PT86937B - Metodo aperfeicoado para testar acidos nucleicos, combinacoes de reagentes e "kits" (equipamentos) para esse fim - Google Patents

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Description

MÉTODO APERFEIÇOADO PARA TESTAR ÁCIDOS NUCLÉICOS,COMBINAÇÕES DE REAGENTES E KITS (EQUIPAMENTOS) PARA ESSE FIM
O método pode também ser levado a cabo utilizando sondas detectoras como iniciadores e sondas de captura para a separação dos ácidos nucleicos. São também referidos, neste invento, as combinações de reagentes utilizados na aplicação do método atrás referido, bem como os kits (equipamentos) para testar ácidos nucleicos de acordo com o referido método .
Campo técnico
O presente invento está relacionado com um método sensível e rápido para testar ácidos nucleicos por meio de técnicas de hibridação, em que as sondas detectoras são iniciadores (primers) modificados incorporados em cópias do ácido nucleico alvo antes da reacção de hibridação e uma combinação de reagente assim como um kit para tal.
Ainda, o invento está relacionado com um método para testar ácidos nucleicos por meio de técnicas de hibridação, em que as sondas de captura são iniciadores modificados a serem incorporados nas cópias dos ácidos nucleicos alvo antes da reacção de hibridação e uma combinação de reagentes assim como um kit para tal.
Fundamento do invento
Nas reacções de hibridação um oligo ou polinucleotídeo marcado, i.e. a sonda, emparelha com o ácido nucleico alvo. Têm sido usados vários métodos de hibridação para a detecção de ácidos nucleicos. Nos métodos de I hibridação directa a amostra está em solução ou fixada a um veículo sólido. O ácido nucleico a ser identificado é demonstrado usando uma sonda marcada.
Na Patente U.S. N2 4.486.539 foi descrito um método de hibridação em sanduíche. Neste método são usadas duas sondas separadas, uma sendo uma sonda detectora marcada e usada na detecção e a outra sendo uma sonda de captura imobilizada num veículo sólido para a separação do ácido nucleico alvo da mistura de reacção.
método de hibridação em solução está descrito na Publicação de Patente Britânica N3 2.169.403.
Neste método são usadas duas sondas diferentes estando ambas na mesma fase de solução. A sonda detectora é marcada com uma marca detectável e à sonda de captura é ligada uma porção tendo afinidade para um outro componente. Após a hibridação o híbrido formado entre a sonda de captura, o ácido nucleico alvo e a sonda detectora pode ser separado da solução de hibridação com a ajuda do outro elemento do par de afinidade.
A polimerização de DNA catalisada por enzimas em que a sequência de nucleotídeos de uma cadeia de ácido nucleico préviamente existente, i.e. o molde, é copiado com precisão para se obter a sua cadeia complementar, é bem conhecida e foi descrita e.g. em kornberg, DNA replicativa, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pág. 221-225 e 670-679, 1980 e Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 122, 1982. Esta multiplicação biológica é usada em ensaios de hibridação nos quais □ microorganismo a ser detectado é cultivado e portanto enriquecido no seu DNA antes do teste e está descrito e.g. em Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 e na Patente U.S. N5 4.358.535. As sequências de DNA específicas podem também ser amplificadas dentro de células vivas, e.g. através do uso de drogas adequadas como descrito por Clewell e Helinski em J. Bacteriol. 110, p. 1135, 1972 e no Pedido de Patente Europeia NQ 55.742. Um enriquecimento mais específico em DNA está descrito no Pedido de Patente Europeia NQ 175.689 em que o alvo está ligado a um replicão plasmídeo e introduzido numa célula adequada. Ainda um outro método está descrito no Pedido de Patente Europeia N° 201.184 em que é utilizada a dependência de iniciador na síntese de DNA para criar uma reacção in vitro para a amplificação do DNA alvo. No Pedido de Patente Europeia N2 200.362 é sugerido um método para detecção de genes amplificados .
Sumário do Invento
No método de hibridação do presente invento as sondas detectoras ou assondas de captura actuam como iniciadores modificados a serem incorporados nas cópias do ácido nucleico alvo num processo de polimerização
I dependente de molde antes da reacção de hibridação.
No método do invento é necessário pelo menos um iniciador e os iniciadores são sempre modificados. Se as sondas detectoras actuarem como iniciadores na reacção de polimerização, os iniciadores são dotados de pelo I menos uma marca detectável adequada ou de pelo menos um sítio específico onde pelo menos possa ser ligada uma marca detectável.
Como alternativa as sondas de captura podem ser usadas como inicidores na reacção de polimerização, neste caso os iniciadores são dotados de pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio onde possa ser ligada pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade.
invento também divulga uma combinaI ção de reagentes e um kit compreendendo na forma empacotada uma unidade de múltiplos reservatórios compreendendo a combinação de reagentes necessária à realização do teste.
I Ao usar-se as sondas detectora ou de captura como iniciadores numa reacção de polimerização é possível aumentar a sensibilidade da reacção de hibridação em várias ordens de grandeza cçmparado com os métodos que medem o alvo directamente. Ainda, o invento proporciona um método conveniente para efectuar a reacção de hibridação em solução de modo que os híbridos sejam fácil e rápidamente separados da solução de hibridação após a reacção de hibri_ dação.
