JP2577881B2

JP2577881B2 - ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法

Info

Publication number: JP2577881B2
Application number: JP59090041A
Authority: JP
Inventors: ジー．ペルゴリッチロバート; ジー．スタブリアノポロスジャニス; ラバーニイラザール; エル．エンゲルハートディーン; クラインスタン
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1983-05-05
Filing date: 1984-05-04
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: NO165975C; CA1228811A; EP0128332B1; DK223384A; ES547003A0; ATE125947T1; EP0611828A1; DE3486478T2; IL71666A0; ES8802261A1; DK223384D0; US9134302B2; DE3486400T2; EP0611828B1; NO165975B; NO841581L; US20100273145A1; AU583787B2; IL71666A; ES532182A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明はポリヌクレオチド相互作用にもとづく一般的
な検出システムを利用する分析物の免疫検定および核酸
検定の両者を含む検定に関するものである。

生物学的および非生物学的試料における物質の微量の
分析および検出は全世界の臨床および分析研究所におけ
る日常の業務になつている。大ざつぱに言えば、分析手
法は配位子−受容体相互作用にもとづくもの（即ち免疫
検定にもとづいた手法）、および核酸ハイブリッド化に
もとづくもの（ポリヌクレオチド連鎖にもとづく手法）
とに分けられることが出来る。

例えば、免疫検定手法は手順中のあるステージまたは
ステップにおいて、抗体結合位置とこれに対する補体と
なる抗原との間の非共有結合を含むものである（例え
ば、T.Chard著“An Introduction to Radioimmunoassay
and Related Techniques"North Holland Publishing C
ompany,Amsterdam,New York,Oxford,1978参照。）ポリ
ヌクレオチド連鎖にもとづく手法において、方法は、あ
るステップまたは他のステップにおいて、ハイブリッド
化条件下に補体となる連鎖に対するポリヌクレオチド連
鎖の非共有結合を含むものである（例えば、Falkow他、
米国特許第4,358,535号、Wah1他、米国特許第4,302,204
号、およびHeimer、米国特許第3,755,086号参照。）一般に広められている動向においては、上記の手法は
両方共正確な分子配列や相互作用によって成し遂げら
れ、そして非共有結合自由エネルギー（例えば水素結
合、分散結合、イオン結合、双極子結合等）の放出によ
ってエネルギー的に与えられる第１認識事象を含んでい
る。該第１認識事象に加えて、上記の手法は両方共、一
つのステップまたは他のステップにおいて、信号を発す
る事象を含むものである。このステップまたは事象は、
人手または装置検出システムに対するいくらかの証明出
来る方法において、第１認識事象を検出する必要性に関
するものである。

信号発信は主として二つの広い分野、放射能および非
放射能手法に集中する。

放射能信号はシステムにおいて例えば³²P,¹³¹I,¹⁴C,³
H等の原子による一つまたはそれ以上の放射性ラベル付
けに依存する。検出は通常放射性検出体による。非放射
性手法はこれらが放射能を含まず、かくしてこのような
手法をより安全に、よりきれいに、そして貯蔵に対して
より安定にせしめるのでこの数年の間にますます使われ
るようになった。これらは放射性ラベル手法と同程度な
高い感度を持つように発展されて来た。現在用いられて
いる最も一般的な非放射性信号発信手法には酸素結合さ
れた免疫検定（例えばSchuurs,A.H.他、Clinica Chimic
a Acta,81:1〜40（1977）），螢光（Bauman等、Chromos
oma,84:1〜18（1981）），間接免疫螢光（Rudkin等、Na
ture,265:472〜473（1977）），アビジン−ビオチン相
互作用（Manning,J.等、Biochemistry,16:1365〜1370
（1977）），例えばフェリチンのような高電子密度核の
電子顕微鏡検査（Broker,T.R.等、Nucleic Acids Resea
rch,5:363〜384（1978）），ラテックス接触（Sodja,
A.,前掲、35:385〜401（1978）），上記手法の組合せ、
そしてその他のものがある。

第１認識事象と信号発信事象は直接または間接に、比
例的にまたは逆比例的に相互に関係付けられることを必
要とする。かくして放射性ラベルされたプローブとの核
酸のハイブリッド化のようなシステムにおいて、放射能
の量は通常存在する分析物の量に直接比例する。検出さ
れるラベルを付された第２抗体の量が正常には試料中に
存在する抗原の量に直接比例するサンドイッチ免疫検定
のようなシステムでは同様なことが云える。逆比例手法
は例えば検出される信号の量が試料中に存在する分析物
の量が増えると減少する競合免疫検定を含む。

従来技術はまた信号発信事象が1:1よりも大きな比率
で第１認識事象と関連する増巾手法を利用して来た。か
くして、検定の信号発信成分は各認識成分に対して10:1
の比率で存在するであろう。

ポリヌクレオチド連鎖にもとづく認識システムの広汎
な多用性はなされるべき実験と研究を広範囲に拡大す
る。この多用性は補体ヌクレオチド塩基相互の正確な配
列、チミジン（Ｔ）に対して配列するアデニン（Ａ）お
よびシチジン（Ｃ）に配列するグアニン、によってもた
らされるものである。この相補性が与えられれば無限に
多方面にわたるシステムを提供するためにいかなる所望
の連鎖を利用することも可能になる。

ポリヌクレオチド相互作用にもとづくシステムのより
広汎な用途に対する障害の一つは、しかしながら、信号
発信または報告グループ（例えば放射性燐、または酵
素、またはビオチン等）をポリマー鎖中の個々のヌクレ
オチド残基に結合する必要性があったことである。この
要求から少くとも二つの問題が生ずる。

第１はポリヌクレオチドポリマーの変性に含まれる化
学反応条件が一般的にとりわけいかなる１つの核酸を充
分に選択するためには激し過ぎることである。例えば、
ケトキザールまたはグリオキザールのようなジカルボニ
ル試薬はグアニンと無差別に反応するであろう。（例え
ば、Shapiro,R.等、Biochemistry,5:2799-2807（196
6）,Litt,M.,前掲、8:3249-3253（1969），またはPolit
z,S.M.等、前掲、20:372-378（1981））参照。）かくしてもしジカルボニル基盤の架橋剤が酵素または
低分子信号発信成分を直接ポリヌクレオチド鎖に結合す
るために用いられるならば鎖中のすべてのグアニン残基
の可成りの量が変性する危険性があるであろう（実際こ
のようなことはある）。このことは認識ステップにおい
てこのような変性された鎖の使用を甚大に妨げる。この
問題は従来技術において、個々の変性されたヌクレオチ
ド（予じめ非水素結合分裂方法で変性された）を発生期
のポリヌクレオチド鎖の中への酵素的な（DNAポリメラ
ーゼを基盤とする）取り入れの使用によって解決されて
いた。しかしながら、最終ポリヌクレオチドそれ自体に
ついての化学的変性手法を利用することが望ましい。

第２の問題は信号発信グループをポリヌクレオチドに
結合することに関連し、第１の問題にいくぶんかは関係
している。該問題は、ポリマー中へのこれら酵素的取り
入れに先立って時には非常に複雑なそして手のこんだ合
成技術による合成の必要性にもとづくものである。かく
して放射性ラベルされたヌクレオチドまたはビオチンラ
ベルされたヌクレオチドは独立して合成されることにな
る。更に最終核酸ポリマー中への化学的に変性されたヌ
クレオチドの結合量はまた分析物上の与えられた連鎖を
認識するためのプローブの能力に影響する。これはもし
信号発信グループが認識グループに大巾に数でまさって
いる増巾手法が利用されるならば特に重要である。それ
故に容易に調整され、化学的変性に対して酵素にもとづ
く反応よりもむしろ制御しやすい成分を利用し、ポリヌ
クレオチドにもとづく連鎖の広汎な多用性を利用し、そ
して信号増巾方法の可能性を含む検定システムを開発す
ることは非常に有用である。

本発明はポリヌクレオチド連鎖認識を利用する一般的
な検定システムを提供するものであり、該検定システム
は化学的変性反応の使用を可能とし、またいかなるタイ
プの非結合相互作用にもとずく認識事象を利用すること
が出来、そして有効な信号発信方法の無数のうちのいか
なるものも用いることが出来るものである。

本発明の手順は（ｉ）分析物（Ａ）の有する分子的認識可能部分を認識
して結合することの出来る第１部分、および（ii）ポリヌクレオチド連鎖からなる第２部分を有する
分子架橋体（Ｂ）および（ｉ）該分子架橋体（Ｂ）のポリヌクレオチド第２部分
にアニーリングすることが出来るポリヌクレオチド部
分、および（ii）信号発信部分を有する信号発信体（Ｃ）を準備るすこと、および該分析物（Ａ）は該分子的識別可能部分を介して該分
子架橋体（Ｂ）の第１部分に結合し、該分子架橋体
（Ｂ）は該ポリヌクレオチド第２部分を介して該信号発
信体（Ｃ）のポリヌクレオチド部分にアニーリングされ
ている複合体を形成すること、および該複合体中に存在する該信号発信部分により信号を検出
すること、からなる分子的認識可能部分を有する分析物（Ａ）を試
料中で検出する方法よりなるものである。

上記手順に加えて本発明は例えば種々な分子架橋体や
種々な信号発信体のようなそれに用いられるべき種々の
要素や成分を該架橋体や発信体からなるキットや該手順
に用いられる他の成分と同様に提供するものである。

本質において、本発明は多重成分検定システムの認識
部分および信号発信部分がシステムの異なった成分上に
存在し、それによってそれらを分離しそして認識部分上
の信号発信部分の妨害を防止するべきであると云う理解
にもとずいている。この多重成分体への分離はまた認識
成分に影響することなくして成分の一つに化学的変性手
法によって結合せしめることを可能にする。

該手順、システム、および成分の用途は限定されるも
のではなく、そして一般的にいかなる試料中の認識する
ことが出来るいかなる分析物の検出のみならず従来の検
定手法が適用されてきた用途のすべてを含むものであ
る。

本発明の明細書および特許請求の範囲において用いら
れる“分析物”なる言葉は検出されるべき、そして所望
なれば定量されるべき単一物もしくは混合物におけるい
かなる物質または複数の物質を含むものである。該分析
物は小さなまたは高分子量の分子、分子複合体、または
例えばウィルス、細胞、または細胞群のような生物系で
あろう。一般的な分析物としては蛋白質、ポリサッカラ
イド、リポポリサッカライド、蛋白質複合体、核酸また
はそのセグメント、単一らせん形状または二重らせん形
状のいづれか、例えばコアーまたはカプシド、種々の異
なったタイプのバクテリア、組織細胞等のようなすべて
のウィルスまたはウィルス成分がある。最も一般的な蛋
白質には構造蛋白質、酵素、免疫グロブリン、またはそ
の断片がある。最も一般的な核酸は例えば、tRNA、mRN
A、rRNA等の種々の異なったタイプのDNAおよびRNAがあ
る。バクテリアは全体、または細胞壁または他の認識可
能部分のようなその断片としてグラム陽性およびグラム
陰性バクテリアを含む。菌、藻類および他の亜顕微鏡的
微生物はまた動物（例えば哺乳類）細胞と同様に含まれ
る。

該分析物は分子的に認識可能な部分をその上に有する
べきである。この相はシステム中の架橋体上の補体分子
部分によって認識されることの出来る分析物のいかなる
分子部分をも示すものである。分子認識は当業者には理
解されているように、２つの分子の補体部分の間の３つ
の次元中の非共有結合を含む。ある分析物上の分子的認
識可能部分には、例えばRNAまたはDNAのようなその補体
連鎖によって認識されるべきポリヌクレオチド連鎖；そ
の対応するモノクローンまたはポリクローン抗体によっ
て認識されるべき抗原部分；その対応する抗原によって
認識されるべき抗体部分；その糖によって認識されるべ
きレクチン部分、そのレクチンによって認識されるべき
糖部分、その受容体によって認識されるべきホルモン部
分；そのホルモンによって認識されるべき受容体部分；
その酵素によって認識されるべき阻害物質部分；その阻
害物質部分によって認識されるべき酵素部分；補因子酵
素結合位置によって認識されるべき補因子部分；その補
因子によって認識されるべき位置部分を結合した補因子
酵素；その基質によって認識される結合配位子およびそ
の逆（例えばビオチン−アビジン）；またはいかなるそ
れらの順列および組合せがある。

