DK175384B1

DK175384B1 - Forbedret fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer samt reagenskombination og reagenssæt dertil

Info

Publication number: DK175384B1
Application number: DK198801295A
Authority: DK
Inventors: Hans Soederlund; Arja Weckman
Original assignee: Sangtec Molecular Diagnostics
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-10
Publication date: 2004-09-20
Also published as: NL8800594A; FR2613077B1; IT8819722A0; GB2202328B; IE61664B1; DE3807994A1; ATA64388A; NL194922B; DK129588D0; NL194922C; IL85480A0; DD272664A5; US5476769A; AU1193788A; DE3807994C2; LU87153A1; CH677285A5; FI94429B; NO881064L; JPS63243875A

Description

i DK 175384 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hurtig og følsom fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer ved hjælp af en hybridiseringsteknik ved hvilken detektor-pro-berne er modificerede primere som inkorporeres i kopier . 5 af mål-nukleinsyren før hybridiseringsreaktionen, såvel som en reagenskombination og et reagenssæt til brug ved denne fremgangsmåde.

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikker, 10 ved hvilke fanger-proberne er modificerede primere som inkorporeres i kopier af mål-nukleinsyrerne før hybridiseringsreaktionen, samt en reagenskombination og et reagenssæt dertil.

Ved hybridiseringsreaktioner lader man et mærket 15 oligo- eller polynukleotid, dvs. proben, danne basepar (dvs. base-parre sig) med nukleinsyre-målet. Der har været anvendt forskellige hybridiseringsmetoder til detektering af nukleinsyrer.Ved direkte hybridiseringsmetoder er prøven enten i opløsning eller fikseret til en fast bærer.

20 Den nukleinsyre som skal identificeres, påvises ved hjælp af én mærket probe.

I US patentskrift nr. 4.486.539 er der beskrevet en sandwich-hybridiseringsmetode. Ved denne metode bruges der to særskilte prober, af hvilke den ene er en detektor-25 probe som er mærket og anvendes til detekteringen og den anden er en fanger-probe som er immobiliseret til en fast bærer til fraskillelse af mål-nukleinsyren fra reaktionsblandingen.

En fremgangsmåde med hybridisering i opløsning er 30 beskrevet i britisk patentpublikation nr. 2 169 403. Ved denne fremgangsmåde bruges der to forskellige prober som begge er i samme opløsningsfase. Detektorproben mærkes med en detekterbar markør og til fangerproben knyttes der en del med affinitet til en anden komponent. Efter hybridi-35 seringen kan den hybrid, der dannes mellem fangerprøven, mål-nukleinsyren og detektorproben, skilles fra hybridi-seringsopløsningen ved hjælp af en anden del af affinitetsparret.

I DK 175384 B1

I Den enzymkatalyserede polymerisation af DNA, hvor I

nukleotid-sekvensen af en i forvejen eksisterende nuklein- I

syrestreng.,., dvs. skabelonen eller mønsteret (template) I

H kopieres præcist til sin komplementære streng, er vel- I

I 5 kendt i teknikken og er fx beskrevet af Kornberg i "DNA- I

I replication", W.H. Freeman & Co, San Francisco, side 221- I

I 225 og 670-679 (1980) og i Maniatis et al., Molecular I

Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- I

I tory, side 122 (1982). Denne biologiske multiplicering el- I

I lp ler formering bruges ved hybridiseringsbestemmelser ved I

I hvilke den mikroorganisme som skal detekteres, dyrkes og I

I dets DNA følgelig beriges forud for testen, og den er be- I

skrevet fx i Woo, Methods Enzymol. 68, 389 ( 1979) og i US I

I patentskrift nr. 4.358.535. Specifikke DNA-sekvenser kan I

I også styrkes eller forøges indeni levende celler, fx ved I

I hjælp af passende lægemidler som beskrevet af Clewell og . I

I Helinski i J. Bacteriol. 110, 1135 (1972) og i europæisk I

I patentansøgning nr. 55 742. En mere specifik DNA-berigelse I

I er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 175 689, I

I 20 ifølge hvilket målet kobles til et plasmid-replikon og I

indføres i én egnet celle. Endnu en fremgangsmåde er be- I

I skrevet i europæisk patentansøgning nr. 201 184, ifølge I

I hvilken DNA-syntesens primer-afhængighed udnyttes til at I

I fremkalde en reaktion in vitro til forøgelse af mængden I

I 25 af mål-DNA. I europæisk patentansøgning nr. 200 362 er der I

I foreslået en fremgangsmåde til detektering af formerede I

(amplified) gener. I

I Formålet med opfindelsen er at anvise en hurtig I

I og nem gennemførbar fremgangsmåde til detektering af I

I 30 små nukleinsyrekoncentrationer. I

I Dette formål opfyldes med opfindelsen ved an- I

I visning af en fremgangsmåde, ved hvilken enten detek- I

I torproberne eller fangerproberne virker som modifice- I

I rede primere, som inkorporeres i kopierne af mål- I

I 35 nukleinsyren under en mønsterafhængig polymerisati- I

I onsreaktion før gennemførelsen af hybridi seringen, I

I ved hvilken mål-nukleinsyren således forøges. I

I Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen behøves der I

mindst én primer og primerne modificeres altid. Hvis de- I

3 DK 175384 B1 tektorproberne virker som primere i polymeriseringsreaktionen, forsynes primerne med mindst én egnet, detekter-bar markør og mindst ét specifikt sted (site) til hvilket i det mindste én egnet, detekterbar markør er knyttet.

5 Fangerproberne kan imidlertid også bruges som pri mere i polymeriseringsreaktionen, i hvilket tilfælde primerne forsynes med mindst én egnet del af et affinitetspar eller mindst ét sted til hvilket der kan knyttes mindst én egnet del af et affinitetspar.

10 Opfindelsen anviser også en reagenskombination og et reagenssæt, der i pakket form indeholder en mangebehol-derenhed indeholdende den reagenskombination der behøves til gennemførelse af testen.

