones. Puede hibridizarse una hebra complementaria al primero (por ejemplo, conjugado oligo-Mab), formando un puente de ADN de doble hebra para su utilizacion en ensayos de Inmuno-PCR Sandwich por Desplazamiento (tai como se describe mas abajo). En el caso de un anticuerpo de captura, la segunda hebra complementaria puede ser biotinilada con un reactivo comercial en el extremo 5' y utilizada para revestir particulas paramagneticas u otro material que contenga avidina unida. La fase solida sirve como medio para capturar antigen° (Ag) o complejos inmunes Ag-MAb. Pueden asignarse propiedades a una hebra de ADN adherida al anticuerpo de captura para la liberacion del complejo inmune desde el medio de captura con el fin de mejorar la sensibilidad de detecciOn.

Los kits de la presente invencion para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos comprende habitualmente un contenedor que contiene moleculas de ADN activadas con disuccinimidil suberato. Las moleculas de ADN pueden, por ejemplo, ser una primera hebra de un puente de acid° nucleico, o una primera hebra de una molecula

de ADN marcador. En una realizacion, los kits tambien pueden contener direcciones

para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos utilizando el kit.

La presente descripcion tambien proporciona metodos novedosos para detectar analitos utilizando desplazamiento de acido nucleico. De acuerdo con estos metodos, generalmente, un analito de acido no nucleico presente en una muestra es contactado con un conjugado informador. El conjugado informador comprende: un primer receptor capaz de unir especificamente el analito; y un marcador de acido nucleico. A continuacion, se permite que el analito se una al conjugado informador, formando de esta manera un complejo informador dependiente del analito. El complejo informador dependiente del analito es contactado a continuaci6n con un segundo receptor para el analito, en que el segundo receptor es adherido a un soporte solido a

traves de un puente de acido nucleico de una secuencia predeterminada. Cuando se une el segundo informador al complejo informador dependiente del analito, forma un complejo informador dependiente del analito/segundo informador unido al soporte solid°, que puede ser eluido, por ejemplo, utilizando acido nucleico desplazador. Finalmente, la presencia del marcador de acid° nucleico puede ser detectada como un indicador de la presencia de analito en la muestra.

Una aplicacion de esta realizacion es en el ensayo de Inmuno-PCR sandwich por Desplazamiento (DSI—PSR). De acuerdo con esta realizacion, el exceso de anticuerpo informador/conjugado de ADN se glade en una soluciOn al antigeno, formando un primer complejo inmune. El complejo es capturado en un soporte solid° revestido con un segundo anticuerpo a traves de un puente de acid° nucleico de doble hebra. El lavado extensivo elimina la mayor parte del exceso de anticuerpo informador (superior al 99%). En realizaciones preferentes, a continuacion este complejo analito/informador es eliminado gradualmente mediante el uso de un acid° nucleico

desplazador. La etiqueta de ADN eluido asociada con el complejo inmune es

amplificada por PCR, y supervisada de forma continua por la generaciOn de una serial fluorescente. La utilizacion de PCR en tiempo real, en que el aumento en la concentracion de copias de acid° nucleico se observa durante el curso de una reacci6n de amplificacion de PCR, permite la determinacion del ninnero original de secuencias de ADN marcador, y de esta manera, el niimero de moleculas de analito. Ello evita la incertidumbre a la hora de cuantificar los productos de PCR en reacciones llevadas a

cabo hasta su finalizacion. Puede detectarse estadisticamente una copia sencilla de un marcador de ADN o el conjugado de MAb informador correspondiente. La presencia de diez copias se detecta con certitud.

Realizar el ensayo de DSI-PCR en ausencia de un antigeno/analito y sin la fase de eluciOn tiene como resultado la "deteccion" de unas 5000 copias de ADN-MAb debido a la union no especifica. Un lavado posterior no disminuye este fondo. Se ha observado que la eliminacion del exceso de MAb-ADN informador mediante un lavado extensivo bajo un conjunto determinado de condiciones de amortiguador dejara siempre algunos informadores unidos de forma no especifica al soporte. Las fases de lavado adicional bajo otro conjunto de condiciones, como por ejemplo una temperatura elevada

o resistencia ionica, produciran un "florecimiento" fresco de serial de fondo eluida, demostrando que las condiciones de lavado anteriores no habian sido suficientes para eliminar toda la serial de fondo.

La dificultad a la hora de eliminar el informador no especificamente unido MAb-ADN sugirio eluir o eliminar el complejo antigendinmune (por ejemplo, PSA/anti-PSA) del soporte antes (por ejemplo, particula paramagnetica de avidina) de la amplificaciOn de PCR. Un medio para conseguirlo fue interponer un brazo espaciador de doble hebra de 26 pares de base que contenia sitios de nucleasa del extremo de

restriccion entre el MAb de captura y la biotina utilizada para enlazar el soporte solid°.

Se sintetizaron moleculas de ADN de 26 mer complementarias que contenian un enlace de amino 5' para contener sitios de nucleasa tanto para Hind III como para Eco RI cuando se hibridizasen. La filncion de amino en una hebra de ADN fue derivada con biotina. La segunda hebra fue conjugada para capturar MAb, y a continuaci6n fue hibridizada a la hebra biotinilada. El conjugado de MAb de captura de doble hebra the completamente unido por avidina inmovilizada, y liberado con Hind III y mas eficazmente, con digestion de Eco RI. Un complejo inmune de PSA capturado the adherido eficazmente desde el soporte solido mediante tratamiento de Eco RI a 37° C durante 15 min. Sin embargo, estas condiciones tambien eluyeron el Mob-ADN informador no especifico. Cuando se utilize) el anticuerpo anti-PSA la sensibilidad solamente mejoro hasta 5,000,000 copias de PSA. Los resultados obtenidos con placas de microtitulacion revestidas de estreptavidina o avidina fueron similares.

La posterior reduccion de fondo, y la mejora de sensibilidad del ensayo, requiere la eliminacion del complejo inmune especifico del soporte solido mediante el uso de un acid° nucleico desplazador tal como se describe en la presente invenciOn. El complejo inmune MAb-Ag-MAb es liberado de nuevo en una soluciOn y transportado a un recipiente limpio. El MAb informador no especificamente unido o atrapado se deja en el soporte solid° o en las paredes del contenedor de ensayo original. Esto tiene el efecto de purificar el complejo inmune especifico. Si la liberacion y la transferencia del complejo son eficaces, la intensidad de la serial se mantiene mientras que se reduce la serial de fondo.

La sensibilidad del ensayo DSI-PCR ha sido mejorada en esta invencion gracias a: (1) etiquetar directamente el MAb informador con una hebra sintetica corta de ADN marcador; (2) emplear pares de sandwich de MAb con constantes de afinidad

> 1010 ; (3) reducir 1000 veces la concentracion de MAb informador de entrada (hasta

aproximadamente 0.01 no); (4) optimizar los protocolos de bloqueo y lavado; y (5) minimizar el area de la superficie del soporte solido y el revestimiento de MAb de captura.