Ο método do invento é conveniente para o diagnóstico de determinadas doenças, as quais são muito difíceis de diagnosticar com métodos convencionais. Assim, o método é especialmente útil na identificação de citomegalovírus e do vírus HI ou da SIDA.
Breve descrição dos desenhos
A Fig. 1 representa a sequência de bases dos iniciadores modificados, P e P. , assim como as sona b das selectivas, S^ e S2 , usadas no Exemplo 1, 2 e 3, assim como os sítios relativos dos iniciadores modificados, P e 3
Pfa e as sondas selectivas, e S2, no ácido nucleico alvo em questão. As linhas A e B indicam as duas cadeias alvo que continuam em ambas as direcções. As setas nos iniciadores , P e P, indicam a direcção em que eles se prolongam
D no processo de polimerização.
A Fig. 2 representa a sequência de bases dos iniciadores modificados, P e P. , e a sonda seleca o tiva, S usada no Exemplo 4, assim como os sítios relativos dos iniciadores modificados, P e P.e a sonda selectiva S no ácido nucleico alvo em questão. A linha A indica o RNA e as suas cópias de DNA idênticas e a linha B mostra as cópias de DNA complementar. As setas são iniciadores Pa e Pfa indicam a direcção em que eles se prolongam no processo de polimerização.
Descrição detalhada do invento
Preparação do material de ensaio
As sondas usadas no método são oligo ou polinucleotídeos. As sondas podem ser preparadas sintéticamente ou semi-sintéticamente, os quais são os métodos
preferidos para a preparação de sondas, que actuarão igualmente como iniciadores. É também possível preparar as sondas por técnicas recombinantes ou partir de ácidos nucleicos isolados directamente da natureza. Uma sonda pode ser ligada a um vector adequado. Ela pode conter partes de vector ou ser totalmente destituída de partes de vector. Ac) tualmete podem ser adquiridas comercialmente uma multiplicidade de iniciadores e sondas adequados que podem ser usados.
As sondas detectoras como iniciadores modificados.
, Num dos métodos do presente invento as sondas detectoras são oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, que podem ser ligadas ao ácido nucleico alvo por emparelhamento de bases e que podem actuar como iniciadores para uma enzima sintetizadora de ácido nucleico dependente de molde. É essencial que os iniciadores detectores sejam dotados de pelo menos uma marca detectável adequada ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligada pelo menos uma marca detectável adequada.
Podem ser usadas como marcas vários isótopos radioactivos ou compostos marcados radioactivamente. A substância usada como marca pode também ser fluorescente, luminescente, emissora de luz, demonstrável enzimática ou imunológicamente etc. Podem ser mencionados como exemplos marcas baseadas na afinidade de biotina e avidina ou estreptavidina, quelatos de lantanidos, ferritina e compostos heme e haptenos demonstráveis imunológicamente tais como AAF e AIF (derivados de acetoxiacetilfluoreno). È também possível a identificação com o auxílio de mediadores, por exemplo proteínas.
método de acordo com o invento não está dependente da marca usada. Todas as substâncias para marcação normalmente usadas e adequadas à hibridação de áci dos nucleicos podem ser empregues livremente no método. É, no entanto, essencial que se as sondas detectoras actuarem como iniciadores, a marca seja seleccionada de um grupo de marcas, as guais não perturbarão a função do iniciador. A marca tem de ser ligada ao iniciador detector de modo a que a enzima de polimerização do ácido nucleico possa ainda reconhecê-lo como iniciador.
As sondas de captura como iniciadores modificados.
No outro método do presente invento as sondas de captura são oligonucleotídeos ou polinucleotídeos que podem ser ligados ao ácido nucleico alvo por emparelhamento de bases e que podem actuar como iniciadores para uma enzima sintetizadora de ácido nucleico e dependente de DNA molde. È essencial que os iniciadores de captura sejam dotados de pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade possa ser ligado. É também possível ligar o elemento ou elementos do par de afinidade, através de um mediador, ao inicidor de captura. As únicas condições são que seja possível separar o híbrido da solução de hibridação com a ajuda do par de afinidade e que a função do iniciador não seja afectada.
elemento do par de afinidade é um componente tendo afinidade para um outro componente. Por exemplo, biotina-avidina ou estreptavidina, um derivado de metal pesado - um grupotio, vários homopolinucleotídeos tais como poli dG-poli dC, poli dA - poli dT e poli dA-poli U, são exemplos de tais pares de afinidade. Mas podem também ser usados pares com outros componentes, desde que eles tenham afinidade suficientemente forte para permitir a ligação específica dos iniciadores de captura modificados tendo sido incorporados nas cópias do ácido nucleico alvo no veículo sólido. Entre ligandos e conjugados usados em métodos imunológicos encontram-se pares de afinidade adequados.
A sonda de captura selectiva.
Num dos métodos do presente invento, em que as sondas detectoras actuam como iniciadores, é necessário uma sonda de captura selectiva para permitir a separação selectiva das cópias do ácido nucleico alvo em que os iniciadores modificados foram incorporados. É essêncial que as sondas de captura sejam suficientemente homólogas do ácido nucleico alvo para permitir a sua hibridação específica com as cópias do ácido nucleico alvo e deste modo a separação selectiva e detecção dos iniciadores detectores tendo sido incorporados nas cópias do ácido nucleico alvo.
A sonda detectora selectiva.
