FR2613077A1 - Methode pour le dosage d'acides nucleiques, combinaison de reactifs et trousse pour doser ces acides - Google Patents
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Abstract
LA METHODE DE DOSAGE SE CARACTERISE EN CE QUE LES SONDES DE CAPTURE JOUENT LE ROLE D'AMORCES MODIFIEES, LESDITES AMORCES ETANT INCORPOREES DANS DES COPIES DE L'ACIDE NUCLEIQUE CIBLE DONT LA PRESENCE EST ENSUITE DETECTEE PAR AU MOINS UNE SONDE DE DETECTION SELECTIVE.
Description
La présente invention est relative à une mé-
thode rapide et sensible pour le dosage d'acides nu-
cléiques par des techniques d'hybridation, dans laquelle
les sondes de détection sont des amorces modifiées, les-
dites amorces étant incorporées dans des copiesdel'acide nucléique
cible avant la réaction d'hybridation et à une combinai-
son de réactifs ainsi qu'à une trousse pour celle-ci.
De plus, l'invention est relative à une méthode
pour doser des acides nucléiques par des techniques d'hy-
bridation, dans laquelle les sondes de capture sont des amorces modifiées, en étant incorporées dans des copies
d'acides nucléiques cibles avant la réaction d'hybrida-
tion et à une combinaison de réactifs ainsi qu'à une
trousse pour celle-ci.
Dans des réactions d'hybridation, on laisse un oligo- ou un polynucléotide marqué, c'est-à-dire la sonde, subir un appariement de basesavec la cible acide
nucléique. Diverses méthodes d'hybridation ont été uti-
lisées pour la détection des acides nucléiques. Dans des méthodes d'hybridation directes, le spécimen est soit en
solution, soit fixé à un support solide. L'acide nucléi-
que devant être identifié est mis en évidence au moyen
d'une sonde marquée.
Une méthode d'hybridation de type sandwich a été décrite dans le Brevet US N 4 486 539. On utilise dans cette méthode deux sondes distinctes, l'une qui est
une sonde de détection marquée et utilisée pour la dé-
tection et l'autre étant une sonde de capture immobi-
lisée sur un support solide pour la séparation de l'acide
nucléique cible du mélange réactionnel.
La méthode d'hybridation en solution est dé-
crite dans la publication du Brevet britannique N 2 169 403. On utilise dans cette méthode, deux sondes différentes qui sont toutes deux dans la même phase en solution. La sonde de détection est marquée avec un traceur détectable et une moitié ayant une affinité
pour un autre composant est fixée à la sonde de capture.
Après hybridation, l'hybride formé entre la sonde de
capture, l'acide nucléique cible et la sonde de détec-
tion, peut être séparé de la solution d'hybridation à l'aide de l'autre moitié de la paire d'affinité.
La polymérisation d'ADN catalysée par une en-
zyme, o la séquence de nucléotides d'un brin d'acide nucléique déjà existant, c'est-à-dire la matrice, est copiée avec précision dans son brin complémentaire, est
bien connue dans l'Art et elle a été décrite par exem-
ple dans Kornberg, DNA replication, W.H. Freeman & Co, San Francisco, pp. 221-225 et 670-679, 1980 et Maniatis et coll. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, p. 122, 1982. Cette multipli-
cation biologique est utilisée dans des essais d'hybri-
dation dans lesquels la bactérie à détecter est cultivée
et donc son ADN enrichi avant le test et elle est dé-
crite par exemple dans Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 et dans le Brevet US N 4 358 535. Des séquences
d'ADN spécifiques peuvent être aussi amplifiées à l'in-
térieur des cellules vivantes, par exemple au moyen de médicaments convenables tels qu'ils sont décrits par Clewell et Helinski dans J. Bacteriol. 110, p. 1135,
1972 et dans la Demande de Brevet Européen N 0 055 742.
Un enrichissement d'ADN plus spécifique est décrit dans la Demande de Brevet Européen N 0 175 689 dans laquelle
la cible est liée à un replicon plasmidique et intro-
duite dans une cellule convenable. Une autre méthode en-
core est décrite dans la Demande de Brevet Européen N 0 201 189, dans laquelle la dépendance de l'amorce de la synthèse d'ADN est utilisée pour créer une réaction
in vitro pour l'amplification de l'ADN cible. Une mé-
thode pour détecter des gènes amplifiées est suggérée
dans la Demande de Brevet Européen N 0 200 362.
Dans la méthode d'hybridation de la présente invention, soit les sondes de détection, soit les sondes
de capture jouent le rôle d'amorces modifiées étant in-
corporées dans des copies de l'acide nucléique cible
dans un procédé de polymérisation dépendant d'une ma-
trice avant la réaction d'hybridation. Dans la méthode de l'invention, une amorce au
moins est nécessaire et les amorces sont toujours modi-
fiées. Si les sondes de détection jouent le rôle d'amor-
ces dans la réaction de polymérisation, les amorces sont pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être
attaché au moins un marqueur détectable convenable.
Dans une variante, les sondes de capture peu-
vent être utilisées comme amorces dans la réaction de polymérisation, auquel cas les amorces sont pourvues d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être
attachée au moins une moitié convenable d'une paire d'af-
finité. L'invention décrit aussi une combinaison de
réactifs et une trousse comprenant sous une forme condi-
tionnée, une unité à plusieurs récipients comprenant la combinaison de réactifs requis pour la réalisation du test.
En utilisant les sondes de détection ou de cap-
ture en tant qu'amorces dans une réaction de polyméri-
sation, il est possible d'augmenter de plusieurs ordres de grandeur la sensibilité de la réaction d'hybridation
par rapport aux méthodes mesurant directement la cible.