En la presente invencion, se han conseguido mas mejoras en la sensibilidad

de DSI-PCR mediante el diserio de un enlace entre el MAb de captura y el soporte de inmunoensayo, que permiten el desplazamiento especifico del complejo inmune en la solucion utilizando unas condiciones de elucion extremadamente comodas, adaptadas especificamente al puente de acid° nucleico utilizado

En una realizacion de la invencion, se etiqueta un MAb con una hebra de ADN sintetico (hebra de captura) a traves de un enlace de amino 5'. Se hibridiza una hebra de ADN sintetico (hebra ancla) que contiene biotina 5' y una secuencia 3' complementaria a la hebra de captura. El conjugado de captura/ADN de anclaje/ADN se utiliza para revestir la superficie de las placas de microtitulacion de avidina o microparticulas paramagneticas u otro soporte solido adecuado. A continuaciOn, el MAb de captura se desplaza desde el suporte mediante la adici6n del oligonucleotido desplazador sobrante que contiene secuencias complementarias tanto del extremo 5' de la hebra de anclaje como del extremo 3' de la hebra de captura. El desplazador hibridiza cerca del extremo 5' de la hebra de anclaje y desplaza la hebra de captura, ya que dicha hebra hibridiza cerca del extremo 3' de la hebra de captura. El conjugado ADN de captura—ADN se libera en tuia soluciOn como funciOn del equilibrio y la estabilidad relativa del original en relaciOn con la hebra de anclaje recientemente hibridizada.

El desplazamiento se consigue sin alteracion en la mayoria de condiciones de

solucion, incluyendo sin limitacion, pH, temperatura o resistencia ionica, todos los cuales han mostrado que liberan de forma independiente conjugado MAb informador- ADN marcador no especificamente unidos de nuevo en la solucion. El ADN desplazador elimina todo el complejo inmune MAb-Ag-MAb y el MAb no unido. Solamente el complejo inmune contiene ADN marcador reconocido por los cebadores de PCR. La liberacion concomitante del exceso de captura de MAb no afecta ni a la serial ni al fondo. La aplicacion de desplazamiento de complejo inmune a Inmuno-PCR tiene como resultado una mejora de 10 veces en la deteccion por la reduccion de la serial de fondo. Se han conseguido sensibilidades de deteccion de unos pocos cientos de moleculas de antigeno de proteina (aproximadamente cinco attogramos).

El Inmuno-PCR, tal como describen Sano y Cantor, emplea un anticuerpo etiquetado con un fragmento biotinilado de ADN a traves de un puente de proteina quimerica que consiste en avidina y proteina A. La etiqueta de ADN fue amplificada por la reaccion en cadena de polimerasa, y detectada de forma semi-cuantitativa por la electroforesis de gel seguida de la tintura con bromuro de etidio. Id. La complejidad multi-fase del ensayo de Sano & Cantor requirio una larga incubacion y ciclos de lavado, superiores a media vida del complejo inmune primario, lo cual provoco una perdida de serial y de precision debido a la disociaciOn macromolecular. Aunque algunos investigadores mas recientes han introducido mejoras, las limitaciones temporales, la complejidad de los reactivos y la contaminacion de las plantillas de ADN han inhibido una aplicacion extensa de esta tecnologia. Por ejemplo, Watanabe y sus colaboradores se han embarcado en una serie de estudios para optimizar la concentraci6n de ADN y las concentraciones de estreptavidina para su utilizaciOn en conjuncion con anticuerpos especificos (Sugawara, et al., Clint Chem. Act, 299:45-54,

2000 (angiotensinogeno), Saito et al., Clin Chem., 45:5:665-669,1999 (tumor necrosis

factor-alpha), y Furuya et al., J. Inmunol. Methods, 238:173-180, 2000 (interleukin

18)). Joerger et al. utilizaron ADN conjugado directamente a anticuerpos especificos para hormonas estimuladoras de la tiroides humana y gonadotropina cori6nica en una preparacion para desarrollar un ensayo capaz de detectar ambos antigenos de forma simultanea (Joerger et al., Clin Chem 41/9: 1371-1377, 1995). Posteriormente, Hendrickson et al. mostraron un inmunoensayo de multianalitos para la detecci6n simultanea de tres analitos (hTSH, hCG y beta-Gal) utilizando anticuerpos etiquetados con ADN (Hendrickson et al. Nucl. Acids Res. 14:6115-28, 1986) ver tambien, Patente No. US 5,985,548)). Jablonski et al. tambien describieron tecnicas para adherir directamente moleculas de ADN a moleculas de proteinas (Jablonski et al., Nucl. Acids Res. 23/3:522-29, 1995). Para otros metodos de conjugar moleculas de ADN a polipeptidos, ver Hermanson, Bioconjugate Techniques, pp 639-666,1996.

De acuerdo con otra realizacion, pueden realizarse los metodos de desplazamiento de la presente descripcion, purificacion de anticuerpos, analitos y complejos de los mismos. Un aspecto de esta realizaciOn comprende un metodo para unir de forma reversible un complejo de anticuerpo/analito a un soporte solid°. Dicho metodo comprende las fases siguientes:

(i)

proporcionar un complejo de anticuerpo/analito, en que el extremo 5' del primer acid° nucleico se conjuga con el anticuerpo, el analito comprende un antigen° reconocido por el anticuerpo, y el analito esta especificamente unido al anticuerpo a traves del sitio de combinaciOn del antigen° del anticuerpo;

(ii)

proporcionar un soporte solid° que comprenda un segundo acid° nucleico, en que el extremo 5' del segundo acid° nucleico esta unido al soporte solid°,

en que el segundo acid° nucleico es sustancialmente complementario al primer acido

nucleico sobre su terminal 3';

(iii) unir el complejo anticuerpo/analito al soporte solido por medio de un puente de acid° nucleico de doble hebra, en que el puente de acido nucleico esta formado por hibridacion de los extremos no unidos del primer y el segundo acido nucleico; y

(iv) eluir el complejo anticuerpo/analito del soporte solido por medio de un acid° nucleico desplazador.

Tai como se ha descrito anteriormente, los metodos para eluir el complejo informador dependiente de analito/segundo receptor de acido no nucleico utilizan habitualmente una molecula de acido nucleico desplazador bajo condiciones que favorecen el desplazamiento del puente de acid° nucleico con el acid° nucleico desplazador, pero reducen o eliminan la elucion de las especies no especificamente unidas. En realizaciones alternativas, puede utilizarse cualquier medio para eluir especificamente la molecula de acid° no nucleico sin contaminar especies no especificas. Por ejemplo, una endonucleasa, como una enzima de restricciOn, puede ser utilizada para digerir el puente de doble hebra, eluyendo de esta manera el complejo informador dependiente de analito/segundo receptor de acido no nucleico.