No outro método do presente invento, em que as sondas de captura actuam como iniciadores modificados , é necessária uma sonda detectora selectiva para permitir a detecção das cópias dos ácidos nucleicos alvo em que os iniciadores modificados foram incorporados. É essêncial que a sonda detectora seja suficientemente homóloga do ácido nucleico alvo para hibridar específicamente e assim identificar selectivamente o ácido nucleico alvo. As sondas detectoras podem ser dotadas de quaisquer marcas detectáveis adequadas, por exemplo as referidas acima.
Combinações de reagentes.
A sonda detectora como iniciador modificado.
O presente invento está relacionado com uma combinação de reagentes compreendendo pelo menos um iniciador modificado, dotado de pelo menos uma marca detectável adequada ou de pelo menos um sítio específico onde pelo menos uma marca detectável adequada possa ser ligada e pelo
menos uma sonda de captura selectiva dotada de pelo menos um elemento de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligado pelo menos um elemento de um par de afinidade.
A sonda de captura como iniciador modificado.
O presente invento está também relacionado com uma combinação de reagentes compreendendo pelo menos um iniciador modificado dotado de pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligado pelo menos um elemento adequado de um par de afinidade e de pelo menos uma sonda detectora dotada de pelo menos uma marca detectável adequada ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligada uma marca detectável adequada.
I i
Kíts
O presente invento também descreve um kit adequado para ensaio de ácidos nucleicos. O kit comi preende na forma empacotada uma unidade com múltiplas diviI sões onde pelo menos uma das combinações de reagentes refeI rida atrás é combinada com pelo menos um dos seguintes reagentes ou instrumentos necessários ao teste i.e. facultativamente um recipiente contendo pelo menos um agente de polimerização dependente do molde facultativamente um recipiente com os quatro trifosfatos de desoxinucleotídeo, facultativamente um material adequado para o processo de polimerização hibridação, facultativamente um material para a separação das cópias dos ácidos nucleicos alvos e facultativamente um material adequado à testagem da marca. Os matérias e reagentes preferidos estão descritos mais detalhadamente na parte da especificação que se segue.
O método do invento.
O método preferido do presente invento começa pela adição de pelo menos dois iniciadores modificados, ambos os iniciadores sendo iniciadores detectores ou detectores de captura, a uma solução de amostra desnaturado. Os iniciadores modificados vão emparelhar com as suas cadeias complementares do ácido nucleico, i.e., o molde e quando da adição de uma enzima sintetizadora de ácido nucleico dependente de molde obtem-se o prolongamento dos iniciadores . O processo decorre eficazmente in vitro criando duas cadeias de ácido nucleico que podem ter vários milhares de bases de componente, desde que as condições sejam adequadas.
Através do uso de um excesso de iniciadores modificados o processo pode ser repetido para criar cópias complementares das novas cadeias sintetizadas, as quais são assim cópias idênticas do primeiro molde. Repetindo este processo inicia-se uma reacção em cascada através da qual é multiplicado o ácido nucleico alvo. O processo pode ser repetido tantas vezes quantas as pretendidas para se obter a sensibilidade de detecção pretendida. Nos casos em que a concentração de ácido nucleico alvo não é extremamente baixa é suficiente uma multiplicação para tornar detectável o ácido nucleico alvo.
É também possível usar apenas um iniciador modificado no método do invento. Neste caso a multiplicação é, no entanto, não tão eficaz como quando se usa pelo menos dois iniciadores pois não se trata de uma reacção do tipo cascata.
Tanto DNA como RNA podem ser determinados pelo método do presente invento. No entanto, se o ácido nucleico alvo fôr RNA é conveniente copiar primeiro o RNA para o correspondente cDNA através da enzima transcriptase reversa, após o que o processo continua como descrito acima.
Após os iniciadores modificados serem incorporados nas cópias dos ácidos nucleicos alvo adiciona-se à mistura de reacção uma sonda selectiva adequada que reconhece a sequência alvo e as suas cópias e a reacção de hibridação é efectuada em condições adequados ao respectivo processo de hibridação escolhido.
Na reacção de hibridação, dependendo da escolha dos iniciadores modificados, uma sonda de captura selectiva ou uma sonda detectora selectiva é hibridada com as cópias de ácido nucleico alvo agora presentes em quantidades muito superiores comparado com a quantidade de ácido nucleico alvo na situação original.
Se a amostra original possuir a sequência alvo, a sonda selectiva adicionada hibridará com as novas cópias sintetizadas do ácido nucleico alvo. Forma-se um híbrido entre a molécula cópia em que o iniciador modificado foi incorporado e a sonda selectiva. Os híbridos formados, são de acordo com o presente invento, convenientemente separados da solução de hibridação com a ajuda do elemento do par de afinidade, o qual é ligado ao iniciador de captura ou à sonda de captura selectiva. Durante o fraccionamento estes híbridos possuidores do elemento decaptura aderem a um veículo sólido com a ajuda do outro elemento do par de afinidade e a quantidade de sonda detectora selectiva ou de iniciador detector que adere ao veículo pode ser mantida por métodos convencionais directamente no veículo ou após eluição no eluato. A quantidade demarca é uma medida de quantidade de ácido nucleico alvo.
Antes do fraccionamento, a solução é diluída, quando necessário, de modo a tornar as condições vantajosas para o par de afinidade. A partir daqui a solução é posta em contacto com o veículo sólido. O veículo em j questão pode ser por exemplo uma coluna de cromatografia í de afinidade, um filtro, uma superfície de plástico ou uma
superfície de vidro. 0 material adequado para se fazer a separação pode ser diferentes tipos de placas de microtitulação, sistemas dipstick ou partículas magnéticas, mas é também possível efectuar a separação em tubos de ensaio ou em esferas, etc.