De plus, l'invention fournit une méthode commode pour mettre en oeuvre la réaction d'hybridation en solution, si bien que les hybrides sont facilement et rapidement séparés de la solution d'hybridation après la réaction d'hybridation. La méthode de l'invention est commode pour
diagnostiquer certaines maladies, qui sont très diffici-
les à diagnostiquer avec des méthodes classiques. La mé-
thode est donc particulièrement utile pour l'identifi-
cation de cytomégalovirus et de virus de HI ou du SIDA.
La Fig. 1 représente la séquence de bases des amorces modifiées, Pa et Pb et également des sondes sé- lectives S1 et S2 utilisées dans les Exemples 1, 2 et 3, ainsi que les sites relatifs des amorces modifiées P a et Pb ' et des sondes sélectives S1 et S2 sur l'acide nucléique cible en question. Les longues lignes A et B indiquent les deux brins cibles qui se poursuivent dans
les deux directions. Les têtes de flèches sur les amor-
ces Pa et Pb ' indiquent la direction dans laquelle
elles sont allongées dans le procéd de polymérisation.
La Fig. 2 représente la séquence de bases des amorces modifiées, Pa et Pb ' et de la sonde sélective
S utilisée dans l'Exemple 4, ainsi que les sites rela-
tifs des amorces modifiées, P et Pb et de la sonde sé-
lective S sur l'acide nucléique cible en question. La ligne A indique l'ADN et ses copies d'ADN identiques
et la ligne B montre les copies d'ADN complémentaires.
Les têtes de flèche sur les amorces Pa et Pb indiquent la direction dans laquelle elles sont allongées dans le
procédé de polymérisation.
Préparation du matériel d'essai.
Les sondes utilisées dans la méthode sont des oligo- ou des polynucléotides. Les sondes peuvent être préparées de façon synthétique ou semi-synthétique, qui sont les modes préférés pour préparer des sondes, qui joueront également le rôle d'amorces. Il est aussi tout-à-fait possible de préparer les sondes par des
techniques recombinantes, ou à partir d'acides nucléi-
ques isolés directement à partir de la nature. Une sonde
peut être liée à un vecteur convenable. Elle peut conte-
nir des parties de vecteur ou être complètement dépourvue de parties de vecteur. Actuellement, un grand nombre
d'amorces et de sondes convenables qui peuvent être uti-
lisées, sont disponibles industriellement.
Sondes de détection en tant qu'amorces modifiées.
Selon l'une des méthodes de la présente inven-
tion, les sondes de détection sont des oligonucléotides ou des polynucléotides, qui peuvent être liés à l'acide
nucléique cible par un appariement de bases et qui peu-
vent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthéti-
sant un acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est O10 essentiel que les amorces de déte tion soient pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins un marqueur
détectable convenable peut être attaché.
Divers isotopes radioactifs ou des composés marqués radioactivement peuvent être utilisés en tant que marqueur. La substance de marquage peut aussi être fluorescente, luminescente, émettrice de lumière, mise en évidence de façon enzymatique ou immunologique, etc. Des marqueurs reposant sur l'affinité de la biotine et de l'avidine ou de la streptavidine, des chélates de
lanthanides, de la ferritine et des hèmes, et des hap-
tènes pouvant être mis en évidence de façon immunologique
comme AAF et AIF (dérivés d'acétoxyacétylfluorène) peu-
vent être mentionnés à titre d'exemples. Il est aussi
possible d'effectuer l'identification à l'aide de média-
teurs par exemple des protéines.
La méthode selon l'invention ne dépend pas du
marqueur utilisé. Toute les substances de marquage cou-
ramment connues convenables pour l'hybridation d'acides
nucléiques peuvent être librement appliquées à la méthode.
Il est cependant essentiel que dans le cas o les sondes de détection jouent le rôle d'amorces, le marqueur soit choisi dans un groupe de marqueurs qui ne perturbe pas le fonctionnement de l'amorce. Le marqueur doit être
attaché à l'amorce de détection de telle sorte que l'en-
zyme polymérisant l'acide nucléique puisse encore le re-
connaître en tant qu'amorce.
Sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
Selon l'autre méthode de la présente inven-
tion, les sondes de capture sont des oligonucléotides ou des polynucléotides, qui peuvent être liés à l'acide
nucléique cible par un appariement de bases et qui peu-
vent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthéti-
sant l'acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est essentiel que les amorces de capture soient pourvues d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site sur lequel au moins une moitié
convenable d'une paire d'affinité peut être attachée.
Il est aussi possible d'attacher la moitié ou les moitiés
de la paire d'affinité par l'intermédiaire d'un média-
teur à l'amorce de capture. Il faut seulement qu'il soit
possible de séparer l'hybride de la solution d'hybrida-
tion à l'aide de la paire d'affinité et que la fonction
d'amorce ne soit pas altérée.
La moitié de la paire d'affinité est un compo-
sant ayant une affinité pour un autre composant. Par exemple, les paires biotine - avidine ou streptavidine,
dérivé de métal lourd - groupe thio, divers homopoly-
nucléotides comme poly dG - poly dC, poly dA - poly dT
et poly dA - poly U, sont de telles paires d'affinité.
Mais on peut aussi utiliser d'autres paires de compo-
sants à condition qu'elles aient une affinité assez forte pour permettre la liaison spécifique des amorces
de capture modifiées ayant été incorporées dans les co-
pies de l'acide nucléique cible au support solide. On a trouvé des paires d'affinité convenables parmi des ligands et des conjugués utilisés dans des méthodes immunologiques.