En otras realizaciones de la descripcion, se proporcionan un metodo para etiquetar anticuerpos o proteinas que unen ligandos directamente con ADN y un medio para realizar inmunoensayos de deteccion de acid° nucleico con PCR en tiempo real en un formato de kit que sera muy resistente al uso. El formato de la descripciOn permite la aplicacion mejorada y practica de un ensayo de Inmuno-PCR. Los metodos de la presente descripcion reducen el problema de la union no especifica del marcador de

ADN, que afecta a todos los ensayos de amplificacion de acido nucleico exponenciales.

La presente invenciOn tambien proporciona precision y cuantificaciOn, utilizando deteccion de PCR en tiempo real.

Kit nara etiauetar Proteinas con Moleculas de Acido Nucleico

Otro aspecto de la presente descripcion se refiere a metodos para etiquetar moleculas de anticuerpo. De acuerdo con este aspecto, se proporciona un reactivo de ADN que, cuando es contactado en solucion bajo unas condiciones apropiadas, forma un enlace covalente con, por ejemplo, un anticuerpo. El reactivo de ADN puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Si es de hebra sencilla, la etiqueta de ADN puede ser convertida en un daplex por hibridacion con una hebra total o parcialmente complementaria.

El reactivo de ADN está formado por la sintesis de una secuencia de ADN que contiene un grupo funcional de amina piimaria. La amina primaria puede localizarse en cualquier punto de la molecula de ADN, pero en realizaciones preferentes, la amina esta localizada en el terminal 5' del ADN. El ADN que contiene amina es contactado con un exceso de agente de reticulado reactivo con amina bajo condiciones apropiadas de reaccion y la mitad de amina del ADN reacciona con el agente de reticulado. El ADN activado es aislado por cromatografia de filtracion de gel bajo condiciones que mantienen la actividad de reticulado residual. El reactivo de ADN se distribuye en cantidades conocidas en recipientes apropiados, se congela rapidamente y se liofiliza hasta desecacion. El anticuerpo (en solucion) ariadido al liofilizado reacciona con el extremo no reaccionado del agente de reticulado para formar un conjugado covalente al ADN. El reactivo hidrolizado excesivo puede ser eliminado, por

ejemplo, por una o mas pasadas a tray& de un ultra-filtro que tenga un limite de peso

molecular apropiado para discriminar el anticuerpo del ADN.

La descripciOn tambien proporciona metodos para etiquetar una proteina de

union de ligando. Se utiliza una solucion de proteina de union para hidratar el reactivo de ADN liofilizado (preparado tal como se indica mas arriba). La parte no reaccionada del agente de reticulado combina con los residuos especificos de aminoacido en la estructura de la proteina para formar una union de covalente al ADN. La proteina de union etiquetada con ADN puede ser contactada con anticumo etiquetado con el ligando cormspondiente, lo cual tiene como resultado un conjugado ADN—anticuerpo.

Un aspecto adicional de la presente descripcion proporciona un metodo para realizar el ensayo DSI-PSR utilizando el proceso de conjugaci6n ADN-anticuerpo. Un inmuno ensayo de este tipo de acuerdo con este aspecto de la descripcion utiliza un formato de sandwich, en que se forma un complejo inmune utilizando dos anticuerpos de epitopos diferentes en el mismo antigeno. Un anticuerpo del par (informador) es etiquetado con ADN marcador. El segundo anticuerpo (captura) es inmovilizado sobre una superficie solida para capturar el complejo inmune formado por el anticuerpo informador y el antigeno. El complejo anticuerpo—antigeno—anticuerpo puede formarse combinando todos los reactivos de forma simultanea o secuencial. El complejo inmune inmovilizado se separa del exceso de conjugado anticuerpo informador—ADN mediante un lavado, seguido de la elucion selectiva, y el ADN marcador es detectado por la amplificacion de PCR.

La reaccion de PCR es iniciada mediante la adicion de los cuatro trifosfatos de nucleosida diferentes, un par cebador de oligonucleOtido para cada modelo que va a ser amplificado, una enzima termoestable que cataliza la polimerizacion de los

trifosfatos de nucleosida desde el extremo del cebador, y cualquier otro reactivo

necesario para la reacci6n de PCR. La amplificacion de las hebras del modelo de ADN se consigue mediante fases sucesivas de calentamiento y enfriamiento.

La reaccion de PCR puede ser detectada mediante tecnicas de cuantificacion de ADN comunes, incluyendo la electroforesis de gel, hibridacion de mancha y autorradiografia. Preferiblemente, el PCR es supervisado en tiempo real utilizando un termociclador automatizado y generaciOn de serial de fluorescencia (ver, por ejemplo, Walker, 2002, Science 296:557-58). La generacion de serial de fluorescencia puede ser, sin limitacion, especifica para cada secuencia (Modelos Moleculares, Taq Man, cebadores fluorogenicos) o dependientes de la masa (Verde SYBR, Bromuro de Etidio).

La amplificacion y deteccion de PCR puede llevarse a cabo en los complejos inmunes unidos al soporte solid°, o en complejos disueltos de nuevo en la soluciOn. De forma ventajosa, la liberaciOn de complejo inmune unido desde una superficie sOlida capturadora mejora la sensibilidad eliminando el conjugado de ADN—anticuerpo informador no especificamente unido.

Otra forma de inmunoensayo de deteccion de acido nucleico utiliza un formato de inmunotintura. Una secciOn fina de tejido fijada a una superficie solida es contactada con un anticuerpo que ha sido etiquetado con un marcador de ADN. Si el antigeno se encuentra presente, se formara un complejo inmune en la seccion del tejido. La muestra se lava para eliminar el exceso de reactivo anticuerpo—ADN y las celulas individuales pueden ser aisladas mediante la tecnica de captura por laser. A continuacion, las celulas individuales capturadas pueden ser lisadas, provocando la liberacion y solubilizaciOn de los complejos antigeno—anticuerpo. La etiqueta de ADN marcador puede ser cuantificada durante o despues de la amplificaciOn.

En otro aspecto de la descripci6n, puede examinarse la actividad de los anticuerpos elevados contra aptenos en relacion con un antigen° determinado etiquetandolos con un marcador de ADN a traves de la formaci6n del complejo con un conjugado proteina de union—ADN.

La presente invenciOn puede ser mejor comprendida mediante los ejemplos siguientes, que tienen como unica finalidad ilustrar la presente invencion, y de ninguna manera deberian ser considerados como limitadores de la invencion en cuestion.

