NO172909B - Fremgangsmaate til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikk og reagenskombinasjon til utfoerelse av fremgangmaaten - Google Patents

Fremgangsmaate til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikk og reagenskombinasjon til utfoerelse av fremgangmaaten Download PDF

Info

Publication number
NO172909B
NO172909B NO881064A NO881064A NO172909B NO 172909 B NO172909 B NO 172909B NO 881064 A NO881064 A NO 881064A NO 881064 A NO881064 A NO 881064A NO 172909 B NO172909 B NO 172909B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
detection
primers
copies
Prior art date
Application number
NO881064A
Other languages
English (en)
Other versions
NO881064L (no
NO881064D0 (no
NO172909C (no
Inventor
Hans Soederlund
Arja Weckman
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of NO881064D0 publication Critical patent/NO881064D0/no
Publication of NO881064L publication Critical patent/NO881064L/no
Publication of NO172909B publication Critical patent/NO172909B/no
Publication of NO172909C publication Critical patent/NO172909C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Description

Oppfinnelsen angår en hurtig og følsom fremgangsmåte til bestemmelse av nukleinsyrer ved hjelp av hybridiseringsteknikker, hvor påvisningsprobene er modifiserte primere som blir innlemmet i kopier av målnukleinsyren før hybridiseringsreaksjonen samt en reagenskombinasjon med egnet beholder og organer til bruk ved fremgangsmåten.
Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikker hvor oppfangelsesprobene er modifiserte primere som er blitt innlemmet i kopier av målnukleinsyrene før hybridiseringsreaksjonen samt en reagenskombinasjon med egnet beholder og organer til bruk ved fremgangsmåten.
I hybridiseringsreaksjoner blir et merket oligo- eller poly-nukleotid, dvs. proben, tillatt å basepare med nukleinsyre-målet. Forskjellige hybridiseringsmetoder er blitt benyttet til påvisning av nukleinsyrer. I direkte hybridiserings-metoder er prøven enten i oppløsning eller festet til en fåst bærer. Nukleinsyren som skal identifiseres, påvises ved bruk av én merket probe.
I US-PS 4 486 539 er det beskrevet en sandwich-hybridiserings-metode. I denne metode blir to separate prober benyttet, den ene er en påvisningsprobe som er merket og som brukes til påvisning, og den andre er en oppfangelsesprobe immobilisert på en fast bærer for separering av målnukleinsyren fra reaksjonsblandingen.
Fremgangsmåten med hybridisering i oppløsning er beskrevet i GB-PS 2 169 403. To forskjellige prober som begge foreligger i den samme oppløsningsfase, benyttes i denne fremgangsmåte. Påvisningsproben er merket med en påviselig merkelapp, og til oppfangelsesproben er der festet en molekyldel som har affinitet for en annen komponent. Etter hybridiseringen kan det hybrid som dannes mellom oppfangelsesproben, målnukleinsyren og påvisningsproben, separeres 'fra hybridiseringsoppløsningen ved hjelp av den annen molekyldel av affinitetsparet.
Den enzymkatalyserte polymerisasjon av DNA hvor nukleotid-sekvensen av en tidligere eksisterende nukleinsyretråd, dvs. malen eller templaten, blir nøyaktig kopiert inn i dens komplementærtråd, er velkjent i faget og er blitt beskrevet f.eks. i Kornberg, DNA replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 221-225 og 670-679, 1980 og Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 122, 1982. Denne biologiske multiplikasjon benyttes i hybridiseringsanalyser hvor mikroben som skal påvises, dyrkes og deretter DNA-anrikes før testen, og er beskrevet f.eks. i Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 og i US-PS 4 358 535. Spesielle DNA-sekvenser kan også amplifiseres inne i levende celler, f.eks. ved bruk av egnede medikamenter som beskrevet av Clewell og Helinski i J. Bacteriol. 110, p. 1135, 1972 og i EP patentsøknad nr. 55 742. En mer spesiell DNA-anriking er beskrevet i EP patentsøknad nr. 175 689, hvor målet kobles til et plasmidreplikon og innføres i en egnet celle. Nok en fremgangsmåte er beskrevet i EP patentsøknad nr. 201 184, hvor primer-avhengigheten av DNA-syntese benyttes til å danne en in vitro-reaksjon for amplifikasjon av mål-DNA. I EP patentsøknad nr. 2 00 3 62 er en fremgangsmåte til påvisning av amplifiserte gener foreslått.
Ved bruk av påvisnings- eller oppfangelsesprobene som primere
i en polymerisasjonsreaksjon er det mulig å øke følsomheten av hybridiseringsreaksjonen med flere størrelsesordener sammenlignet med fremgangsmåter som måler målet direkte.
Det er derfor hensikten med oppfinnelsen å tilveiebringe en hurtig og følsom fremgangsmåte for bestemmelse av nukleinsyrer hvor påvisnings- og oppfangelsesprobene er modifiserte primere som er innlemmet i nukleinsyrene før hybridiseringen.
Denne hensikt oppnås ved en fremgangmåte og reaksjonskombinasjon kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.
I hybridiseringsmetoden ifølge oppfinnelsen tjener enten påvis-r.ingsprobene eller oppf angelsesprobene som modifiserte primere som er innlemmet i kopiene av målnukleinsyren i en templateavhengig polymerisasjonsprosess før hybridiseringsreaksjonen.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er minst én primer nødvendig og primerne er alltid modifiserte. Dersom påvisningsprobene tjener som primere i polymerisasjonsreaksjonen, er primerne forsynt med minst én egnet, påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet, påviselig merkelapp kan festes.
Alternativt kan oppfangelsesprobene benyttes som primere i polymerisasjonsreaksjonen, i hvilket tilfelle primerne er forsynt med minst én egnet molekyldel av et affinitetspar eller minst ett sete, til hvilket minst én egnet molekyldel av et affinitetspar kan festes.
Oppfinnelsen angir også en reagenskombinasjon og en multibeholder-enhet omfattende reagenskombinasjonen som er nødvendig for utførelse av testen.
Videre skaffer oppfinnelsen en bekvem fremgangsmåte til utførelse av hybridiseringsreaksjonen i oppløsning slik at hybridene lett og hurtig separeres fra hybridiseringsoppløs-ningen etter hybridiseringsreaksjonen.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er passende til diagnosti-sering av visse sykdommer som er meget vanskelige å diagnosti-sere med vanlige metoder. Således er fremgangsmåten særlig nyttig for identifisering av cytomegalovirus og HI- eller AIDS-virus.
Fig. 1 viser basesekvensen av de modifiserte primere, Pa og P^, såvel som de selektive prober, S\ og S2, benyttet i eksempel 1, 2 og 3, samt de relative seter for de modifiserteprimere Pa og Ptø og de selektive prober S^ og S2 og den aktuelle målnukleinsyre. De lange linjer A og B indikerer de to måltråder som fortsetter i begge retninger. Pilhodene på primerne Pa og Pj-, angir den retning som de forlenges i ved polymerisasjonsprosessen.