O material veículo da coluna de afinidade pode ser um polímero natural ou sintético, por exemplo, celulose, poliacrilamida, polistireno, dextrano ou agarose. Estes materiais podem também ser usados como suspensões ι num tubo de ensaio. É igualmente vantajoso usar tubos de ensaio tendo o outro, elemento de um par de afinidade fixados à sua superfície interna. É um pré-requisito para o material seleccionado que seja possível fixar-lhe um componente tendo afinidade para o elemento do par de afinidade que é ligado ao iniciador de captura ou à sonda de captura selectiva.
Não é necessário ligar o elemento ou elementos do par de afinidade ao iniciador de captura no I começo da polimerização. Não é também necessário ligar a marca detectável ao iniciador detector antes da polimerização. Estes podem também ser adicionados após o processo de polimerização ao iniciador modificado tendo sido incorporado nas cópias do ácido nucleico alvo. Por exemplo, quando a marca detectável é sensível às condições de hibridação ela pode ser adicionada em primeiro lugar após a hibridação da sonda de captura selectiva com as cópias do ácido nucleico alvo.
Se as sondas detectoras actuarem como iniciadores modificados a serem incorporados nas cópias do ácido nucleico alvo, o híbrido pode ser separado da mistura de reacção com a ajuda de sondas de captura selectivas imobilizadas em véiculos sólidos. Neste método que também foi descrito no Pedido de Patente Europeia N2 237362 o pas- [
so limitante da velocidade é criado quando o ácido nucleico alvo e as suas cópias, em que os iniciadores detectores foram incorporados, deve hibridar com a sonda de captura selectiva que é imobilizada num veículo sólido. Assim, a hibridação em solução é, relativamente àquele método, mais preferida neste invento. No entanto, se o método fôr efectuado usando uma sonda de captura imobilizada, o híbrido formado no veículo sólido é lavado e a quantidade de marca no veículo é medida por métodos convencionais.
principio do teste está demonstrado nos exemplos que se seguem.
Exemplo 1
Detecção de DNA de citomegalovírus usando sondas detectoras como iniciadores modificados.
i Nesta experiência modelo o alvo foi !
um plasmídeo recombinante (pBR322/CMV HindIII L) que possui um fragmento de 12,3 kb do genoma do citomegalovírus (CMV, AD 169, ATCCVR-538). Os dois iniciadores detectores (P_, α Pfa, Fig. 1) usados tinham 20 nucleotídeos de comprimento e foram sintetizados por métodos convencionais num sintetizador automático. Eles correspondenm a duas regiões da inserção específica do CMV que distam 111 nucleotídeos uma | da outra. Duas sondas de captura selectivas (Sj, S2, Fig. 1)| reconheciam regiões em cada uma das duas cadeias entre o' i dois iniciadores detectores. Os iniciadores detectores P„;
a!
e P^ foram marcados com P nos seus extremos 5' para uma actividade específica de 4x10^ CPM/ug usando a reacção bem conhecida com cinase de polinucleotídeos e gama- P-ATP (Maniatis et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ί Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Adicionaram-se nucleotídeos biotinilados aos extremos 3' das sondas de captura usando bio 11-dUTP (BRL) e transferase terminal (Promega Biotech.) como descrito por Riley et al., DNA, 5 (4)), pp 333-337, 1986. O plasmídeo alvo foi linearizado por clivagem com a enzima de restrição EcoRI. A DNA-polimerase, fragmento Klenow foi adquirida à Boehringer-Mannheim e a agarose com estreptavidina à BRL.
Utilizando estes reagentes fez-se a experiência que se segue:
Montaram-se quatro reacções diferentes
6 8 z contendo 0, 10 , 10 e 10 moléculas (correspondendo a 0, —20 —18 —16
2x10 , 2x10 e 2x10 moles) respectivamente do plasmídeo alvo. Além disto as quatro reacções continham num volume total de 50 pl:2 pmoles de cada um dos dois iniciadores, os quatro trifosfatos de desoxinucleosídeo (i.e. dATP, dCTP, dGTP, dTTP) cada um 0,5 mM, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 50 mM NaCl e 10 mM ditiotreitol. A mistura foi aquecida a 100°C durante 2 min, depois incubada durante 5 min. a 37°C, após o que se adicionou 1 pl (igual a 1 unidade) de DNA-polimerase. Em seguida a mistura foi novamente incubada durante 10 min. a 37°C. A fervura seguida de emparelhamento dos iniciadores detectores e uma incubação com a DNA polimerase adicionada a 37°C constitui um ciclo de síntese de DNA.