最も一般的な分子的認識可能部分には、多くの異なっ
た種類の抗原においての三次元的蛋白質配列、種々の細
胞中に存在する細胞壁構造、または生物のDNAまたはRNA
中に存在する核酸連鎖がある。

該システムの第２の成分は“架橋体”である。この架
橋体は分析物上の分子的認識可能部分を認識することの
出来る第１部分と、そしてポリヌクレオチド連鎖からな
る第２部分のみを含むことを必要とする。該架橋体のこ
れら２つの部分は同じタイプ（即ち異なったものとは云
えどもその両方共がポリヌクレオチド連鎖）または異な
ったタイプ（例えば一つが抗体部分であり、他がポリヌ
クレオチド部分である）のものであろう。

分析物上の分子的認識可能部分を認識することが出来
る架橋体の部分は分析物上の認識可能部分の補体である
分子または分子断片を含まねばならない。それ故にもし
分析物がポリヌクレオチド連鎖を含んでいるならば、該
架橋体の認識部分は補体ポリヌクレオチド連鎖または
“プローブ”であるべきである。もし分析物上の分子的
認識可能部分が広く一般に使用されている抗原であれ
ば、該架橋体上の認識部分はそれに対する抗体である。
糖／レクチン，受容体／ホルモン，阻害物質／酵素等の
前記された補体対に関しても同様なことが云える。

該分子架橋体の第２部分は一つのポリヌクレオチド連
鎖からなる。該ポリヌクレオチド連鎖は、与えられた厳
重な条件下で補体連鎖との安定なアニーリングを与える
に充分であること、それが信号発信体上のポリヌクレオ
チド連鎖の補体となること、そしてもし該架橋体上の認
識部分がそれ自体ポリヌクレオチド鎖であるならば、分
析物連鎖と架橋体上の第２ポリヌクレオチド部分との間
のハイブリッド形成を避けるためにそれが該認識連鎖部
分から充分に相違することが備えられたいかなる選択さ
れた連鎖ともすることが出来る。該三つの条件の後者は
悪い結果を生ずる付随物によって分子混同を防ぐことが
必要である。

架橋体上の第２部分ポリヌクレオチド連鎖（即ち信号
発信体上の連鎖に対する一つの補体）は一つもしくは複
数の特殊遺伝子生成物に対するコードを有するか、また
は遺伝子生成物に対するコードを全く有しないであろ
う。かくしていかなる構造遺伝子またはその部分も架橋
体上のポリヌクレオチド連鎖部分として用いられること
が出来るであろう。望ましい連鎖は、しかしながら、こ
のようなコードを有することは分析物中に存在する補体
遺伝子連鎖に干渉するものであるから、与えられた遺伝
子に対するコードは有しないであろう。かくして例えば
ポリデオキシG,ポリデオキシA,ポリデオキシGT,ポリデ
オキシGA,ポリデオキシGAT,ポリデオキシGTA,または他
のいかなる複合（繰返し）連鎖からなる連鎖のような分
析物上の連鎖に対するコードを有さずそして補体であり
そうもない架橋体上のポリヌクレオチド連鎖を選択する
ことが望ましい。“ポリヌクレオチド”の意味には、ポ
リリポヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオチドま
たはいかなるポリ−プリン、ピリミジン、またはそれら
の類似物およびそれらの結合が含まれる。

本発明において用いられる架橋体の特殊な例はポリヌ
クレオチドとモノクローンまたはポリクローン抗体、蛋
白質抗原とポリヌクレオチド，サッカライドとポリヌク
レオチド，小分子量有機化合物とポリヌクレオチド，レ
クチンとポリヌクレオチド，受容体とポリヌクレオチ
ド，ホルモンとポリヌクレオチド，酵素阻害物質とポリ
ヌクレオチド，酵素補因子とポリヌクレオチド，および
これらの組合せもしくは順列との共有結合されたもので
ある。

架橋体上の認識部分のポリヌクレオチド連鎖部分に対
する分子比率は1:1であることを必要としない。認識部
分より以上のポリヌクレオチド連鎖部分が存在するかあ
るいはその逆もあるであろう。ポリヌクレオチド連鎖部
分の架橋体上の認識部分に対する比率は１よりも大き
く、例えば5,10またはそれ以上である場合には、システ
ムは比率に等しい因子によって第１認識を増巾する。

本発明の好ましい架橋体には単一または二重らせん形
状をなすDNAの環状ポリマーがある。単一らせん形状の
ものは例えばfd,flおよびM13のようないわゆる線状ファ
ージを含んでいる（Van Wezenbeek,P.,Gene,11:129（19
80）参照）。これら線状ファージはこれらの宿主を分離
させない。むしろこれらは細胞が生長と分化を続けるの
で感染した細胞から解放される。M13は市場で入手可能
であり（Bethesda Research Labs,Inc.），そしてクロ
ーン化および連鎖化システムとして広く用いられて来て
いる。それはその中へいかなる所望のポリヌクレオチド
プローブ連鎖を取り入れるために、架橋体の認識部分と
しての役目を果すために制限エンドヌクレアーゼ位置で
切断されることが出来る。同じ位置または異なった位置
のいづれかで、該環状DNAは架橋体のポリヌクレオチド
部分と結合を開始して信号発信部分上の補体部分にアニ
ーリングすることが出来るようになる。この様式におい
てはハイブリッド化による分析体上の遺伝子連鎖を認識
することが可能であり、そしてまた他の連鎖を介して信
号発信体にアニーリングすることが可能である架橋体が
得られる（この種類の一般化システムは第２図に示され
る）。

一つの特に好ましい実施例においては、該架橋体は与
えられた遺伝子（例えばHepatitis Bウィルス、EBV等の
ウィルスプローブ）に対する連鎖、およびポリマーの他
の部分にはポリG,またはポリGT,またはポリdG,またはポ
リdC,またはポリdCA,またはポリdGdTポリヌクレオチド
部分を担持するDNAポリマーからなる。理想的には単一
らせん形状をなすDNAポリマーは信号発信体へのアニー
リング可能なポリヌクレオチド部分（例えばポリdGT）
を担持すること、そしてまた使用物がその中へいかなる
所望のDNAプローブも取り入れることが出来るような制
限エンドヌクレアーゼ位置を担持することをもたらすこ
とが出来る。この様式においては、いくらかの単一酵素
的操作によって、該DNAポリマー架橋体は広い範囲の架
橋体の中へ迅速に変転されることが出来る。本発明の信
号発信体は架橋体上の補体部分に対してアニーリングす
ることの出来るポリヌクレオチド部分および信号発信部
分の両方を担持する必要がある。

信号発信体上のポリヌクレオチド部分は分子架橋体上
の補体部分と同じパラメーターによって定義される。架
橋体上の相当するポリヌクレオチドによる安定なポリヌ
クレオチドハイブリッドを形成することが出来る長さの
ものであるべきである。本発明のこの部分において用い
られるようなアニーリングは厳密な条件のいかなる与え
られる一組の下において、二つの補体ポリヌクレオチド
らせんの間の要求される塩基対の結び付きを云う。この
分野において一般に一つの列において約12から13のヌク
レオチドが安定なアニーリングに対して必要とされる。
かくして最小、連鎖中のヌクレオチドの数は架橋体のポ
リヌクレオチド部分に安定にアニーリングするために必
要なだけにすべきである。ハイブリッドの形成はハイブ
リッド化の後に続くいかなる洗滌、流し出し、または信
号検出過程に対しても充分安定であるべきである。

該信号発信体の“信号発信”部分は事実上従来用いら
れている信号発信システムおよび将来において開発され
るべきいかなるシステムも含むことが出来る。それはそ
れ自体信号を発信する部分（例えば放射性ラベル）、ま
たは更に反応または操作することによって信号を生ずる
部分（例えば酵素−結合システム）からなる。両方のタ
イプ共、こゝでは“信号発信”部分と呼ばれる。

かくして該信号発信部分は放射性ラベル（例えば¹⁴C,
³²P,³H等）、酵素（例えばパーオキシダーゼ、アルカリ
または酸ホスファターゼ等）、バクテリアラベル、螢光
ラベル、抗体（二重抗体システムにおいて用いられるで
あろう）、抗体（ラベルされている抗体と共に用いられ
るべきである）、ビオチンのような低分子（アビジン、
ストレプトアビジン、またはアンチビオチンシステムと
共に用いられるべきである）、ラテックス粒子（浮揚力
またはラテックス膠着システムにおいて用いられるべき
である）、フェリチンのような高電子密度化合物（電子
顕微鏡検査において用いられるべきである）、またはそ
れらの組み合せまたは順列からなるであろう。

例えば、もし信号発信体の信号発信部分が抗原である
場合、信号は該抗原と一つの抗体／酵素結合体との複
合、その後の酵素基質の添加によって発信させることが
出来る。もし信号発信体の信号発信部分が抗体であった
ならば、信号は抗−抗体または蛋白質Ａのような蛋白質
を結合しているF_cの複合化によって発信させられること
が出来、第２抗体または蛋白質Ａは酵素に対になって結
合せられている。

望ましい信号発信部分にはビオチン／アビジンシステ
ムにもとづくものがある。このシステムは種々の手段に
よって信号の中へ取り入れられることが出来る。例え
ば、該信号発信体のポリヌクレオチド部分はチトシクロ
ームｃ架橋を介してビオチンに共有結合することが出来
る（Manning等、Biochemistry,16:1364〜1370（1977）,
Manning等、Chromosoma,53:107〜117（1975）,Sodja,
A.,Nucleic Acids Research,5:385〜401（1978）），ま
たは該ビオチンは固有ヌクレオチド残基の中へ共有結合
物に取り入れられることが出来る（Langer,P.R.,Procee
dings of the National Academy of Sciences,USA,78:6
633〜6637（1981），また該ビオチンはジアミン（例え
ばペンタンジアミン）によってポリヌクレオチドに結合
されることが出来る（Broker,T.R.等、Nucleic Acids R
esearch,5:363〜384（1978））。信号発信部分における
ビオチン分子とアビジン、ストレプトアビジンまたは抗
ビオチン抗体との相互作用はその後行なわれ、アビジ
ン，ストレプトアビジンまたは抗体がラテックス粒子
（Sodja,A.等、上記、またはManning等、Chromosoma,上
記）、フェリチン（Broker,上記）、フルオレセインの
ような螢光物質、酵素等のような信号発信成分と対にな
って結合される。

ビオチン／アビジン基盤および非ビオチン／アビジン
基盤の両方の種々な非放射性信号発信システムの完全な
記述は二つの現在継続中の特許出願において見出すこと
が出来る。（Ward等による1981年４月17日米国特許庁出
願の米国特許出願第255,223号“Modified Nucleotides
and Methods of Preparing and Using Same",およびEng
elhardt等による1982年６月23日米国特許庁出願の米国
特許出願第391,440号“Modified Nucleotides,Methods
of Preparing and Utilijing,and Compositions Contai
ning the Same"）そしてこの特許出願の両方ともこゝに
参照によって完全に取り入れられている。

加うるに、該信号発信体の信号発信部分はいかなる方
法によっても化学的に変性または、人工的に改変されて
いるポリヌクレオチドであることを必要としない。ある
生物学的システムはこのシステムによって利用され得る
生体内変性を行なうものである。このようなシステムの
一つはE.coliにおいて成長せしめられたファージT₄であ
る。T₄ DNAはグリコシル化されているＣ残基の非常に高
い含有量を有する。低度複雑性繰返しポリヌクレオチド
連鎖（クローン）をファージT₄の中へ挿入することは可
能である。その後、このファージは宿主において自然に
繁殖せられそしてグリコシル化せられる。ウィルスDNA
はE.coliから単離せられそして架橋部分上の補体連鎖に
結合せしめられる。検出はその後、レクチン／酵素シス
テム，またはレクチン／螢光染料，またはレクチン／高
電子密度物質，またはレクチン／放射性ラベルを介して
T₄ DNA上の自然グルコース残基を投錨点として用いて達
成せられることが出来る。例えばT₂,T₆，またはT₈のよ
うな他のＴ（均等）ファージがまた用いられる。