Fig. 2 viser basesekvensen for de modifiserte primere Pa og Pj-, og den-'selektive probe S som benyttes i eksempel 4, samt de relative seter for de modifiserte primere Pa og P^ og den selektive probe S på den aktuelle målnukleinsyre. Linje A angir RNA og dets identiske DNA-kopier, og linje B viser de komplementære DNA-kopier. Pilhodene på primerne Pa og Pj-, angir retningen som de forlenges i i polymerisasjonsprosessen.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Preparering av prøvemateriell
Probene som benyttes i fremgangsmåten er oligo- eller polynuk-leotider. Probene kan fremstilles syntetisk eller halv-syntetisk, hvilket er den foretrukne fremgangsmåte for frem-stilling av prober, som også vil tjene som primere. Det er også fullt mulig å fremstille probene ved rekombinantteknikker eller fra nukleinsyrer isolert direkte fra naturen. En probe kan være bundet til en egnet vektor. Den kan inneholde vektordeler eller være fullstendig fri for vektordeler. I virkeligheten er en rekke egnede primere og prober som kan benyttes, tilgjengelige i handelen.
påvisningsprober som modifiserte primere
I en av fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen er påvisningsprobene oligonukleotider eller polynukleotider som kan være bundet til målnukleinsyren ved baseparing, og som kan tjene som primere for et malavhengig nukleins.yre-syntetiserende enzym. Det er helt påkrevet at påvisningsprimerne er forsynt med minst én egnet, påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet, påviselig merkelapp kan festes.
Forskjellige radioaktive isotoper eller radioaktivt merkede forbindelser kan benyttes som merkelapper. Merkelappstoffet kan også være fluorescerende, luminescerende, lysemitterende, enzymatisk eller immunologisk påviselig etc. Merkelapper basert på affiniteten av biotin og avidin eller streptavidin, lantanideehelater, ferritin og hemeforbindelser og immunologisk påviselige haptener såsom AAF og AIF (acetoksyacetylfluoren-derivater) kan nevnes som eksempler. Identifikasjon ved hjelp av mellomprodukter, f.eks. proteiner, er også mulig.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ikke avhengig av den merkelapp som benyttes. Alle for tiden kjente merkelappstoffer egnet til nukleinsyrehybridisering kan fritt anvendes på fremgangsmåten. Det er imidlertid helt nødvendig, hvis påvisningsprobene tjener som primere, at merkelappen velges fra en gruppe merkelapper som ikke vil virke forstyrrende inn på primerens funksjon. Merkelappen må festes på påvisningsprimeren på en slik måte at det nukleinsyre-polymeriserende enzym fortsatt kan gjenkjenne den som en primer.
Oppfangelsesprober som modifiserte primere
I den annen fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen er oppfangelsesprobene oligonukleotider eller polynukleotider som kan være bundet til målnukleotidsyren ved baseparing, og som kan tjene som primere for et malavhengig nukleinsyre-syntetiserende enzym. Det er helt påkrevet at oppfangelsesprimerne er forsynt med minst én egnet molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet molekyldel av et affinitetspar kan festes. Det er også mulig å feste molekyldelen eller -delene av affinitetsparet gjennom et mellomprodukt (mediator) til oppfangelsesprimeren. De eneste betingelser er at det er mulig å separere hybridet fra hybridiserings-oppløsningen ved hjelp av affinitetsparet og at primer-funksjonen ikke skades.
Molekyldelen av affinitetsparet er en komponent som har affinitet for en annen komponent. For eksempel biotin - avidin eller streptavidin, et tungmetallderivat - en tiogruppe, forskjellige homopolynukleotider såsom poly dG - poly dC, poly dA - poly dT, og poly dA - poly U, er slike affinitetspar, men også andre komponentpar kan benyttes, forutsett at de har sterk nok affinitet til å tillate den spesifikke binding av de modifiserte oppfangelsesprimere som er blitt innlemmet i kopiene av målnukleinsyren på den faste bærer. Slike affinitetspar finnes blant ligander og konjugater som benyttes i immunologiske metoder.
Den selektive oppfangelsesprobe
I en av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen hvor påvisningsprobene tjener som primere, er en selektiv oppfangelsesprobe nødvendig for å tillate den selektive separasjon av kopiene av målnukleinsyren i hvilken de modifiserte primere er blitt innlemmet. Det er helt nødvendig at oppfangelsesprobene er tilstrekkelig homologe med målnukleinsyren til å tillate deres spesifikke hybridisering med kopiene av målnukleinsyren og derved selektiv separasjon og påvisning av påvisningsprimerne som er blitt innlemmet i kopiene av målnukleinsyren.
Den selektive påvisningprobe
I den annen fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hvor oppfangelsesprobene tjener som modifiserte primere, er det nødvendig med en selektiv påvisningsprobe for å tillate påvisningen av kopiene av målnukleinsyrene i hvilke de modifiserte primere er blitt innlemmet. Det er helt påkrevet at påvisningsproben er tilstrekkelig homolog med målnukleinsyren til å hybridisere spesifikt og derved å identifisere målnukleinsyren selektivt. Påvisningsprobene kan forsynes med hvilke som helst egnede påviselige merkelapper, f.eks. med dem som er angitt ovenfor.
Reagenskombinasjoner
Påvisningsproben som en modifisert primer
Den foreliggende oppfinnelse angår en reagenskombinasjon som omfatter minst én modifisert primer, forsynt med minst én egnet, påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet, påviselig merkelapp kan festes og minst én selektiv oppfangelsesprobe forsynt med minst én molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én molekyldel av et affinitetspar kan festes.
Oppfangelsesproben som en modifisert primer
Den foreliggende oppfinnelse angår også en reagenskombinasjon som omfatter minst én modifisert primer forsynt med minst én egnet molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet molekyldel av et affinitetspar kan festes og minst én selektiv påvisningsprobe forsynt med minst én egnet, påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én egnet, påviselig merkelapp kan festes. Denne reaksjonskombinasjon ifølge oppfinnelsen omfatter også en multibeholder-enhet i hvilken en av de ovenfor angitte reagenskombinasjoner er kombinert med minst én av de følgende reaktanter eller organer som er nødvendige i testen, dvs. en beholder som omfatter minst ett templateavhengig polymerisa-sjonsmiddel, en beholder med de fire deoksynukleosidtrifosfater, et egnet crgan for polymerisasjons- og hybridiseringsprosessen, et. egnet organ for separasjonen av kopier av målnukleinsyrene og et egnet organ til bestemmelse av merkelappen. De foretrukne organer og reagenser er beskrevet i nærmere detalj i den etterfølgende del av beskrivelsen.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen
Den foretrukne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen starter med tilsetning av minst to modifiserte primere, som begge er enten påvisnings- eller oppfangelsesprimere, til en denaturert prøveoppløsning. De modifiserte primere vil hver føye seg til sin komplementærtråd av målnukleinsyren, dvs. templaten, og ved tilsetning av et templateavhengig nukleinsyre-syntetiserende enzym blir primerne forlenget. Prosessen fortsetter effektivt
in vitro idet der dannes nye nukleinsyretråder som kan være flere tusen baser lange, forutsatt at betingelsene er egnede.
Ved bruk av modifiserte primere kan fremgangsmåten gjentas for dannelse av komplementære kopier til de nylig syntetiserte tråder som således er identiske kopier av den første template. Ved gjentagelse av denne prosess blir en kaskadereaksjon initiert, hvorved målnukleinsyren multipliseres. Fremgangsmåten kan gjentas så mange ganger som ønskelig for oppnåelse av den ønskede påvisningsfølsomhet. I tilfeller hvor konsentrasjonen av målnukleinsyre ikke er ekstremt lav, er én multiplikasjon tilstrekkelig til å gjøre målnukleinsyren påviselig.