Nesta experiência o ciclo foi efectuado apenas uma vez ou repetido 5 ou 15 vezes. Após o último ciclo a amostra foi novamente aquecida a 100°C após o que se adicionou 10 pmoles da sonda de captura selectiva juntamente com NaCl (0,9 M), EDTA (20 mM), fosfato de sódio (pH 7,5; 20 mM) e dodecilsulfato de sódio (0,1%). O volume aumentou para 100 pl e as concentrações dadas são como concentrações finais. A mistura foi então incubada a 50°C durante 1 h. Após esta reacção de hibridação adicionou-se mo
200 pl de uma solução a 25% de estreptavidina-agarose em 1M NaCl, 20 mM fosfato de sódio (pH 7,5), 1 mM EDTA. As léculas biotiniladas ligaram-se à estreptavidina-agarose du rante 15 min. a 37°C num misturador rotativo. Colheu-se a agarose numa centrifugação curta e removeu-se o sobrenadante por aspiração. A agarose foi então lavada uma vez em NaCl 1M tamponado e duas vezes numa solução contendo 150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio e 0,2% de dodecilsulfato de sódio (pH 8) a 37°C. A radioactividade de agarose a que os híbridos formados se ligaram foi então determinada num contador de radioactividade. O processo de colheita e lavagem dos híbridos de DNA contendo uma marca biotinilada faz parte de processos préviamente conhecidos descritos e.g. na Publicação da Patente Britânica NQ 2.169.403.
Os resultados da experiência estão apresentados na Tabela 1. Pode-se observar que um ciclo de síntese de DNA incorpora radioactividade suficiente para detecção apenas se estiverem presentes concentrações elevadas de alvo mas mesmo assim a quantidade de alvo muito baixa é detectável após 15 ciclos. Com elevada quantidade de alvo e 15 ciclos a quantidade de iniciador detector torna-se limitante.
Tabela 1
Quantidade de alvo (moles) Actividade de (CPM acima do 32P nos híbridos colhidos9) fundo)13)
1 5 15 No. de ciclos
0 0 0 0
2xl0“20 ND ND 650
2xl0-18 ND 300 11000
2xl0-16 700 13000 36000
a) Média de duas determinações
b) ND-não detectável (radioactividade inferior a duas vezes a actividade média do fundo).
Exemplo 2
Determinação do DNA de citomegalovírus usando sondas de captura como iniciadores modificados.
Neste exemplo as sondas de captura actuam como iniciadores. Os reagentes usados foram os mesmos do Exemplo 1 com as seguintes excepções: Os iniciadores de captura (P P^, Fig. 1) não foram marcados com P mas em vez disto os seus extremos 5' foram modificados para conterem um resíduo de biotina. Esta modificação química foi feita usando métodos conhecidos descritos por Chollet e Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, pp 1529-1541, 1985.
As duas sondas selectivas (S1 e Sj, Fig. 1) foram neste caso marcadas nos seus extremos 5' para actuarem como sondas detectoras. As suas actividades específicas eram de aproxima9 9 damente 2x10 e 2,5x10 cpm/pg respectivamente.
As misturas de reacção foram montadas
como descrito no Exemplo 1. Os iniciadores de captura biotinilados foram no entanto, adicionados em quantidades de vezes, i.e. 20 pmoles de cada por reacção. Efectuaram-se 1,5 ou 15 ciclos como descrito após o que as amostras foram aquecidas a 100°C e adicionadas 0,5 pmoles de cada uma das sondas e S£ marcadas com Ρ. A hibridação foi efectuada nas mesmas condições do Exemplo 1.
Os híbridos foram então colhidos em estreptavidina-agarose, lavados e contada a actividade de
P, como no Exemplo 1. O resultado esta apresentado na Tabela 2.
Tabela 2
Quantidade de Actividade de 82P nos híbridos colhidos3) alvo (moles) (CPM acima do fundo)’3')
1 5 15 No. de ciclos
0 0 0 0
2xl0-20 ND ND 800
2xl0-18 ND 400 13000
2xl0-16 300 11000 54000
a) Média de duas determinações |
b) ND-Não detectável (cf ex 1) |
I
I
I i
Exemplo 3
Detecção de DNA de citomegalovirus em amostras clinicas através da utilização de sondas de captura como iniciadores modificados.
Neste exemplo a aplicabilidade do método para o estudo de amostras clínicas é demonstrada pela detecção de CMV na urina de uma criança que se sabia sofrer de uma infecção por citomegalovirus. A urina de uma criança saudável foi incluída como testemunha. Ambas as amostras consistiram em 10 ml de urina da qual se isolou o DNA total com odescrito em Virtanen et al. , J. Clin. Microbiol., .20 (6), pp 1083-1088, 1984. Os DNAs, dissolvidos em 20 pl de HjO foram usados como alvo em reacções efectuadas como descrito no Exemplo 2. Após 10 ciclos de síntese de DNA a soni da selectiva marcada foi adicionada à amostra, hibridada e I os híbridos colhidos. O DNA da urina do paciente mostrou uma radioactividade claramente elevada em híbridos enquanto que o da pessoa saudável apresentou apenas uma radioactividade de fundo. Os valores de cpms foram de 2300 e 240 res- í pectivamente. j
Exemplo 4
Detecção de RNA do vírus de Semliki Forest usando ondas de captura como iniciadores modificados.
O Exemplo 4 é para demonstrar que o mé- j todo descrito também pode ser usado para a detecção de RNA. O modelo usado foi o RNA do virus de Semliki Forest (SFV).