Sonde de capture sélective.
Dans l'une des méthodes de la présente inven-
tion, dans laquelle les sondes de détection jouent le rôle d'amorces, il faut une sonde de capture sélective pour permettre la séparation sélective des copies de
l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incor-
porées les amorces modifiées. Il est essentiel que les sondes de capture soient suffisamment homologues de l'a- cide nucléique cible pour permettre leur hybridation spécifique avec les copies de l'acide nucléique cible et
donc une séparation et une détection sélective des amor-
ces de détection ayant été incorporées dans les copies
de l'acide nucléique cible.
Sonde de détection sélective.
Dans l'autre méthode de la présente invention,
dans laquelle les sondes de capture jouent le rôle d'a-
morces modifiées, il faut une sonde de détection sélec-
tive pour permettre la détection des copies des acides nucléiques cibles dans lesquelles ont été incorporées les
amorces modifiées. Il est essentiel que la sonde de dé-
tection soit suffisamment homologue de l'acide nucléique cible pour s'hybrider spécifiquement et identifier ainsi
l'acide nucléique cible sélectivement. Les sondes de dé-
tection peuvent être pourvues de quelconques marqueurs détectables convenables, par exemple de ceux qui sont
mentionnés ci-dessus.
Combinaisons de réactifs.
Sonde de détection en tant qu'amorce modifiée.
La présente invention est relative à une com-
binaison de réactifs comprenant au moins une amorce mo-
difiée pourvue d'au moins un marqueur détectable conve-
nable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachés au moins un marqueur détectable convenable et au moins une sonde de capture sélective pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins
une moitié d'une paire d'affinité.
Sonde de capture en tant qu'amorce modifiée.
La présente invention est aussi relative à une combinaison de réactifs comprenant au moins une amorce modifiée pourvue d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site sélectif sur lequel peut être attachée au moins une moitié convenable
d'une paire d'affinité; et au moins une sonde de détec-
tion sélective pourvue d'au moins un marqueur détecta-
ble convenable ou d'au moins un site spécifique sur le-
quel peut être attaché au moins un marqueur détectable convenable. Trousses. La présente invention décrit aussi une trousse convenable pour doser des acides nucléiques. La trousse comprend sous forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients dans laquelle l'une des combinaisons de réactifs mentionnées plus haut est combinée à au moins l'un des réactifs ou dispositifs suivants requis dans
le test, c'est-à-dire éventuellement un récipient com-
prenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, éventuellement un récipient avec les quatre
désoxynucléosiee triphosphates, éventuellement un dispo-
sitif convenable pour le procédé de polymérisation et d'hybridation, éventuellement un dispositif convenable
pour la séparation des copies des acides nucléiques ci-
bles et éventuellement un dispositif convenable pour do-
ser le marqueur. Les réactifs et dispositifs préférés sont
décrits en détail dans la description ultérieure.
Méthode de l'invention.
La méthode préférée de la présente invention
commence par l'addition d'au moins deux amorces modi-
fiées, les deux amorces étant soit des amorces de détec-
tion, soit de capture, à une solution d'échantillon dé-
naturé. Les amorces modifiées vont chacune s'enrouler sur
le brin complémentaire de l'acide nucléique cible, c'est-
à-dire la matrice et par addition d'une enzyme synthéti-
sant l'acide nucléique dépendant d'une matrice, les
amorces seront allongées. Le procédé se déroule effica-
cement in vitro et crée de nouveaux brins d'acide nucléi-
que qui peuvent avoir plusieurs milliers de bases de long, si les conditions sont convenables Le procédé peut être répété pour créer des
copies complémentaires des brins nouvellement synthé-
tisés, par l'utilisation d'un excès des amorces modi-
fiées, lesquelles sont donc des copies identiques de la première matrice. En répétant ce procédé, on initie une réaction en cascade, si bien que l'acide nucléique cible est multiplié. Le procédé peut être répété autant
de fois que l'on veut, pour obtenir la sensibilité de dé-
tection désirée. Dans les cas o la concentration de l'acide nucléique cible n'est pas extrêmement faible, une multiplication suffit pour rendre détectable l'acide
nucléique cible.
Il est aussi possible de n'utiliser qu'une amorce modifiée dans la méthode de l'invention. Dans
ce cas, la multiplication n'est cependant pas aussi ef-
ficace qu'avec au moins deux amorces, parce que la réac-
tion n'est pas une réaction du type en cascade.
A la fois l'ADN et l'ARN peuvent être déter-
minés par la méthode de la présente invention. Cependant,
si l'acide nucléique cible est un ARN, il est plus com-
mode de copier d'abord l'ARN en l'ADNc correspondant par une enzyme transcriptase-inverse, puis de poursuivre
ensuite le procédé comme cela est décrit plus haut.
Après incorporation des amorces modifiées dans les copies des acides nucléiques cibles, on ajoute une
sonde sélective convenable reconnaissant la séquence ci-
ble et ses copies dans le mélange réactionnel et l'on effectue la réaction d'hybridation dans des conditions convenables pour le procédé d'hybridation respectif choisi. Dans la réaction d'hybridation, en fonction du choix des amorces modifiées, on laisse s'hybrider soit
une sonde de capture sélective, soit une sonde de détec-
tion sélective, avec les copies de l'acide nucléique ci-
ble maintenant présentes en quantité fortement accrue par rapport à la quantité d'acide nucléique cible dans
la situation d'origine.