EJEMPLOS

Eientolo 1: Activacion del ADN de Amino 5'

Una secuencia de 59 bases de ADN marcador:

5'NH3-(C12)-TGCGTAGCGA TGACTAGCTG CTGATCGATA TTAGCTAGCA TCAGCGATCG ATACGAGCA-3' (SEQ ID NO: 13)

fue sintetizada para contener un solo grupo de amina primaria en el extremo 5' a traves de un brazo espaciado de carbon 12 (Glen Research, Sterling, VA). El ADN de amino 5' (350 jig) se disolvio en 20 IA de amortiguador de fosfato de sodio 10.05 M, pH 8.0. El suberato de disuccidimidil se disolvio en DMSO seco a una concentracion de 12 mg/ml. Inmediatamente se aiiadio un alicuoto de 40 gl a la solucion de ADN, mezclando con un re-pipeteado suave. Despues de un minuto a temperatura ambiente, la mezcla de la reacciOn se cargo en una columna (fina) G-25 de 0.5 x 20 cm equilibrada en 5 mM de acid° citrico, ajustado a un pH de 5.4 con 0.1 M de hidroxido de sodio, y desarrollado a un coeficiente de flujo de 0.5 ml/min a temperatura ambiente. El primer pico eluido the recogido directamente en un Dispositivo de Filtro Centrifugo YM-10 (Millipore Corp., Bedford MA) incrustado en hielo. El ADN modelo activado por

suberato fue concentrado por centrifugacion a 5000-x g durante 30 minutos a 4°C, a

200-300 d. La concentracion de ADN se determin6 por absorciOn a 260 nm. Se distribuy6 una unidad A260 (aproximadamente 30 111) en tubos microcentrifugos que contenian 5 tl de manitol al 10%, e inmediatamente fue congelada en un bail() de hielo seco/acetona. Las bolitas fueron liofilizadas en seco, selladas con argon seco y

almacenadas congeladas.

La actividad del ADN activado liofilizado fue evaluada mediante reaccion con una molecula que contenia una pequeria parte de amina. Se hizo reaccionar glutationa a 50 mg/ml en 0.1 M de fosfato de sodio, pH 8.0 con una cantidad estoicometrica de Netilmalimida (NEM). El pH the reajustado a 8.0 con hidroxido de sodio. Se disolvio una unidad A260 de ADN activado con suberato en 10 tl de NEM-glutationa, y a

continuaciOn se diluy6 25 veces con agua a 4.0 unidades de A260/ml. La conjugacion con NEM-glutationa tuvo como resultado una sola banda migrante mas lenta en electroforesis de gel de urea de TBE de poliacrilamida al 15 % en comparaci6n con el ADN amino 5' no modificado. El ADN activado con suberato, purificado y liofilizado bajo las condiciones descritas, muestra habitualmente casi un 100% de conjugacion con NEM-glutationa, lo cual indica una activacion completa y un mantenimiento de la reactividad de la amina.

Eiemnlo 2: Coniu2acion del Anticuerno Monoclonal con ADN

Se concentraron cien microlitros de anticuerpo monoclonal en PSA (1 mg/ml) (A45110136P de Biospecific, Emeryville, CA) y se intercambio en 0.1 M de fosfato de sodio, 0.15 M cloruro de sodio, pH 8.25 mediante dos pasadas a traves de un dispositivo de filtracion centrifuga Microcon YM-50 a 10,000 x g en un microcentrifugo a

temperatura ambiente. El volumen final de 25 a 50 pl the recogido por centrifugado en

un tubo microcentrifugo, y fue afiadido a una bolita liofilizada de ADN marcador activado. Se dej6 continuar la reaccion de conjugaciOn durante varias horas a temperatura ambiente.

El grado de etiquetado de anticuerpo the evaluado por SDS y electroforesis de gel de proteina nativa. La incorporaci6n de una o mas hebras de ADN en una estructura de anticuerpo aumenta tanto el peso molecular como la densidad de la carga negativa. Los anticuerpos etiquetados con una o mas hebras de ADN aparecen como bandas de migracion Inas lenta diferenciadas en electroforesis de gel de SDS al 4%, lo cual corresponde al grado de incorporaciOn. Estas mismas moleculas de conjugado migran mas rapidamente que el anticuerpo no derivado correspondiente en una electroforesis de gel de proteina nativa al 4-12%. La separaci6n es menos dramatica, pero no tiene una definicion tan optima para conjugados de orden superior en geles nativos.

Se evaluo el grado de conjugacion del ADN mediante densidades de banda relativas para anticuerpos libres y conjugados, y vari6 entre 50 y 100%, dependiendo de la reactividad relativa y de la exposicion de grupos de amina de lisina contenidos en la estructura del anticuerpo. El grado de etiquetado se determino a partir del niunero y la densidad relativa de las bandas de proteina de conjugado, e indicaron una mezcla de etiquetas de ADN predominantemente sencillo y doble por anticuerpo.

El ADN no reaccionado the eliminado del preparado de conjugado mediante cromatografia de filtracion de gel FPLC, empleando una columna Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en una solucion salina amortiguadora de fosfatos. El anticuerpo no reaccionado the eliminado mediante una cromatografia de intercambio de aniones FPLC utilizando una columna Mono Q HR 5/5

equilibrada en 20 MM de amortiguador Tris-CI, pH 8.0 y una pendiente del 5% min. de

NaC1 de 1.0 M a 0.5 ml/min.

El ADN conjugado fue convertido en bicatenatio mediante hibridaci6n a un oligonucleOtido 59-mer complementario:

5'-TGCTCGTATC GATCGCTGAT GCTAGCTAAT ATCGATCAGC AGCTAGTCAT CGCTACGCA-3' (SEQ ID NO: 18)

El exceso de ADN complementario fue eliminado mediante varias pasadas a traves de un dispositivo de filtro centrifugo Microcon YM-100.

Eiemplo 3: Etiquetado de Anticuerno Monoclonal Con Biotina.

Se etiqueto MAb de captura en PSA (A45120136P (Biospecific)) con biotina para inmovilizacion en soportes solidos revestidos con avidina. Se hizo reaccionar MAb de captura (1 mg/ml) sulfo-NHS-LC-biotina de exceso molar 7.5 y 15 veces mas (Pierce, Rockford, Ill.) en 0.1 M de fosfato de sodio, pH 8.0, durante 2-4 horas a temperatura ambiente. La reaccion produjo 3.6 y 7.3 moles de biotina/moles de MAb, respectivamente, tal como se determino mediante la reacciOn con HABA. El MAb de captura biotinilado fue purificado en una columna de desalacion, y se probo su reactividad inmune al antigeno especifico de pr6stata (PSA) mediante ELISA.

Eiemnlo 4: Eticluetar ADN Amino 5' Con Biotina.