Ved anvendelse af detektor- eller fangerproberne 15 som primere i en polymeriseringsreaktion, er det muligt at forøge følsomheden af hybridiseringsreaktionen med flere størrelsesordener i sammenligning med fremgangsmåder ved hvilke man måler målet direkte. Desuden tilvejebringer opfindelsen en hensigtsmæssig måde til gennemførelse 20 af hybridiseringsreaktionen i opløsning, således at hybriderne let og hurtigt skilles fra hybridiseringsopløsnin-gen efter hybridiseringsreaktionen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er praktisk til diagnosticering af visse sygdomme som det er meget vanske-25 ligt at diagnosticere ved kendte metoder. Fremgangsmåden er således særlig nyttig til identificering af cytomegalovirus og HI- eller AIDS-virus.

På tegningen viser fig. 1 basesekvensen af de modificerede primere, 30 Pa og Ρ^ såvel som de selektive prober S1 og S2 som bruges i eksemplerne 1, 2 og 3, samt de relative steder eller beliggenheder af de modificerede primere PQ og P^ og de selektive prober og S2 på vedkommende mål-nukleinsyre; de lange linjer A og B viser de to mål-strenge som fort-35 sættes i begge retninger. Pilespidserne på primerne P_ og α Ρ^ viser den retning i hvilken de forlænges ved polyme-riseringsprocessen; og I DK 175384 B1

H fig. 2 viser basesekvensen i de modificerede pri- I

mere P og P, og den selektive probe S som bruges i eksem- I

pel 4, såvel som de relative steder for eller beliggen- heder af de modificerede primere Pa og og den selektive 5 probe S på vedkommende mål-nukleinsyre. Linjen A viser RNA og de dermed identiske DNA-kopier og linjen B viser

de komplementære DNA-kopier. Pilespidserne på primerne P

dl og Ρ^ viser den retning i hvilken de forlænges ved polynie- riseringsprocessen.

I 10

Fremstilling af prøvemateriale

De prober der bruges ved fremgangsmåden er oligo- og polynukleotider. Proberne kan fremstilles syntetisk eller halvsyntetisk, hvilket er den foretrukne måde til 15 fremstilling af prober der også kan virke som primere. Det er også muligt at fremstille proberne med rekombi- nant-teknikker eller ud fra nukleinsyrer som er isoleret direkte fra naturen. En probe kan bindes til en egnet vek- tor. Den kan indeholde vektordele eller kan være fuldstæn- 20 dig fri for vektordele. Faktisk er der en mangfoldighed I af egnede og brugbare primere og prober tilgængelige i han- delen.

I Detektorproberne som modificerede primere 25 Ved en af udførelsesformerne for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er detektorproberne oligonukleotider eller polynukleotider som kan bindes til I mål-nukelinsyren ved baseparring og som kan virke som pri- I mere for et mønsterafhængigt nukleinsyresyntetiserende en- 30 zym. Det er vigtigt at detektorprimerne udstyres med I mindst én egnet, detekterbar markør eller mindst ét specifikt I sted til hvilket mindst én egnet detekterbar markør kan I knyttes.

I Som markører kan der bruges forskellige radioakti- 35 ve isotoper eller radioaktivt mærkede forbindelser. Markør- I stoffet kan også være fluorescerende, luminescerende, lys- I udsendende eller enzymatisk eller immunologisk påviseligt.

DK 175384 B1 5

Som eksempler kan nævnes markører baseret på affiniteten af biotin og avidin eller streptavidin, lanthanid-chela-ter, ferritin og hæm-forbindelser samt immunologisk påviselige haptener såsom AAF og AIF (acetoxyacetylfluorenderiva-5 ter). Identificering ved hjælp af mediatorer, fx proteiner, kan også komme på tale.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ikke afhængig af den anvendte markør. Alle for tiden kendte markørsubstanser egnet til nukleinsyrehybridisering kan frit ud-10 nyttes ved den foreliggende fremgangsmåde. Det er imidlertid afgørende at hvis detektorproberne virker som primere, så må markøren vælges blandt en gruppe markører som ikke forstyrrer primerens funktion.

Markøren må knyttes til detektorprimeren på en så-15 dan måde at nukleinsyre-polymeriseringsenzymet stadig kan genkende det som primer.

Fangerproberne som modificerede primere

Ved den anden udførelsesform for fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen er fangerproberne oligonukleotider eller polynukleotider som kan bindes til mål-nukleinsyrer ved baseparring og som kan virke som primere for et mønsterafhængigt nukleinsyresyntetiserende enzym. Det er afgørende at fangerprimerne forsynes med mindst én egnet del af et affi-25 nitetspar eller mindst et specifikt sted til hvilket der kan knyttes mindst én egnet del af et affinitetspar. Det er også muligt at knytte delen eller delene af affinitetsparret via et mellemled (mediator) til fangerprimeren. De eneste betingelser erf at det er muligt at skille hybriden 30 fra hybridiseringsopløsningen ved hjælp af affinitetsparret og at primerfunktionen ikke beskadiges.

Den pågældende del af affinitetsparret er en komponent som har affinitet til en anden komponent. Eksempler på sådanne affinitetspar er biotin - avidin eller strepta-35 vidin; et tungmetalderivat - en thiogruppe; forskellige homopolynukleotider såsom poly dG - poly dC; poly dA - poly dT; og poly dA - poly U. Der kan også bruges andre kompo- I DK 175384 B1

I nentpar blot forudsat at de har en affinitet som er stærk I

I nok til at muliggøre den specifikke binding af de modifi- I

cerede fangerprimere, der er inkorporeret i kopierne af I

I mål-nukleinsyren, til den faste bærer. Egnede affinitetspar I

I 5 findes blandt ligander og konjugater som bruges ved immu- I

nologiske fremgangsmåder. I

I Pen selektive fanqerprobe I

Η I en af udførelsesformerne for den foreliggende op- I

I 10 findelse, ved hvilken detektorproberne virker som primere, I

I behøves der en selektiv fangerprobe for at muliggøre den I

I selektive fraskillelse af kopierne af mål-nukleinsyren, I

I i hvilke de modificerede primere er blevet inkorporeret.