Det er også mulig å bruke bare én modifisert primer i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I dette tilfelle er imidlertid ikke multiplikasjonen så effektiv som ved bruken av minst to primere, fordi reaksjonen ikke er en kaskadetype-reaksjon.
Både DNA og RNA kan bestemmes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Dersom målnukleinsyren er RNA, er det imidlertid mest bekvemt først å kopiere RNA til det tilsvarende cDNA ved revers transkriptase-enzym, hvoretter prosessen fortsetter som beskrevet ovenfor.
Etter at de modifiserte primere er innlemmet i kopiene av målnukleinsyrene, blir en egnet, selektiv probe som gjenkjenner målsékvensen og dens kopier, tilsatt reaksjonsblandingen og hybridiseringsreaksjonen utført under betingelser som er egnet for den respektive hybridiseringsprosess som velges.
I hybridiseringsreaksjonen, avhengig av valget av modifiserte primere, blir enten en selektiv oppfangelsesprobe eller en selektiv påvisningsprobe tillatt å hybridisere med kopiene av målnukleinsyren som nå foreligger i mange ganger så store mengder sammenlignet med mengden av målnukleinsyre i den opprinnelige situasjon.
Dersom den opprinnelige prøve inneholdt målsékvensen, vil den tilsatte selektive probe hybridisere til nylig syntetiserte kopier av målnukleinsyren. En hybrid dannes mellom kopimole-kylet hvori den modifiserte primer er blitt innlemmet og den selektive probe. Hybridene som dannes blir i henhold til den foreliggende oppfinnelse passelig separert fra hybridiserings-oppløsningen ved hjelp av molekyldelen av affinitetsparet som er festet; enten på oppfangelsesprimeren eller på den selektive oppfangelsesprobe. Under fraksjonering fester disse hybrider, som inneholder oppfangelsesmolekyIdel, seg til en fast bærer ved hjelp av den andre molekyldel av affinitetsparet og mengden av selektiv påvisningsprobe eller påvisningsprimer som fester seg til bæreren, kan måles ved vanlige metoder direkte fra bæreren eller etter eluering fra eluatet. Mengden av merkelapp er et mål på mengden av målnukleinsyre.
Før fraksjoneringen blir oppløsningen fortynnet om nødvendig for å gjøre betingelsene fordelaktige for affinitetsparet. Deretter blir oppløsningen bragt i berøring med den faste bærer. Den aktuelle bærer kan f.eks. være en affinitetskromato-grafikolonne, et filter, en plastflate eller en glassflate. Egnede organer til utførelse av separasjonen er forskjellige typer mikrotiterplater, dyppepinnesystemer eller magnetiske partikler, men det er fullt mulig å utføre separasjonen i reagensrør og på perler av glass etc.
Bærermaterialet av affinitetskolonnen kan være naturlig eller
syntetisk polymer, f.eks. cellulose, polyakrylamid, polystyren, dekstran eller agarose. Disse materialer kan også benyttes som suspensjoner i et reagensrør. Det er også fordelaktig å benytte reagensrør som har den annen molekyldel av et affinitetspar festet til sin innvendige flate. Det er en forutsetning for det materiale som velges, at det er mulig å feste det til en komponent som har affinitet for molekyldelen av affinitetsparet som er festet til oppfangelsesprimeren eller den selektive oppfangelsesprobe.
Det er ikke nødvendig å feste molekyldelen eller molekyIdelene av affinitetsparet til oppfangelsesprimeren ved begynnelsen av polymerisasjonen. Heller ikke er det nødvendig å feste den påviselige merkelapp til påvisningsprimeren før polymerisasjonen. Disse kan også tilsettes etter polymerisasjonsprosessen til den modifiserte primer som er blitt innlemmet i kopiene av målnukleinsyren. For eksempel, når den påviselige merkelapp er følsom for hybridiseringsbetingelsene, kan den tilsettes-' først etter hybridiseringen av den selektive oppfangelsesprobe med kopiene av målnukleinsyren.
Dersom påvisningsprobene tjener som modifiserte primere som innlemmes i kopiene av målnukleinsyren, kan hybridet separeres fra reaksjonsblandingen ved hjelp av selektive oppfangelsesprober immobiliserte på faste bærere. Ved denne fremgangsmåte, som også er blitt beskrevet i EP patentsøknad nr. 237 362, blir et hastighetsbegrensende trinn dannet når målnukleinsyren og dens kopier, i hvilke påvisningsprimere er blitt innlemmet, må hybridisere med den selektive oppfangelsesprobe som er immobilisert på en fast bærer. Derfor er hybridiseringen i oppløsning en mer foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen enn dette. Dersom fremgangsmåten utføres ved bruk av en immobilisert oppfangelsesprobe, blir imidlertid hybridet som dannes på den faste bærer vasket, og mengden av merkelapp på bæreren måles ved vanlige metoder.
Prinsippet for testen er vist og anvendeligheten av testen er belyst i de følgende eksempler.
Eksempel 1
Påvisning av cytomegalovirus-DNA ved bruk av påvisningsprober som modifiserte primere
I dette modelleksperiment var målet et rekombinant plasmid (pBR322/CMV Hindlll L) som inneholdt et 12,3 kb-fragment av cytomegalovirus-genomet (CMV, AD 169, ATCC VR-538). De to påvisningsprimere (Pa, Pfc, fig. 1) som ble benyttet, var 20 nukleotider lange og syntetisert med standardfremgangsmåter på et automatisert syntetiseringsapparat. De tilsvarte to regioner på det CMV-spesifikke innskudd som var 111 nukleotider fra hverandre. To selektive oppfangelsesprober (Slr S2, fig. 1) gjenkjente regioner på hver av de to tråder mellom de to påvisningsprimere. Påvisningsprimerne Pa og P^ var merket med <32>P ved deres 5'-ender til en spesifikk aktivitet på 4 x IO<9> CPM/jug ved bruk av den velkjente reaksjon med poly-nukleotidkinase og gamma <32>P-ATP (Maniatis et al., Molecular Cloning, Å Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Biotinylerte nukleotider ble satt til 3<*->endene av oppfangelsesprobene ved hjelp av bio 11-dUTP (BRL) og terminaltrans-ferase (Promega Biotech.) som beskrevet av Riley et al., DNA, 5 (4), pp. 333-337, 1986. Målplasmidet ble linearisert ved kløyving med restriksjonsenzymet EcoRI. DNA-polymerase, Klenow-fragment ble innkjøpt fra Boehringer-Mannheim og streptavidin-agarose fra BRL.
Ved bruk av disse reagenser ble det følgende eksperiment utført.
Fire forskjellige reaksjoner ble gjort klar inneholdende 0, IO<4>, IO<6> og IO<8> molekyler (svarende til henholdsvis
0,2 x 10~<20>, 2 x 10~1<8> og 10~<16> mol) av målplasmidet. Dessuten inneholdt alle fire reaksjoner i et samlet volum på 50 jul: 2 pmol hver av de to primere, 0,5 nM av hver av de fire deoksynukleosidtrifosfater (dvs. dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 10 mm Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 10 mM ditiotreitol. Blandingen ble varmet opp til 100°C i 2 min, deretter inkubert i 5 min ved 37°C, hvoretter 1 jul (svarende til 1 enhet) av DNA-polymerase ble tilsatt. Blandingen ble igjen inkubert i 10 min ved 37°C. Kokingen fulgt av tilføyelse av påvisningsprimere og en inkubasjon med tilsatt DNA-polymerase ved 37°C utgjør en DNA-syntetiseringssyklus.