Se biotinilaron oligonucleotidos sintetizados para contener un enlace amino 5' (C12) mediante la adici6n de sulfo-NHS-LC-biotina solida en exceso en una soluciOn de 1-5 mg/ml en 0.1 M de bicarbonato de sodio, pH 8.5. Se dejo proceder la reacci6n durante 4 horas hasta el dia siguiente a temperatura ambiente. El ADN

biotinilado fue purificado a partir de la mezcla de reaccion mediante HPLC utilizando

una columna de fase inversa C-18 eluida con una pendiente de acetonitrilo en agua. Se secaron los oligonucleotidos biotinilados puros mediante centrifugaci6n al vacio y se almacenaron congelados.

Eiemplo 5: Preparacion De Microparticulas Paramagneticas Revestidas con Cmab -Biotina.

Se colocaron particulas paramagneticas de estreptavidina Bio-Mag (Polysciences, Warrington, PA) o SeraMag-Streptavidina (Seradyn, Ramsey, MN) (5 mg en 500 Ill) en un frasco de tap& de rosca de 2 ml. Las particulas fueron recogidas en la parte lateral del frasco bajo un campo magnetico, y el supernadante fue descartado. Las particulas fueron lavadas dos veces por recogida magnetica y resuspensi6n en 2 ml de Solucion Salina Amortiguadora de Fosfatos que contenia 0.05% de Tween-20. Las particulas fueron resuspendidas en 1 ml de solucion de bloqueo (PBS que contenia 1% de albumina de suero bovino, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmon y 0.1% de azida s6dica) y fueron transferidas a un tubo conico de 50 ml. Para ello se aiiadieron 24 ml de 10 nM cMAb biotinilado (etiquetado con biotina, ya fuera directamente, como en el ejemplo 3, o a traves de un puente de ADN de doble hebra) en una solucion de bloqueo, seguido de una incubacion durante una hora bajo una agitacion suave a temperatura ambiente. Las particulas fueron lavadas tres veces por recogida magnetica y resuspensi6n en 25 ml de PBS/Tween y una vez en PBS. Las particulas fueron resuspendidas en 2.5 ml de solucion de bloqueo y almacenadas a 4°C.

De forma parecida, tambien se revistieron placas de microtitulacion Reacti- Bind NeutrAvidin Polystyrene (Pierce, Rockford, IL.) con cMAb mediante una etiqueta de biotina. El grado de revestimiento en los soportes fue supervisado por la perdida de

MAb biotinilado de la solucion tal como fue medido por el acid° bicinconinico

(Reactivo de Ensayo de Proteina BCA de Pierce). Se mostr6 el MAb de captura inmovilizado por medio de la electroforesis de gel de proteina para unir el complejo de ADN de PSA y MAb informador de PSA.

Eiemplo 6: Ensavo de Sandwich Inmuno-PCR para Anti2eno Especifico De Prostata.

Se afiadieron ochenta (80) pi de conjugado de 12.5 pM rMAb-ADN del ejemplo 1 en solucion de bloqueo a cada pocillo de muestra en una placa iCycler (Bio-Rad, Hercules CA), seguido de 20 ml de muestra de suero o series de disolucion standard. La solucion fue mezclada con suavidad por repipeteado. La placa fue cubierta con un sellador para impedir la evaporacion, y the incubada durante 2 horas a temperatura ambiente para formar el primer complejo inmune en solucion.

Se afiadieron microparticulas magneticas recubiertas con cMAb-biotina (5 up, que fueron mezcladas mediante repipeteado suave. La placa fue cubierta con un sellador y se incub6 durante 30 minutos bajo agitaci6n suave para capturar el complejo inmune

de PSA sobre la particula.

Las particulas fueron recogidas en las partes laterales de los pocillos bajo un campo magnetic°, y el supernadante the extraido utilizando una pipeta equipada con puntas de filtro. Las particulas fueron resuspendidas en 120 pi de TKMT (10 mM Tris, pH 8.0 que contenia 50 mM de KC1, 1.5 mM de MgC12, Tween20 al 0.05%) utilizando pipetas con filtro en el extremo. Esta recogida y resuspension de las particulas se repiti6 cinco veces de forma adicional, incrementando el volumen de cada lavado sucesivo en

20 tl. De esta manera se aseguro la eliminacion del exceso de conjugado ADN—MAb

informador del menisco liquido en las paredes del pocillo.

Captura del Complejo Inmune de PSA En Particulas.

Las particulas fueron resuspendidas en 50 il de reacci6n de PCR (Platinum Quantitative PCR Super Mix, Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenian Verde SYBR @ 1:30000 (Molecular Probes, Eugene, OR), 10 nM de fluoresceina, 0.2 tM cada cebador, y 0.5 x TKMT. La placa fue cubierta con cinta selladora de calidad optica

y golpeada con suavidad para eliminar las burbujas en el fondo de los pocillos. La amplificaciOn de PCR se llevO a cabo de forma automatica durante 40 ciclos de fusi6n a 95°C durante 15 segundos y extension de 62°C durante 1 minuto en un Instrumento iCycler. La intensidad de fluorescencia the supervisada en tiempo real y se registro un nitmero de ciclo para cada muestra que consiguio un nivel de umbral de serial. Este ninnero de ciclo de umbral se compare) a continuacion con los valores obtenidos para una serie de diluciOn standard de ADN marcador. Los ensayos de este formato detectaron habitualmente unas 5000 moleculas de PSA por encima del fondo (serial en ausencia de PSA). La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de PCR de ADN marcador adherido a rMAb para PSA.

Elena)lo 7: Ensavo de Inmuno-PCR nor Desnlazamiento nara Anti2eno Esnecifico de Prostata. El anticuerpo capturado a PSA (Bioespecifico A45120136P) the conjugado con:

5'-NH3 (C12)-TAGGACTTCAGACTGGGACGAT-3' (SEQ ID NO: 2)

e hibridizado a:

3'-ATCCTGAAGTCTGACCCTGCTAGCTCGAG-(C12) NH3-5'-biotina

(SEQ ID NO:1)

a continuacion fue revestido en microparticulas paramagneticas de Estreptavidina BioMag (lote 495594) a 50 pmol/mg. El Antigeno Especifico de Prostata (0 a 106 moleculas) fue incubado durante 2 horas a temperatura ambiente con 10 pM rMAb (Biospecific A215110136P) conjugado a:

5' -NH3 -(C12)TGC GTAGCGA TGACTAGCTGC TGATCGATAT TAGCTAGCAT CAGCGATCG ATACGAGCA-3' (SEQ ID NO:13)

hibridizado a

3'-ACGCATCGCT ACTGATCGAC GACTAGCTAT AATCGATCGT AGTCGCTAGC TATGCTCGT-5' (SEQ ID NO: 14)

en 0.1 ml de estructtu-a de bloqueo.