Det er væsentligt at fangerproberne er tilstrækkeligt ho- I

15 mologe med mål-nukleinsyren til at muliggøre specifik hy-

bridisering deraf med kopierne af mål-nukleinsyren og der- I

med selektiv fraskillelse og detektering af de detektor- I

I primere som er blevet inkorporeret i kopierne af mål-nukle-

insyren. I

I 20

Den selektive detektorprobe I

H Ved den anden udførelsesform for den foreliggende fremgangsmåde, i hvilken fangerproberne virker som modifi- cerede primere, behøves der en selektiv detektorprobe til 25 at muliggøre detektering af kopierne af de mål-nukleinsy- I rer i hvilke de modificerede primere er blevet inkorpore- I ret. Det er afgørende at detektorproben er tilstrækkelig I homolog med mål-nukleinsyren til at hybridisere specifikt I og dermed til at identificere mål-nukleinsyren selektivt.

I 30 Detektorproberne kan forsynes med hvilke som helst egnede I og detekterbare markører, fx dem der er nævnt foran.

I Reagenskombinationer I D§tektorproben_som_modi.f iceret_primer I 3 5

Opfindelsen angår som nævnt også en reagenskombina- I tion som omfatter mindst én modificeret primer forsynet DK 175384 B1 7 med mindst én egnet og detekterbar markør eller mindst ét specifikt sted til hvilket der kan knyttet mindst én ' egnet og detekterbar markør, og mindst én selektiv fanger-probe forsynet med mindst én del af et affinitetspar el-5 ler mindst ét specifikt sted til hvilket mindst én del af et affinitetspar kan knyttes.

3L§222£E£2ben_§9m_modif iceret_primer

Opfindelsen angår endvidere en reagenskombination 10 omfattende mindst én modificeret primer forsynet med mindst én egnet del af et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted til hvilket mindst én egnet del af et affinitetspar kan knyttes, og mindst én selektiv detektorpro-be forsynet med mindst én egnet og detekterbar markør eller ^ mindst ét specifikt sted til hvilket der kan knyttes mindst én egnet og detekterbar markør.

Opfindelsen angår også et praktisk reagenssæt til 20 bestemmelse af nukleinsyren. Sættet indeholder i pakket form en mangebeholderenhed i hvilken én af de ovenfor nævnte reagenskombinationer er kombineret med mindst ét af følgende reagenser eller faciliteter som behøves ved testen, dvs. eventuelt en beholder indeholdende mindst ét 25 mønsterafhængigt polymerisationsmiddel, eventuelt en beholder med de fire deoxynukleosidtrifosfater, eventuelt et egnet middel til polymeriserings- og hybridiseringsproces-sen, eventuelt et passende middel til fraskillelse af kopierne af mål-nukleinsyrerne og eventuelt et egnet middel ^ til bestemmelse eller måling af markøren. De foretrukne midler og reagenser beskrives mere udførligt i den efterfølgende del af beskrivelsen.

Den foretrukne udførelsesform for den foreliggende fremgangsmåde begynder med at man sætter mindst to modifi- 35

I DK 175384 B1 I

I I

I cerede primere, der begge er enten detektorprimere eller I I fangerprimere, til en denatureret prøveopløsning. De modi- I I ficerede primere vil begge renaturere til deres komplemen- I I tære streng i mål-nukleinsyren, dvs. mønsteret eller skabe- I I Ionen (template), og efter tilsætning af det mønsterafhæn- I I gige nukleinsyresyntetiseringsenzym vil primerne blive for- I I længet. Processen skrider effektivt frem in vitro og der I I dannes herved nye nukleinsyrestrenge som kan have en læng- I I de på flere tusinde baser under forudsætning af at betin- I I gelserne er gode. I I Ved anvendelse af overskud af modificerede primere I I kan processen gentages til dannelse af kopier der er kom- I I plementære til de nysyntetiserede strenge, og således er I I identiske kopier af det første mønster. Ved gentagelse af I I denne proces går der en kaskadereaktion i gang, ved hvil- I

ken mål-nukleinsyren formeres eller multipliceres. Proces- I I sen kan gentages så mange gange som helst til dannelse af I I den ønskede detekterings-følsomhed. I tilfælde hvor koncen- I I trationen af mål-nukleinsyre ikke er ekstremt lav, vil én I I multiplikation være tilstrækkelig til at gøre mål-nuklein- I I syren detekterbar. I I Det er også muligt at bruge kun én modi- I

ficeret primer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I I I dette tilfælde er multipliceringen imidlertid ikke så ef- I I fektiv som når man bruger mindst to primere fordi reaktio- I I nen ikke er en reaktion af kaskadetype. I I Både DNA og RNA kan bestemmes ved fremgangsmåden I I ifølge opfindelsen. Hvis mål-nukleinsyren imidlertid er I I et RNA, er det mest hensigtsmæssigt først at kopiere ved- I I kommende RNA til det tilsvarende cDNA ved hjælp af et re- I I vers-transcriptaseenzym, hvorefter processen fortsættes I

som beskrevet ovenfor. I I Efter at de modificerede primere er inkorporeret I I i kopierne af mål-nukleinsyrerne, sættes der en egnet se- I

lektiv probe som genkender mål-sekvensen og dens kopier I I til reaktionsblandingen, og hybridiseringsreaktionen gen- I I nemføres under betingelser der egner sig til vedkommende I

............... '- Ί|| M1IIWIII ^:Μ^··8!·Μ»ΒΙ!ΒΜΒ^Μ·ΙίΒ8!Μ1 DK 175384 B1 9 valgte hybridiseringsproces.

Ved hybridiseringsreaktionen lader man, i afhængighed af valg af modificerede primere, enten en selektiv fangerprobe eller en selektiv detektorprobe hybridisere 5 med kopierne af mål-nukleinsyren, der nu er til stede i mangedoblede mængder i sammenligning med mængden af mål-nukleinsyren i den oprindelige situation.

Hvis den oprindelige prøve indeholdt målsekvensen, vil den tilsatte selektive probe hybridisere til de ny-10 syntetiserede kopier af mål-nukleinsyren. Der dannes en hybrid mellem kopimolekylet, i hvilket den modificerede primer er blevet inkorporeret, og den selektive probe.

De dannede hybrider skilles ifølge den foreliggende opfindelse hensigtsmæssigt fra hybridiseringsopløsningen ved 15 hjælp af den del af affinitetsparret som er tilknyttet, enten på fangerprimeren eller på den selektive fangerprobe. Under fraktioneringen hæfter disse fangerdel-indehol-dende hybrider sig til en fast bærer ved hjælp af den anden del af affinitetsparret, og den mængde selektiv detek-20 torprobe eller detektorprimer, der hæfter sig til bæreren, kan måles ved konventionelle metoder, enten direkte fra bæreren eller efter eluering fra eluatet. Mængden af markør er et mål for mængden af mål-nukleinsyren.