信号発信部分の数は該信号発信体上のポリヌクレオチ
ド部分の数と化学量論的に1:1である必要はない。該信
号発信体の信号発信部分におけるポリヌクレオチド部分
に対する信号発信部分の比が１よりも大きな時（例えば
５または10より大きい時）、該システムは増巾システム
として作用している。かくして例えばもし信号発信体に
おいてポリヌクレオチド部分に対して10の信号発信部分
が存在するならば、架橋体をおおって10:1信号増巾が得
られる。もし、加うるに、架橋体がそれ自体信号増巾シ
ステムを有するならば、即ち架橋体上の認識部分に対す
るポリヌクレオチドの比率が１よりも大きいならば、す
べての信号増巾システムは両方の比率の積である。この
ことは分析物の水準で発生するすべての第１認識事象に
対して増巾が迅速に増大して非常に鋭敏なシステムを導
びくことを意味している。この因子はシステム構成要素
の設計によって容易に制御され得る。

調製の手順前述したように該架橋体は認識部分とポリヌクレオチ
ド部分とからなることが必要である。該信号発信体はポ
リヌクレオチド部分および信号発信部分を必要とする。
かくして一般には、該システムにおいて個々の成分の調
製方法はポリヌクレオチドまたは個々の成分の１）蛋白
質部分、２）サッカライド部分、３）他のポリヌクレオ
チド部分、４）低分子量化合物（例えば分子量約1000以
下の）、５）放射性ラベル、または６）例えばバクテリ
ア粒子またはラテックス粒子のような不溶性相に対する
共有結合に関係するだろう。それ故、核酸のそれらの相
当する一つまたは複数の相手との共有結合または対をな
す結合の中に含まれる化学はよく知られた技術の範囲の
中にある。

ポリヌクレオチド連鎖の蛋白質に対する共有結合はま
た文献中に充分記載されている。通常、該反応はカルボ
ジイミド架橋（Halloran,M.K.,J.Immunol,373（196
6））によって、またはホルムアルデヒド（例えばBrutl
ag,D.等、Biochemistry,8:3214〜3218（1969）,Mannin
g,J.E.等、Chromosoma,53:107〜117（1975）をみよ）、
（４−アジドフェニール）グリオキザール（Politz,S.
M.,Biochemistry,20:372〜378（1981）のような試薬の
存在下の核酸に対する蛋白質の架橋によってポリヌクレ
オチドの２′,3′−ハイドロキシ末端の酸化、次いで
ｉ）蛋白質のアミノ基とのシッフ塩基形成、そしてii）
ボロハイドライド反応（Sodja,A.等、Nucleic Acids Re
search,5:385〜401（1978））によって直接に行われ
る。他の方法はDNAの直接ブロム化（Jones,A.S.,Nature
183:1603（1959））それにつづくジアミノヘキサンと
の反応（Lowe,C.R.,Eur.J.Biochem,73:265〜274（197
7））そして蛋白質カルボキシル官能基を介しての対に
なる結合、またはシトシン部分の水銀化（Dale,R.M.K.
等、P.N.A.S.,70:2263〜2242,（1973）），それに続く
ハロゲン化（Dale,R.M.K.等、Nucleic Acids Res.,2:91
5〜930（1975）），ジアミノヘキサンとの反応そして蛋
白質カルボキシル基との対になる結合を含むものであ
る。

特に興味があるのは、該信号発信体の調製において、
グアニン塩基の化学変性のためのジカルボニル試薬の使
用である。これは現在の多重成分検定システムの特に有
用な利点の一つを示す。もし信号発信体上のポリヌクレ
オチド部分が非常に低いＧ含量を有するならば、当のポ
リヌクレオチド部分のアニーリング特性の非可逆変性の
おそれなくして、該ポリヌクレオチド部分を例えばジカ
ルボニル化合物のような架橋剤を介していかなる物質と
も化学的に反応させることが可能である。このことはい
かなる小分子量分子のポリヌクレオチド部分とのジカル
ボニル化合物または他の非識別架橋の使用による結合に
対して等しく好都合に適用されるものである。この手法
は個々のヌクレオチド残基を予かじめ変性しそしてその
後に酵素重合によってポリヌクレオチドらせんの中へこ
れらを取り入れると云うような労力と時間とを節約する
ものである。

ポリヌクレオチド連鎖のサッカライドに対する結合は
Cramer等、Chem,Ber 92:384〜391（1959）によって行わ
れることが出来る。20以内のサッカライド単位を有する
サッカライドが望ましい。

ポリヌクレオチド連鎖の他のポリヌクレオチド連鎖に
対する結合は例えば短太な終端の結紮またはエンドヌク
レアーゼ分解酵素によって生ずる結合力を有す末端の存
在にもとづく結紮を用いて、化学的または酵素的手法の
いづれかによって行なわれ得る。DNA連鎖の相互分割お
よび結紮はHellingおよびLomax,“The Molecular Cloni
ng of Genes-General Procedures",Chakrabartyによる
“Genetic Engineering"の第１章、CRC Press,1978,Pag
es 1〜30に詳細に述べられている。

ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドに対する結合の
ための他の方法はSS Dna＋Ribo dUTP＋末端トランスフ
ァラーゼ（Roychoudery,R.＋Wu,R.,in Meth.in Enz.,LX
V,43,（1980））；過ヨウ素酸塩酸化、1,6ジアミノヘキ
サン（１）,3−アミノプロピオン酸（２），またはビス
（２−アミノエタンチオール）（３）を含むアミノ誘導
体との還元アミノ化（Perikeh,I Mach,S,およびCuatrec
asas,in Meth.in Enz.XXXIV,82（1974）；またはＣの制
限ブロム化（水銀化を介して）（DaleおよびWard上記参
照）そしてそれに続くDNAの同様の試薬（（１），
（２）＋（３））との反応を用いることを含む。

上記化合物（１）または（２）のDNA誘導体はこれに
続いて水溶性カルボジイミド誘導体を介して蛋白質と対
に結合される（Inman,J.K.in Meth in Enz.,XXXIV,52〜
53,（1974））。（３）の場合には、該蛋白質はブロモ
酢酸のＮ−ハイドロキシサクシンイミドエステルによっ
て活性化され得る。得られた活性化蛋白質は室温でチオ
ール化核酸と共有的に結合させることが出来る。

例えば³²Pのような放射性ラベルのDNA連鎖の中への共
有結合による取り入れは例えば酵素重合による放射性ラ
ベルされているヌクレオチドの直接結合、遷移翻訳等の
ような種々の方法のいづれによってもなされることが出
来る（Rigby等、J.Mol.Biol.113:237〜251（197
7），）。

例えば蛋白質／ラテックス結合体、蛋白質／フェリチ
ン結合体、抗体／酵素結合体、螢光物質／抗体結合体、
アビジン／酵素結合体等のような信号発信システムの個
々の要素の調製はこの技術分野ではよく知られておりそ
して以下の詳細な説明には記述されないであろう。

個々のポリヌクレオチド連鎖の特別な調製はまた当業
者にはよく知られている。例えば、もし一つのポリヌク
レオチド連鎖が１つまたは複数の遺伝子からなっている
ならば、合成方法または逆トランスクリプターゼを用い
てmRNAを逆転写して補体DNAを生ずることによってそれ
が調整され得る。もし該ポリヌクレオチド連鎖がいかな
るヌクレオチドのらせん（例えばポリdGまたはポリdC）
またはいかなるジヌクレオチド対（例えばポリdGT等）
からなるものであれば、それは例えばDNAポリメラーゼ
を用いることにより、また合成方法論によって容易に調
整され得る。

使用方法検出されるべき分析物は例えば血液、尿糞便、だ液、
うみ、精液、血清、その他の組織、発酵肉汁、培地等の
臨床試料のようないかなる生物学的または非生物学的試
料中に存在し得る。もし必要であれば、該分析物はその
混合成分から分析物の特別なタイプのものを濃縮するた
めに知られた方法によって予備抽出または精製される。
例えば、もし分析物が蛋白質または蛋白質含有フラクシ
ョンであれば、例えば塩沈澱、アルコール沈澱またはク
ロマトグラフのような蛋白質抽出方法が利用され得る。
もし分析物が同定されるべき核酸セグメントからなって
いれば、例えばフェノール抽出のような核酸抽出方法が
利用され得る。該分析物は、もしこのような場合もある
ならば精製されていない材料と共に、精製されながら該
混合物中で試験されることが出来、また特にそれが核酸
セグメントである場合には固定されることが出来る（例
えば、Wahl等、米国特許出願4,302,204をみよ）。

該分析物を含むと思われる細成物はある時間、分析物
の認識可能部分と架橋体上の認識部分との間の複合化を
行わしめるに充分な条件下で孵置される。これらの条件
は分析物と架橋体の性質および量によって種々に変化す
る。通常は複合化が起った後に、該試料は中性溶液で洗
滌して過剰の架橋体を除去する。これに代えて、このス
テージでは洗滌を行わずに信号発信体は混合物に添加し
てそして架橋体上のポリヌクレオチドらせんと信号発信
体上のそれとの間にアニーリングが起った後に洗滌が行
われる。該架橋体らせんの該信号発信らせんとのハイブ
リッド化はハイブリッド化条件下でそして厳密な条件の
いかなる組み合せの下で行われる。最後の洗滌は信号の
発信に先立って必要であろう。

信号発信は信号発信システムの性質によっていづれか
の与えられた手法によって行なう。かくしてもし酵素結
合検定が利用されるならば、分析物，架橋体そして信号
発信体間の三成分からなる複合体は酵素担持試薬（例え
ば酵素／抗体結合体）と共に孵置せしめられ、そして基
質は発色のためにそこへ添加される。それに代えて、酵
素は信号発信体上のポリヌクレオチドらせんに直接に結
合され、この場合には基質は直接に添加されてその後発
色が得られる。もし該信号発信体の信号発信部分がビオ
チン部分であれば、アビジン，ストレプトアビジンまた
は抗−ビオチン抗体のようなビオチン反応分子がそれに
添加される。該ビオチン反応分子は酵素，螢光化合物，
高電子密度化合物、または不溶性固体相と対になって結
合してそして検出が適当な方法で行われる。

応用本発明のシステムの応用は制限されない。試料中の検
出されそして分析されることが望まれるいかなる分析物
にも本発明の方法を行なうことが出来る。例えば該シス
テムは分析物中の認識可能部分および認識部分、および
架橋体の夫々いかなる種類のものを用いることによって
も微生物検出および同定のために用いられ得る。

特に興味あることは、ウィルスおよびバクテリアDNA
連鎖の検出および同定である。

該方法は遺伝的不調が併なわれるDNA遺伝子連鎖に対
するポリヌクレオチド補体を調整し、そしていづれかの
第１認識事象の存在を測定することによって遺伝的不調
の診断に利用することが出来る。これら遺伝的疾病とし
ては、例えば、サラセミアをあげることが出来る。サラ
セミアの判定はオリゴヌクレオチドのゲノームDNAに対
するハイブリッド化、それに続いて固有洗滌方法または
制限分析およびサザーン，ノーザーンまたはドットブロ
ットによって（既知の遺伝欠陥に対して）なされること
が出来る。

本発明のシステムに対する他の用途は染色体上に位置
する特定の遺伝連鎖の一連に対して対をなす変性ポリヌ
クレオチドの一連を用いること、そしてその後その上の
第１認識事象を測定することからなる染色体核型決定に
存する。

他の用途は架橋体中に存在するホルモン受容体結合成
分を受容体位置に結合すること、そしてその後本発明の
信号発信システムによって第１認識事象を測定すること
からなる細胞表面上のホルモン受容体位置の同定または
位置決定のための方法を含む。

他の用途は疑がいのある被検体の血液または血清中の
例えばCEA（悪性腫瘍の胚に対する抗原）のような癌に
関連する抗原の存在を検出することによる癌の診断から
なる。他の用途は本発明の手法によって正常受容体の不
存在を検出することによって悪性細胞を同定することか
らなる腫瘍または癌細胞の同定または検出方法を含む。