Os reagentes usados foram dois iniciadores de captura biotinilados no extremo 5’ (Fig. 2) (preparado como descrito no Exemplo 2), uma única sonda detectora 3 2 selectiva marcada com P no extremo 5’ (preparada como des-
crito no Exemplo 1), transcriptase reversa (Promega Biotech) e DNA-polimerase, fragmento Klenow (Boehringer Mannheim).
primeiro passo na detecção do SFV-RNA foi sintetizar uma cópia de cDNA. A mistura de reacção de 20 pi continha 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, os quatro trifosfatos de desoxinucleosídeo 0,5 mM cada, 0,5 pg de t-RNA, 10 pq de SFV-RNA, 10 pmoles do iniciador de captura e 100U de transcriptase reversa. Esta mistura foi incubada a 37°C durante 15 min. Em seguida a mistura foi aquecida a 100°C durante 5 min e arrefecida até à temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se 50 pl de uma solução contendo 10 mM Tris-HCL (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 , 10 mM ditiotreitol , 10 pmoles do iniciador de captura P^ e os 4 trifosfatos de desoxinucleosídeo 0,5 MM cada. Subiu-se a temperatura para 37°C e após 5 min adicionou-se 1U de DNA-polimerase. Após mais 10 minutos de incubação a mistura de reacção foi incubada a 100°C durante 5 min., arrefeceu-se a mistura até 37°C e fez-se 5 ciclos de síntese de DNA. Após um passo de desnaturação final adicionou-se 0,1 pmole (1,2x10^ cpm) da sonda detectora selectiva em 80 pl de 1M NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM fosfato de sódio (pH 7,5) e 0,1% dodecilsulfato de sódio. A solução foi então incubada durante 2 hrs a 55°C após o que os híbridos foram colhidos e lavados como descrito no Exemplo 1.
Como testemunha negativa das reacções, uma amostra idêntica sofreu o mesmo tratamento excepto não se ter adicionado transcriptase reversa. A mostra erti que o RNA foi convertido em cDNA com transcriptase reversa deu
420 cpm de actividade de P nos híbridos capturados, enquanto que a testemunha negativa deu 50 cpm.
I
Exemplo 5
Comparação de diferentes modos de detecção de DNA multiplicado.
Neste exemplo foram comparados três modos diferentes de detecção de DNA multiplicado. Os reagentes e o processo de multiplicação foram como descrito nos Exemplos 1 e 2 excepto as sondas de captura ou detectoras selectivas serem clones de M13, que reconhecem cerca de 100 nucleotídeos entre os iniciadores.
Os clones de M13 foram obtidos por subclonagem de um fragmento de restrição HaelII do plasmídeo recombinante pBR322/CMV HindlII L no vector fágico M13mpl0 usando técnicas convencionais. Os clones de M13 a serem adicionados como sondas de captura selectivas foram modifiTM cados com biotina usando photoprobe biotin (Vector Laboratories). Os clones de M13 a serem usados como sondas 32 detectoras selectivas foram marcados com P-dCTP usando DNA-polimerasel (o fragmento Klenow) e prolongamento do iniciador (Hu e Messing, Gene 17, p. 271-277, 1982) para uma Q actividade específica de 2x10 cpm/^g.
A multiplicação de 3xl05 moléculas (0,5x10 θ moles) do plasmídeo pBR322/CMV HindlII L linearizado foi efectuada com 10 ciclos. Para detecção de acordo com os Modos 1 e 2, empregaram-se os iniciadores detectores
Pa e marcados com P e o processo de multiplicação foi feito como descrito no Exemplo 1. Para detecção de acordo com o modo 3, usou-se 25 pmoles dos iniciadores de captura biotinilados no processo de multiplicação e a reacção foi efectuada como descrito no Exemplo 2.
Modo 1 de detecção - Sonda de captura selectiva usada para colheita dos híbridos formados em solução com ascópias do ácido nucleico alvo.
Neste modo de detecção usaram-se sondas de captura selectivas de M13 biotiniladas para colher os fragmentos de DNA multiplicados. Após o último ciclo de multiplicação a mistura de amostra foi aquecida a 100°C e 9 adicionadas 2x10 moléculas de cada uma das sondas de captura selectivas biotiniladas juntamente com NaCl (0,6M), EDTA (5 mM) , fosfato de sódio (20 mM) e SDS (0,1%). 0 volume aumentou para 100 ul e são dadas as concentrações finais.
A mistura foi incubada a 65°C durante 2 horas. Os híbridos formados foram colhidos em estreptavidina-agarose como descrito no Exemplo 1, excepto terem sido feitas duas lavagens adicionais de 1 minuto a 50°C com 15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio, 0,2% de SDS. Mediu-se a radioactividade dos híbridos colhidos.
Modo 2 de detecção - Sonda de captura selectiva imobilizada antes da sua hibridação com as cópias do ácido nucleico alvo.
Neste caso as sondas de M13 selectivas mobilizadas foram usadas para captura do DNA multiplicado. Após o último ciclo de multiplicação as amostras foram aquecidas a 100°C. Adicionou-se NaCl (0,6M), citrato de sódio (60 mM), Ficoll™ (0,02%), polivinilpirrolidona (0,02%), albumina do soro bovina (0,02%) e DNA de esperma de arenque desnaturado (0,2 mg/ml) para dar as concentrações indicadas num volume final de 100 pl. Adicionou-se a cada uma das amostras um disco de filtro de nitrocelulose no qual tinham sido imobilizadas sondas selectivas de acordo com um processo préviamente descrito (US 4.486.539). A mistura foi incubada com os filtros a 65°C durante 2 horas ou 18 horas. Após a reacção de hibridação os filtros foram lavados duas vezes durante 20 min. a 50°C com 15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio e 0,2% de SDS e medida a radioactividade ligada aos filtros.