Før fraktioneringen fortyndes opløsningen om nød-25 vendigt for at gøre betingelserne fordelagtige for affinitetsparret. Derefter bringes opløsningen i kontakt med den faste bærer. Den pågældende bærer kan fx være en affi-nitetskromatograferingskolonne, et filter, en plastoverflade eller en glasoverflade. Egnede midler til gennemfø-30 relse af separationen er forskellige typer mikrotiterplader, pejlestoksystemer eller magnetiske partikler, men det er også muligt at gennemføre separationen i reagensglas eller på perler og lignende.

Bærematerialet i affinitetskolonnen kan være natur-35 lige eller syntetiske polymerer, fx cellulose, polyakryl-amid, polystyren, dextran eller agarose. Disse materialer kan også bruges i form af suspensioner i et reagensglas.

I DK 175384 B1

I 10 I

Det er endvidere fordelagtigt at bruge reagensglas hvor I den anden del af affinitetsparret er fikseret til den ind- vendige overflade. Det er en betingelse for det valg- te materiale, at det er muligt at fiksere det til en 5 komponentet med affinitet til den del af affinitetsparret, der er knyttet til fangerprimeren eller den selektive fan- gerprobe.

Det er ikke nødvendigt at binde delen eller delene af affinitetsparret til fangerprimerne ved begyndelsen af 10 polymeriseringen. Det er heller ikke nødvendigt at binde den detekterbaré markør til detektorprimeren før polymeri- seringen. Disse kan også sættes efter polymeriseringspro- cessen til den modificerede primer som er blevet inkorpore- ret i kopierne af mål-nukleinsyren. Når fx den detekter- 15 bare markør er følsom for hybridiseringsbetingelserne, kan I man vente med at tilsætte den til efter hybridiseringen af den selektive fangerprobe med kopierne af mål-nukleinsy- ren.

Hvis detektorproberne virker som modificerede pri- 20 mere,som inkorporeres i kopierne af mål-nukleinsyren, kan I hybriden skilles fra reaktionsblandingen ved hjælp af se- I lektive fangerprober som er blevet immobiliseret på faste I bærere. Ved denne fremgangsmåde, som også er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 237362, opstår det hastig- 25 hedsbegrænsende trin når mål-nukleinsyren og dens kopier, I i hvilke der er inkorporeret detektorprimere, må hybridise- re sig med den selektive fangerprobe som er immobiliseret I på en fast bærer. Hybridisering i opløsning er derfor en I mere foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge 30 opfindelsen end den nævnte. Hvis fremgangsmåden imidlertid I udføres ved hjælp af en immobiliseret fangerprobe, vaskes den på den faste bærer dannede hybrid, og mængden af markø- I ren på bæreren måles ved konventionelle metoder.

I Princippet ved testen forklares nærmere i de føl- 35 gende eksmepler.

11 DK 175384 B1

Eksempel 1

Detektering af cytomegalovirus-DNA ved anvendelse af detektorprober som modificerede primere__ 5 I dette modelforsøg var målet et rekombinant-plas- mid (pBR322/CMV Hindlll L) som rummede et fragment på 12,3 kb af cytomegalovirus-genomet (CMV, AD 169, ATCC VR-538).

De to anvendte detektorprimere (P og P. , fig·. 1) var 20 nukleotider lange og syntetiseret ved standardmetoder på en automatiseret syntetisator. De svarede til to områder på den CMV-specifikke indsætning, der var 111 nukleotider fra hinanden. To selektive fangerprober (S^ of S2» fig. 1) genkendte områder på hver af de to strenge mellem de to detektorprimere. Detektorprimerne P og P. var mærket med 32 a D g 15 Pi deres 5'-ender til en specifik aktivitet på 4 x 10 CPM/pg under anvendelse af den velkendte reaktion med poly- 32 nukleotid-kinase og y- P-ATP (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982).

2q Der sattes biotinylerede nukleotider til 3'-enderne af fangerproberne ved hjælp af bio-11-dUTP {BRL) og terminal transferase (Promega Biotech.) som beskrevet af Riley et al. i DNA, 5(4), side 333-337 (1986). Mål-plasmidet blev gjort linjeformet ved spaltning med restriktionsen-25 zymet EcoRI. Klenow-fragmentet af DNA-polymerase blev købt hos Boehringer-Mannheim og streptavidin-agarose fra BRL.

Ved hjælp af disse reagenser blev følgende forsøg gennemført:

Der sattes fire forskellige reaktionssystemer in-4 6 8 2Q deholdende 0, 10 , 10 og 10 molekyler (svarende til henholdsvis 0, 2 x 10-^8, 2 x 10"18 og 2 x 1θ”^8 mol) af mål-plasmidet. Desuden indeholdt alle fire reaktionssystemer i et samlet rumfang på 50 μΐ: 2 pmol af hver af de to primere, 0,5 mM af hver af de fire deoxynukleosidtrifosfater 35 (dvs. dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 10 mM tris-Cl (pH 7,5), 10 mM MgC^f 50 mM NaCl og 10 mM dithiothreitol. Blandingen opvarmedes til 100°C i 2 minutter og inkuberedes deref- I DK 175384 B1 I 12 ter i 5 minutter ved 37°C hvorpå der tilsattes 1 μΐ (sva- rende til 1 enhed) DNA-polymerase. Blandingen blev derefter på ny inkuberet i 10 minutter ved 37°C. Kogningen efter- fulgt af renaturering af detektorprimerne og en inkubering 5 med tilsat DNA-polymerase ved 37°C udgør et DNA-syntese- kredsløb.

I dette tilfælde gennemførtes kredsløbet enten kun én gang, eller gentoges 5 eller 15 gange. Efter sidste kredsløb blev prøven på ny opvarmet til 100°C hvorefter 10 der tilsattees 10 pmol af den selektive fangerprobe sammen med NaCl (0,9 M), EDTA {20 mM), natriumfosfat (pH 7,5; 20 H mM) og natriumdodecylsulfat (0,1%). Rumfanget blev forøget til 100 μΐ og de anførte koncentrationer er slutkoncentra- tioner. Blandingen blev derefter inkuberet ved 50°C i 1 time.