Si l'échantillon d'origine contenait la sé-
quence cible, la sonde sélective ajoutée s'hybride aux copies nouvellement synthétisées de l'acide nucléique cible. Il se forme un hybride entre la molécule de copie dans laquelle a été incorporée l'amorce modifiée et la
sonde sélective. Les hybrides formés sont, selon la pré-
sente invention, commodément séparés de la solution
d'hybridation à l'aide de la moitié de la paire d'affi-
nité, qui est attachée soit à l'amorce de capture, soit
à la sonde de capture sélective. Au cours du fractionne-
ment, ces hybrides contenant la moitié capturante adhè-
rent à un support solide grâce à l'autre moitié de la paire d'affinité et la quantité de sonde de détection sélective ou d'amorce de détection adhérant au support peut être mesurée par des méthodes classiques, directement
à partir du support ou après élution à partir de l'éluant.
La quantité de marqueur est une mesure de la quantité
d'acide nucléique cible.
Avant le fractionnement, la solution est di-
luée, si cela est nécessaire, pour rendre avantageuses les conditions pour la paire d'affinité. La solution est
ensuite mise en contact avec le support solide. Le sup-
port en question peut être par exemple une colonne de
chromatographie d'affinité, un filtre, une surface plas-
tique ou une surface de verre. Des dispositifs commodes pour effectuer la séparation comprennent différents types de plaques de microtitration, des systèmes à plongeur ou
des particules magnétiques, mais il est tout à fait pos-
il sible de réaliser la séparation dans des tubes à essais et sur des billes, etc. Le matériau support de la colonne d'affinité
peut être un polymère naturel ou synthétique, par exem-
ple une cellulose, un polyacrylamide, un polystyrène, du dextrane ou de l'agarose. Ces matières peuvent être aussi utilisées en tant que suspensions dans un tube à essais. Il est aussi avantageux d'utiliser des tubes à essais ayant l'autre moitié d'une paire d'affinité fixéesur sa surface intérieure. Il est indispensable qu'on puisse fixer sur la matière choisie un composant
ayant une affinité pour la moitié de la paire d'affi-
nité qui est attachée à l'amorce de capture ou à la sonde
de capture sélective.
Il n'est pas nécessaire d'attacher la ou les moitiés de la paire d'affinité à l'amorce de capture au commencement de la polymérisation. Il n'est pas non plus nécessaire d'attacher le marqueur détectable à
l'amorce de détection avant la polymérisation. Ils peu-
vent être aussi ajoutés après le procédé de polymérisa-
tion à l'amorce modifiée ayant été incorporée dans les copies de l'acide nucléique cible. Par exemple, lorsque le marqueur détectable est sensible aux conditions
d'hybridation, il peut être d'abord ajouté après l'hybri-
dation de la sonde de capture sélective avec les copies
de l'acide nucléique cible.
Si les sondes de détection jouent le rôle
d'amorces modifiées ayant été incorporées dans les co-
pies de l'acide nucléique cible, l'hybride peut être séparé du mélange réactionnel au moyen des sondes de
capture sélectives immobilisées sur des supports soli-
des. Dans cette méthode, qui a été aussi décrite dans la
* Demande de Brevet Européen N 0 237 362, l'étape limi-
tant la vitesse est créée lorsque l'acide nucléique cible et ses copies, dans lesquelles ont été incorporées des amorces de détection, doivent s'hybrider avec la sonde de capture sélective qui est immobilisée sur un support solide. L'hybridation en solution est donc une méthode plus avantageuse de l'invention que celle-là. Cependant, si la méthode est réalisée avec une sonde de capture immobilisée, l'hybride formé sur le support solide est
lavé et la quantité du marqueur sur le support est me-
surée par des méthodes classiques.
Le principe du test est mis en évidence dans les Exemples suivants:
EXEMPLE 1
Détection d'ADN de cytomégalovirus avec des sondes de
détection en tant qu'amorces modifiées.
Dans cette expérience modèle, la cible était
un plasmide recombinant (pBR322/CMV HindIII L) qui in-
cluait un fragment de 12,3 kb du génome du cytomégalo-
virus (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Les deux amorces de
détection (Pa ' Pb ' Fig. 1) utilisées avaient une lon-
gueur de 20 nucléotides et étaient synthétisées par des méthodes standards sur un synthétiseur automatisé. Ils correspondaient à deux régions sur l'insert spécifique du CMV qui étaient distantes de 111 nucléotides. Deux
sondes de capture sélectives (S1, S2, Fig. 1) recon-
naissaient des régions sur chacun des deux brins entre
les deux amorces de détection. Les amorces de détec-
32p leurs ex-3
tion P et P ont été marquées avec du 32P à leurs ex-
a b9 trémités 5', à une activité spécifique de 4.10 CPM/pg grâce à la réaction bien connue avec la polynucléotide
kinase et le gamma-32P-ATP (Maniatis et coll., Mole-
cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982).
Des nucléotides biotinylés ont été ajoutés aux extrémités 3' des sondes de capture avec du bio 11-dUTP (BRL) et de la transférase terminale (Promega Biotech.) comme cela est décrit par Riley et coll., DNA, 5 (4), pp. 333-337, 1986. Le plasmide cible a été
linéarisé par coupure avec l'enzyme de restriction EcoR!.
L'ADN polymérase, le fragment de Klenow, a été achetée chez BoehringerMannheim et la streptavidine agarose
chez BRL.