他の用途は分子架橋体中の認識部分としてその代りに
抗原を用いることによって動物中のある伝染性疾病に対
する抗体を検出する方法を含む。糖水準または特異なグ
リコシル化されているヘモグロビン水準は分子架橋体上
の認識部分としてのレクチンを用いて糖尿病の判定をす
ることが出来る。

更に本発明の手順およびシステムに対する用途は分析
物の不溶化に存する。かくして、もし試料が分析物を含
んでいると思われ、そして試料から該分析物を抽出およ
び精製することが望まれるならば、該“信号発信体”は
例えば水性不溶性樹脂，ガラス，アクリレートまたはメ
タクリレートのようなプラスチック，試験管内壁または
その縦孔等の不溶性固体相に特別に結合することからな
るか、または結合する能力を有するように設計される。
該架橋体は固体相と共に孵置され、かくして作られる分
析物のための認識位置（即ち親和性表面）はそれからそ
れに結合される。

本発明は検出および同定手順を行なうために必要な要
素の一つまたはそれ以上からなるキットの作成を容易に
与えるものである。かくして、キットは密閉部中に例え
ば試験管，小型びん，フラスコ，ボトル，シリンジ等の
一つまたはそれ以上の物入れ手段または一連の物入れ手
段をその中の密閉部中に受け入れるために区画された入
れ物からなるであろう。該物入れ手段または一連の物入
れ手段の第１のものは色々な種類の分析物のいずれかを
認識するための架橋体を含むであろう。第２物入れ手段
または一連の物入れ手段は信号発信体を含むであろう。
第３物入れ手段または一連の物入れ手段は結果が内析さ
れることが出来る標準曲線を作成することが出来るよう
にする分析物の予じめ検出された量を含むであろう。他
の物入れ手段または一連の物入れ手段は例えば酵素結合
体，アビヂン結合体，フェリチン結合体，ラテックス結
合体，螢光物質結合体等の信号を発信するために必要な
要素を含むであろう。

望ましい実施例においては、該キット入れ物は予備検
出される連鎖のポリヌクレオチド部分と、分析物と関連
されている試験を行なうそして同定する遺伝連鎖のため
のいくつかの遺伝子プローブのいかなるものと結合する
ために用いられ得るDNA上の制限位置または分割位置を
担持するDNAである架橋システムからなる第１物入れ手
段を含む。この望ましいキットにおける他の物入れ手段
は第１物入れ手段中に存在する該DNA中に存在するポリ
ヌクレオチド部分に対する補体となるポリヌクレオチド
部分と、前記システムのうちのいづれかである信号発信
部分とを担持する信号発信体からなるであろう。この望
ましいキットにおける第３物入れ手段または一連の物入
れ手段は例えばウィルス，バクテリア，細胞等の一つま
たはそれ以上のポリヌクレオチド含有分析物上に存在す
る遺伝連鎖の補体となるDNAプローブの種々なものから
なる。

かくして使用者は第１入れ物中のDNAを開き、第３物
入れまたは一連の物入れの中に存在するいづれかの所望
のDNAプローブをそれに取り入れ、ポリマーを結紮しそ
してその後分析物中に存在するいかなる所望の遺伝連鎖
の存在をも検出し同定するために該架橋体および信号発
信体を利用するための分割方法（例えば制限エンドヌク
レアーゼの使用）を利用するであろう。単一らせんは連
結剤（該位置にかゝる）がそれに最初ハイブリッド化さ
れ、それによってその位置において二重らせんが作成さ
れることなくして制限酵素によって切断されることは出
来ない。正常には遺伝子は微生物中で増巾され得るよう
にRF（二重らせん形状をなす）の中へ結紮されるであろ
う。

今一般的に本発明を述べたが、同じことが実証のため
にのみここに含まれ限定する意図は全くない、もしそう
でない場合は明細に述べられるであろうある特別な実施
例に対する参考資料によって実証されるであろう。

実施例実施例１〜31は架橋および信号発信部分の調製の手順
に関するものである。該実施例は下記のカテゴリーに組
分けされるであろう調製方法を示す。

１）後続の蛋白質，サッカライドおよび低分子との対に
なる結合のためのオリゴヌクレオチドの化学活性化。

２）後続のDNA,サッカライドおよび低分子との対になる
結合のための蛋白質の化学活性化。

３）後続のDNA,蛋白質および低分子との対になる結合の
ためのサッカライドの化学活性化。

４）後続のDNAと蛋白質との対になる結合のための低分
子の化学活性化。

５）DNAの蛋白質，サッカライドおよび低分子との対に
なる結合。

上記カテゴリーに組分けされる実施例は下記の通りで
ある。

１）オリゴヌクレオチドの化学活性 A.末端リポヌクレオチドラベル付けとそれに続く過ヨウ
素酸的酸化および還元アミノ化による。実施例11,12。

B.非固有ブロム化による：実施例28,29,30。

C.5−ヨウドシトシンを介するシトシン部分の固有活性
化による：実施例16,17,18。

D.3,4,5−トリクロロジアゾベンゼンとの反応を介する
グアノシン部分の固有活性化による：実施例１。

E.2,3−ジブロモプロパナールとの反応を介するアデノ
シンおよびグアノシン一部分の固有活性化による：実施
例９。

２）蛋白質の化学活性化 A.ブロモアセチル化による：実施例13,14。

３）サッカライドの活性化 A.還元サッカライドの活性化による：実施例4,5,6。

B.非還元サッカライドの活性化による：実施例7,8。

４）低分子の活性化 A.ビオチン：実施例2,33,23,24,25,26。

B.DCTA:実施例３。

５）DNAと蛋白質，サッカライド，および低分子との対
になる結合 A.蛋白質への：実施例15,19,20。

B.サッカライド：実施例19,18。

C.低分子への：実施例19,10,21,27。

実施例１ DNAの3,4,5−トリクロロアニリンによる活性化。

100mgの3,4,5−トリクロロアニリンは50％DMSO中の2.
5mlの0.5M HCl中に溶解されそして氷上で冷却され、激
しい攪拌下で冷1M溶液からのNaNO₂の等モル量が出来る
だけ迅速に添加せられ、そしてその後攪拌は10分間継続
された。300μｌの水中3Hまたはfd DNAの1mgが2Mカコジ
ル酸塩バッファーpH6.6の300μｌと500μl DMSOにより
混合せられた。（DMSOの添加により溶液のpHは8.3に上
昇する）。20μｌの新たに調製されたジアゾニウム溶液
がそれに添加されそして該混合物は室温で２時間孵置さ
れた。孵置の間に現れる若干の沈澱は遠心分離で除去さ
れた。該溶液はその後酢酸アンモニウムで0.4Mにされそ
して該DNAはエタノールで沈澱された。

実施例1a トリクロロアニリン−活性化DNAのチオールとの反応、D
CTA-SHとチオール活性マンノースとの反応の例 3,4,5−トリクロロアニリンによって活性化されたFd
DNA（実施例１）は0.1Mカセイソーダと等量の0.1M K₂HP
O₄中で溶解された。この溶液は0.1M DCTA-SH（実施例
３）またはチオール活性化マンノース（実施例６および
９）の等量で処理され、そしてアルゴン雰囲気で２時間
65℃で孵置された。沈澱されたジサルフィドが遠心分離
によって除去されそして該DNAはG50クロマトグラフィー
によって精製されそして−20℃で貯蔵された。誘導体化
されたDNAを平均にするために放射性Niを用いて、60％
のグアニンがラベルされていたことを測定した。

実施例２ビオチン−SH ビオチン−NHSエステルの３ミリモルは無水DMFの25ml
中に溶解されそして0.5M重炭酸ソーダの12ml中のシステ
アミンハイドロクロライドの1M溶液に混合され、そして
該混合液は室温で一晩孵置された。孵置の間に重い沈澱
が生じた。該液体は45℃、減圧下で除去されそして残基
は50mlアブソルートエタノール中に懸濁され、1gのNaBH
₄が添加されそして該懸濁液は75℃１時間攪拌された。
エタノールは除去されそして冷1M HClが添加されてpH4.
5に調節せられ、そして水は35℃、減圧下で除去され
た。（これら操作のすべてはチオールの酸化を防止する
ためにアルゴン雰囲気下で行なわれた。固体残基は4ml
の冷脱気された0.01M酢酸の4mlを加えて粉末化されそし
て粉砕された。これらの手順は二回繰返されそして残基
は凍結乾燥された。TLCクロマトグラフ検定は主ビオチ
ンスポットはチオールを含み、二つの小スポットはチオ
ール陰性であることを示した。すべての反応において、
ビオチンの量はチオール含有量にもとづいた。

実施例３ DCTA-SH DCTA−ブロマイドの１ミルモルが2,3−ジチオエチレ
ンの0.2mlをトリエチルアミンの0.5mlを含む50％DMFの5
mlに添加された。該混合物はアルゴン雰囲気下に２時
間、60〜70℃で孵置された。該溶液はそれから20mlの水
と混合され、9mlベッドボリュームのDowex AG-1カラム
上に負荷された。該カラムは流通液中にチオールがなく
なるまで50mlの0.1M酢酸溶液で洗滌された。DCTA-SHは
その後0.25M HClで流出された。チオール含有フラクシ
ョンは合一せられ、蒸発せられて40℃減圧下で乾燥され
そして遊離酸（300mg）はアルゴン雰囲気で−20℃で貯
蔵された。

実施例４１−０−メチル−６−０−トシル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシド非還元サッカライドはトシレートを形成すること、そし
てそれをアンモニアで置換してアミノ基を形成するかま
たはジオールで置換してチオール基を形成することによ
って第１級アルコール類を介して活性化せられた。この
実施例では、α−メチル−ｄ−マンノシド、非還元蔗糖
およびマンノースが還元糖として記載される。該トシル
化は刊行物に記載された手順と類似の方法で行われた
（F.Cramer等、Chem.Ber.92,384〜391（1979））。

23gのメチル−Ｄ−マンノシドが400mlのアブソリュー
トピリジン中に溶解せられ、そして該溶液は氷−塩混合
物上で−15℃に冷却せられた。80mlアブソリュートピリ
ジン中24.6gのｐ−トルエンスルホン酸クロライドの溶
液が激しく攪拌されている混合液中に添加されそして−
15℃、30分間そして20℃12時間反応せしめられた。ピリ
ジンは40℃、減圧下に除去されそして残基はクロロホル
ム中に溶解された。該溶液は50℃に加温されそして0.5M
硫酸水素カリウムで連続的に洗滌せられその後50℃で0.
5M重炭酸カリウム溶液で洗滌された（ゲル形成を防止す
るために50℃代の温度が必要である）。

実施例５６−アミノ−α−メチル−Ｄ−マンノシドハイドロクロ
ライド 130mlのアブソリュートメタノール中の6gのトシレー
ト（実施例４）の溶液は１℃で乾燥アンモニアによって
飽和され、そして16時間、120℃のオートクレーブ処理
された。暗所反応生成物は木炭と共に還流されそしてメ
タノールは蒸溜によって除去され若干黄色いシロップが
残った。該シロップは水に溶解されそして置換反応がア
ニオン変換体を通して溶液を通過することによって除去
されている間スルホン酸塩が遊離される。HClが流出液
に添加せられてpH5.0に調節され、そして水が減圧下40
℃で除去される。残基はアブソリュートメタノールの15
mlとアブソリュートエタノールの15mlの混合液とともに
粉砕されそして該固体物質は50mlのアブソリュートメタ
ノール中に溶解されそして冷却され、25mlアブソリュー
トエーテルの添加は結晶化を惹起こし、2.5gハイドロク
ロライドを得た。

実施例６Ｓ−（２−メルカプトエチル）−６−チオ−α−Ｄ−メ
チル−マンノピラノシド 6gの糖トシレート（実施例４）は20mlの新らしく調製
されたソジウムメトキサイドの溶液を含む250mlのアブ
ソリュートメタノール中に溶解された。該混合液に対し
て、5mlの1.2エタンジチオールが添加された。該混合液
は120℃10時間のオートクレーブ処理され、反応生成物
は上記のようにして処理された。収量は3.1gであった。