15 Efter denne hybridiseringsreaktion tilsattes der 200 μΐ

25%s suspension af streptavidin-agarose i 1 M NaCl, 20 mM

natriumfosfat (pH 7,5) og 1 mM EDTA. De biotinylerede mole- kyler fik lov ti at binde sig til streptavidin-agarosen i 15 minutter ved 37°C i en roterende blander. Agarosen 20 opsamledes ved kortvarig centrifugering og den ovenstående væske fjernedes ved bortsugning. Agarosen blev derefter vasket én gang i det pufrede 1 M NaCl og to gange i en op- H løsning indeholdende 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat og 0,2% natriumdodecylsulfat (pH 8) ved 37°C. Radioaktivite- 25 ten af den agarose, til hvilken de dannede hybrider var bundet, blev derefter bestemt i en radioaktivitetstæller.

Indhøstningsproceduren og vaskeproceduren for DNA-hybrider I indeholdende en biotinyleret markør er kendte procedurer som er beskrevet i fx britisk patentpublikation nr.

I 30 2 169 403.

I Resultaterne af forsøget er vist i tabel 1. Det ses at ét kredsløb af DNA-syntese kun bevirker inkorporering af tilstrækkelig megen radioaktivitet til detektering, I hvis der er tilstrækkelig høje målkoncentrationer til ste- 35 de, men at selv den meget lave målmængde er detekterbar I efter 15 kredsløb. Med en høj mængde målmateriale og 15 kredsløb blev mængden af detektorprimer den begrænsende I faktor.

13 DK 175384 B1

Tabel 1 Mængde mål, ^P-aktivitet i opsamlede hybrider a^ mol (CPM over baggrund) 1 5 15 Kredsløb 5 - 0 0 0 0 ' -20 2 x 10 ND ND 650 2 x 10'18 ND 300 11000 2 x 10"16 700 13000 36000 10 a) Gennemsnit af to bestemmelser b) ND - ikke detekterbar (mindre radioaktivitet end to gange den gennemsnitlige baggrundsaktivitet) 15 Eksempel 2

Bestemmelse af cytomegalovirus DNA ved hjælp af fanger- prober som modificerede primere_ I dette eksempel virker fangerproberne som primere.

2Q De anvendte reagenser var de samme som i eksempel 1 med følgende undtagelser: fangerprimerne (P og P, , fig. 1) 32 a o blev ikke mærket med P, men deres 5’-ender blev i stedet modificeret på en sådan måde at de kom til at indeholde en biotinrest. Denne kemiske modificering blev udført ved 25 kendte metoder, beskrevet af Chollet og Kawashima i Nucleic Acids Research 13, 1529-1541 (1985). De to selektive prober (S1 og S2, fig. 1) blev i dette tilfælde mærket i deres 5'-ender så de virkede som detektorprober. Deres 9 specifikke aktivitet var henholdsvis ca. 2 x 10 og 2,5

Q

2Q x 10 cpm/pg.

Reaktionsblandingerne blev samlet som beskrevet i eksempel 1. De biotinylerede fangerprimere tilsattes imidlertid i de tidobbelte mængder, dvs. 20 pmol hver pr. reaktion. Der gennemførtes 1, 5 eller 15 kredsløb som beskre- ,s vet, hvorefter prøverne blev opvarmet til 100°C og der 32 tilsattes 0,5 pmol af hver af de P-mærkede prober S1 og S2. Hybridiseringen udførtes under samme betingelser som

I DK 175384 B1 I

I I

I beskrevet i eksempel 1. I

I Hybriderne blev derefter opsamlet på streptavidin- I

I 32 I

agarose, vasket og talt med hensyn til P-aktivitet som

I i eksempel 1. Resultaterne fremgår af tabel 2. I

I I

I Tabel 2 I

I 32 Ά) m

Mængde mål, P-aktivitet i opsamlede hybrider I

I mol (CPM over baggrund) **)· I

I 1515 Kredsløb I

I io I

I o ooo I

I 2 x 10-20 ND ND 800 I

I 2 x 10"18 ND 400 13000 I

I 2 x 10“16 300 11000 54000 I

I 15 I

I a) Gennemsnit af to bestemmelser I

I b) ND - ikke detekterbar (se eks. 1) I

I Eksempel 3 I

I 20 I

I Detektering af cytomegalovirus-DNA fra kliniske prøver I

I ved hjælp af fangerprober som modificerede primere I

I I dette eksempel påvises anvendeligheden af frem- I

I gangsmåden til undersøgelse af kliniske prøver ved detek- I

I 25 tering af CMV fra urinen fra et spædbarn som vides at lide I

I af infektion med cytomegalovirus. Der indgik urin fra et I

I raskt barn som kontrol. Begge prøver var 10 ml urin, fra I

I hvilket den samlede mængde DNA blev isoleret som beskre- I

I vet af Virtanen et al. i J. Clin. Microbiol. 20 (6), 1083- I

I 20 1088 (1984). DNAerne, opløst i 20 pi H^O, brugtes som mål I

I ved reaktioner som i øvrigt gennemførtes som beskrevet i I

I eksempel 2. Efter 10 kredsløb DNA-syntese blev den mær- I

I kede selektive probe sat til prøven, man lod den hybridi- I

I sere og hybriderne indsamledes. DNA fra patientens urin I

I 35 viste en klart forøget radioaktivitet i hybrider, mens I

I urinen fra det raske barn kun udviste baggrundsradioakti- I

I vitet. De faktiske cpm-værdier var henholdsvis 2300 og 240. I

15 DK 175384 B1

Eksempel 4

Detektering af Semliki Forest virus-RNA ved anvendelse af fangerprober som modificerede primere___ 5 Eksempel 4 tjener til at vise at den beskrevne frem gangsmåde også kan bruges til detektering af RNA. Den anvendte model var RNA fra Semliki Forest virus (SFV).

De anvendte reagenser var to 5'-biotinylerede fan- gerprimere (fig. 2; fremstillet som beskrevet i eksempel 32 1Q 2), en enkelt 5'- P-mærket selektiv detektorprobe (fremstillet som beskrevet i eksempel 1), revers-transcriptase (Promega Biotech) og DNA-polymerase, Klenow-fragmentet (Boehringer Mannheim).