L'expérience suivante a été réalisée avec ces réactifs. Quatre réactions différentes ont été assemblées
4 6 8
contenant 0, 104, 10 et 10 molécules (correspondant à
0,2 x 10- 20 2 x 10- 18 et 2 x 10- 16 moles) respective-
ment cible. De plus, toutes les quatre réactions conte-
naient en un volume total de 50 pl: 2 pmoles de cha-
cune des deux amorces, 0,5 mM de chacun des quatre dé-
soxynucléoside triphosphates (c'est-à-dire dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM de MgC12, 50 mM de NaCl et 10 mM de dithiothréitol. Le mélange a été chauffé à 100 C pendant 2 minutes, puis incubé pendant 5 minutes à 37 C et ensuite additionné
de 1 pl (équivalent à une unité) d'ADN polymérase. En-
suite, le mélange a été encore incubé pendant 10 minu-
tes à 37 C. L'ébullition suivie d'un enroulement des amorces de détection et d'une incubation avec de l'ADN
polymérase ajoutée à 37 C, constituent un cycle de syn-
thèse d'ADN.
Dans cette expérience, le cycle a été réalisé soit une seule fois, soit répété 5 ou 15 fois. Apres le dernier cycle, l'échantillon a été encore lavé à 100 C, puis 10 pmoles de la sonde de capture sélective ont été ajoutées avec du NaCl (0,9 M), de 1'EDTA (20 mM), du
phosphate de sodium (pH 7,5; 20 mM) et du dodécylsul-
fate de sodium (0,1 %). Le volume atteignait 100 pl et
les concentrations données sont des concentrations fi-
nales. Le mélange a été ensuite incubé à 50 C pendant une heure. Après cette réaction d'hybridation, on a ajouté 200 pl d'une suspension à 25 % de streptavidine dans du NaCl 1 M, du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) et de i'EDTA 1 mM. Les molécules biotinylées ont été laissées se fixer au streptavidine-agarose pendant 15 minutes à 37 C dans un mélangeur tournant. L'agarose
a été collecté par une brève centrifugation et le sur-
nageant enlevé par aspiration. L'agarose a été ensuite lavé une fois dans du NaCl 1 M tamponné et deux fois dans une solution contenant 150 mM de NaCl, 15 mM de citrate de sodium et 0,2 % de dodécylsulfate de sodium (pH 8) à 37 C. La radioactivité de l'agarose auquel
étaient liés les hybrides formés, a été ensuite déter-
minée dans un compteur de radioactivité. La procédure
de récolte et de lavage pour des hybrides d'ADN conte-
nant un marqueur biotinylé sont des procédures déjà con-
nues décrites par exemple dans la Publication de Brevet
britannique N 2 169 403.
Les résultats de l'expérience sont montrés dans le Tableau I. On constate qu'un cycle de synthèse
d'ADN incorpore assez de radioactivité pour la détec-
tion seulement s'il y a de fortes concentrations de ci-
ble, mais que, même la très faible quantité de cible est détectable après 15 cycles. La quantité d'amorce de détection devient limitante avec une forte quantité de
cible et 15 cycles.
TABLEAU 1
Quantité de Activité de 32p dans des hybrides cible (moles) collectés a) (CPM au-dessus du fondb) 1 5 15 N de cycles
0 0 0 0
-20 2 x 10 ND ND 650 2 x 10 ND 300 11000 -16 2 x 10 700 13000 36000 a) Moyenne de deux déterminations b) ND - non détectable (moins de radioactivité que 2 fois l'activité moyenne du fond)
EXEMPLE 2
Détermination de l'ADN de cytomégalovirus avec des sondes
de capture en tant qu'amorces modifiées.
Dans cet Exemple, les sondes de capture jouent le rôle d'amorces. Les réactifs utilisés étaient les
mêmes que dans l'Exemple 1 avec les exceptions suivantes.
Les amorces de capture (Pa ' Pb ' Fig. 1) n'étaient pas marquées avec du P, mais leur extrémité 5' était
plutôt modifiée de façon à contenir un résidu biotine. Cette modification chimique a été faite selon des mé-
thodes connues, décrites par Chollet et Kawashima,Nucleic
Acids Research, 13, pp. 1529-1541, 1985. Les deux son-
des sélectives (S1 et S2, Fig. 1) étaient dans ce cas marquées à leur extrémité 5' de façon à jouer le rôle de sondes de détection. Leur activité spécifique était
d'environ 2 x 109 et 2,5 x 109 cpm/pg respectivement.
Les mélanges de réaction ont été assemblés selon la procédure de l'Exemple 1. Les amorces de capture biotinylées ont été cependant ajoutées en des quantités décuples, c'est-à-dire à raison de 20 pmoles de chacune par réaction. On a effectué 1, 5 ou 15 cycles comme cela est décrit plus haut, puis on a chauffé les échantillons à 100 C et ajouté 0, 5 pmole de chacune des sondes S1 et S2 marquées par du 32p. L'hybridation a été effectuée
dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 1.
Les hybrides ont été ensuite collectés sur streptavidine-agarose, lavés et leur activité de 32p comptée, comme dans l'Exemple 1. Le résultat est fourni
dans le Tableau 2.
Quantité de Activité de P dans les hybrides col-
cible (moles) lectés a)(CPM au-dessus du fond) b) 1 5 15 N de cycles
0 0 0 0
-20 2 x 10 20 ND ND 800 2 x 101 ND 400 13000 2 x 1016 300 11000 54000 a) Moyenne de deux déterminations b) ND - non détectable (cf ex 1)
EXEMPLE 3
Détection d'ADN de cytomégalovirus à partir d'échantil-
lons cliniques avec des sondes de capture en tant qu'a-
morces modifiées.