実施例７ 2,3,4,6,テトラアセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルク
ロライドこの化合物は刊行物に記載されたと類似な方法で調製
された。（D.Horton,Organic Synthesis Vol 46,p.1,Wi
lley N.Y.1966）。

25gの乾燥マンノースは60mlのアセチルクロライドに
攪拌しつゝゆっくり添加された。容器には還流コンデン
サーが接続されそして該混合液は室温で16時間攪拌され
る。クロロホルム、300ml、がコンデンサーを通して添
加されそして該混合液は激しく攪拌しつつ300gの氷と10
0mlの水の上へ注がれた。該混合物は別なロートにうつ
され、そして有機物相は出来るだけ迅速に氷と300mlの
飽和重炭酸ソーダ溶液を含むビーカーの中へ注がれた。
該有機物相は分離されそして無水硫酸マグネシウムの25
gによって乾燥された。乾燥剤は除去され乾燥アルコー
ルフリークロロホルムで洗滌されそして該結合クロロホ
ルム溶液はロータリーエバポレーター中で減圧下35mlに
濃縮された。50℃でエーテルが若干濁るまで該溶液に添
加され、該溶液は室温に放置された。結晶はろ過によっ
て除去されそして乾燥エーテルで洗滌された。収量は39
gであった。

実施例８Ｓ−（２−メルカプトエチル）−１−β−Ｄ−マンノピ
ラノシルスルファイドおよびＳ−（２−アミノエチル）
−１−β−Ｄ−マンノピラノシルスルファイド 60ml無水DMF中に10gアセトクロロマンノース（実施例
７）の溶液に4mlの1,2エタンジオールまたは5gシステア
ミンハイドロクロライドおよび5gの粉末化炭酸ソーダが
アルゴン雰囲気下、６時間、70℃で攪拌されている該懸
濁液に添加された。該炭酸塩は除去されそして該液体は
減圧下45℃で蒸発された。該残基はアブソリュートメタ
ノール中に溶解されそして新らしく調節された0.1Mソジ
ウムメトキサイドがpHを8.0に調節するために添加され
そして該混合液は室温で５時間攪拌された。2mlの氷酢
酸が添加せられそして該溶液は減圧下に除去された。該
残基は酢酸から再結晶された。収量は3.1gであった。

実施例９ 1,2ジブロモプロパナールによるDNAの活性化エーテル中のアクロレイン（1.7g）の溶液が氷浴上で
冷却されそして1.3mlのブロムが次のブロム添加までに
色が消えるのを待ちながら攪拌下にゆっくり添加され
た。エーテルが溶液にアルゴンを吹き込むことによって
部分的に除去された。以下の操作に用いられるDNAはDMF
への溶解を容易にするためにトリエチルアンモニウム型
にした。

250μｌの水中の0.5mgの3H fd-DNA（線状）（部分的
にトリチウム化される）が3.0mlの70％エタノール中0.5
Mトリエチルアンモニウムアセテート、pH4.5と共に混合
せられそして50μｌのジブロモプロパナール溶液が添加
された。該混合液は暗所で37℃、40時間攪拌された。反
応は螢光の発現によって監視された。該反応混合液は減
圧下に蒸発されて乾燥され、そして該DNAは0.6ml水に溶
解されそしてG50濾過によって流出媒として水を用いて
脱塩された。放射能を含むフラクションは合一せられそ
して該容量は0.2mlに減小された。

実施例10 3,4,5−トリクロロアニリンDNAのDCTA-SHによるラベル 0.2mlの水中0.5mgの該活性化されたDNA（実施例１）
が90％DMF中2.0mlの0.5Mトリエチルアンモニウムアセテ
イトと混合されそしてトリエチルアンモニウム型のDCTA
-SHの50mgが添加された。該混合液は暗所で４時間、50
℃で攪拌された。該DMFは減圧下、45℃で除去されそし
て該DNAはG-50濾過によって脱塩された。ラベルの程度
はその後放射性Ni63の使用によって測定された。計算に
よれば平均して5.3塩基ごとにラベルされていた。

同様な手順がこれら物質（実施例2,6および８）のチ
オ誘導体を用いて該活性化DNAのビオチン化およびグリ
コシル化のために用いられた。

DNAの化学的ラベル原理あるジアゾニウム塩とグアノシンの対になる結合は８
位置では安定な着色生成物を与え（H.Fischer,Z.Physio
l.Chem.,60,696〜78（1909）），そして２位置では酸変
性されやすい黄色生成物を形成する（H.Kossel,Z.Physi
ol.Chem.340,210,1965,E.N.Moudrianakis等、Biochim.B
iophys.Acta 123,421（1966））。単一らせん形状の核
酸中のグアノシン残基はジアゾニウム塩と結合出来そし
てこの反応は単一らせん形状の核酸をセルロースに固定
するために用いられて来た（J.C.Alwine等、Methods in
Enzymology,Vol.68,p.220〜242,1979））。もし該結合
されたジアゾニウム化合物がチオールまたはアミンによ
って容易に置換されることが出来る活性基を含んでいる
ならば、これはビオチンまたは他の基を単一らせん形状
の核酸に結合するための容易な方法を構成する。3,4,5
−トリクロロフェニルジアゾニウウクロライドは本発明
者等によってビオチン、1,2−ジアミノシクロヘキサン
−N,N,N,N−テトラ酢酸（DCTA）およびある種の糖を単
一らせん形状のDNAに添加するために用いられて来た物
質である。

単一らせん形状の核酸をラベルするための他の可能性
はクロロアセチルアルデヒドはpH4.5でアデニンと反応
して螢光ビニル誘導体を形成し（穏やかな条件下）、J.
R.Barrio等、Biochem.Biophys.Res.Commun.46,597〜60
4,1972），シチジンはpH3.5で反応しそしてグアニンはp
H6.5で反応する。pH4.5ではグアニジンは全く反応しな
い（P.D.Sattsangi等、J.Org.Chem.,42,3292〜3296,（1
977）。

クロロアセチルアルデヒドの代りに1,2ジブロモプロ
パナールを用いることによって、活性第１級ブロム化物
と共に穏やかな反応条件下で、チオールまたはアミン誘
導体と反応するDNAを誘導化することが可能であり、DNA
をラベルする他の方法を提供する。これら二つの方法は
塩基固有性である。

実施例11 ５′−ウリジンモノホスフェイト（UMP）の末端トラン
スファラーゼおよび５′−ウリジントリホスフェイトに
よる線状3H fd-DNAに対する末端付加孵置混合液の600μｌは400μｇのDNA,1mM CoCl₂,0.2m
Mジチオスレイトール,0.1Mカコジル酸,25mmolトリス塩
基,1mM UTPおよび400単位の末端トランスファラーゼを
含む。該混合物の最終pHは6.9〜7.0であった。

該混合液は２時間、35℃で孵置された。該DNAはエタ
ノールで沈澱されそして400μｌの0.2M酢酸ソーダpH4.7
に溶解された。

実施例12 末端リボ基の酸化と還元アミノ化。アミノカルボキシお
よびチオ−末端置換DNAの合成孵置混合液の450μｌは、400μｇの末端ラベル化され
たDNA（実施例11）、0.2M酢酸ソーダpH4.7および0.1M N
aIO₄を含む。それは暗所で室温で２時間孵置されそして
該混合液は0.3Mホウ酸カリウムpH9.0〜9.3中で平衡化さ
れたG 50カラムに通されて0.2mlのフラクションが集め
られた。すべての放射性フラクションは総量1.2mlに合
一せられた。該DNA溶液はアミノ成分の１つ（ε−アミ
ノカプロン酸、システアミン、または1,6−ジアミノヘ
キサン、pH9.3に調節された1Mのストック溶液を用い
る）によって0.4Mにされた。

得られたシッフ塩基は下記のようにNaBH₄で還元され
た。水（1ml）中1:0.2Mに新らしく溶解されたNaBH₄は30
分間隔で４つの部分に添加された。該孵置は計３時間続
けられた。塩と過剰のアミノ成分は1mMベータ−メルカ
プトエタノールを含む0.4M酢酸ソーダ中で平衡化された
カラム中のG 50濾過によって除去され、該DNA含有フラ
クションはその後合一せられ−70℃でアルゴン雰囲気下
に貯蔵された。使用前にDNAはエタノールで沈澱されそ
して所望のバッファーに溶解された。

実施例13 ブロモ酢酸Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステルの
活性化ブロモ酢酸のNHS（Ｎ−ハイドロキシサクシンイミ
ド）エステルは下記の通りに調製された。ブロモ酢酸の
100ミリモル（13.9g）は50mlの無水DMF中に溶解され、
この溶液に対して100ミリモル（20.6g）のＮ−Ｎジシク
ロヘキシルカルボジイミドが攪拌しつゝ添加せられ、次
いで100ミリモルのＮ−ハイドロキシサクシンイミド（1
00％純度として11.9gに調節された）が添加せられ、そ
して該混合液は６時間37℃で攪拌された。該混合液はそ
の後ハイドロキシ尿素の沈降を促進するために−20℃で
２時間放置され、該沈澱は濾過によって除去された。該
濾過物において、DMFは減圧下45℃で除去されそして活
性化エステルは２−プロパナールから再結晶された。

実施例14 IgGのブロモアセチル化 0.3molホウ酸バッファーpH9.9中のIgG（20mg/ml）がD
MSO中のブロム酢酸（実施例13）のNHSエステルの10mg/m
l溶液の0.06容量と混合された。該試料はその後0.1M Na
Cl 0.1mol燐酸塩バッファーpH7.5に対して透析された。

実施例15 DNA-IgG結合体の合成 0.3Mホウ酸カリウムバッファー中のブロモアセチル化
IgG（実施例14）の1.6mg/mlは室温でアルゴン雰囲気下
でチオ−置換された末端ラベルされたDNA溶液（実施例1
2）の3mg/mlと共に２時間孵置された。メルカプトエタ
ノール0.01Mがその後添加されそして該混合物は更に同
温度で２時間孵置され未反応ブロム残基を除去された。
該溶液はその後蛋白質Ａカラム上で吸着されそして未結
合DNAは1.0M NaClによって流出された。該DNA-IgG結合
体と該未反応IgGはイソチオシアナートによって流出さ
れそして0.1M燐酸塩バッファー,pH7に対して透析されて
イソチオシアナートを除去された。該結合IgGと遊離IgG
は硫酸アンモニア50％でその後沈澱され、ペレットは1.
0ml燐酸塩バッファー中に溶解されそして遊離IgGは結合
IgGから0.01M NaCl、0.1M燐酸塩pH7.2の中で平衡された
Bio-Gel p-300カラム上で分別することによって分離さ
れた。

実施例16_p BR 322の水銀化水銀酢酸（3mg,0.01ミリモル）を含む5mM酢酸ソーダp
H7.5の1ml中に溶解された_pBR 322 DNA（100μｇ）はDal
e等の方法（Nucl.Acid Res.2:915 1975）によって50℃
４時間反応された。５−シトシン水銀化DNAは完全に0.0
2M食塩2mMEDTAを含む0.01MトリスHCl中で透析された。

実施例17 水銀化_pBR 322 DNAのヨウ素化 1ml0.1MトリスHCl pH7.5中の前実施例からの水銀化DN
AへDale等の方法（Nucl.Acid Res.2,915,1975）を用い
て1mgのヨウ素が添加された。20℃２時間の反応の後過
剰I₂はクロロホルムで抽出されそしてヨウ素化されたDN
Aは0.02M食塩と2mM EDTAを含む0.01mトリスHClに対して
透析された。置換されたDNAはN.クラッサエンドヌクレ
アーゼ、蛇毒ホスホジエステラーゼDNAラーゼそしてE.c
oliアルカリホスファターゼによる連続分解により分析
された（H.Yamasaki等Cancer Res.37:1389,1977）。該
混合液はDE-52アミノセルロースを介して流出され、そ
してヌクレオチドは標準としてオーセンティック５−ヨ
ウド−２′−デオキシウリジンを用いて逆相HPLCによっ
て分析された。