Første trin i detekteringen af SFV-RNA var at syn-^5 tetisere en cDNA-kopi. Den 20 μΐ store reaktionsblanding indeholdt 10 mM tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgC^» 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM af hver af de fire de-oxynukleosid-trifosfater, 0,5 pg t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pmol fangerprimer P og 100 enheder revers-transcriptase.

2q Denne blanding inkuberedes ved 37°C i 15 minutter. Derpå blev blandingen opvarmet til 100°C i 5 minutter og afkølet til omgivelsernes temperatur. Derpå tilsattes der 50 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgC^, .10 mM dithiothreitol, 10 pmol af 2jj fanger-primeren og 0,5 mM af hver af de fire deoxynu- kleosidtrifosfater. Temperaturen hævedes til 37°C og efter 5 minutter tilsattes der 1 U DNA-polymerase. Efter yderligere 10 minutters inkubering blev reaktionsblandingen inkuberet ved 100°C i 5 minutter, blandingen afkøledes til 37°C og der gennemførtes 5 kredsløb DNA-syntese. Efter et slutteligt denatureringstrin tilsattes der 0,1 pmol (1,2 x 10® cpm) af den selektive detektorprobe i 80 μΐ 1M NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM natriumfosfat (pH 7,5) og 0,1% natrium-dodecylsulfat. Opløsningen inkuberedes derpå i 2 timer ved 25 55°C, hvorefter hybriderne opsamledes og vaskedes som be skrevet i eksempel 1.

I DK 175384 B1 I

I 16 I

I Som negativ kontrol for reaktionerne fik en iden- I

I tisk prøve den samme behandling, bortset fra at der ikke I

I blev tilsat noget revers-transcriptase. Den prøve i hvil- I

ken RNA var blevt omdannet til cDNA med revers-transcrip- I

I 32 I

5 tase gav 420 cpm P-aktivitet i de fangede hybrider mens

I den negative kontrol gav 50 cpm. I

I Eksempel 5 I

I 1q Sammenligning af forskellige måder til detektering af mul- I

I tipliceret DNA__ I

I I dette eksempel blev tre forskellige måder til de- I

I tektering af multipliceret DNA sammenlignet. Reagenserne I

I og multiplikationsprocessen var som beskrevet i eksempler- I

^ ne 1 og 2, med den forskel at den selektive fangning af I

I detektorprøverne var M13 kloner som genkendte ca. 100 nu- I

I kleotider blandt primerne. I

I M13-klonerne frembragtes ved subkloning af et I

I Haelll restriktionsfragment af rekombinant-plasmidet I

I 20 pBR322/CMV Hindlll L i fag-vektoren M13mp10 ved standard- I

I teknikker. De M13-kloner, der skulle tilsættes som selek- I

I tive fangerprober, blev modificeret ved hjælp af "Photo- I

I probe" biotin (Vector Laboratories). De M13-kloner der I

I skulle bruges som selektive detektorprober blev mærket med I

I 32 I

25 P-dCTP ved hjælp af DNA-polymerase I (Klenow-fragmen- I

I tet) og primerudvidelse (Hu og Messing, Gene 17 side 271- I

I 277, 1982) til en specifik aktivitet på 2 x 10® cpm/pg. I

C _"10 V I

Multipliceringen af 3 x 10 molekyler (0,5 x 10 I

I mol) af det linjedannede pBR322/CMV Hindlll L plasmid blev I

I udført med 10 kredsløb. Til detektering ved de undersøgte I

I 32 I

måder 1 og 2 anvendtes der 2 pmol af hver af de P-mærke- I

I de detektorprimere Pfl og P^, og multipliceringsprocessen I

I udførtes som beskrevet i eksempel 1. Til detektering på I

I den tredje af de undersøgte måder anvendtes der 25 pmol af I

35 de biotionylerede fangerprimere i multipliceringsprocedu- I

I ren, og reaktionen gennemførtes som beskrevet i eksem- I

I pel 2. I

^«»1MI ->-_:_2££aS9!^ - · ·ν -· - - ' r. ^f^i-'jiMi!iM,UJBMW»>>'^»MtaBi DK 175384 B1 17

Detekteringsmåde 1 - Selektiv fangerprobe anvendt til opsamling af hybrider dannet i opløsning med kopierne af mål-Dukleinsyren______________________________________________

Ved denne detekteringsmetode anvendtes biotinylere-de selektive M13-fangerprober til opsamling af de multiplicerede DNA-fragmenter. Efter det sidste multiplice-ringskredsløb blev prøveblandingen opvarmet til 100°C og 9 der tilsattes 2 x 10 molekyler af hver af de biotmylere-de selektive fangerprober sammen med 0,6 M NaCl, 5 mM EDTA, ^ 20 mM natriumfosfat og 0,1% SDS. Rumfanget forøgedes til 100 pi og det er slutkoncentrationerne der er angivet.

Blandingen inkuberedes ved 65°C. i 2 timer. De dannede hybrider opsamledes på streptavidin-agarose som beskrevet i eksempel 1, dog med den forskel at der blev foretaget 15 o

to yderligere vaskninger på 1 minut ved 50 C med 15 mM

NaCl, 1,5 mM natriumcitrat og 0,2% SDS. De opsamlede hybriders radioaktivitet blev målt.

Detekteringsmåde 2 - Selektiv fangerprobe immobiliseret 20 f idiser ing_rned_kopierne_af _mål-nukleinsyren_____ I dette tilfælde blev der brugt immobiliserede selektive M13-prober til fangning af det multiplicerede DNA.

Efter sidste multipliceringskredsløb blev prøverne opvarme met til 100°C. Der tilsattes 0,6M NaCl, 60 mM natriumci-trat, 0,02% "Ficoll’ , 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% okseserumalbumin og 0,2 mg/ml denatureret sildesperma-DNA for at give de angivne koncentrationer i et slutrumfang på 100 pi. Til hver prøve blev der ført en nitrocellulose-20 filterskive til hvilken 5 x 1010 molekyler af hver af de selektive prober var immobiliseret ved en tidligere beskrevet fremgangsmåde (US patentskrift nr. 4.486.539). Blandingen inkuberedes med filtre ved 65°C i 2 timer eller 18 timer. Efter hybridiseringsreaktionen blev filtrene vasket to gange i 20 minutter ved 50°C med 15 mM NaCl, 1 mM natriumcitrat og 0,2% SDS og den til filtrene bundne radioaktivitet blev målt.