I dette forsøk ble cyklusen enten utført bare én gang eller gjentatt 5 eller 15 ganger. Etter den siste cyklus ble prøven igjen varmet opp til 100°C, hvoretter 10 pmol av den selektive oppfangelsesprobe ble tilsatt sammen med NaCl (0,9 M), EDTA (20 mM)r natriumfosfat (pH 7,5, 2 0 mM) og natriumdodecylsulfat (0,1%). Volumet øket til 100 jul og de konsentrasjoner som er gitt, er endelige konsentrasjoner. Blandingen ble deretter inkubert ved 50°C i 1 h. Etter denne hybridiseringsreaksjon ble 200 /xl av en 25% suspensjon av streptavidin-agarose i 1 M NaCl, 20 mM natriumfosfat (pH 7,5), 1 mM EDTA tilsatt. Biotinylerte molekyler ble tillatt å binde til streptavidin-agarosen i 15 min ved 37°C i en roterende mikser. Agarosen ble samlet opp ved kortvarig sentrifugering og supernatanten fjernet ved suging. Agarosen ble deretter vasket én gang i det buffrede 1 M NaCl og to ganger i en oppløsning inneholdende 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat og 0,2% natriumdodecylsulfat (pH 8) ved 37°C. Radioaktiviteten av agarosen til hvilken de hybrider som var dannet var bundet, ble deretter bestemt i en radioaktivitetsteller. Innhøstingen og vaskemetoden for DNA-hybrider inneholdende en biotinylert markør er tidligere kjente fremgangsmåter beskrevet f.eks. i GB-PS 2 169 4 03.
Resultatene av eksperimentet er vist i tabell 1. Det kan ses at en cyklus av DNA-syntese innlemmer tilstrekkelig radioaktivitet for påvisning bare dersom høye målkonsentrasjoner foreligger, men at selv den meget lave målmengde er påviselig etter 15 cykluser. Med høy målmengde og 15 cykluser ble mengden av påvisningsprimer begrensende.
Eksempel 2
Bestemmelse av cytomegalovirus-DNA ved anvendelse av oppfangelsesprober som modifiserte primere
I dette eksempel tjener oppfangelsesprobene som primere. Reagensene som ble benyttet var de samme som i eksempel 1,
med de følgende unntagelser: Oppfangelsesprimerne (Pa, P^, Fig.
1) var ikke merket med P, men deres 5<1->ender var isteden modifisert for å inneholde en biotinrest. Denne kjemiske modifikasjon ble utført ved kjente fremgangsmåter beskrevet av Chollet og Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, pp. 1529-1541, 1985. De to selektive prober ( S-^ og S2, Fig. 1) var i dette tilfelle merket i deres 5<1->ender for å tjene som påvisningsprober. Deres spesifikke aktiviteter varhenholdsvis tilnærmet 2 x IO<9> og 2,5 x IO<9> cpm/jug.
Reaksjonsblandingene ble satt sammen som beskrevet i eksempel 1. De biotinylerte oppfangelsesprimere ble imidlertid tilsatt i 10 ganger så store mengder, dvs. 20 pmol hver pr. reaksjon.. 1, 5 eller 15 cykluser ble utført som beskrevet, hvoretter prøvene ble varmet opp ved 100°C og 0,5 pmol hver av de <32>p<->merkede prober og S2 ble tilsatt. Hybridiseringen ble utført under de samme betingelser som beskrevet i eksempel 1.
Hybridene ble deretter samlet opp på streptavidin-agarose, vasket og undersøkt for <32>P-aktivitet som i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 3
Påvisning av cytomegalovirus-DNA fra kliniske prøver ved bruk av oppfangelsesprober som modifiserte primere.
I dette eksempel er anvendeligheten av fremgangsmåten for undersøkelse av kliniske prøver vist ved påvisning av CMV fra urin hos et spedbarn som man visste led av cytomegalovirus-infeksjon. Urinen fra et frisk barn ble innlemmet som en kontrollprøve. Begge prøver bestod av 10 ml urin fra hvilke det samlede DNA ble isolert som beskrevet hos Virtanen et al., J. Clin. Microbiol., 20 (6), pp. 1083-1088, 1984. DNA
oppløst i 20 /il H2C ble brukt som målet i reaksjoner som ellers ble utført som beskrevet i eksempel 2. Etter 10 cykluser av DNA-syntese ble den merkede selektive probe satt til prøven, tillatt å hybridisere og hybridene ble samlet opp. DNA fra urinen hos,pasienten viste en klart forhøyet radioaktivitet i hybrider, méns det fra den friske person viste kun bakgrun-nsradioaktivitet. De faktiske cpm-verdier var henholdsvis 2 3 00 og 240.
Eksempel 4
Påvisning av Semliki Forest virus-RNA ved bruk av oppfangelsesprober som modifiserte primere
Eksempel 4 viser at fremgangsmåten som er beskrevet også kan benyttes for påvisning av RNA. Den modell som benyttes, var RNA fra Semliki Forest virus (SFV).
Reagensene som ble brukt var to 5'-biotinylerte oppfangelsesprimere (fig. 2) (fremstilt som beskrevet i eksempel 2), en enkelt 5' <32>P-merket selektiv påvisningsprobe (fremstilt som beskrevet i eksempel 1), reverstranskriptase (Promega Biotech) og DNA-polymerase, Klenow-fragment (Boehringer Mannheim).
Det første trinn i påvisningen av SFV-RNA var å syntetisere en cDNA-kopi. Reaksjonsblandingen på 20 /il inneholdt 10 mMTris-Cl (pH 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol,0,5 mM hver av fire deoksynukleosidtrifosfater, 0,5 /xg t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pmol oppfangelsesprimer Pa og 100U reverstranskriptase. Denne blanding ble inkubert ved 37°C i 15 min. Deretter ble blandingen varmet opp til 100°C i 5 min og avkjølt til omgivelsetemperatur. Deretter ble 50 /il av en oppløsning inneholdende 10 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 10 pmol av oppf angelsesprimeren Pj-j og 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleosidtrifosfater tilsatt. Temperaturen ble øket til 37°C og etter 5 min ble 1 U DNA-polymerase tilsatt. Etter ytterligere 10 min inkubasjon ble reaksjonsblandingen inkubert ved 100°C i 5 min, blandingen ble avkjølt til 37°C og fem cykluser med DNA-syntese ble utført. Etter et endelig denatureringstrinn ble 0,1 pmol (1,2 x IO<6 >cpm) av den selektive påvisningsprobe tilsatt i 80 /il 1 M NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM natriumfosfat (pH 7,5) og 0,1% natriumdodecylsulfat. Oppløsningen ble deretter inkubert i 2 h ved 55°C, hvoretter hybridene ble samlet opp og vasket som beskrevet i eksempel 1.