実施例18 ５−ヨウドシトシン_pBR 322 DNAのアミンとの反応。1,6
−ジアミノヘキサンとの反応の実施例 1ml 0.1Mホウ酸ソーダ中に透析された前反応からのヨ
ウド化DNAに116mg（１ミリモル）ジアミノヘキサンが添
加された。該反応混合液はアルゴンで曝気せられそして
100℃２時間加熱された。該アミノヘキシル置換DNAは完
全に0.01MトリスHCl pH7.5の中へ透析された。

アミノカプロン酸、ビス（２−アミノエタン）ジスル
ファイドおよび６−アミノ−α−メチル−Ｄ−マンノ
（実施例５）に対する反応条件は本質的に同一である。

実施例19 １−エチル−３−ジイソプロピル−アミノカルボジイミ
ド（EDAC）を用いたアミノおよびカルボキシ−置換核酸
の蛋白質またはアミンへの対になる結合 1ml0.01M NaCl pH7.5（HCl）中に溶解されているアミ
ノ−または−カルボキシ−末端置換DNA（実施例11）（5
0μｇ）と3H−ラベルストレプトアビジン（50μｇ）に
対して5mgEDACが添加された。該反応物は暗所で20時間
孵置されそしてDNAは4M CaCl₂（0.03ml）の添加によっ
て沈澱せしめられた。DNAは1ml水中に再溶解されそして
この手順は未結合蛋白質を除去するために２回以上繰返
えされた。該蛋白質−結合DNAはイミノビオチン−セフ
ァローズ親和性カラム（K.Hoffman等、PNAS 77:4666,19
80）中で親和性精製された。

実施例20 カルボキシヘキシル−置換DNAのＮ−ハイドロキシサク
シンイミド活性化および蛋白質またはアミンとの結合、
ストレプトアビジン結合 DNAの実施例カルボキシ末端置換DNA（実施例19）（50μｇ）はDow
ex 50-WX（Et₃N＋）と共に水溶液を振盪することによっ
てトリエチルアンモニウム塩に変換された。該溶液は凍
結乾燥されそして該乾燥されたDNAはジンクロヘキシル
カルボジイミド（10.3mg,0.05モル）とＮ−ハイドロキ
シサクシンイミド（5.8mg 0.05モル）が添加されている
無水ジメチルホルムアミド（0.5ml）中に溶解された。
室温で20時間の孵置の後、該反応物は遠心分離されそし
て上澄は２時間10mM NaCl中へ透析された。0.2Mホウ酸
塩、pH8.5（1ml）中に溶解されているストレプトアビジ
ン（50μｇ）はＮ−ハイドロキシサクシンイミド活性化
DNAに添加されそして該反応物は20時間孵置されそして
0.01M NaClの中へ透析された。該ストレプトアビジン結
合DNAはCaCl₂沈澱および前記されたと同様にイミノビオ
チン親和性クロマトグラフによって精製された。

実施例21 DNAのグリオキザールとの反応 DNA（１μｇ）（プラスミド_pDK14からのBAM挿入）は
0.025Mグリオキザール（0.2ml）中に溶解されそして100
℃30分密閉試験管中で加熱された。該反応物は10mM NaC
lに対して透析された。グアノシン上の反応の程度を評
価するために、反応物の一部分はHClでpHを1.0に低下さ
せそして100℃で30分加熱することによって酸デプリネ
ーションを受ける。該デプリネーションされたDNAはDE-
52アミノセルロースを通しての流出によって除去されそ
して流出されたプリンは逆相上HPLCによって分析され
た。アデノシン、グアノシンおよびグリオキザール−グ
アノシンアダクトのピーク高さの比較（R.Shapiro等、B
iochem,5:2799,1966）は70％のグアノシンが置換された
ことを示した。

実施例22 Ｎ−ビオチニル−４−アミノ−アセトフェノン 20mlジメチルホルムアミド（DMF）中に溶解されたビ
オチン−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（50
μg,0.014ミリモル）の溶液に50mlDMFと100ml0.1Mホウ
酸塩バッファーpH8.5中に溶解された４−アミノフェニ
ルアセトフェノン（4.35g,0.03モル）が添加された。室
温で20時間の反応の後、該溶媒はロータリーエバポレー
ターで蒸発されることによって除去された。残基油状物
質は先づ0.1N HClですり砕かれその後５％重炭酸ソーダ
ですり砕かれる。生成物はエタノールから結晶化せしめ
られる。

実施例23 ビオチニル（４−アミノフェニル）グリオキザールセレニウムジオキサイド（0.75g,7ミリモル）が0.15m
l水を含む4mlジオキサン中に溶解された。これへ5mlジ
オキサン中に溶解されたＮ−ビオチニル−４−アミノア
セトフェノン（1.9g,7ミリモル）の溶液が滴加された。
該反応物は3.5時間還流されその後該混合液は濾過され
そして真空下で濃縮された。粗生成物はシリカゲルクロ
マトグラフによって精製された。

実施例24 1,N−ビオチニル−1,6−ヘキサンジアミンジメチルホルムアミド（５μｍ）中に溶解されている
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル
（1.0g,2.9ミリモル）が0.1Mホウ酸ソーダ（500ml）中
ジアミノヘキサン（1.15g,10ミリモル）の溶液に添加さ
れた。室温で５時間反応の後、該溶液はロータリーエバ
ポレーターによって蒸発され、10ml水中に再溶解されそ
してDowex 50-WX（Ｈ＋）上でクロマトグラフにかけら
れた。カラムは50％メタノール水溶液で洗滌されそして
50％メタノール水溶液（0.3M）中に溶解しているトリエ
チルアミンを有する流出フラクションが集められた。蒸
発残基はエーテルで完全にすり砕かれそしてDMF/エーテ
ルから再結晶させられた。

実施例25 CH₃‐CO-CONH-(CH₂)₆‐NH−ビオチン 20ml無水DMF中ピルビン酸（0.44g,5ミリモル）の４℃
に冷却した溶液へイソブチルクロロホルム化（0.64g 5
ミリモル）およびトリ−Ｎ−ブチルアミン（1.43g,1.5
ミリモル）が添加された。この温度で20分後、更に1.4g
トリ−Ｎ−ブチルアミンが添加されそして該混合液は30
ml DMFと30ml 0.1Mホウ酸ソーダ中に溶解された1,N−ビ
オチニル−1,6−ヘキサンジアミン（実施例24）の溶液
に添加された。４℃１時間の反応の後、該混合液は更に
20時間室温で放置せられそして続いて真空中で濃縮され
た。該混合液はシリカゲル上クロマトグラフによって精
製されそして生成物はエタノールから再結晶された。

実施例26 CHO-CO-CONH-(CH₂)₆‐NH−ビオチンセレニウムジオキサイド（54mg,0.5ミリモル）が25μ
ｌ水を含むジオキサン（0.5ml）中に溶解された。1mlジ
オキサン中に溶解されたCH₃‐CO-CONH-(CH₂)₆‐NH−ビ
オチン（実施例25）（0.21g 0.5ミリモル）が滴加され
そして該反応物は100℃４時間加熱された。得られた沈
澱は遠心分離によって取除かれジオキサンで洗滌せられ
そして上澄は真空で濃縮された。該粗混合物はシリカゲ
ル上でクロマトグラフにかけられた。

実施例27 DNAのビオチン化グリオキザール誘導体との反応トリエチルアンモニウム塩としてのDNA（１μｇ）が1
00μｌ水に溶解された。これに対してジメチルホルムア
ミド中（Ｎ−ビオチニル（４−アミノフェニル））グリ
オキザール（0.05M）またはCHO-CO-CONH-(CH₂)₆‐NH−
ビオチン（0.05M）の溶液の100μｌが添加された。該混
合液は密閉された試験管中100℃30分加熱されそして続
いて0.01M NaClに対して透析された。反応物の大きさは
前に述べたプリンヌクレオシドの酸デプリフィケーショ
ンとHPLC検定で検出された。

実施例28_p BR 322 DNAのブロム化 0.5M酢酸塩バッファーpH5.5中に溶解された_pBR 322 D
NA（100μｇ）の溶液に対してブロム（5.5μl,0.1ミリ
モル）が添加された。該反応物は60℃30時間孵置されそ
して0.01M NaClに対して完全に透析された。

実施例29 ブロム化_pBR 322 DNAのチオールとの反応。システアミ
ンと３−メルカプトプロピオン酸との反応の実施例 0.1Mホウ酸塩pH8.5（1ml）中ブロム化_pBR DNA（500μ
ｇ）の溶液がシステアミンまたは３−メルカプトプロピ
オン酸（20mg）のいづれかとアルゴン雰囲気下室温で20
時間孵置された。得られたアミン−またはオルボキシ−
置換DNAは0.01M NaClに対して透析された。

実施例30 ブロム化_pBR 322 DNAのアミンとの反応。1,6−ジアミノ
ヘキサンとの反応の実施例ブロム化_pBR 322 DNA（100μｇ）と1Mの1,6−ジアミ
ノヘキサン（1ml）の溶液はアルゴン雰囲気下で65℃３
時間加熱された。得られたアミン置換DNAは0.1M NaClに
対して透析された。

実施例31 信号発信ポリヌクレオチドに結合された蛋白質の合成。
化学的に放射性ラベルされたDNAに結合されたIgGの実施
例 Fd DNAは実施例11において述べられた条件下で末端ト
ランスファラーゼを用いてUMPで末端ラベルされた。該
末端ラベルされたDNAは2,4,5−トリクロロアニリン（実
施例１）で誘導化されそして実施例1aに述べられたと同
一な条件下でDCTA-SHと反応させられた。該末端ラベル
されたDCTA誘導体化されたDNAは過ヨウ素酸ソーダによ
って酸化され、システアミンと反応されそして実施例12
で述べたようにソジウムボロハイドライドで還元され
た。これは順番に実施例15において述べた条件を用いて
ボロアセチル化IgG（実施例14）と反応せられた。

実施例32 架橋体としてのバクテリオファージM13の使用組み換えDNA技術の手法を用いて、非対称DNA連鎖はM1
3のような単一らせん形状のファージの複製（二重らせ
ん形状）の中へ挿入されることが出来る。挿入物の一つ
のらせんはグアニン残基中に欠けているだろう。本発明
の一つの結果として、二つの単一らせん形状のファージ
は二つの極性、一つは（Ｇ−）らせん、即ち非対称連鎖
にグアニル酸残基を有していない、他はＧ（＋）連鎖と
呼ばれるべきＧ（−）連鎖と補体をなす連鎖を含んでい
る、で得られるであろう。該Ｇ（＋）ファージは例えば
ヘルペス単純ウィルスI DNA連鎖のような関心のあるDNA
プローブを担持するためのベクトル（架橋体）として用
いられる。

該Ｇ（−）ファージ（信号発信体）は例えば1,2−ジ
カルボニル試薬のようなグアノシン固有試薬と化学的に
反応せられる。該Ｇ（−）ファージ中の該Ｇ（−）挿入
物はグアニル酸残基を欠くので変性されない。

単一らせん形状のM13の調製のための一般的手順は次
の通りである。

1.M13 mp8 rf（複製型、二重らせん形状）が培養せられ
る。それは短太な末端を残したHinc IIで切断される。

2.pd（Ｇ−Ｔ)₅とpd（Ａ−Ｃ)₅が与えられそしてハイブ
リッド化されて完全な二重らせんを形成する。該末端は
完全に対になって結合されるべきである。この条件を得
るためにハイブリッド化のために高C_ot条件を用いるこ
とが必要である。

3.ハイブリッドは制限酵素Rsa Iの存在下で結紮され
る。Rsa Iは連鎖GTACを認識しそしてそれ故に切断して
短太な末端を残しそして結紮を修正するであろう。

4.該結紮生成物は単離される。これらは二重らせん形状
のポリｄ（Ｇ−Ｔ）ポリｄ（Ａ−Ｃ）である（いかなる
補体、繰返し、低複雑性連鎖をも使用出来る。該連鎖変
性および化学的性質はしたがって調節せられるべきであ
る。） 5.アルカリホスファターゼは５′ホスフェイトの除去に
用いられる。