La estructura de hibridaciOn es tal como se indica mas abajo:

5'-NH3 ( C12 ) —TGCGTAGCGA TGACTAGCTG CTGATCGATA 1111111111 IIIIIIIlI 1111111111 VACGCATCGCT ACTGATCGAC GACTAGCTAT

TTAGCTAGCA TCAGCGATCG ATACGAGCA-5" (SEQ ID NO:13) .1111111ili 1111111111 11111111) AATCGATCGT AGTCGCTAGC TATGCTCGT —5' (SEQ ID NO: 14)

El complejo inmune fue eliminado de la solucion al cabo de 30 minutos a temperatura ambiente mediante la adicion de 5 1.1,1 en suspension de microparticulas

revestidas (2 mg/ml). Las microparticulas fueron lavadas 6 veces por recogida

magnetica y resuspensi6n en TKMT repetidamente, y divididas en dos grupos.

Un grupo the resuspendido en 25 IA de TKMT y sometido a un analisis de PCR en tiempo real utilizando el grupo del cebador.

5' -TGCGTAGCGA TGACTAGCTG CTG -3' (SEQ ID NO:15) 5' -TGCTCGTATC GATCGCTGAT GCT-3' (SEQ ID NO:16)

El otro grupo fue resuspendido en 25 !al de liAM de oligonucleOtido desplazador de la secuencia:

5'-GGACTTCAGA CTGGGACGAT CGAGCTC-3' (SEQ ID NO: 3)

disuelto en TKMT. Las particulas fueron recogidas por campo magnetic°, y el sobrenadante the sometido a analisis de PCR en tiempo real utilizando los mismos cebadores. La sdial de cada reaccion the analizada con relacion a una curva standard de conjugado rMAb-ADN.

Los resultados que aparecen en la figura 2 indican una reduccion del fondo de aproximadamente 10 veces por el desplazamiento del complejo inmune de las microparticulas paramagneticas, lo cual tiene como resultado una mejora equivalente en la sensibilidad del ensayo definitivo.

Eiemplo 8: Reacciones de Desplazamiento.

Division de Endonucleasa: se creo un enlazador disociable que conectase el MAb de captura con la biotina, utilizando un ADN de doble hebra de 26 pares de base que contenia puntos de endonucleasa de restriccion (SEQ ID NO: 17). Los

oligonucleotidos de 26-bases, cada uno de ellos con un enlace de amino 5' fueron

sintetizados para contener puntos de restriccion Hind III y Eco RI cuando fueran hibridizados. La funcion de amino en una hebra de ADN fue derivada con sulfo-NHSLC-biotina. La segunda hebra fue conjugada para capturar MAb con PSA seguido de hibridacion a la hebra complementaria biotinilada. El conjugado de MAb de captura biotinilado fue plenamente unido por la avidina inmovilizada (o estreptavidina) y liberado por digesti6n con una endonucleasa de restriccion. Se empleo tanto Hind III como Eco RI, aunque la digesti6n de Eco RI fue mas eficiente. Un complejo PSA capturado—MAb informador fue adherido efectivamente desde el soporte paramagnetic° mediante tratamiento con Eco RI a 37°C durante 15 min. Sin embargo, estas condiciones eluyeron tambien el conjugado MAb informador no especifico—ADN. La sensibilidad de un ensayo Sandwich Inmuno-PCR (Ejemplo 6) mejoro de forma marginal para la deteccion de PSA cuando el complejo inmune the desplazado del soporte solid° por division de restricci6n del enlace de ADN. Los resultados obtenidos con placas de microtitulaciOn revestidas con estreptavidina o avidina fueron similares.

5' CAGGTAGAAT TCCTAAGCTT CAGGCT (SEQ ID NO:17) 3' GTCCATCTTA AGGATTCGAA GTCCGA Eco R1 Hind III

Desplazamiento: otro medio para reducir el fondo durante la reacci6n de PCR final utilizo un enlazador de ADN de doble hebra entre el MAb de captura y la biotina utilizada para enlazar con el soporte solid°. Se sabe que el Acido nucleico peptido (PNA) forma hibridos extremadamente tensos con el ADN complementario, y se utilizo para desplazar una hebra de ADN hibridizada de la misma secuencia. El MAb de

captura fue biotinilado mediante un brazo enlazador compuesto de ADN de doble hebra, que se disociaria en presencia de un PNA complementario excesivo.

Acido Nucleico Proteinico: Se sabe que el Acido nucleico peptido (PNA) forma hibridos extremadamente tensos con el ADN complementario, y se utilizo para desplazar una hebra de ADN hibridizada de la misma secuencia.

Una secuencia de anclaje de ADN de 22 bases fue sintetizada con una funciOn de amino 5', y fue biotinilada. Una secuencia de captura de ADN de 15 bases, complementaria al extremo 3' de la secuencia de anclaje, the sintetizada con una funcion de amino 5' y fue conjugada al MAb de captura. El conjugado de MAb de captura fue hibridizado a una secuencia de anclaje biotinilada, dejando una region de hebra sencilla de 7 bases en el extremo 5' del anclaje. Se sintetizaron secuencias identicas de desplazador de ADN de 18 bases para ser complementarias al extremo 5' de la secuencia de anclaje. La hibridacion de la secuencia de desplazador a la region abierta de 7 bases de la sonda de anclaje "desplazaria" la secuencia de captura hibridizada, liberando el complejo inmune, y por lo tanto el modelo de ADN, en la solucion. La secuencia de anclaje biotinilada, y la secuencia desplazadora hibridizada, asi como el MAb informador—ADN unido a la superficie, permanecerf an con el soporte revestido de avidina. El supernadante seria transferido a un nuevo recipiente para la amplificacion de PCR. Este sistema se denomina captura/desplazamiento (ver, por ejemplo, la Figura 1).

La secuencia de captura tambien the conjugada a fosfatasa alcalina con el fin de supervisar y optimizar el sistema de capturaidesplazamiento siguiendo la actividad de la enzima. Esta disposicion de las secuencias de ADN demostrn la captura y liberacion de las particulas de avidina y los pocillos de microtitulacion.

Sorprendentemente, se descubrio que la secuencia de ADN desplazador superaba en rendimiento a la secuencia de PNA en amortiguador salino isotonic°, mientras que

podia afirmarse lo contrario en condiciones de salinidad baja. La adicion de 1 [tM de ADN desplazador a la fosfatasa alcalina inmovilizada a traves de ADN biotinilado de doble hebra the liberada completamente en la solucion en cuestion de segundos. El sistema fue igualmente eficiente cuando se aphid) al ensayo de inmuno-PCR. Las

condiciones de desplazamiento utilizando ADN fueron identicas a las condiciones de lavado anteriores, y compatibles con PCR. La captura/desplazamiento tuvo como resultado una reduccion evidente del fondo, sin afectar a la serial.