Som en negativ sammenligningsprøve for reaksjonene ble en identisk prøve gitt den samme behandling bortsett fra at ikke noe reverstranskriptase ble tilsatt. Prøven i hvilken RNA ble omdannet til cDNA med reverstranskriptase, gav 420 cpm <32>P-aktivitet i oppfangede hybrider, mens den negative sammen-ligningsprøve gav 50 cpm.
Eksempel 5
Sammenligning mellom forskjellige påvisningsmetoder for multiplisert DNA 1 dette eksempel ble tre forskjellige påvisningsmetoder for multiplisert DNA sammenlignet. Reagensene og multiplikasjons-prosessene var som beskrevet i eksemplene 1 og 2, bortsett fra at de selektive oppfangelses- eller påvisningsprober var M13-kloner som gjenkjenner ca. 100 nukleotider•mellom primerne.
M13-klonene ble oppnådd ved subkloning av et Haelll-restrik-sjonsfragment av det rekombinante plasmid pBR322/CMV Hindlll L inn i fagvektoren M13mpl0 ved bruk av standardteknikker. M13-klonene som skulle tilsettes som selektive oppfangelsesprober, ble modifisert med biotin ved bruk av "Photoprobe" biotin (Vector Laboratories). M13-klonene som skulle anvendes som selektive påvisningsprober, ble merket med <32>P-dCTP ved bruk av DNA-polymerase I (Klenow-fragmentet) og primerforlengelse (Hu og Messing, Gene 17, pp. 271-277, 1982) til en spesifikk aktivitet på 2 x IO<8> cpm//ig-
Multiplikasjonen av 3 x IO<5> molekyler (0,5 x IO-<18> mol) av det lineariserte pBR322/CMV Hindlll L-plasmid ble utført med 10 cykluser. For påvisning i henhold til fremgangsmåte 1 og 2 ble 2 pmol hver av de <32>P-merkede påvisningsprimere Pa og Pj-, anvendt, og multiplikasjonsprosessen ble utført som beskrevet i eksempel 1. For påvisning i henhold til fremgangsmåte 3 ble 25 pmol av de biotinylerte oppfangelsesprimere brukt i multi-plikasjonsmetoden, og reaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel 2.
Påvisningsmetode 1 - Selektiv oppfangelsesprobe benyttet for oppsamling av hybrider dannet i oppløsning med kopiene av målnukleinsyren
I denne påvisningsmetode ble biotinylerte selektive M13-oppfangelsesprober benyttet til oppsamling av de multipliserte DNA-fragmenter. Etter den siste multiplikasjonssyklus ble prøveblandingen varmet opp til 100°C og 2 x IO<9> molekyler hver av de biotinylerte selektive oppfangelsesprober ble tilsatt sammen med NaCl (0,6 M), EDTA (5 mM), natriumfosfat (20 mM) og SDS (0,1%). Volumet øket til 100 fil og de endelige konsentrasjoner er gitt. Blandingen ble inkubert ved 65°C i 2 h. Hybridene som ble dannet ble samlet opp på streptavidin-agarose som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at ytterligere to 1 min's vaskinger ved 50°C med 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat, 0,2% SDS ble utført. Radioaktiviteten av de oppsamlede hybrider ble målt.
Påvisningsmetode 2 - Selektiv oppfangelsesprobe immobilisert før dens hybridisering med kopiene av målnukleinsyren
I dette tilfelle ble immobiliserte selektive M13-prober benyttet for å fange opp det multipliserte DNA. Etter den siste multiplikasjonscyklus ble prøvene varmet opp til 100°C.
NaCl (0,6 M), natriumcitrat (60 mM), "Ficoll" (0,02%), poly-vinylpyrrolidon (0,02%), bovinserumalbumin (0,02%) og denaturert sildesperm-DNA (0,2 mg/ml) ble tilsatt for å gi de angitte konsentrasjoner i et endelig volum på 100 fil. En 10 filterskive av nitrocellulose, til hvilken 5 x 10<10> molekyler av hver av de selektive prober var blitt immobilisert i henhold til en tidligere beskrevet fremgangsmåte (US-PS 4 486 539), ble satt til hver prøve. Blandingen ble inkubert sammen med filtrene ved 65°C i 2 h eller 18 h. Etter hybridiseringsreaksjonen ble filtrene vasket to ganger i 2 0 min ved 50°C med 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat og 0,2% SDS og radioaktiviteten som var bundet til filtrene, ble målt.
Påvisningsmetode 3 - Selektiv påvisningsprobe brukt til påvisning
Her ble <32>P-merkede selektive M13-påvisningsprober benyttet for påvisningen av det multipliserte DNA og hybridene ble samlet opp ved hjelp av oppfangelsesprimerne biotinylert ved 5<1->endene som beskrevet i eksempel 2. De multipliserte prøver ble varmet opp til 100°C og 2 x IO<8> molekyler (2 x IO<5> cpm) av hver av de <32>P-merkede selektive prober ble tilsatt sammen med salter som beskrevet for metode 1. Hybridisering og oppsamling av de dannede hybrider ble utført som for metode 1.
En sammenligning av resultatene som ble oppnådd ved de tre påvisningsmetoder er vist i tabell 3.
Metode 1 og 3 har fordelen av den hurtigere hybridiseringshas-tighet i oppløsning sammenlignet med filterhybridiseringen i metode 2. Den høyeste <32>P-aktivitet fås ved metode 3, fordiden selektive påvisningsprobe inneholder multiple <32>P-atomer pr. molekyl.
Eksempel 6
Multiplikasjon av cytomegalovirus-DNA ved bruk av biotinylerte påvisningsprimere og indirekte påvisning med streptavidin-pepperrotperoksidase.
I dette eksempel ble multiplikasjon av det CMV-spesifikke plasmid (pBR322/CMV Hindlll L) utført ved bruk av debiotiny-lerte primere Pa og Pj-, beskrevet i eksempel 2 som påvisningsprimere. M13-klonene beskrevet i eksempel 5 modifisert med sulfongrupper ble brukt som selektive oppfangelsesprober. De hybrider som ble dannet, ble samlet opp i mikrotitrerings-brønner belagt med antistoffer som kjente igjen sulfonmodifisert DNA. Den endelige påvisning av de hybrider som ble dannet, ble utført med et strepatvidin-pepperrotperoksidase-konjugat, som påviser biotinmolekyldelene av primerne.
M13-klonene ble modifisert ved en sulfoneringsreaksjon ved bruk av reagenser fra og fremgangsmåten anbefalt av Orgenics Ltd (Yavne, Israel). Polystyren-mikrotitreringsbrønner (Nunc, Danmark) ble belagt med 10 /ug/ml av IgG renset fra et mono-klonalt antistoff mot sulfonmodifisert DNA (Orgenics Ltd) i 10 mM natriumkarbonat-buffer (pH 9,6) over natten ved 4°C.
En reaksjonsblanding inneholdende 3 x IO<5> molekyler av de. lineariserte pBR322/CMV Hind III L-plasmider eller kontroll-prøver uten plasmidet og 25 pmol hver av de biotinylerte primere Pa og Pj-, ble behandlet i 10 multiplikasjonscykluser ved de betingelser som er beskrevet i eksempel 1. Prøvene ble varmet opp til 100°C, hvorpå 2 x IO<9> molekyler hver av de sul-fonerte selektive oppfangelsesprober ble tilsatt sammen med reagenser som angitt for påvisningsmetode 1 i eksempel 5.