６ポリヌクレオチドキナーゼと³²P‐ATPは³²P−ホス
フェイトで５′末端を置き換えるために用いられる。

7.該反応混合物は15〜20％非変性ポリアクリルアミドゲ
ルに展開せられて異なったサイズの断片を分離する。

8.該断片は放射線写真測定によってゲル上の位置を検出
される。

9.所望のサイズのバンドはゲルを切断すること、該ゲル
を潰ぶしそれから高塩バッファーで抽出することによっ
てゲルから流出される。

10.DNAは例えばエタノール沈澱、スペルミン沈澱、凍結
乾燥等の多くの可能な手法のいづれかによって濃縮され
る。

11.該断片はHinc II−切断M13の中へクローン化される
べく用意される。

標準スタンダード手法を用いて、次の手順が行われ
る。

a.断片はM13の中へ結紮される。

b.細胞（例えばE.coli JM103）はM13で変転される。

c.変転細胞は被覆せられる、そして d.組み換え体が選択される。

12.組み換え体の選択のためには二つの可能なルートが
ある。

a.もし、既知の寸法の組が挿入されたならば、斑点は選
ばれそして挿入物の存在をチェックするため順序付けさ
れる。

b.改変方法はステップ４で作成された連鎖のすべてをM1
3の中へ狙い打ちすることである。この手順はより多く
のクローンが選ばれそして順序付けによってチェックさ
れることを要求する。

13.一たん適当なクローンが得られたならば（適当な寸
法の連鎖を有するM13）、単一らせん複製形状の中へGTG
T等を与えるらせんは選択されるであろう。このクロー
ンはその後複製形状の中へ種々の病原菌からの連鎖を挿
入することによって更に進んで遺伝子工学のために用い
られる。

14.複製形状中のACAC等を与えるらせんはマス培養中で
クローン化され、Ｇ′ｓに固定な報告体（信号発信部
分）によって変性される。かくしてＧ（−）ファージは
二官能性試薬ｐ−アジドフェニルグリオキザール（AP
G）と完全に反応せられる。APGのジカルボニル部分は只
DNAの単一らせん形状部分におけるグアノシン残基との
み反応する。グアノシンを欠く挿入物はこの処理によっ
ては影響されない。

15.G（＋）そして誘導体化された（Ｇ−）DNAは当モル
濃度で混合せられそしてターゲットDNAおよび相互にハ
イブリッド化せしめられる。ハイブリッドの視覚化は標
準信号報告手法による。

本発明に関しては既に充分に述べたけれども、ここに
述べられた本発明もしくは実施例のいずれの精神又は範
囲にも影響することなく、同様の構成や過程を生ずる広
範囲に亘る改変の対象となりうる通常の技術によって理
解される。

【図面の簡単な説明】

本発明は添付図面と参照することによってより良く理解
されるであろう。第１図は本発明の検定システムに対する一般化図式を表
わす。分子的に認識可能な部分２を有する分析物１には
分析物１上の分子的認識可能部分２を認識することが出
来る部分４を有する分子架橋体３との接触がもたらされ
る。加うるに架橋体３は一般にATCGATC‥‥として記さ
れるポリヌクレオチド連鎖からなる部分５を担持する。
またシステムにおける存在は架橋体３のポリヌクレオチ
ド部分５にアニーリングし得るポリヌクレオチド部分７
を有する信号発信体６である。信号発信体６はまた信号
発信部分８を担持する。分析物が分析される試料中に存
在する時、認識可能および認識部分２と４を夫々介して
架橋体３との相互作用が起る。それによって形成される
複合体はそれからポリヌクレオチド部分５を介して分析
物１とのある化学量論的関係の中へ信号発信部分８を持
って来る信号発信体上の補体ポリヌクレオチド部分７に
対してアニーリングされる。第２図は分析物９がDNA連鎖10（一般的にATCGATCGATCと
して示される）からなる本発明のより広い概念の下のよ
り望ましいシステムを示す。単一らせん形状の環状ポリ
ヌクレオチドポリマーとして示される架橋体11は分析物
のDNA連鎖と補体をなすDNA連鎖である認識部分12を担持
する。加うるに架橋体11はまた信号発信体14上の補体ポ
リＣ連鎖15との安定なハイブリッドをアニーリングしそ
して形成することの出来るポリＧ連鎖13を担持する。信
号発信体14はまたその信号発信基としてビオチン部分16
を担持する。分析される試料の中のDNA連鎖の存在は架
橋体11へのハイブリッド化を惹起し、それに続く信号発
信体のかくして形成された複合体へのアニーリングは網
状形状を介してビオチン部分を分析物に結合する。該ビ
オチン部分16はその後例えばアビジン／酵素結合体の添
加、次いで酵素基質の添加、そして色検出によって検出
されることが出来る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジャニスジー．スタブリアノポロスアメリカ合衆国 10019 ニューヨーク、ニューヨーク、ストリート 59 ウェスト 515 (72)発明者イラザールラバーニアメリカ合衆国 10003 ニューヨーク、ニューヨーク、フィフスアベニュー 69 (72)発明者ディーンエル．エンゲルハートアメリカ合衆国 10024 ニューヨーク、ニューヨーク、リバーサイドライブ173 (72)発明者スタンクラインアメリカ合衆国 11217 ニューヨーク、ブルックリン、リンカンプレイス 235