Cinetica de Desplazamiento: la Fosfatasa Alcalina the conjugada a un oligonucleOtido de captura de 15 bases (GTGCTTCCTC TTTCT (SEQ ID NO:8)) a traves de un brazo de enlace de amino 5' (C12) utilizando disuccidimidil suberato. El ADN the hibridizado a un oligonucleotido de anclaje complementario de 22 bases (5'- GACACACAGA AAGAGGAAGC AC (SEQ ID NO:9)) etiquetado con biotina a traves de un brazo de enlace de amino 5', lo cual dio como resultado una fosfatasa alcalina etiquetada con biotina a traves de un enlace de ADN parcialmente de doble hebra. El conjugado de fosfatasa alcalina/ADN fue disuelto en PBS con un contenido de 1 MM MgC12, 0.1 mM ZnC12, y 0.1% BSA. Se lavaron cincuenta microgramos de microparticulas paramagneticas avidiniladas (Estreptavidina BioMag, Polysciences, Inc., Warrington PA, 18976) con el mismo amortiguador, y fueron combinadas con 2.5 jtg de conjugado de fosfatasa alcalina/ADN en 0.5 ml de amortiguador. Se aprecio que aproximadamente la mitad de la actividad enzimatica estaba unida a las microparticulas, tal como determino el seguimiento del cambio en la densidad optica a 405 nm en presencia de 1 mg/ml de para-nitrofenil fosfato disuelto en 2.4 M dietanolamina y 57 tiM de MgC12, pH 10. Las particulas fueron lavadas 4 veces en el amortiguador y

divididas en tres cantidades iguales. La liberacion de actividad enzimatica de las

microparticulas en la solucion fue supervisada como una funcion de tiempo a continuaci6n de la adicion de oligonucleotido de desplazamiento o acido nucleico proteinico (PNA) (5'-CTTCCTCTTTCTGTGTGT (cadena de ADN: SEQ ID NO: 6 y cadena de PNA: SEQ ID NO:11)).

Tabla 1 Tiempo (min) Actividad Enzima Soluble

Control (sin adicion)

5 1.3%

10

1.4%

20

1.4%

30

1.5%

Adici6n de PNA 1 50% 3 65% 5 80% 10 90% 20 94% 30 97%

Adicion de ADN 1 82% 3 91% 5 97% 10 98% 20 98% 30 98%

Esta observaciOn se repitio varias veces utilizando Fosfatasa Alcalina

conjugada a (5'-GCTACTTGAC TTCGAGTGCT TCCTCTTTCT (SEQ ID NO:5))/

(GACACACAGA AAGAGGAAGC AC biotina 5'(SEQ ID NO:9) ) y eliminada con el

mismo desplazador a 1 gM. En todos los casos, casi el 100% de la actividad de la

enzima unida fue desplazada de nuevo a la solucion al cabo de 5 minutos.

57

La cinetica de desplazamiento tambien puede observarse con conjugados de anticuerpo a PSA desplazado otra vez a la solucion. La presencia de cantidades bajas de anticuerpo en la solucion es determinada por ELISA. El anticuerpo contra PSA es capturado en las placas revestidas de PSA, y a continuaci6n se reviste con un HRP-Ab secundario. La actividad de HRP es proporcional a la presencia del primer anticuerpo.

Las placas de microtitulacion recubiertas con avidina (Reacti-Bind Neutravidin Coated Polystyrene Strip Plate with SuperBlock Blocking Buffer, Pierce, Rockford, IL 61105) fueron incubadas durante 30 minutos con 10 nM de Ab anti-PSA (no etiquetado, etiquetado con biotina directamente, o conjugado al hibrido de oligonucleotido de anclaje de captura/biotinilado). Los pocillos fueron lavados tres veces en PBS que contenia 0.05% Tween. El conjugado de anticuerpo fue desplazado

por la adicion de 1 11M de oligonucleOtido desplazador y el PNA correspondiente en 10 mM Tris, pH 8, que contenia de 0 a 500 mM de sal. Los pocillos fueron vaciados y lavados como una funcion del tiempo de incubacion. Se afiadio anticuerpo anti-raton etiquetado con HRP en los pocillos, y se dejo incubar durante 1.5 horas. De acuerdo con

la actividad de HRP, se determino que el anticuerpo anti-PSA se midi6 en 490 nm en presencia de OPD/PerOxido en tin lector de placa de Molecular Devices Corp. Hay que selialar que, aunque en este ejemplo se utiliza PNA, las moloculas de ADN y ARN tambien pueden utilizarse como acid° nucleico desplazador.

La Figura 3 muestra que el hibrido de captura/anclaje es estable bajo las condiciones salinas del amortiguador. El conjugado de anticuerpo/ADN biotinilado permanece unido al pocillo, asi como los controles. La Figura 4 muestra el efecto del desplazamiento de PNA en el conjugado de anticuerpo/ADN biotinilado unido. A una resistencia ionica baja, el desplazamiento de PNA es muy eficaz, eliminando el anticuerpo en unos pocos minutos. No resulta tan efectivo como en alta concentracion

de sal. La Figura 5 muestra el desplazamiento con una molecula de ADN. Resulta muy efectivo en una alta concentracion de sal, y no es efectivo en ausencia de sal.

Desplazamiento/Recaptura: en caso necesario, el concepto de captura/desplazamiento puede ser ampliado para incluir otra ronda de captura y liberacion. Para probar esta hipotesis, se sintetizo una secuencia de captura mas larga, de 30 bases, que contenia una segunda regiOn complementaria a la secuencia de la segunda captura. El complejo inmune desplazado a la solucion desde el primer soporte revestido de avidina seria recapturado mediante una hibridacion de solucion a una segunda secuencia biotinilada, seguida de la exposicion a un soporte solid° de avidina fresca. Cada fase de captura/liberacion mejora la sensibilidad, eliminando MAb informador-ADN no especifico. La secuencia de ADN de captura para el sistema de captura/desplazamiento/recaptura se conjugO a fosfatasa alcalina y MAb de captura. Se analizo la eficacia del sistema siguiendo la actividad enzimatica capturada, desplazada y recapturada en particulas paramagneticas. A continuacion, el conjugado de MAb fue incorporado al ensayo de inmuno-PCR. En realizaciones preferentes de la presente invencion, solamente se explora una ronda de captura/desplazamiento. Para la presente invencion, se utiliza captura/desplazamiento. Sin embargo, en caso necesario, en la presente invenciOn pueden utilizarse fases adicionales de captura/desplazamiento.