Blandingen ble inkubert ved 65°C i 2 h, fortynnet med 100 /xl av 0,2% "Tween 20" og overført til de belagte mikrotitrerings-brønner. Hybridene ble tillatt å binde til brønnene i 2 h ved 37°C. Reaksjonsblandingen ble kassert og brønnene ble vasket tre ganger med 0,1% "Tween 2 0" i 0,15 M natriumklorid, 2 0 mM natriumf osf at (pH 7,5) (PBS) . 200 /il av et streptavidin-pepperrotperoksidase-konjugat (Amersham, UK) fortynnet 1:2000 i en oppløsning av 1% bovinserumalbumin, 0,1% "Tween 20" i PBS ble tilsatt og brønnene ble inkubert i 45 min ved 37°C. Etter fire vaskinger som angitt ovenfor ble 200 /il av en substrat-oppløsning bestående av 0,46 mg/ml 0-fenylen-diamin,
0,01% H202 i 0,1 M natriumacetatbuffer (pH 5,0) tilsatt.
Etter 15 min ved 22°C ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 50 /il av 2N H2S04 og absorbansen av det fargede produkt ble målt med et spektrofotometer ved 492 nm. Oppsamlings- og påvis-ningsmetodene er tidligere beskrevet av Syvanen et al. (Nucleic Acids Res> 14, pp. 5037-5048, 1986).
Resultatene av forsøket er vist i tabell 4. 3 x IO<5> molekyler (0,5 x IO-<18> mol) av målplasmidet ble klart påvist etter 10 cykluser multiplikasjon.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridisering, karakterisert ved at oppfangelsesprobene tjener som modifiserte primere som blir innlemmet i kopiene av målnukleinsyren, hvis nærvær deretter påvises ved minst én selektiv påvisningsprobe, eller at påvisningsprobene tjener som modifiserte primere som blir innlemmet i kopiene av målnukleinsyren som separeres ved hjelp av minst én selektiv oppfangelsesprobe og hvis nærvær deretter påvises, idet oppfangelsesproben er modifisert ved at den inneholder minst én molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete hvor minst én molekyldel av et affinitetspar kan bindes, og at
påvisningsproben er modifisert ved at den inneholder minst én detekterbar merkelapp eller minst ett spesifikt sete hvor en slik merkelapp kan bindes.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter: å tillate den eller de nevnte oppfangelsesprimere å reagere med den enkelttrådede nukleinsyre under betingelser som er egnede for en templateavhengig polymerisasjonsreaksjon, å tillate de enkelttrådede kopier av målnukleinsyre hvori oppfangelsesprimerne er blitt innlemmet å hybridisere med en påvisningsprobe som er i stand til selektivt å hybridisere med målnukleinsyren under betingelser som er egnede for en hybridi-seringsreaks j on, å separere kopiene av målnukleinsyren hvori oppfangelsesprimerne er blitt innlemmet ved hjelp av den andre molekyldel av affinitetsparet, å påvise nærværet av de selektive påvisningsprober som har hybridisert med kopiene av målnukleinsyren.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter: å tillate den eller de nevnte påvisningsprimere å reagere med den enkelttrådede nukleinsyre under betingelser som er egnede for en templateavhengig polymerisasjonsreaksjon, å tillate de enkelttrådede kopier av målnukleinsyren hvori påvisningsprimerne er blitt innlemmet å hybridisere med en oppfangelsesprobe som er i stand til selektivt å hybridisere med målnukleinsyren under betingelser som er egnede for en hybridiseringsreaksj on, å separere kopiene av målnukleinsyren hvori oppfangelsesprimerne er blitt innlemmet ved hjelp av den selektive oppfangelsesprobe, å påvise nærværet av kopiene av målnukleinsyrene.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 3, karakterisert ved at den selektive oppfangelsesprobe er forsynt med minst én molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én molekyldel av et affinitetspar kan bindes.
5. Reagenskombinasjon for bestemmelse av nukleinsyrer, karakterisert ved at den omfatter: (a) minst én modifisert primer av målnukleinsyren forsynt med minst én påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én påviselig merkelapp kan bindes, og (b) minst én oppfangelsesprobe som er i stand til selektiv hybridisering med målnukleinsyren, forsynt med minst én molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én molekyldel av et affinitetspar kan bindes eller p ) minst én modifisert primer av målnukleinsyren forsynt med minst én molekyldel av et affinitetspar eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst ett affinitetspar kan bindes, og minst én påvisningsprobe som er i stand til selektiv hybridisering med målnukleinsyren, forsynt med minst én påviselig merkelapp eller minst ett spesifikt sete til hvilket minst én påviselig merkelapp kan bindes, (e ) en beholder omfattende minst ett templateavhengig polymeri-sasjonsmiddel, (f.) en beholder med de fire deoksynukleosidtrif osf ater, (g ) et organ for polymerisasjons- og hybridiseringsprosessen, (h ) et organ for separasjonen av kopiene av målnukleinsyren, (i ) et organ til bestemmelse av merkelappen.
NO881064A 1987-03-11 1988-03-10 Fremgangsmaate til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikk og reagenskombinasjon til utfoerelse av fremgangmaaten NO172909C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2460487A 1987-03-11 1987-03-11

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO881064D0 NO881064D0 (no) 1988-03-10
NO881064L NO881064L (no) 1988-09-12
NO172909B true NO172909B (no) 1993-06-14
NO172909C NO172909C (no) 1993-09-22

Family

ID=21821443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO881064A NO172909C (no) 1987-03-11 1988-03-10 Fremgangsmaate til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikk og reagenskombinasjon til utfoerelse av fremgangmaaten

Country Status (25)

Country Link
US (2) US5476769A (no)
JP (1) JP3244500B2 (no)
AT (1) AT395434B (no)
AU (1) AU622104B2 (no)
BE (1) BE1003990A5 (no)
CA (1) CA1338207C (no)
CH (1) CH677285A5 (no)
DD (1) DD272664A5 (no)
DE (1) DE3807994C2 (no)
DK (1) DK175384B1 (no)
ES (1) ES2006377A6 (no)
FI (1) FI94429C (no)
FR (1) FR2613077A1 (no)
GB (1) GB2202328B (no)
GR (1) GR1000315B (no)
HU (1) HU202583B (no)
IE (1) IE61664B1 (no)
IL (3) IL85480A0 (no)
IT (1) IT1216048B (no)
LU (1) LU87153A1 (no)
NL (1) NL194922C (no)
NO (1) NO172909C (no)
NZ (1) NZ223700A (no)
PT (1) PT86937B (no)
SE (1) SE500262C2 (no)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4038804A1 (de) 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
US5753433A (en) * 1909-12-05 1998-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the sensitive detection of nucleic acids
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
FI80476C (fi) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning.