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）分析物（Ａ）の有する分子的認識可
能部分を認識して結合することの出来る第１部分と、（ii）夫々ポリヌクレオチド連鎖からなる１またはそれ
以上の第２部分を有する分子架橋体（Ｂ）および夫々が（ｉ）該分子架橋体（Ｂ）のポリヌクレオチド第２部分
にアニーリングしそれによって安定なポリヌクレオチド
ハイブリッドを形成することが出来るポリヌクレオチド
部分と、（ii）１またはそれ以上の信号発信部分を有する１またはそれ以上の信号発信体（Ｃ）を準備す
ること、および該分析物（Ａ）は該分子的識別可能部分を介して該分子
架橋体（Ｂ）の第１部分に結合し、該分子架橋体（Ｂ）
は該ポリヌクレオチド第２部分を介して該信号発信体
（Ｃ）のポリヌクレオチド部分にアニーリングされてい
る複合体を形成すること、および該複合体中に存在する該信号発信部分により信号を検出
すること、からなる分子的認識可能部分を有する分析物（Ａ）を試
料中で検出する方法。
【請求項２】該分子架橋体（Ｂ）は２以上の第２部分か
らなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】認識第１部分に対するポリヌクレオチド第
２部分の数比率は２以上である特許請求の範囲２に記載
の方法。
【請求項４】数比率が５以上である特許請求の範囲３に
記載の方法。
【請求項５】数比率が10以上である特許請求の範囲４に
記載の方法。
【請求項６】２以上の信号発信体（Ｃ）が準備され、そ
の結果複合体を形成する特許請求の範囲１に記載の方
法。
【請求項７】信号発信体（Ｃ）は２以上の信号発信部分
からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項８】信号発信体（Ｃ）中のポリヌクレオチド部
分に対する信号発信部分の数比率は２以上である特許請
求の範囲７に記載の方法。
【請求項９】数比率が５以上である特許請求の範囲８に
記載の方法。
【請求項１０】数比率が10以上である特許請求の範囲９
に記載の方法。
【請求項１１】分子架橋体（Ｂ）中の該第２部分が２以
上のポリヌクレオチド連鎖、および／あるいは２以上の
信号発信体（Ｃ）が準備されその結果形成された複合
体、および／あるいは該信号発信体（Ｃ）が２以上の信
号発信部分からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項１２】分子架橋体（Ｂ）中の第１部分に対する
第２部分の数比率が２以上、および／あるいは分子架橋
体（Ｂ）に対する信号発信体（Ｃ）の数比率が２以上、
および／あるいは信号発信体中のポリヌクレオチド部分
に対する信号発信部分の数比率が２以上である特許請求
の範囲１に記載の方法。
【請求項１３】夫々の数比率が独立して５以上である特
許請求の範囲12に記載の方法。
【請求項１４】夫々の数比率が独立して10以上である特
許請求の範囲13に記載の方法。
【請求項１５】該分析物は生物学的または非生物学的試
料に存在する特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項１６】該分析物の分子的認識可能部分は蛋白質
様物質である特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項１７】該分析物の分子的認識可能部分は核酸か
らなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項１８】該分析物の分子的認識可能部分はサッカ
ライドからなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項１９】該分析物は抗原、抗体、受容体、ウィル
ス、ウィルス構成要素、バクテリア、バクテリア構成要
素、細胞、細胞構成要素、または試料のいかなる病原
性、あるいは非病原性構成要素からなる群から選択され
る特許請求の範囲16,17または18に記載の方法。
【請求項２０】該分子架橋体上の該認識第１部分はポリ
ヌクレオチド連鎖からなる特許請求の範囲１に記載の方
法。
【請求項２１】該分子架橋体上の該認識第１部分は抗原
からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２２】該分子架橋体上の該認識第１部分は抗体
からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２３】該分子架橋体上の該認識第１部分はサッ
カライドからなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２４】該分子架橋体上の該認識第１部分はレク
チンからなる特許請求の範囲１に記方法方法。
【請求項２５】該分子架橋体上の該認識第１部分はホル
モンからなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２６】該分子架橋体上の該認識第１部分は受容
体からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２７】該分子架橋体上の該認識第１部分は酵素
阻害物質または酵素補助因子からなる特許請求の範囲１
に記載の方法。
【請求項２８】該分子架橋体上の該認識第１部分は酵素
活性位置、補助因子結合位置、または受容体蛋白質から
なる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項２９】該分子架橋体上の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は遺伝子生成物またはそれらの断片
に対するコードを有する特許請求の範囲１に記載の方法
【請求項３０】該分子架橋体上の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は遺伝子またはそれらの断片に対す
るコードを有しない特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３１】該分子架橋体上の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分はポリデオキシＧ、ポリデオキシ
Ｃ、ポリデオキシＴまたはポリデオキシＡ連鎖、または
ポリ−リボまたは−デオキシリボプリン、ピリミジンま
たは類似物からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３２】該分子架橋体上の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分はグアノシン残基の豊富な連鎖部分
からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３３】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は他のポリヌクレオチド連鎖に共有
結合されている特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３４】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は抗体に共有結合されている特許請
求の範囲１に記載の方法。
【請求項３５】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は抗原に共有結合されている特許請
求の範囲１に記載の方法。
【請求項３６】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分はサッカライドに共有結合されてい
る特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３７】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分はレクチンに共有結合されている特
許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３８】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分はホルモンに共有結合されている特
許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３９】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は受容体に共有結合されている特許
請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４０】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は酵素阻害物質または酵素補助因子
に共有結合されている特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４１】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド連
鎖からなる第２部分は酵素に共有結合されている特許請
求の範囲１に記載の方法。
【請求項４２】該分子架橋体は環状DNAポリマーである
特許請求の範囲20に記載の方法。
【請求項４３】該DNAは単一鎖をなす特許請求の範囲42
に記載の方法。
【請求項４４】該環状DNAポリマーは線状ファージから
誘導される特許請求の範囲42に記載の方法。
【請求項４５】線状ファージはM13またはそれの変種で
ある特許請求の範囲44に記載の方法。
【請求項４６】該M13ファージはグアノシン残基または
シトシン残基の豊富な連鎖部分を担持する特許請求の範
囲45に記載の方法。
【請求項４７】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部
分は遺伝子生成物またはその断片に対するコードを有す
る特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４８】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部
分は遺伝子生成物またはその断片に対するコードを有し
ない特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４９】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部
分はポリデオキシＣ、ポリデオキシＧ、ポリデオキシ
Ａ、ポリデオキシＴ連鎖、または低度複雑性の繰返し連
鎖からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項５０】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部
分はシトシン残基またはグアノシン残基の豊富な連鎖部
分からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項５１】該信号発信体はポリヌクレオチドポリマ
ーである特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項５２】該ポリヌクレオチドポリマーは自然発生
変性DNAである特許請求の範囲51に記載の方法。
【請求項５３】該ポリヌクレオチドポリマーはＴ（均
等）ファージから誘導される特許請求の範囲52に記載の
方法。
【請求項５４】該Ｔ（均等）ファージはT₄である特許請
求の範囲53に記載の方法。
【請求項５５】該変性DNAはクローン化挿入物を担持す
る特許請求の範囲52に記載の方法。
【請求項５６】該ポリマーは単一鎖をなす特許請求の範
囲51に記載の方法。
【請求項５７】該ポリマーは線状ファージから誘導され
る特許請求の範囲56に記載の方法。
【請求項５８】該ファージはM13またはそれの変種であ
る特許請求の範囲57に記載の方法。
【請求項５９】該信号発信体の該信号発信部分は放射性
ラベル付される特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項６０】該信号発信体の該信号発信部分は放射性
ラベル付されない特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項６１】発信号発信部分は酵素からなる特許請求
の範囲60に記載の方法。
【請求項６２】発信号発信部分はビオチン部分からなる
特許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項６３】発信号発信部分は螢光化合物からなる特
許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項６４】該信号発信部分は高電子密度化合物から
なる特許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項６５】発信号発信部分は不溶性相からなるかま
たはそれと結合している特許請求の範囲60に記載の方
法。
【請求項６６】該不溶性相はラテックス粒子、樹脂、ま
たはバクテリアからなる特許請求の範囲65に記載の方
法。
【請求項６７】該信号発信部分は抗体または抗原からな
る特許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項６８】該信号発信部分はサッカライドまたはレ
クチンからなる特許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項６９】該信号信部分による信号を検出する該ス
テップは放射能測定からなる特許請求の範囲１に記載の
方法。
【請求項７０】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは酵素反応からなる特許請求の範囲１に記載の
方法。
【請求項７１】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは蛍光測定または電子顕微鏡的測定からなる特
許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項７２】発信号発信部分は信号を含んでいる部分
を確認することが出来るポリヌクレオチド連鎖である特
許請求の範囲60に記載の方法。
【請求項７３】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは抗体／抗原複合化反応からなる特許請求の範
囲１に記載の方法。
【請求項７４】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップはビオチンとビオチン結合部分との間の複合化
反応からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項７５】該部分はアビジン、ストレプトアビジン
または抗−ビオチン抗体である特許請求の範囲74に記載
の方法。
【請求項７６】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは高電子密度化合物の検出からなる特許請求の
範囲１に記載の方法。
【請求項７７】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップはサッカライドとレクチンとの間の複合化反応
からなる特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項７８】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは不溶性相上に結合するステップからなる特許
請求の範囲１に記載の方法。
【請求項７９】該信号発信部分による信号を検出する該
ステップは自然発生変性DNA上のクローン挿入物と分子
架橋体との間の複合化、それに続く変性レクチンの該信
号発信体への結合からなる特許請求の範囲１に記載の方
法。
【請求項８０】該変性DNAはT₄ファージから誘導される
特許請求の範囲79に記載の方法。
【請求項８１】該不溶性相はラテックス粒子である特許
請求の範囲78に記載の方法。
【請求項８２】該分析物の該認識可能部分はポリヌクレ
オチド連鎖であり、該分子架橋体上の該認識第１部分は
それに対して安定にアニーリングすることが出来るポリ
ヌクレオチド連鎖であり、該分子架橋体は単一鎖をなす
DNAポリマーであり、そして該信号発信体上の該信号発
信部分による検出の該ステップは非放射性検出に基づく
特許請求の範囲１に記載の方法。
【請求項８３】該分子架橋体は線状ファージから誘導さ
れる特許請求の範囲82に記載の方法。
【請求項８４】該信号発信体は線状ファージから誘導さ
れる特許請求の範囲82に記載の方法。
【請求項８５】Ｉ）密閉部中に１個またはそれ以上の物
入れ手段を受け入れるために区画された入れ物 II）（ｉ）分析物（Ａ）の有する分子的認識可能部分を
認識して結合することの出来る第１部分と、（ii）ポリヌクレオチド連鎖からなる第２部分を有する
分子架橋体（Ｂ）を含む第１物入れ手段および III）（ｉ）該分子架橋体（Ｂ）の該ポリヌクレオチド
第２部分にアニーリングし、それによって安定なポリヌ
クレオチドハイブリッドを形成することが出来るポリヌ
クレオチド部分と、（ii）信号発信部分を有する信号発信体（Ｃ）を含む第２物入れ手段とから
なる分子的認識可能部分を有する分析物（Ａ）の検出の
ために使用されるキット。
【請求項８６】IV）該信号発信手段からの信号を検出す
るために必要とされる構成要素を含む第３物入れ手段を更に設けた特許請求の範囲85のキット。
【請求項８７】該分子架橋体上の該認識第１部分はポリ
ヌクレオチド連鎖からなる特許請求の範囲85に記載のキ
ット。
【請求項８８】該分子架橋体上の該認識第１部分は抗原
からなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項８９】該分子架橋体上の該認識第１部分は抗体
からなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９０】該分子架橋体上の該認識第１部分はサッ
カライドからなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９１】該分子架橋体上の該認識第１部分はレク
チンからなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９２】該分子架橋体上の該認識第１部分はホル
モンからなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９３】該分子架橋体上の該認識第１部分は受容
体からなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９４】該分子架橋体上の該認識第１部分は酵素
阻害物質または酵素補助因子からなる特許請求の範囲85
に記載のキット。
【請求項９５】該分子架橋体上の該認識第１部分は酵素
活性位置または補助因子結合位置からなる特許請求の範
囲85に記載のキット。
【請求項９６】該分子架橋体上のポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分は遺伝子生成物またはその断片に対す
るコードを有する特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９７】該分子架橋体上のポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分は遺伝子生成物またはその断片に対す
るコードを有しない特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９８】該分子架橋体上のポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分はポリdG、ポリdC、ポリdT、ポリdA連
鎖または低度複雑性（繰返し）ポリヌクレオチドからな
る特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項９９】該分子架橋体上のポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分はグアノシン残基を豊富に含む連鎖部
分からなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１００】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は他のポリヌクレオチド連鎖に共
有結合される特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０１】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は抗体に共有結合される特許請求
の範囲85に記載のキット。
【請求項１０２】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は抗原に共有結合される特許請求
の範囲85に記載のキット。
【請求項１０３】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分はサッカライドに共有結合される
特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０４】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分はレクチンに共有結合される特許
請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０５】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分はホルモンに共有結合される特許
請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０６】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は受容体に共有結合される特許請
求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０７】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は酵素阻害物質または酵素補助因
子に共有結合される特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１０８】該分子架橋体中の該ポリヌクレオチド
連鎖からなる第２部分は酵素に共有結合される特許請求
の範囲85に記載のキット。
【請求項１０９】該分子架橋体は環状DNAポリマーであ
る特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１１０】該環状DNAは単一鎖をなす特許請求の
範囲109に記載のキット。
【請求項１１１】該環状DNAポリマーは線状ファージか
ら誘導される特許請求の範囲110に記載のキット。
【請求項１１２】該線状ファージはM13またはそれの変
種である特許請求の範囲111に記載のキット。
【請求項１１３】該M13ファージはグアノシンまたはシ
トシン残基を豊富に含む連鎖部分を担持する特許請求の
範囲112に記載のキット。
【請求項１１４】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド
部分は遺伝子生成物またはその断片に対するコードを有
する特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１１５】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド
部分は遺伝子生成物またはその断片に対するコードを有
しない特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１１６】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド
部分はポリdC、ポリdG、ポリdA、ポリdT連鎖または繰返
し低複雑性ポリヌクレオチドからなる特許請求の範囲85
に記載のキット。
【請求項１１７】該信号発信体上の該ポリヌクレオチド
部分はシトシンまたはグアノシン残基を豊富に含む連鎖
部分からなる特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１１８】該信号発信体は環状DNAポリマーであ
る特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１１９】該DNAは単一鎖をなす特許請求の範囲1
18に記載のキット。
【請求項１２０】該DNAは線状ファージから誘導される
特許請求の範囲119に記載のキット。
【請求項１２１】該ファージはM13またはそれの変種で
ある特許請求の範囲120に記載のキット。
【請求項１２２】該信号発信体上の該信号発信部分は放
射性ラベル付される特許請求の範囲85に記載のキット。
【請求項１２３】該信号発信体上の該信号発信部分は放
射性ラベル付されない特許請求の範囲85に記載のキッ
ト。
【請求項１２４】該信号発信部分は酵素からなる特許請
求の範囲123に記載のキット。
【請求項１２５】該信号発信部分はビオチン部分からな
る特許請求の範囲123に記載のキット。
【請求項１２６】該信号発信部分は螢光物質からなる特
許請求の範囲123に記載のキット。
【請求項１２７】該信号発信部分は高電子密度化合物か
らなる特許請求の範囲123に記載のキット。
【請求項１２８】該信号発信部分は不溶性相からなるか
またはそれと結合している特許請求の範囲123に記載の
キット。
【請求項１２９】該不溶性相はラテックス粒子、樹脂、
またはバクテリアからなる特許請求の範囲123に記載の
キット。
【請求項１３０】該信号発信部分は抗体からなる特許請
求の範囲123に記載のキット。
【請求項１３１】該信号発信部分はサッカライドからな
る特許請求の範囲123に記載のキット。
【請求項１３２】該分析物上の該認識可能な部分はポリ
ヌクレオチド連鎖であり、該分子架橋体上の該認識第１
部分はそれに安定にアニーリングすることの出来るポリ
ヌクレオチド連鎖であり、該分子架橋体は単一鎖をなす
DNAポリマーであり、そして該信号発信体上の該信号発
信部分は非放射性検出にもとづく特許請求の範囲85に記
載のキット。
【請求項１３３】該分子架橋体は線状ファージから誘導
される特許請求の範囲132に記載のキット。
【請求項１３４】該信号発信体は線状ファージから誘導
される特許請求の範囲132に記載のキット。
【請求項１３５】（ｉ）分析物（Ａ）の有する該分子認
識可能部分を認識して結合することの出来る第１部分
と、（ii）夫々ポリヌクレオチド連鎖からなる１またはそれ
以上の第２部分を有する分子架橋体（Ｂ）および、（ｉ）該分子架橋体（Ｂ）の該ポリヌクレオチド第２部
分にアニーリングし、それによって安定なポリヌクレオ
チドハイブリッドを形成することが出来るポリヌクレオ
チド部分と、（ii）１またはそれ以上の信号発信部分を有する１またはそれ以上の夫々の信号発信体（Ｃ）からなる組成物。
【請求項１３６】該分子架橋体（Ｂ）は２以上の第２部
分からなる特許請求の範囲135に記載の組成物。
【請求項１３７】認識第１部分に対するポリヌクレオチ
ド第２部分の数比率が２以上である特許請求の範囲136
に記載の組成物。
【請求項１３８】数比率が５以上である特許請求の範囲
137に記載の組成物。
【請求項１３９】数比率が10以上である特許請求の範囲
138に記載の組成物。
【請求項１４０】分子架橋体（Ｂ）に対する信号発信体
（Ｃ）の数比率が２以上である特許請求の範囲135に記
載の組成物。
【請求項１４１】数比率が５以上である特許請求の範囲
140に記載の組成物。
【請求項１４２】数比率が10以上である特許請求の範囲
141に記載の組成物。
【請求項１４３】１またはそれ以上の信号発信体（Ｃ）
中のポリヌクレオチド部分に対する信号発信体部分の数
比率が２以上である特許請求の範囲135に記載の組成
物。
【請求項１４４】数比率が５以上である特許請求の範囲
143に記載の組成物。
【請求項１４５】数比率が10以上である特許請求の範囲
144に記載の組成物。
【請求項１４６】該分子架橋体（Ｂ）が２以上の第２部
分からなるか、および／あるいは該組成物が２以上の信
号発信体（Ｃ）、および／あるいは２以上の信号発信部
分からなる特許請求の範囲135に記載の組成物。
【請求項１４７】分子架橋体（Ｂ）中の第１部分に対す
る第２部分の数比率が２以上、および／あるいは分子架
橋体（Ｂ）に対する信号発信体（Ｃ）の数比率が２以
上、および／あるいは信号発信体（Ｃ）中のポリヌクレ
オチド部分に対する信号発信部分の数比率が２以上であ
る特許請求の範囲146に記載の組成物。
【請求項１４８】夫々の数比率が独立して５以上である
特許請求の範囲147に記載の組成物。
【請求項１４９】夫々の数比率が独立して10以上である
特許請求の範囲148に記載の組成物。