I DK 175384 B1 I

I 18 i

I Detekteringsmåde 3 - Selektiv detektorprobe anvendt I

£il_detektering__________________ ____ __ ____ I

I 32 I

I dette tilfælde blev der brugt P-mærkede selek- I

I tive M13-detektorprober til detektering af det multipli- I

5 I

cerede DNA, og hybriderne blev opsamlet ved hjælp af fan- I gerprimere som var biotinyleret i 5'-enderne som beskre- vet i eksempel 2. De multiplicerede prøver blev opvarmet I til 100°C og der tilsattes 2 x I08 molekyler (2 x 10^ cmp)

H 32 I

H af hver af de P-mærkede selektive prober sammen med sal- 10 te som beskrevet i forbindelse med detekteringsmåde 1. Hy- bridisering og opsamling af de dannede hybrider skete som I i detekteringsmåde 1. ·

Sammenligning af de på de tre detekteringsmåder op- nåede resultater er vist i tabel 3.

^ Første og tredje måde har fordelen af en større hy- bridiseringshastighed i opløsning end filterhybridiserin- 32 gen i detekteringsmåde 2. Den højeste P-aktivitet opnås ved detekteringsmetode 3 på grund af,at den sekektive de- j 32 tektorprobe indeholder multible P-atomer pr. molekyle.

I Tabel 3 ^ “ 32 Måde Primere Selektiv Hybridise- P-aktivitet M13-probe ringstid, i hybrider, timer cmp a} I 25 ^ 1 P-mærket biotinyleret 2 870 I detektor fangning I 32 2 P-mærket immobiliseret 2 43 I detektor fangning 18 920 I 32 3 biotinyleret P-mærket 2 7800 I fangning detektor I a) Gennemsnit af tre bestemmelser (cpm over baggrund) I 35 DK 175384 Β1 —ίΒ^—π« · Ψ^Π\ ____^|^___·_ 19

Eksempel 6

Multiplicering af cytomegalovirus-DNA ved hjælp af bio-tinylerede detektorprimere og indirekte detektering med streptavidin-peberrodsperoxidase_ 5 I dette eksempel blev der foretaget multiplice ring af CMV-specifikt plasmid (pBR322/CMV Hindlll L) ved hjælp af de biotinylerede primere Pa og som er beskrevet i eksempel 2 som detektorprimere. De i eksempel 5 beskrevne M13-kloner modificeret med sulfongrup-10 per blev brugt som selektive fangerprober. De dannede hybrider opsamledes i mikrotitreringsrum (wells) overtrukket med antistoffer som genkender sulfonmodi-ficeret DNA. Den sluttelige detektering af de dannede hybrider blev foretaget med et streptavidin-peberrods-15 peroxidasekonjugat som opdager biotindelene af primerne.

Ml3-klonerne blev modificeret ved en sulfoneringsreaktion under anvendelse af reagenser fra og den fremgangsmåde der er anbefalet af Orgenics Ltd (Yavne,

Israel). Polystyren-mikrotitreringrum (Nunc, Danmark) 20 blev overtrukket med 10 pg/ml IgG renset ud fra et mo-noklonalt antistof mod sulfonmodificeret DNA (Orgenics Ltd) i .10 mM natriumkarbonatpuffer (pH 9,6) natten over ved 4°C.

5

En reaktionsblanding indeholdende 3 x 10 mole-25 kyler af de linieformede pBR322/CMV Hindlll L plasmi-der eller kontroller uden plasmid og 25 pmol af hver af de biotinylerede primere P& og blev behandlet med 10 formeringskredsløb under de i eksempel 1 beskrevne betingelser. Prøverne blev opvarmet til 100°C,hvorefter g 30 der tilsattes 2 x 10 molekyler af hver af de sulfonerede selektive fangerprober sammen med reagenser som angivet i forbindelse med detekteringsmåde 1 i eksempel 5.

Blandingen blev inkuberet ved 65°C i 2 timer, 35 fortyndet med 100 μΐ 0,2%s "Tween’® 20 og overført til de overtrukne mikrotitreringsrum (wells). Man lod hybriderne binde sig til rummene i 2 timer ved 37°C. Re-