On a démontré dans cet Exemple, l'applicabi-
lité de la méthode à l'étude d'échantillons cliniques par la détection de CMV à partir de l'urine d'un jeune
enfant souffrant d'une infection par un cytomégalovirus.
L'urine provenant d'un enfant en bonne santé a été in-
w.. cluse comme témoin. Les deux échantillons étaient 10 ml
d'urine dont l'ADN total avait été isolé de la façon dé-
crite dans Virtanen et coll., J. Clin. Microbiol., 20 (6), pp. 1083-1088, 1984. Les ADN dissous dans 20 pl de H20 ont été utilisés comme cible dans des réactions qui ont été par ailleurs effectuées selon la procédure de l'Exemple 2. Après 10 cycles de synthèse d'ADN, la sonde sélective marquée a été ajoutée à l'échantillon
laissée s'hybrider et les hybrides collectés. L'ADN pro-
venant de l'urine du malade a présenté une radioactivité nettement élevée dans des hybrides tandis que celui de
la personne en bonne santé ne présentait que la radio-
activité de fond. Les valeurs de cpm réelles étaient de
2300 et 240 respectivement.
EXEMPLE 4
Détection de l'ARN du virus Semiliki Forest avec des
sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
L'Exemple 4 montre que la méthode décrite peut aussi être utilisée pour la détection d'ARN. Le modèle
utilisé était 'ARN du virus Semiliki Forest (SFV).
Les réactifs utilisés étaient deux amorces de capture biotinylées en 5' (Fig. 2) (préparés selon la procédure de l'Exemple 2), une seule sonde de détection sélective marquée par du 32p en 5' (préparée selon la procédure de l'Exemple 1), une transcriptase inverse (Promega Biotech) et une ADN polymérase, fragment de
Klenow (Boehringer Mannheim).
La première étape de la détection de 'ARN de SFV consistait à synthétiser une copie d'ADNc. Les
pl de mélange réactionnel contenaient 10 mM de tris-
C1 (pH 8,3), 50 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, 10 mM de
dithiothréitol, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynu-
cléoside triphosphates, 0,5 ug de l'ARNc, 10 pg d'ARN de SFV, 10 pmoles d'amorce de capture Pa et 100 U de transcriptase inverse. Ce mélange a été incubé à 37 C pendant 15 minutes. Puis le mélange a été chauffé à C pendant 5 minutes et refroidi à la température
ambiante. On a ensuite ajouté 50).l d'une solution con-
tenant 10 mM de tris-Cl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 10 pmoles de l'amorce
de capture Pb et 0,5 mM de chacun des 4 désoxynucléoside-
triphosphates. La température a été élevée à 37 C et après une période de 5 minutes, 1U d'ADN-polymérase a été ajoutée. Apres 10 minutes d'incubation supplémentaires le mélance réactionnel a été incubé à 100 C pendant 5 minutes, refroidi à 37 C et 5 cycles de synthèse d'ADN ont été effectués. Après une étape de dénaturation finale, on aajouté 0,1 pmole (1,2.106 cpm) de la sonde détectrice sélective dans 80 pl de NaCl 1 M, 50 mM d'EDTA, 50 mM
de phosphate de sodium (pH 7,5) et 0,1 % de dodécylsul-
fate de sodium. La solution a été ensuite incubée
pendant 2 heures à 55 C, puis les hybrides ont été col-
lectés et lavés selon la procédure de l'Exemple 1. Un témoin négatif pour les réactions était fourni par un échantillon identique qui a été soumis au même traitement, sauf que la transcriptase inverse n'a pas été ajoutée. L'échantillondans lequel 1'ARN était converti en ADNc avec la transcriptase inverse a donné
une activité de 32p de 420 cpm dans des hybrides cap-
turés, tandis que le témoin donnait une activité de 5U cpm.
EXEMPLE 5
Comparaison de différents modes de détection d'ADN mul-
tiplié.
On a comparé dans cet Exemple trois différents modes de détection d'ADN multiplié. Les réactifs et le procédé de multiplication étaient tels que décrits dans les Exemples 1 et 2, sauf que les sondes de détection
ou de capture sélectives étaient des clones M13 recon-
naissant environ 100 nucléotides entre les amorces.
On a obtenu les clones M13 en sous-clonant un fragment de restriction HaeIII de plasmide recombinant pBR322/CMV HindIII L dans le vecteur phage M13mplO avec des techniques standards. Les clones M13 à ajouter en tant que sondes sélectives de capture étaient modifiés avec de la biotine au moyen de la photoprobeTM (marque déposée) biotine (Vector Laboratories). Les clones M13 devant servir de sondes sélectives de détection étaient marqués avec du 32P-dCTP au moyen d'ADN-polymérase I (le fragment de Klenow) et d'un allongement d'amorce
(Hu et Messing, Gene 17, pp. 271-277, 1982)) une acti-
vité spécifique de 2 x 108 cpm/Pg.
La multiplication de 3 x 105 molécules (0,5 x 10 18 moles) du plasmide linéarisé pBR322/CMV HindIII L
a été effectuée avec 10 cycles. Pour effectuer la détec-
tion selon les modes 1 et 2, on a employé 2 pmoles de chacune des amorces de détection Pa et Pb marquées par du 32P et effectué le procédé de multiplication selon la procédure de l'Exemple 1. Dans le cas de la détection selon le Mode 3, on a utilisé 25 pmoles des amorces de capture biotinylées dans la procédure de multiplication
et réalisé la réaction selon la procédure qui est dé-
crite dans l'Exemple 2.