Tabla 2: Secuencias para NADIA de Captura/Desplazamiento

Secuencia de anclaje para Biotinilacion : (29mer) (SEQ ID NO: 1) 5'NH2-(C12)-GAGCTCGATC GTCCCAGTCT GAAGTCCTA 3'

9470 g/mol; e = 2.75E5; 1 od = 34.4 gg/m1 o 3.64 1AM Secuencia de captura para etiquetado de anticuerpo (22 mer) (SEQ ID NO : 2) 5'NH2-(C12)-TAGGACTTCA GACTGGGACG AT 3'

7261 g/mol; e = 2.18E5; 1 od = 33.2 ptg/m o 4.58 ptM Secuencia de desplazador (27 mer) (SEQ ID NO : 3) 5'GGACTTCAGA CTGGGACGAT CGAGCTC 3'

8897 g/mol; e = 2.60E5; 1 od = 34. 2 gg/m1 o 3.85 liM la captura (SEQ ID NO : 4) 3'CACGAAGGAG AAAGACACAC AG 5'-(C12)-N113-biotina

MW = 9574, e = 2.59E5, 1 OD = 37 ptg/m1 o 3.86 W 30 mer (SEQ ID NO: 5) Captura Ab-5'NH3-(C12)-GCTACTTGAC TTCGAGTGCT TCCTCTTTCT Eliminacion de PNA (SEQ ID NO: 11) 5'CTTCCTCTTT CTGTGTGT 3' 2a captura 3'CGATGAACTG AAGCTCAC-(C 12) NH2 5'-biotina o 5'NH3-(C12)-CACTCGAA GTCAAGTAGC (SEQ ID NO :7)

MW = 5782, e = 1.785E5, 10D = 32.4 ps/m1 o 5.6 , liM

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un kit para detectar un analito de acid° no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento, que comprende:

   (i)

   un primer contenedor que contiene un anticuerpo de captura unido a un soporte solid° con un puente de acid° nucleico que consta de dos hebras de acido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de las cuales esta unida a un soporte sOlido;

   (ii)

   un segundo contenedor que tiene un conjugado del mismo anticuerpo o de un anticuerpo diferente y una molecula de marcador de acido nucleico; y

   (iii) un tercer contenedor que contiene un acido nucleico desplazador que tiene una secuencia por lo menos parcialmente complementaria a una de las hebras del puente de acid° nucleico.
2. 2. Un kit para detectar un analito de acido no nucleico en un ensayo de inmuno-PCR sandwich por desplazamiento, que comprende:

   (i)

   un primer contenedor que comprende moleculas de ADN activadas quimicamente utilizando un compuesto de reticulacion que va a ser unido de forma covalente a una proteina o anticuerpo de enlace de ligando, en que la proteina o anticuerpo de enlace de ligando es capaz de unir de forma especifica el analito de acid° no nucleico, en que las moleculas de ADN comprenden (a) una primera hebra de un puente de acid° nucleic°, y (b) una primera hebra de una molecula de ADN marcador, en que dichas dos hebras son distintas y no complementarias entre si;

   (ii)

   un segundo contenedor que comprende moleculas de ADN complementarias, en que las moleculas de ADN complementarias comprenden: (a)

   moleculas de ADN conjugadas a un ligando, en que las moleculas de ADN son sustancialmente complementarias a la primera hebra del puente de acid° nucleico, (b) moleculas de ADN sustancialmente complementarias a la primera hebra de la molecula de ADN marcador, y (c) moleculas de ADN de hebra de desplazador que son complementarias en su totalidad o en parte a la hebra del puente de acido nucleico; y

   (iii) direcciones para detectar un analito de acid° no nucleico utilizando el kit.

3. 3.

   El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que las moleculas de ADN activadas son activadas con disuccinimidil suberato.

4. 4.

   El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que las moleculas de ADN activadas son activadas con ester maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida disuccinimidil suberato.

5. 5.

   El kit de acuerdo con la reivindicacion 2, en que el ligando es biotina.

6. 6.

   Un kit para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos, que comprende:

   (i)

   un primer contenedor que comprende moleculas de ADN activadas quimicamente utilizando dissuccinimidil suberato para ser unidas de forma covalente a una proteina o anticuerpo de union de ligando, en que las moleculas de ADN son (a) una primera hebra de un puente de acido nucleico, y (b) una primera hebra de una molecula de ADN marcador, en que dichas dos hebras son distintas y no complementarias entre Si; y

   (ii)

   un segundo contenedor que comprende moleculas de ADN de hebra de desplazador que son complementarias en su totalidad o en parte a la hebra del puente de acid° nucleico; y

   (iii) direcciones para etiquetar proteinas, polipeptidos o peptidos utilizando el

   kit.

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   Fig. 2

   1000000

   + Desplazamiento

   -Desolazamiento

   100000

   10000

7. 15.

   1000

   100

   IIIIIII

   1. E+00

   1. E+02 1. E+04 1. E+06

   PSA

   Fig. 3

8. 0. 7—

9. 0. 6

10. 0. 5

11. 0. 4

    -0-- No Na+

    0) lop

    -0 50mMNa+

12. 0. 3

    -4-150mMNa+

    500mMNa+

13. 0. 2

14. 0. 1

    0

    0

    10

    Minutos

    Fig. 4
15. 0.6
16. 0.5
17. 0.4 (ft

    RI* 0.3
18. 0.2
19. 0. 1

    0 -0. 1

    Fig. 5
20. 0.6
21. 0.5
22. 0.4

    re. 0.3 olt
23. 0.2
24. 0. 1

    NoNa+ -0--50mMNa+ 150mMNa+ -4.--500mMNat

    10

    5

    Minutos

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    RFU Sustraido de la Linea de Base PCR

    69

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

    Esta lista de referencias citada por el solicitante es para facilitar la comprensi6n

    del lector unicamente. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido un cuidado extremado a la hora de recopilar las referencias, no pueden descartarse errores u omisiones, y la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

    •

    Documentos de patente citados en la descripcion:

    •

    EP 1249500 A [0007]

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    US 5985548 A [0008] [0070]

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    71

    TRADUCCION DEL FASCICULO DE UNA PATENTE EUROPEA CONCEDIDA, OUE DESIGNA A ESPASTA, PARA LA PROTECCION EN ESPAN-A DE SU OBJETO

    Titular :

    IRIS INTERNATIONAL, Inc.

    N° de publicacion de la patente europea :

    EP 2 290 100 B1

    Referencias del Boletin europeo de patentes

    en el que aparece la publicacion de la menciOn

    de la concesiOn :

    19 — Febrero — 2014 Boletin 2014/08

    La presente traducci6n del texto ingles el fasciculo de patente europea n° 2 290 100 B1

    concedida con designacion de Espaiia, ha sido realizada, para dar cumplimiento a lo establecido en el Decreto 242/1986 de 10 de Octubre de 1986, con la intervencion de Agente de la Propiedad Industrial, acreditado ante la Oficina Espariola de Patentes y Marcas.

    Barcelona, 05 de Mayo de 2014

    EL AGENTE DE LA PROPLEDAD INDUSTRIAL

    LLAGOSTERA SOTO, Ma del Carmen Colegiado n° 478