Modo 3 de detecção - Sonda detectora ι
selectiva usada na detecção.
Aqui usaram-se sondas detectoras de M13
- .
selectivas marcadas com P para a detecção de DNA multiplicado e colheram-se os híbridos com a ajuda dos iniciadores de captura biotinilados nos extremos 5' como descrito no Exemplo 2. As amostras multiplicadas foram aquecidas a 100°C e adicionaram-se 2x10® moléculas (2x10^ cpm) de cada uma das sondas selectivas marcadas com P juntamente com sais como descrito no Modo 1. A hibridação e colheita dos híbridos formados foi feita como no Modo 1.
Na Tabela 3 está apresentada uma comparação dos resultados obtidos pelos três modos de detecção.
ι
Os Modos 1 e 3 têm a vantagem da velo-I cidade de hibridação ser mais rápida em solução comparado!
I 32' j com a hibridação em filtros no Modo 2. A actividade de Ρ i ί mais elevada é obtida pelo Modo 3 pois a sonda detectora se. ,32 lectiva contem múltiplos átomos de P por molécula.
Tabela 3
Modo Iniciadores Sonda deM13 selectiva Tempo de hibridação (horas) Actividade de 32 P nos híbridos (cpm) a)
1 Detector marcado 32 com P de captura biotinilada 2 870
2 detector marcado com P de captura imobilizada 2 18 43 920
3 de captura biotinilada detector mar- 32 cado com P 2 7800
a) Média de três determinações (cpm acima do fundo).
i
Exemplo 6
Multiplicação do DNA de citomegalovírus usando iniciadores detectores biotinilados e detecção indirecta com estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre .
Neste exemplo a multiplicação do plasmídeo específico de CMV (pBR322/CMV HindlII L) foi feita usando os iniciadores biotinilados P e P, descritos no a b
Exemplo 2 como iniciadores detectores. Os clones de M13 descritos no Exemplo 5 modificados com grupos sulfona foram usados como sondas de captura selectiva. Os híbridos formados foram colhidos em poços de microtitulação revestidos com anticorpos que reconhecem o DNA modificado com sulfona. A detecção final dos híbridos formados foi feita com um con jugado de estreptavidina peroxidase de rábano silvestre, o gual detecta as porções biotiniladas dos iniciadores.
Os clones de M13 foram modificados por uma reacção desulfonação usando reagentes e o processo recomendado por Orgenics Ltd (Yavne, Israel). Os poços de microtitulação em poliestireno (Nunc, Denmark) foram revestidos com 10 jig/ml de IgG purificada a partir de um anticor po monoclonal contra DNA modificado com sulfona (Orgenics Ldt) em tampão carbonato de sódio 10 mM (pH 9,6) durante a noite a 4°C.
Uma mistura de reacçao contendo 3x10 moléculas dos plasmídeos pBR322/CMV HindlII L linearizados ou testemunhas sem o plasmídeo e 25 pmoles de cada um dos iniciadores P^ e P^ biotinilados foram processados durante 10 ciclos de multiplicação nas condições descritas no Exemplo 1. As amostras foram aquecidas a 100°C, após o que se 9 adicionou 2x10 moléculas de cada uma das sondas de captura selectivas sulfonadas juntamente com reagentes como especif: cado no Modo 1 da detecção do Exemplo 5.
A mistura foi incubada a 65°C durante
I 2 horas, diluída com 100 ul de 0,2% de Tween 20 e transferi' .i da para os poços de microtitulaçao revestidos. Deixou-se!
os híbridos ligarem aos poços durante 2 horas a 37°C. A;
mistura de reacção foi rejeitada e os poços lavados trêsve- I zes com 0,1% de Tween 2o em cloreto de sódio 0,15M, fosfato!
de sódio 20 mM (pH 7,5) (PBS). Adicionou-se 200 pl de um conjugado de estreptavidina-heroxidase de rábano silvestre (Amersham, UK) diluido a 1:2000 numa solução de 1% de albumina do soro bovina, 0,1% de Tween 20 em PBS e incubaram-se os poços durante 45 minutos a 37°C. Após quatro lavagens como acima, adicionou-se 200 pl de uma solução de substracto consistindo em 0,46 mg/ml de O-fenileno-diamina, 0,01% !
de ^2°2 em tamP3° acetato de sódio 0,1M (pH 5,0). Após 15| min. a 22°C parou-se a reacção pela adição de 50 pl de E^SO^ j 2N e a absorvância do produto corado foi medida com um es-, ,ι pectofotometro a 492 nm. Os processos de colheita e detec- | ção foram previamente descritos por Syvãnen et al. (Nucleic Acids Res, 14, pp. 5037-5048, 1986).
i
I Os resultados da experiência estão apre- ι sentados na Tabela 4. Detectou-se claramente 3x10^ moléculas (0,5x10 moles) do plasmídeo alvo após 10 ciclos de multiplicação.
Tabela 4
Quantidade de alvo (moles) Absorvância a 492 nm a)
O,5xl0-18 0,348
0 0,120
a) Média de ensaios em triplicado.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES la. - Método para testar ácidos nucleicos através de hibridação caracterizado por as sondas de captura actuarem como iniciadores modificados a serem incorporados nas cópias do ácido nucleico alvo, a presença do qual é então detectada através de pelo menos uma sonda detectora selectiva.