Mode 1 de détection - sonde sélective de cap-
ture utilisée pour collecter des hybrides formés en so-
lution avec les copies de l'acide nucléique cible.
Dans ce mode de détection, on a utilisé des
sondes sélectives de capture M13 biotinylées pour col-
lecter les fragments d'ADN multipliés. Après le dernier cycle de multiplication, le mélange d'échantillon a été chauffé à 100 C et additionné de 2 x 109 molécules de chacune des sondes sélectrices de capture biotinylées, avec du NaCl (0,6 M), de l'EDTA (5 mM), du phosphate de sodium (20 mM) et du SDS (0,1 %). Le volume a été porté
à 100 pl et les concentrations finales sont données.
Le mélange a été incubé à 65 C pendant 2 heures. Les
hybrides formés ont été collectés sur streptavidine-
agarose selon la procédure de l'Exemple 1, sauf que deux lavages supplémentaires d'une minute ont été effectués à 50 C avec du NaCl 15 mM, du citrate de sodium 1,5 mM, 0,2 % de SDS. La radioactivité des hybrides collectés
a été mesurée.
Mode 2 de détection - Sonde sélective de cap-
ture immobilisée avant son hybridation avec les copies
de l'acide nucléique cible.
On a utilisé dans ce cas, des sondes M13 sé-
lectives immobilisées pour capturer l'ADN multiplié.
Après le dernier cycle de multiplication, les échantil-
lons ont été chauffés à 100 C. On a ajouté du NaCl (0,6 M), du citrate de sodium (60 mM), du FicollTM (marque déposée) (0,02 %), de la polyvinylpyrrolidone (0,02 %), de l'albumine de sérum bovin (0,02 %) et de l'ADN de sperme de hareng dénaturé (0,2 mg/ml) pour donner les concentrations indiquées dans un volume final de 100 pl. On a ajouté à chaque échantillon, un disque de filtre de nitrocellulose sur lequel ont été immobilisées 5 x 10 molécules de chacune des sondes sélectives selon une procédure décrite préalablement
(US 4 486 539). Le mélange a été incubé avec les fil-
tres à 65 C pendant 2 heures ou 18 heures. Apres la réaction d'hybridation, les filtres ont été lavés deux fois pendant 20 minutes à 50 C avec du NaCl 15 mM, du
citrate de sodium 1,5 mM et 0,2 % de SDS et la radio-
activité liée aux filtres a été mesurée.
Mode 3 de détection - Sonde sélective de dé-
tection utilisée pour la détection.
On a utilisé des sondes de détection M113 sé-
lectives marquées par du P pour la détection de l'ADN multiplié et collecté les hybrides à l'aide des amorces de capture biotinylées aux extrémités 5', comme cela
est décrit dans l'Exemple 2. Les échantillons multi-
pliés ont été chauffés à 100 C et additionnés de
8 V
2 x 10 molécules (2 x 10 cpm) de chacune des sondes sélectives marquées par du 32p, avec les sels indiqués à propos du Mode 1. L'hybridation et la collection des hybrides formés ont été effectuées de la façon qui est
décrite dans le Mode 1.
Le Tableau 3 montre une comparaison des ré-
sultats obtenus par les trois modes de détection.
Les Modes 1 et 3 ont l'avantage de la plus grande
vitesse d'hybridation en solution par rapport à l'hybri-
dation sur filtre dans le mode 2. On obtient la plus forte
activité de 32p par le mode 3 parce que la sonde de dé-
tection sélective contient plusieurs atomes de 32p par
molécule.
TABLEAU 3
Mode Amorces Sonde M13 Durée Activité de sélective d'hybridation 32p dans les (Heures) hybrides (cpm) a) 1 Détection mar- Biotinylée quée par du 32p de capture 2 870 2 Détection mar- Immobilisée 2 43 quée par du 32p de capture 18 920
3 Biotinylée Détection mar-
de capture quée par du 32p 2 7800 a) Moyenne de trois déterminations (cpm au-dessus du fond)
EXEMPLE 6
Multiplication d'ADN de cytomégalovirus avec des amorces de détection biotinylées en une détection indirecte avec
un conjugué peroxydase streptavidin-raifort.
Dans cet Exemple, on a effectué la multipli-
cation du plasmide spécifique du CMV (pBR322/CMV HindIIIL) en utilisant les amorces biotinylées Pa et Pb décrites dans l'Exemple 2 en tant qu'amorces de détection. Les clones M13 décrits dans l'Exemple 5 modifiés avec des
groupes sulfone, ont été utilisés comme sondes sélecti-
ves de capture. Les hybrides formés ont été collectés dans des puits de microtitration enduits d'anticorps reconnaissant l'ADN modifié par le groupe sulfone. La détection finale des hybrides formés a été faite avec un conjugué de peroxydase de streptavidin-raifort, qui
détecte les parties biotine des amorces.
Les clones M13 ont été modifiés par une réac-
tion de sulfonation avec les réactifs et selon la pro-
cédure recommandés par Orgenics Ltd (Yavne, Israel).
Les puits de microtitration en polystyrène (Nunc, Danemark) ont été enduits de 10 pg/ml d'IgG purifiée provenant d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'ADN modifié par le groupe sulfone (Orgenics Ltd) dans un tampon au carbonate de sodium 10 mM (pH 9,6) pendant
une nuit à 4 C.