I DK 175384 B1 I

I 20 I

I aktionsblandingen blev kasseret og rummene blev vasket I

I tre gange med 0,1% "Tween1® 20 i 0,15 M natriumklorid, I

I 20 mM natriumfosfat (pH 7,5; PBS). Der tilsattes 200 μΐ I

I af et streptavidin-peberrodsperoxidase-konjugat (Arners- I

I 5 ham, UK) fortyndet 1:2000 i en opløsning af 1% okse- I

I serumalbumin og 0,1% "Tween1® 20 i PBS, og der inkube- I

I redes i 45 minutter ved 37°C. Efter fire vaskninger som I

I beskrevet ovenfor tilsattes der 200 μΐ af en substrat- I

I opløsning bestående af 0,46 mg/ml 0-fenylendiamin og I

I 10 0,01% H2°2 ^ 0,1 M natriumacetatpuffer (pH 5,0). Efter I

I 15 minutter ved 22°C blev reaktionen standset ved til- I

sætning af 50 μΐ 2N H2SO4, og det farvede produkts ab- I

I sorption blev målt med et spektrofotometer ved 492 nm. I

Opsamlings- og detekteringsprocesserne er tidligere be- I

I 15 skrevet af Syvånen et al. (Nucleic Acids Res., 14, I

I 5037-5048, 1986). I

I Resultaterne af forsøget er vist i tabel 4. Der I

c _ -i o I

blev tydeligt detekteret 3x10 molekyler (0,5 x 10 I

I mol) af målplasmidet efter 10 multiplicerings-kredsløb. I

I 20 I

I Tabel 4 I

I Mængde mål, mol Absorption ved 492 nm a) I

I 0,5 x 10~18 0,348 I

I 25 0 0,120 I

I a) Gennemsnit af tre bestemmelser. I

I 35 30

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer ved hybridisering, kendetegnet ved, at man i den forbindelse anvender modificerede primere 5 enten som (a) fangerprober eller (b) detektorprober, der inkorporeres i kopier af mål-nukleinsyren under en mønsterafhængig polymeriseringsreaktion før gennemførelse af hybri di seringen med enten (a) mindst én detektorprobe eller (b) mindst én fangerprobe.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k ende- tegnet ved, at man (a) forsyner mindst en primer for mål-nukleinsyren med mindst én del af et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én del af affini- 15 tetsparret kan knyttes, (b) lader den eller de som fangerprobe eller fangerprober virkende primere reagere med den enkelt-strengede mål-nukleinsyre under betingelser, der egner sig til en mønsterafhængig polymeriseringsreakti- 20 on, (c) lader de enkeltstrengede kopier af den mål-nukleinsyre, hvori den som fangerprobe virkende primer er blevet inkorporeret, hybridisere med en detektorprobe med evne til selektivt at hybridisere sig 25 med mål-nukleinsyren, (d) fraskiller de kopier af mål-nukleinsyren, i hvilket den som fangerprobe virkende primer er blevet inkorporeret, ved hjælp af den anden del af affinitetsparret , og 30 (e) detekterer tilstedeværelse af de selektive detektorprober, som har hybridiseret sig med kopier af mål-nukleinsyren.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til bestemmelse af I DK 175384 B1 I I 22 I I nukleinsyrer ved hybridisering ved, at man som detek- I I torprobeme anvender modificerede primere, der inkor- I I poreres i kopierne af mål-nukleinsyrerne, kende- I I tegnet ved, at man først hybridiserer kopierne I I 5 af mål-nukleinsyrerne, i hvilke de modificerede pri- I I mere er inkorporeret med mindst én selektiv fan- I I gerprobe, den dannede hybrid fraskilles ved hjælp af I I fangerproben og derefter detekteres den foreliggende I I hybrid. I I 10

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3,kendeteg- I I net ved, at man I I (a) forsyner mindst én primer for mål-nukleinsyren I I med mindst én detekterbar markør eller mindst ét spe- I I cifikt sted, til hvilket mindst én detekterbar markør I I 15 kan knyttes, I I (b) lader den eller de som detektorprobe eller detek- ·. I I torprober virkende primere reagere med den enkelt- I I strengede mål-nukleinsyre under betingelser, der eg- I I ner sig til en mønsterafhængig polymeriseringsreakti- I I 20 on, I I (c) lader de enkeltstrengede kopier af mål- I I nukleinsyren, i hvilke de som detektorprober virkende I I primere er blevet inkorporeret, hybridisere med en I I fangerprobe med evne til selektivt at hybridisere I I 25 mål-nukleinsyren, I I (d) fraskiller kopier af den mål-nukleinsyre, i hvil- I ken de som detektorprober virkende primere er blevet I I inkorporerede, ved hjælp af den selektive fangerpro- I I be, og I I 30 (e) detekterer tilstedeværelse af kopierne af mål- I I nukleinsyrerne. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, k e n d e- I I tegnet ved, at den selektive fangerprobe forsy- I DK 175384 B1 23 nes med mindst én del af et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én del af et affinitetspar kan knyttes.

6. Reaktionskombination til bestemmelse af nukle-5 insyrer ifølge et af kravene 1, 3, 4 eller 5, kendetegnet ved, at det indeholder (a) mindst en modificeret primer for en mål-nukleinsyre forsynet med mindst én detekterbar markør eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én 10 detekterbar markør kan knyttes, og (b) mindst en fangerprobe med evne til selektiv hy-bridisering med mål-nukleinsyren, forsynet med mindst én del af et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én del af et affinitetspar 15 kan knyttes.

7. Reagenskombination til bestemmelse af nukleinsyrer ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den har (a) mindst én modificeret primer for mål-nukleinsyren, 20 forsynet med mindst én del af et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én del af et affinitetspar kan knyttes, og (b) mindst en detektorprobe med evne til selektiv hybrid! sering med mål-nukleinsyren og mindst én detek- 25 terbar markør eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én detekterbar markør kan knyttes.

8. Reagenssæt til bestemmelse af nukleinsyrer ifølge et af kravene 1, 3, 4 eller 5, kende -tegnet ved, at det indeholder: 30 (a) mindst en modificeret primer for en mål-nukleinsyre forsynet med mindst én detekterbar markør eller mindst ét specifikt sted, til hvilket mindst én detekterbar markør kan knyttes, og I DK 175384 B1 I I 24 I I (b) mindst en fangerprobe med evne til selektiv hy- I I bridisering med mål-nukleinsyren, og mindst én del af I I et affinitetspar eller mindst ét specifikt sted, til I I hvilket mindst én del af et affinitetspar kan knyt- I I 5 tes, I I (c) eventuelt en beholder indeholdende mindst ét rea- I I gens til mønsterafhængig polymerisering, I I (d) eventuelt en beholder med de fire deoxynukleo- I I sidtrifosfater, I I 10 (e) eventuelt faciliteter til gennemførelse af poly- I I meriserings- og hybridiseringsprocessen, I I (f) eventuelt faciliteter til fraskillelse af kopier I I af mål-nukleinsyren, og I I (g) eventuelt faciliteter til bestemmelse af markø- I I 15 ren. I

9. Reagenssæt til bestemmelse af nukleinsyrer I I ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at I I det i pakket form indeholder en mangebeholderenhed I I med: I I 20 (a) mindst en modificeret primer for mål- I I nukleinsyren, forsynet med mindst én del af et affi- I I nitetspar eller mindst ét specifikt sted, til hvilket I I mindst én del af et affinitetspar kan knyttes, I I (b) mindst en detektorprobe med evne til selektivt at I I 25 hybridisere med mål-nukleinsyren, og mindst én detek- I terbar markør eller mindst ét specifikt sted, til I I hvilket mindst én detekterbar markør kan knyttes, I I (c) eventuelt en beholder indeholdende mindst ét rea- I I gens til mønsterafhængig polymerisation, I I 30 (d) eventuelt en beholder med de fire nukleosidtri- I I fosfater, I I (e) eventuelt faciliteter til gennemførelse af poly- I I meriserings- og hybridiseringsprocesser, I DK 175384 B1 I (f) eventuelt faciliteter til fraskillelse af kopier- I ne af mål-nukleinsyren, og I (g) eventuelt faciliteter til bestemmelse af markøen. I