CA1325761C (en) * 1987-12-25 1994-01-04 Takanori Oka Method of detecting an intended nucleic acid in a sample
JPH0775560B2 (ja) * 1987-12-25 1995-08-16 湧永製薬株式会社 検体中の目的核酸の検出法
WO1989009281A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 Akzo N.V. Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
GB8827160D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab Detection & quantitative determination of rna & dna
CA2002076A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Brent A. Burdick Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
DK175170B1 (da) * 1988-11-29 2004-06-21 Sangtec Molecular Diagnostics Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser
US5536648A (en) * 1988-12-09 1996-07-16 Amrad Corporation Limited Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein
WO1990006374A1 (en) * 1988-12-09 1990-06-14 Amrad Corporation Limited Amplified dna assay
CA2004326A1 (en) * 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
CA2008096A1 (en) * 1989-01-19 1990-07-19 Samuel Rose Nucleic acid amplification using single primer
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
SG50434A1 (en) * 1989-02-13 1998-07-20 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
CA2011818A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-17 Fred T. Oakes Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
DE69003104T2 (de) * 1989-06-12 1994-03-17 Cis Bio International Saclay Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen.
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
NZ240079A (en) * 1990-10-09 1993-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the detection of a nucleic acid or part thereof
WO1992011390A1 (en) * 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
DE4106251A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Boehringer Mannheim Gmbh Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5888819A (en) * 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
US5387510A (en) * 1991-10-02 1995-02-07 Eastman Kodak Company Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit
IT1252295B (it) * 1991-11-15 1995-06-08 Schiapparelli Diagnostici Ismu Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico
JPH07502655A (ja) * 1991-12-23 1995-03-23 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
US5658729A (en) 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
DE4421901A1 (de) * 1994-06-23 1996-01-04 Bayer Ag Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial
US5705366A (en) * 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
WO1997035033A1 (en) 1996-03-19 1997-09-25 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6071493A (en) 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
IL122147A0 (en) * 1997-11-10 1998-04-05 Technion Res & Dev Foundation Method for labeling polynucleotides
CN100340666C (zh) 1997-12-18 2007-10-03 孟山都技术有限公司 抗昆虫的转基因植物以及用于改善δ－内毒素抵抗目标昆虫活性的方法
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6743906B1 (en) 1998-10-02 2004-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas PPP2R1B is a tumor suppressor
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
WO2000029008A2 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6432642B1 (en) 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US6156515A (en) * 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
WO2000066780A2 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
PT1471926E (pt) 1999-06-01 2011-03-11 Baylor College Medicine Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
WO2001081379A2 (en) 2000-04-21 2001-11-01 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
WO2002000174A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
CA2415422C (en) 2000-07-10 2014-07-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors
CA2446788A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
WO2002095002A2 (en) 2001-05-22 2002-11-28 University Of Chicago N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase
JP2005532780A (ja) 2001-09-19 2005-11-04 インタージェネティックス インコーポレイテッド 発癌リスク層別化のための遺伝的解析
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
ES2205998B1 (es) * 2001-12-14 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas. Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv).
CA2476755C (en) 2001-12-17 2014-08-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
EP2213737B1 (en) 2002-02-01 2012-11-07 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
ATE497774T1 (de) 2002-07-15 2011-02-15 Univ Texas Screening kombinatorischer proteinbibliotheken mittels periplasmatischer expression
JP4796299B2 (ja) 2002-08-12 2011-10-19 ジェンネレックス インコーポレイティッド ポックスウイルスおよび癌に関する方法および組成物
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
CA2512108C (en) 2003-01-06 2013-04-02 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
DE602004029560D1 (de) 2003-03-07 2010-11-25 Rubicon Genomics Inc Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden
CN1878866B (zh) 2003-07-25 2012-08-01 安比恩股份有限公司 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
CN101133157A (zh) 2004-06-03 2008-02-27 阿什洛米克斯控股有限公司 诊断应激的药物和方法
US20080311564A1 (en) * 2004-08-06 2008-12-18 Fort Thomas L Sequences and Methods for Detection of Cytomegalovirus
ES2345993T3 (es) 2004-09-14 2010-10-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Metodo para el tratamiento con bucindolol basado en direccionamiento genetico.
JP5897780B2 (ja) 2005-01-28 2016-03-30 デューク ユニバーシティ プリント回路基板上の液滴操作装置及び方法
US7993853B2 (en) 2005-05-06 2011-08-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid target capture
WO2007006091A1 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US8249814B2 (en) 2005-10-21 2012-08-21 Genenews Inc. Method, computer readable medium, and system for determining a probability of colorectal cancer in a test subject
WO2008019162A2 (en) 2006-01-18 2008-02-14 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
EP2007905B1 (en) 2006-03-15 2012-08-22 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
CA2921048C (en) 2006-09-15 2018-06-05 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
EP2102239B1 (en) 2006-11-30 2012-04-25 Research Development Foundation Improved immunoglobulin libraries
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
ES2599632T3 (es) 2007-04-09 2017-02-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso
CA2685675C (en) 2007-05-01 2016-02-16 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
BRPI0920041A2 (pt) 2008-10-06 2017-06-27 Univ Chicago composições e processos relacionados às proteínas eap, emp e/ou adsa bacterianas
PL3281947T3 (pl) 2009-04-03 2020-07-27 The University Of Chicago Kompozycje i sposoby związane z wariantami białka A (SpA)
KR101815716B1 (ko) 2009-04-22 2018-01-05 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 만성 폐쇄성 폐 질환 및 천식의 치료에 사용하기 위한 조성물
EP2789689B1 (en) 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
EP2272979A1 (en) 2009-06-30 2011-01-12 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method for testing a subject thought to be predisposed to having cancer
CN107090031A (zh) 2009-07-17 2017-08-25 生物蛋白有限公司 在生产宿主中同时整合抗体/蛋白的性能和表达的筛选和演化的方法
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US9512481B2 (en) 2009-09-11 2016-12-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Polymorphisms in the PDE3A gene
KR101759888B1 (ko) 2009-09-14 2017-07-20 신라젠(주) 종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법
EP2510088B1 (en) 2009-12-10 2016-10-05 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
WO2011079273A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
JP5791634B2 (ja) 2010-01-29 2015-10-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ
JP2013523818A (ja) 2010-04-05 2013-06-17 ザ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ 免疫反応のエンハンサーとしてのプロテインＡ（ＳｐＡ）抗体に関連する組成物および方法
ES2911185T3 (es) 2010-04-23 2022-05-18 Univ Florida Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1)
JP6002128B2 (ja) 2010-07-02 2016-10-05 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ プロテインＡ（ＳｐＡ）変種に関連する組成物および方法
SG10201902596TA (en) 2010-07-16 2019-04-29 Bioatla Llc Novel methods of protein evolution
WO2012034067A1 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
EP2455485A1 (de) 2010-11-19 2012-05-23 Anagnostics Bioanalysis GmbH Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
US9919047B2 (en) 2011-01-04 2018-03-20 Sillajen, Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