On a soumis un mélange réactionnel contenant 3 x 105 molécules des plasmides pBR322/CMV HindIII L linéarisés ou des témoins sans plasmide et 25 pmoles de chacune des amorces Pa et Pb biotinylées à 10 cycles de multiplication dans les conditions décrites dans l'Exemple 1. Les échantillons ont été chauffés à 100 C, puis additionnés de 2 x 109 molécules de chacune des sondes sélectives sulfonées de capture avec les réactifs
spécifiés à propos du Mode 1 de détection de l'Exemple 5.
Le mélange a été incubé à 65 C pendant 2 heu-
res, dilué avec 100 yl de Tween 20 à 0,2 %, puis trans-
féré dans des puits de microtitration enduits. On a lais-
sé les hybrides se fixer aux puits pendant 2 heures à 37 C. Le mélange réactionnel a été rejeté et les puits lavés à trois reprises avec 0,1 % de Tween 20 dans du chlorure de sodium 0,15 M, du phosphate de sodium 20 mM
(pH 7,5) (PBS). 200 1l d'un composé streptavidine-rai-
fort peroxydase (Amersham, UK) dilué à 1:2000 dans une solution de 1 % d'albumine de sérum bovin, 0,1 % de Tween 20 dans du PBS ont été ajoutés et les puits ont été incubés pendant 45 minutes à 37 C. Après quatre lavages comme ci-dessus, on a ajouté 200)l d'une solution de substrat consistant en 0,46 mg/ml d'O-phénylène-diamine 0,01 % de HO dans un tampon d'acétate de sodium 0,1 M
(pH 5,0). Après 15 minutes à 22 C, on a arrêté la réac-
tion en ajoutant 50 "l de H2SO4 2N et mesuré le taux d'ab-
sorption du produit coloré avec un spectrophotomètre à 492 nm. Les procédures de collection et de détection ont été déjà décrits par Syvânen et coll. (Nucleic Acids
Res, 14, pp. 5037-5048, 1986).
Les résultats de l'expérience sont montrés
dans le Tableau 4. On a nettement détecté 3 x 105 molé-
cules (0,5 x 10 -18 mole) du plasmide cible après 10 cy-
cles de multiplication.
TABLEAU 4
Quantité de cible (moles) Taux d'absorption à 492 nm a) 0,5 x 10- 18 0, 348
0 0,120
a) Moyenne de trois essais.
Claims (9)
1.-Méthode pour doser des acides nucléiques par hybridation, caractérisée en ce que les sondes de capture jouent le rôle d'amorces modifiées, lesdites amorces étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dont la présence est ensuite détectée par au moins une
sonde de détection sélective.
2.- Méthode suivant la revendication 1, carac-
térisée en ce que: a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléique cible d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins une moitié d'une paire d'affinité peut être attachée, b) on laisse cette ou ces amorces de capture réagir-avec
l'acide nucléique cible à brin unique dans des con-
ditions convenables pour une réaction de polyméri-
sation dépendant d'une matrice,
c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléi-
que cible dans lesquelles les amorces de capture
ont été incorporées, s'hybrider avec une sonde de dé-
tection capable de s'hybrider sélectivement avec l'a-
cide nucléique dans des conditions convenables pour une réaction d'hybridation, d) on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans
lesquelles ont été incorporées les amorces de cap-
ture, à l'aide de l'autre moitié de la paire d'affi-
nité,
e) on détecte la présence des sondes de détection sélec-
tives s'étant hybridées avec les copies de l'acide
nucléique cible.
3.- Méthode pour doser des acides nucléiques par hybridation, dans laquelle les sondes de détection jouent le rôle d'amorces modifiées étant incorporées
dans les copies des acides nucléiques cibles, caracté-
risée en ce que les copies d'acides nucléiques cibles dans lesquelles ont été incorporées les amorces modifiées, sont d'abord hybridées avec au moins une sonde de capture sélective et l'hybride formé est alors séparé à l'aide de cette sonde capturante, puis la présence de l'hybride est détectée.
4.- Méthode suivant la revendication 3, carac-
térisée en ce que: a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléique cible d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, b) on laisse cette ou ces amorces de détection réagir avec l'acide nucléique cible à brin unique dans des
conditions convenables pour une réaction de polymé-
risation dépendant d'une matrice,
c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléi-
que cible dans lesquelles ont été incorporées les
amorces de détection s'hybrider avec une sonde de cap-
ture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible dans des conditions convenables pour une réaction d'hybridation, d) on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans
lesquelles ont été incorporées les amorces de détec-
tion à l'aide de la sonde de capture sélective,
e) on détecte la présence des copies des acides nucléi-
ques cibles.
5.- Méthode suivant la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la sonde de capture sélective est pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être
attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
6.- Combinaison de réactifs pour doser des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins un marqueur détectable, et b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au
moins un site spécifique sur lequel peut être atta-
chée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
7.- Combinaison de réactifs pour doser des aci-
des nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, et b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins
un marqueur détectable.
8.- Trousse pour doser des acides nucléiques
caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme condi-
tionnée, une unité à plusieurs récipients ayant:
a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique ci-
ble pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au
moins un site spécifique sur lequel peut être atta-
chée au moins une moitié d'une paire d'affinité, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice,
d) éventuellement un récipient avec les quatre désoxy-
nucléosidetriphosphates, e) éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d'hybridation, f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies de l'acide nucléique cible, g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
9.- Trousse pour doser des acides nucléiques
caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme condi-
tionnée, une unité à plusieurs récipients ayant: a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique
cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'af-
finité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider sélectivement avec un acide nucléique cible, pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice,
d) éventuellement un récipient avec quatre nucléoside-
triphosphates, e) éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d'hybridation, f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies de l'acide nucléique cible,
g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
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