    23. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender:
    a) o fornecimento de pelo menos um ini- ciador do ácido nucleico alvo com pelo menos um elemento de um par de afinidade ou pelo menos um sítio especifico onde pelo menos um elemento de um par deafinidade possa ser ligado :
    b) a reacção do referido iniciador ou iniciadores de captura com o ácido nucleico alvo de cadeia simples em condições adequadas a uma reacção de polimerização dependente de um molde;
    c) a hibridação de cópias de cadeia simples do ácido nucleico alvo onde os iniciadores de captura foram incorporados com uma sonda detectora capaz de hibri- ; dar selectivamente com o ácido nucleico alvo em condições j adequadas à reacção de hibridação: í
    d) a separação das cópias do ácido nu- cleico alvo em que os iniciadores de captura foram incorporados com a ajuda do outro elemento do par de afinidade:
    e) a detecção da presença das sondas detectoras selectivas tendo hibridado com as cópias do ácido nucleico alvo.
  2. 3a. - Método para testar ácidos nucleicos por hibridação, caracterizado por as sondas detectoras actuarem como iniciadores modificados sendo incorporados nas cópias dos ácidos nucleicos alvo que são separados atra- I vés da ajuda de pelo menos uma sonda de captura selectiva j cuja presença é então detectada.
    i
  3. 4â. - Método de acordo com a reivindi- I cação 3 caracterizado por compreender:
    í
    a) o fornecimento de pelo menos um ini- i ciador do ácido nucleico alvo com pelo menos umamarca de j tectável ou pelo menos um sítio específico onde pelo menos i uma marca detectável pode ser ligada; <
    b) a reacção do referido iniciador ou iniciadores detectores com o ácido nucleico alvo de cadeia simples em condições adequadas à reacção de polimerização dependente de um molde;
    i i
    c) a hibridação das cópias de cadeia · simples do ácido nucleico alvo, em que os iniciadores detectores foram incorporados, com uma sonda de captura capaz de hibridar selectivamente com o ácido nucleico alvo em condições adequadas à reacção de hibridação;
    I
    d) a separação das cópias do ácido nu- i cleico alvo em que os iniciadores detectores foram incorporados com a ajuda da sonda de captura selectiva;
    I
    e) a detecção da presença das cópias dos ácidos nucleicos alvo.
    I i
    I
  4. 5ã. - Método de acordo com a reivindi- cação 3 ou 4, caracterizado por a sonda de captura selecti i
    va incluir pelo menos um elemento de um par de afinidade ou pelo menos um sítio específico ao qual possa ser ligado pelo menos um elemento de um par de afinidade.
  5. 6ã. - Combinação de reagentes para tes tar ácidos nucleicos alvo caracterizado por compreender:
    a) pelo menos um iniciador modificado do ácido nucleico alvo, provido de pelo menos uma marca detectável ou de pelo menos um sítio específico onde se possa ligar pelo menos uma marca detectável; e
    b) pelo menos uma sonda de captura capaz de hibridar selectivamente com o ácido nucleico alvo, provida de pelo menos um elemento de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde se possa ligar pelo menos um elemento de um par de afinidade.
  6. 7â. - Combinação de reagentes para testar ácidos nucleicos caracterizada por compreender:
    a) pelo menos um iniciador modificado do ácido nucleico alvo, provido de pelo menos um elemento de um par de afinidade ou pelo menos um sítio específico onde possa ser ligado pelo menos um elemento de um par de afinidade ; e
    b) pelo menos uma sonda detectora capaz de hibridar selectivamente com o ácido nucleico alvo provida de pelo menos uma marca detectável ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligada pelo menos uma marca detectável.
  7. 8â. - Kit (equipamento) para testar ácidos nucleícos caracterizado por compreender na forma embalada uma unidade com várias divisões tendo:
    a) pelo menos um iniciador modificado do ácido nucleico alvo, provido de pelo menos uma marca detectável ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligada pelo menos uma marca detectável;
    b) pelo menos uma sonda de captura capaz de hibridar selectivamente com o ácido nucleico alvo, provida de pelo menos um elemento de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligado pelo menos um elemento de um par de afinidade;
    c) facultativamente uma embalagem contendo pelo menos um agente de polimerização dependente do molde;
    d) facultativamente uma embalagem com os quatro trifosfatos de desoxinucleosídeos;
    e) facultativamente um material para o processo de polimerização e de hibridação;
    f) facultativamente um material para a separação das cópias do ácido nucleico alvo.
    g) facultativamente um material para testar a marca.
  8. 9^. - kit para testar ácidos nucleicos caracterizado por compreender na forma embalada uma unidade com várias divisões tendo:
    a) pelo menos um iniciador modificado do ácido nucleico alvo, provido de pelo menos um elemento de um par de afinidade ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligado pelo menos um elemento de um par de
    -30afinidade;
    b) pelo menos uma sonda detectora capaz de hibridar selectivamente com o ácido nucleico alvo, provida de pelo menos uma marca detectável ou de pelo menos um sítio específico onde possa ser ligada pelo menos uma marca detectável;
    c) facultativamente uma embalagem compreendendo pelo menos um agente de polimerização dependente de molde;
    d) facultativamente uma embalagem com quatro trifosfatos de nucleosídeo;
    e) facultativamente um material para o processo de polimerização e hibridação;
    f) facultativamente um material para a separação das cópias do ácido nucleico alvo.
    g) facultativamente um material para testar a marca.
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