EP2673299B1 (en) 2011-02-07 2017-05-10 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
CA2829300A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
EP2694534B1 (en) 2011-04-08 2018-06-20 Evaxion Biotech ApS Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
EP2718427B1 (en) 2011-06-08 2017-01-11 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions for glioblastoma treatment
JP2014527398A (ja) 2011-06-21 2014-10-16 オンコファクター コーポレイション がんの療法および診断のための組成物および方法
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
WO2013053899A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Moeller Niels Iversen Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination
WO2013096798A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Amplification of a sequence from a ribonucleic acid
CA2861387A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
DK2844275T3 (da) 2012-04-26 2020-07-13 Univ Chicago Staphylokok-koagulase-antigener og fremgangsmåder til anvendelse af disse
US9416403B2 (en) * 2012-08-31 2016-08-16 Toray Industries, Inc. Method of detecting target nucleic acid
EP2740805B1 (en) 2012-12-07 2019-02-20 SuppreMol GmbH Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura
EP2934751B1 (en) 2012-12-21 2019-05-29 Micronics, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
US10065186B2 (en) 2012-12-21 2018-09-04 Micronics, Inc. Fluidic circuits and related manufacturing methods
CN104919035B (zh) 2012-12-21 2017-08-11 精密公司 便携式荧光检测系统和微测定盒
US10125373B2 (en) 2013-01-22 2018-11-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
CA2901501C (en) 2013-02-21 2023-03-07 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Vaccine composition
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
WO2014182844A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
WO2014182847A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids
EP3052193B1 (en) 2013-10-03 2018-01-31 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
WO2015082536A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
DK3447493T3 (da) 2014-01-07 2020-08-17 Bioatla Llc Proteinrettede ortologer
WO2015191916A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Micronics, Inc. Microfluidic cartridges and apparatus with integrated assay controls for analysis of nucleic acids
WO2016075305A2 (en) 2014-11-13 2016-05-19 Evaxion Biotech Aps Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
US10539566B2 (en) 2014-12-08 2020-01-21 Berg Llc Use of markers including filamin A in the diagnosis and treatment of prostate cancer
EP4279080A3 (en) 2015-01-12 2024-02-21 Evaxion Biotech A/S Treatment and prophylaxis of k. pneumoniae infection
AU2016219511B2 (en) 2015-02-09 2020-11-12 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3070178B1 (en) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
EP4116316A1 (en) 2015-07-04 2023-01-11 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
AU2016297510B2 (en) 2015-07-17 2021-09-09 President And Fellows Of Harvard College Methods of amplifying nucleic acid sequences
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
WO2017144523A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
WO2017214068A1 (en) 2016-06-05 2017-12-14 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
WO2018127545A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
CN110462062A (zh) 2017-01-26 2019-11-15 俄克拉荷马医学研究基金会 系统性红斑狼疮疾病活动性、强度和急性发作的生物标志物
KR102554477B1 (ko) 2018-10-18 2023-07-11 오클라호마 메디컬 리써치 화운데이션 질병 활성도의 특징을 규명하는 전신 홍반성 낭창(sle) 질병 활성도 면역 지수를 위한 생체지표
WO2020083904A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting m. catharrhalis
US20220143168A1 (en) 2019-02-27 2022-05-12 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting H. influenzae
US20200377951A1 (en) 2019-04-30 2020-12-03 Chondrial Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
EP3772543B1 (en) 2019-08-09 2023-09-27 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
WO2021140123A1 (en) 2020-01-06 2021-07-15 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
CN115989415A (zh) 2020-06-30 2023-04-18 健肺生命人工智能公司 用于检测肺癌的方法
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
IL307528A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
WO2022216846A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
IL307530A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Estrogen receptor-like (ER) breast cancer protein markers LUMINAL A (LA) and LUMINAL B1 (LB1)
CA3224564A1 (en) 2021-07-05 2023-01-12 Andreas Holm MATTSSON Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
BG36086A1 (en) * 1982-01-19 1984-09-14 Glbov Method for inducing interferon
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
CA1256005A (en) * 1983-09-26 1989-06-20 W. Peter Hansen Sandwich hybridization method for nucleic acid detection
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
US4743562A (en) * 1984-08-21 1988-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Purified human cytomegalovirus protein
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
FI72146C (fi) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror.
CA1272443A (en) * 1985-02-22 1990-08-07 Nanibhushan Dattagupta Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
GB8509367D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Amersham Int Plc Nucleic acid hybridisation
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
GB8515276D0 (en) * 1985-06-17 1985-07-17 Amersham Int Plc Nucleic acid sequencing
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
EP0238332A2 (en) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase

Also Published As

Publication number Publication date
IE880697L (en) 1988-09-11
IT1216048B (it) 1990-02-22
GB8805681D0 (en) 1988-04-07
FI94429B (fi) 1995-05-31
FI94429C (fi) 1995-09-11
DE3807994C2 (de) 1998-08-27
IE61664B1 (en) 1994-11-16
GR880100139A (en) 1989-01-31
SE500262C2 (sv) 1994-05-24
CH677285A5 (no) 1991-04-30
CA1338207C (en) 1996-04-02
HUT50868A (en) 1990-03-28
LU87153A1 (fr) 1988-08-23
BE1003990A5 (fr) 1992-07-28
PT86937A (pt) 1989-03-30
NL194922C (nl) 2003-07-04
GB2202328A (en) 1988-09-21
DK175384B1 (da) 2004-09-20
AU622104B2 (en) 1992-04-02
ATA64388A (de) 1992-05-15
SE8800864L (sv) 1988-09-12
FI880994A0 (fi) 1988-03-03
ES2006377A6 (es) 1989-04-16
DK129588A (da) 1988-09-12
FR2613077B1 (no) 1994-11-10
IL102154A (en) 1994-04-12
IL102154A0 (en) 1993-01-14
IL85480A0 (en) 1988-07-31
DK129588D0 (da) 1988-03-10
HU202583B (en) 1991-03-28
JPS63243875A (ja) 1988-10-11
NO881064L (no) 1988-09-12
PT86937B (pt) 1995-03-01
NZ223700A (en) 1990-04-26
SE8800864D0 (sv) 1988-03-10
NO881064D0 (no) 1988-03-10
US5989817A (en) 1999-11-23
GB2202328B (en) 1991-07-03
FI880994A (fi) 1988-09-12
IT8819722A0 (it) 1988-03-10
US5476769A (en) 1995-12-19
DD272664A5 (de) 1989-10-18
NL8800594A (nl) 1988-10-03
JP3244500B2 (ja) 2002-01-07
NL194922B (nl) 2003-03-03
DE3807994A1 (de) 1988-09-22
FR2613077A1 (fr) 1988-09-30
GR1000315B (el) 1992-06-25
AT395434B (de) 1992-12-28
NO172909C (no) 1993-09-22
AU1193788A (en) 1988-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO172909B (no) Fremgangsmaate til bestemmelse av nukleinsyrer ved hybridiseringsteknikk og reagenskombinasjon til utfoerelse av fremgangmaaten
JP2577881B2 (ja) ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法
US5869252A (en) Method of multiplex ligase chain reaction
EP0439222B1 (en) Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
EP0408738B1 (en) Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
JPH05508074A (ja) インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイ
EP0370694A2 (en) Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
AU656965B2 (en) Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization
JPH10508741A (ja) 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法
JPH07505293A (ja) 多重リガーゼ連鎖反応方法
JPH0343099A (ja) 増幅した遺伝子を使用する配列のアツセイ
JPH0398586A (ja) プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法
Gudibande et al. Rapid, non-separation electrochemiluminescent DNA hybridization assays for PCR products, using 3′-labelled oligonucleotide probes
JP2005095184A (ja) 似通った融点を有する２つ以上のｄｎａを増幅及び検出するための診断用組成物、要素、方法並びに試験キット
US6007984A (en) Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization
JPH07505533A (ja) 定量的ウイルスアッセイ
CA2024978A1 (en) Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
EP0543222A1 (en) Method for detecting nucleic acids and relative diagnostic kit
JPH05192198A (ja) 核酸の検出法

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired