JPH04228076A - アビジン−ビオチン開裂による一本鎖ビオチニル化核酸の調製および単離 - Google Patents
アビジン−ビオチン開裂による一本鎖ビオチニル化核酸の調製および単離Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はビオチニル化された標的
核酸の調製方法および単離方法に関する。これらの方法
は分子生物学、生化学、および遺伝学の分野で有用であ
り、そして診断および核酸の塩基配列決定法において産
業上の応用性を持つ。
核酸の調製方法および単離方法に関する。これらの方法
は分子生物学、生化学、および遺伝学の分野で有用であ
り、そして診断および核酸の塩基配列決定法において産
業上の応用性を持つ。
【０００２】
【従来の技術】一本鎖ＤＮＡは多くの重要な科学技術に
おいて有用である。例えば、核酸の塩基配列決定法は分
子生物学、生化学および遺伝学の分野において膨大な影
響を与えた。多くの塩基配列決定法は、その方法のある
段階において一本鎖ＤＮＡの使用または生成を要求する
。核酸の塩基配列決定法はかなりの研究および商業活動
に役立ってきた。単一な核酸は、一般的にヌクレオチド
配列、分子量、大きさ、および形状により特徴付けられ
る。例えば、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ ら （Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８５， ７
６５２〜７６５６ページ、１０月、１９８８） によっ
て有用な塩基配列決定方法が記載されている。
おいて有用である。例えば、核酸の塩基配列決定法は分
子生物学、生化学および遺伝学の分野において膨大な影
響を与えた。多くの塩基配列決定法は、その方法のある
段階において一本鎖ＤＮＡの使用または生成を要求する
。核酸の塩基配列決定法はかなりの研究および商業活動
に役立ってきた。単一な核酸は、一般的にヌクレオチド
配列、分子量、大きさ、および形状により特徴付けられ
る。例えば、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ ら （Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８５， ７
６５２〜７６５６ページ、１０月、１９８８） によっ
て有用な塩基配列決定方法が記載されている。
【０００３】一本鎖核酸はまた、病原体、疾病、遺伝的
特徴もしくは疾病原因の状況を検出するための核酸の相
補ヌクレオチドのハイブリッド形成に基づいた医学診断
上のプローブとしても有用である。ＤＮＡ複合体は常態
では安定であるが、しかしその鎖は相補ヌクレオチド間
の水素結合を分裂する条件によって分離（または変性）
できる。
特徴もしくは疾病原因の状況を検出するための核酸の相
補ヌクレオチドのハイブリッド形成に基づいた医学診断
上のプローブとしても有用である。ＤＮＡ複合体は常態
では安定であるが、しかしその鎖は相補ヌクレオチド間
の水素結合を分裂する条件によって分離（または変性）
できる。
【０００４】さらに、ハイブリッド形成アッセイは、刑
事的（犯行現場もしくは被害者に残された毛髪、血液も
しくは精液の試料による人物の特定）ならびに非刑事的
（例えば親子鑑定および入国審査）の両方の法医学的試
験で使用されている。微量の標的核酸を検出する目的で
の相補的な核酸の使用は、例えば米国特許第４，６８３
，１９５号、同 ４，６８３，２０２号明細書に記載さ
れているようなポリメラーゼ連鎖反応法の開発によりか
なりさかんになってきた。これらの操作の詳細には触れ
ないが、それらは標的核酸鎖に対し相補的なエクステン
ション産物を調製するためにポリメラーゼの使用を必要
とし、そしてエクステンション産物は変性されサイクル
様式においてそれ自身何倍にも増加される。こうして最
初の標的鎖は、最終の検出のために顕著に増加されてい
る。ある例では、上記のような操作において使用される
一種もしくは両方のプライマーが捕捉もしくは検出用の
アビジンとの複合体化のためにビオチニル化される。
事的（犯行現場もしくは被害者に残された毛髪、血液も
しくは精液の試料による人物の特定）ならびに非刑事的
（例えば親子鑑定および入国審査）の両方の法医学的試
験で使用されている。微量の標的核酸を検出する目的で
の相補的な核酸の使用は、例えば米国特許第４，６８３
，１９５号、同 ４，６８３，２０２号明細書に記載さ
れているようなポリメラーゼ連鎖反応法の開発によりか
なりさかんになってきた。これらの操作の詳細には触れ
ないが、それらは標的核酸鎖に対し相補的なエクステン
ション産物を調製するためにポリメラーゼの使用を必要
とし、そしてエクステンション産物は変性されサイクル
様式においてそれ自身何倍にも増加される。こうして最
初の標的鎖は、最終の検出のために顕著に増加されてい
る。ある例では、上記のような操作において使用される
一種もしくは両方のプライマーが捕捉もしくは検出用の
アビジンとの複合体化のためにビオチニル化される。
【０００５】核酸は、ハイブリッド鎖の検出を促進する
目的で各種の検出可能な成分で標識されてきた。ビオチ
ンは容易にアビジンと結合して安定で検出可能な複合体
を形成するため、一般に検出可能成分として使用されて
きた。糖タンパク質アビジンに対するビオチンの高い親
和性は、タンパク質もしくは核酸と組み合わされたビオ
チンの検出と単離における多くの確立した方法の基礎を
供給する。さまざまな研究員によるビオチニル化ヌクレ
オチド類縁体の概説によれば、ビオチニル化ハイブリッ
ド形成プローブを用いることにより、特異的な核酸の検
出にこの親和性の系を応用することが可能となってきた
。強いアビジン−ビオチン複合体は、原料混合物から高
収率で標的核酸を回収する単一の工程を提供できる。
目的で各種の検出可能な成分で標識されてきた。ビオチ
ンは容易にアビジンと結合して安定で検出可能な複合体
を形成するため、一般に検出可能成分として使用されて
きた。糖タンパク質アビジンに対するビオチンの高い親
和性は、タンパク質もしくは核酸と組み合わされたビオ
チンの検出と単離における多くの確立した方法の基礎を
供給する。さまざまな研究員によるビオチニル化ヌクレ
オチド類縁体の概説によれば、ビオチニル化ハイブリッ
ド形成プローブを用いることにより、特異的な核酸の検
出にこの親和性の系を応用することが可能となってきた
。強いアビジン−ビオチン複合体は、原料混合物から高
収率で標的核酸を回収する単一の工程を提供できる。
【０００６】当業者は、アビジン−ビオチン複合体を分
解するような苛酷な化学的変性条件（例えば６モル濃度
グアニジンＨＣｌ 、ｐＨ１．５）を避けることを望む
ので、多くの試薬を合成して捕捉プローブから捕捉され
た核酸を放出し、単離することを可能にした。例えば、
ある例では、核酸がヌクレオチドとビオチンとの間の結
合を化学的開裂できるように化学的に変性されていた。 Ｓｈｉｍｋｕｓ ら （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８２， ２５９３〜２５９７ペー
ジ、１９８５） は、アビジン−アガロースカラムにヌ
クレオチドを可逆的にバインディングする手段としてジ
スルフィド結合の使用を記載している。比較的穏やかな
条件下、化学的に開裂するための手段を提供するような
他の化学的開裂可能なヌクレオチド類は、米国特許第
４，７７２，６９１号に記載されている。
解するような苛酷な化学的変性条件（例えば６モル濃度
グアニジンＨＣｌ 、ｐＨ１．５）を避けることを望む
ので、多くの試薬を合成して捕捉プローブから捕捉され
た核酸を放出し、単離することを可能にした。例えば、
ある例では、核酸がヌクレオチドとビオチンとの間の結
合を化学的開裂できるように化学的に変性されていた。 Ｓｈｉｍｋｕｓ ら （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８２， ２５９３〜２５９７ペー
ジ、１９８５） は、アビジン−アガロースカラムにヌ
クレオチドを可逆的にバインディングする手段としてジ
スルフィド結合の使用を記載している。比較的穏やかな
条件下、化学的に開裂するための手段を提供するような
他の化学的開裂可能なヌクレオチド類は、米国特許第
４，７７２，６９１号に記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】当該技術分野で知られ
ている化学的に変性された試薬類は、望ましい機能を奏
するとはいえ、時間のかかる合成法と経費がかかるため
、そのような試薬を合成または購入する必要性を避ける
ことが強く望まれるであろう。苛酷な化学的変性条件お
よび高価な試薬類を必要とすることなく、ビオチニル化
核酸を単離または調製するのに単純ではあるが効果的な
手段を入手することが望まれるであろう。
ている化学的に変性された試薬類は、望ましい機能を奏
するとはいえ、時間のかかる合成法と経費がかかるため
、そのような試薬を合成または購入する必要性を避ける
ことが強く望まれるであろう。苛酷な化学的変性条件お
よび高価な試薬類を必要とすることなく、ビオチニル化
核酸を単離または調製するのに単純ではあるが効果的な
手段を入手することが望まれるであろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記の課題は核酸混合物
からのビオチニル化標的核酸の単離方法であって、Ａ．
少なくとも核酸の一種がビオチニル化標的核酸である核
酸の水性混合物とアビジンもしくはその誘導体の分子を
共有結合した支持体を接触し、その支持体上にアビジン
もしくはその誘導体と少なくとも一種のビオチニル化標
的核酸の水不溶性複合体を形成させる工程、Ｂ．水不溶
性複合体から未複合体化物質を分離する工程、 Ｃ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｄ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法によって解決される。
からのビオチニル化標的核酸の単離方法であって、Ａ．
少なくとも核酸の一種がビオチニル化標的核酸である核
酸の水性混合物とアビジンもしくはその誘導体の分子を
共有結合した支持体を接触し、その支持体上にアビジン
もしくはその誘導体と少なくとも一種のビオチニル化標
的核酸の水不溶性複合体を形成させる工程、Ｂ．水不溶
性複合体から未複合体化物質を分離する工程、 Ｃ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｄ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法によって解決される。
【０００９】さらに、標的核酸の増幅方法であって、Ａ
．ポリメラーゼ連鎖反応と少なくとも一種のビオチニル
化プライマーを用いて被検体中の標的核酸を増幅してビ
オチニル化標的核酸を形成する工程、Ｂ．ビオチニル化
標的核酸とアビジンもしくはその誘導体の分子を共有結
合した支持体を接触し、その支持体上にアビジンもしく
はその誘導体とビオチニル化標的核酸の水不溶性複合体
を形成させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法。
．ポリメラーゼ連鎖反応と少なくとも一種のビオチニル
化プライマーを用いて被検体中の標的核酸を増幅してビ
オチニル化標的核酸を形成する工程、Ｂ．ビオチニル化
標的核酸とアビジンもしくはその誘導体の分子を共有結
合した支持体を接触し、その支持体上にアビジンもしく
はその誘導体とビオチニル化標的核酸の水不溶性複合体
を形成させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法。
【００１０】本発明はまた、一本鎖ＤＮＡの調製方法で
あって、 Ａ．ポリメラーゼ連鎖反応およびプライマー類の１つだ
けがビオチニル化されている一組のプライマーを用いて
被検体中の標的核酸を増幅し、混合物として標的核酸の
ビオチニル化鎖および標的核酸の未ビオチニル化鎖を形
成する工程、 Ｂ．その混合物とアビジンもしくはその誘導体の分子を
共有結合した支持体を接触し、その支持体上にアビジン
もしくはその誘導体と標的核酸のビオチニル化鎖の水不
溶性複合体を形成させる工程、 Ｃ．洗浄により水不溶性複合体から未ビオチニル化鎖を
分離する工程、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して標的核酸のビオチニル化鎖を解離す
る工程、ならびに Ｅ．解離した標的核酸のビオチニル化鎖を採取する工程
、を含んでなる方法も提供する。
あって、 Ａ．ポリメラーゼ連鎖反応およびプライマー類の１つだ
けがビオチニル化されている一組のプライマーを用いて
被検体中の標的核酸を増幅し、混合物として標的核酸の
ビオチニル化鎖および標的核酸の未ビオチニル化鎖を形
成する工程、 Ｂ．その混合物とアビジンもしくはその誘導体の分子を
共有結合した支持体を接触し、その支持体上にアビジン
もしくはその誘導体と標的核酸のビオチニル化鎖の水不
溶性複合体を形成させる工程、 Ｃ．洗浄により水不溶性複合体から未ビオチニル化鎖を
分離する工程、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上で分離した水不溶
性複合体を加熱して標的核酸のビオチニル化鎖を解離す
る工程、ならびに Ｅ．解離した標的核酸のビオチニル化鎖を採取する工程
、を含んでなる方法も提供する。
【００１１】標的核酸の測定方法であって、Ａ．ポリメ
ラーゼ連鎖反応と少なくとも１種のビオチニル化プライ
マーを用いて被検体中の標的核酸を増幅してビオチニル
化標的核酸を形成させる工程、Ｂ．ビオチニル化標的核
酸とアビジンもしくはその誘導体の分子を共有結合した
支持体を接触し、その支持体上にアビジンもしくはその
誘導体とビオチニル化標的核酸の水不溶性複合体を形成
させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃で分離した水不溶性複
合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解離す
る工程、 Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸と少なくとも１種の
ビオチニル化鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプローブ
を接触して水不溶性ハイブリッド生成物を形成させる工
程、 Ｆ．水不溶性ハイブリッド生成物からハイブリッド生成
物を形成していない水可溶性物質を分離する工程、Ｇ．
水不溶性ハイブリッド生成物と酵素−アビジン結合体を
接触して前記結合体とハイブリッド生成物間に水不溶性
複合体を形成させる工程、ならびにＨ．被検体中の標的
核酸量の測度として前記水不溶性複合体を検出する工程
、を含んでなる方法も提供する。
ラーゼ連鎖反応と少なくとも１種のビオチニル化プライ
マーを用いて被検体中の標的核酸を増幅してビオチニル
化標的核酸を形成させる工程、Ｂ．ビオチニル化標的核
酸とアビジンもしくはその誘導体の分子を共有結合した
支持体を接触し、その支持体上にアビジンもしくはその
誘導体とビオチニル化標的核酸の水不溶性複合体を形成
させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃で分離した水不溶性複
合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解離す
る工程、 Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸と少なくとも１種の
ビオチニル化鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプローブ
を接触して水不溶性ハイブリッド生成物を形成させる工
程、 Ｆ．水不溶性ハイブリッド生成物からハイブリッド生成
物を形成していない水可溶性物質を分離する工程、Ｇ．
水不溶性ハイブリッド生成物と酵素−アビジン結合体を
接触して前記結合体とハイブリッド生成物間に水不溶性
複合体を形成させる工程、ならびにＨ．被検体中の標的
核酸量の測度として前記水不溶性複合体を検出する工程
、を含んでなる方法も提供する。
【００１２】
【具体的な態様】本発明は、核酸混合物中のビオチニル
化核酸、特にそれらの予定された（すなわち、標的）核
酸の調製、増幅、もしくは単離に向けられる。そのよう
な物質は、細胞もしくはウイルスの試料、毛髪、体液ま
たはビオチニル化可能で検出可能な遺伝子ＤＮＡもしく
はＲＮＡを含む人もしくは動物の組織内に見い出すこと
ができる。
化核酸、特にそれらの予定された（すなわち、標的）核
酸の調製、増幅、もしくは単離に向けられる。そのよう
な物質は、細胞もしくはウイルスの試料、毛髪、体液ま
たはビオチニル化可能で検出可能な遺伝子ＤＮＡもしく
はＲＮＡを含む人もしくは動物の組織内に見い出すこと
ができる。
【００１３】本発明により単離されたビオチニル化核酸
の利用法の幾つかとしては、診断方法、核酸の塩基配列
決定法および法医学的試験が挙げられる。本発明はまた
、化学合成で生じる核酸混合物から多量の特定な核酸を
得るのにも利用できる。精製ビオチニル化核酸の他の利
用法は、当業者に容易に明らかである。
の利用法の幾つかとしては、診断方法、核酸の塩基配列
決定法および法医学的試験が挙げられる。本発明はまた
、化学合成で生じる核酸混合物から多量の特定な核酸を
得るのにも利用できる。精製ビオチニル化核酸の他の利
用法は、当業者に容易に明らかである。
【００１４】核酸は、プラスミド、いずれかの起源（細
菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物およびヒト）由来
の天然に見い出されるＤＮＡもしくはＲＮＡを初めとす
る種々の供給源から得られる。それらは、当該技術分野
で知られている原料および方法を用いて種々の組織およ
び流体から抽出されるかも知れない。好ましい態様では
、ビオチニル化標的核酸は、以下により詳細に記述され
るポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅後に核酸混合物か
ら単離される。
菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物およびヒト）由来
の天然に見い出されるＤＮＡもしくはＲＮＡを初めとす
る種々の供給源から得られる。それらは、当該技術分野
で知られている原料および方法を用いて種々の組織およ
び流体から抽出されるかも知れない。好ましい態様では
、ビオチニル化標的核酸は、以下により詳細に記述され
るポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅後に核酸混合物か
ら単離される。
【００１５】ビオチニル化標的核酸は、核酸の水性混合
物とアビジン分子を共有結合した支持体を接触すること
により混合物から単離される。この接触は、水性混合物
内で粒子状の支持体を混合するか、または混合物をフィ
ルム状の支持体に適用することによるなどのいずれかの
適する様式によって行われる。接触方法は、利用される
支持体の型式によるところが大きく、それらの主要なも
のとしては、フィルム、多孔性フィルターもしくはマト
リックス、ビーズ、試験管、ミクロタイタープレートお
よびその他当該技術分野において知られているものが挙
げられる。接触は、通常は室温であるが、いずれかの適
当な温度であれば起こる可能性があり、そして支持体上
に十分なビオチンとアビジンの複合体を与えるためには
、少なくとも１０秒から５時間で接触が起こるであろう
。
物とアビジン分子を共有結合した支持体を接触すること
により混合物から単離される。この接触は、水性混合物
内で粒子状の支持体を混合するか、または混合物をフィ
ルム状の支持体に適用することによるなどのいずれかの
適する様式によって行われる。接触方法は、利用される
支持体の型式によるところが大きく、それらの主要なも
のとしては、フィルム、多孔性フィルターもしくはマト
リックス、ビーズ、試験管、ミクロタイタープレートお
よびその他当該技術分野において知られているものが挙
げられる。接触は、通常は室温であるが、いずれかの適
当な温度であれば起こる可能性があり、そして支持体上
に十分なビオチンとアビジンの複合体を与えるためには
、少なくとも１０秒から５時間で接触が起こるであろう
。
【００１６】本明細書で使用されている語としての「ビ
オチン」は、ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ
〔３，４〕イミダゾール−４−ペンタン酸、（ビタミン
Ｈとしても知られている）およびビオチン誘導体、例え
ばビオチン−ε−Ｎ−リジン、ビオシチンヒドラジド、
２−イミノビオチンおよびビオチニル−ε−Ｎ−アミノ
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの
アミノもしくはスルフヒドリル誘導体、スルホスクシン
イミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラ
ジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオチン、および３−（Ｎ
−マレインイミドプロピオニル）ビオチンを含み、これ
らの誘導体であれば核酸に適切に結合することが可能で
ある。
オチン」は、ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ
〔３，４〕イミダゾール−４−ペンタン酸、（ビタミン
Ｈとしても知られている）およびビオチン誘導体、例え
ばビオチン−ε−Ｎ−リジン、ビオシチンヒドラジド、
２−イミノビオチンおよびビオチニル−ε−Ｎ−アミノ
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの
アミノもしくはスルフヒドリル誘導体、スルホスクシン
イミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラ
ジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオチン、および３−（Ｎ
−マレインイミドプロピオニル）ビオチンを含み、これ
らの誘導体であれば核酸に適切に結合することが可能で
ある。
【００１７】ビオチニル化核酸は、当該技術分野で知ら
れている方法を用いて容易に調製される。例えば、好ま
しい方法が国際公開第８９／０２９３１ 号に詳細に記
載されている。この方法は、通常次のとおりである。す
なわち、フタルイミドトリエチレングリコールホスホラ
ミジトは、目的のオリゴヌクレオチドの５′末端に結合
し、フタルイミドは、水酸化アンモニウムを用いる加水
分解により第一級アミノ基に転化される。次に、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチンは、フリーなアミノ基
と結合して所期のビオチニル化核酸を形成する。
れている方法を用いて容易に調製される。例えば、好ま
しい方法が国際公開第８９／０２９３１ 号に詳細に記
載されている。この方法は、通常次のとおりである。す
なわち、フタルイミドトリエチレングリコールホスホラ
ミジトは、目的のオリゴヌクレオチドの５′末端に結合
し、フタルイミドは、水酸化アンモニウムを用いる加水
分解により第一級アミノ基に転化される。次に、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチンは、フリーなアミノ基
と結合して所期のビオチニル化核酸を形成する。
【００１８】本明細書で使用されている語としての「ア
ビジン」は、一般に卵白中に存在するタンパク質ならび
にその誘導体もしくはそれらの等価なもの、例えばスト
レプトアビジン、スクシニル化アビジン、モノマー性ア
ビジンもしくはビオチンに対する抗体を示す。アビジン
は、支持体表面上の反応性基を通して適当な支持体に共
有結合することができる。アビジン分子のフリーアミノ
基と反応する多くの有用な反応性基が存在する。限定さ
れるものでないが、そのような基としては、カルボキシ
ル基、活性ハロゲン、活性２−置換エチルスルホニル基
、活性２−置換エチルカルボニル基、活性エステル、ビ
ニルスルホニル基、ビニルカルボニル基、アルデヒド基
、エポキシ基、アミノ基およびスルフヒドリル基が挙げ
られる。
ビジン」は、一般に卵白中に存在するタンパク質ならび
にその誘導体もしくはそれらの等価なもの、例えばスト
レプトアビジン、スクシニル化アビジン、モノマー性ア
ビジンもしくはビオチンに対する抗体を示す。アビジン
は、支持体表面上の反応性基を通して適当な支持体に共
有結合することができる。アビジン分子のフリーアミノ
基と反応する多くの有用な反応性基が存在する。限定さ
れるものでないが、そのような基としては、カルボキシ
ル基、活性ハロゲン、活性２−置換エチルスルホニル基
、活性２−置換エチルカルボニル基、活性エステル、ビ
ニルスルホニル基、ビニルカルボニル基、アルデヒド基
、エポキシ基、アミノ基およびスルフヒドリル基が挙げ
られる。
【００１９】特に有用な反応性基としては、カルボキシ
ル基、活性ハロゲン、活性２−置換エチルスルホニル基
およびビニルスルホニル基が挙げられ、それらはすべて
当該技術分野において知られている。これらの基のある
ものは、アビジン分子と直接反応するであろうが、カル
ボキシル基のような他のものは、アビジン分子と反応す
るであろう中間体を生成するのにある種の化合物の使用
を必要とする。これらの反応基を担持するフィルムおよ
び粒子のような支持体の調製は、当該技術分野で周知で
ある。特に、好ましい小さなポリマー粒子は、乳濁化重
合法もしくは懸濁重合法を用いて容易に調製される。次
の文献は、そのような支持体およびそこに反応するアビ
ジンの幾つかを調製するのに有用な詳細を提供する。米
国特許第４，５８２，８１０号、国際公開第８４／０３
３５８号ヨーロッパ特許公開第 ０，３０２，７１５号
、特開平１−１２７９５８号および１９８９年１１月２
０日に出願された特願平１−２９９８７７号。
ル基、活性ハロゲン、活性２−置換エチルスルホニル基
およびビニルスルホニル基が挙げられ、それらはすべて
当該技術分野において知られている。これらの基のある
ものは、アビジン分子と直接反応するであろうが、カル
ボキシル基のような他のものは、アビジン分子と反応す
るであろう中間体を生成するのにある種の化合物の使用
を必要とする。これらの反応基を担持するフィルムおよ
び粒子のような支持体の調製は、当該技術分野で周知で
ある。特に、好ましい小さなポリマー粒子は、乳濁化重
合法もしくは懸濁重合法を用いて容易に調製される。次
の文献は、そのような支持体およびそこに反応するアビ
ジンの幾つかを調製するのに有用な詳細を提供する。米
国特許第４，５８２，８１０号、国際公開第８４／０３
３５８号ヨーロッパ特許公開第 ０，３０２，７１５号
、特開平１−１２７９５８号および１９８９年１１月２
０日に出願された特願平１−２９９８７７号。
【００２０】特に有用な支持体は、ポリマーで構成され
たポリマー粒子であり、その外表面の少なくとも１つは
１種もしくはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマ
ーから調製され、それらはアビジンと反応するためのカ
ルボキシル基、活性ハロゲン原子、活性２−エチルスル
ホニル基もしくはビニルスルホニル基を持っている。
たポリマー粒子であり、その外表面の少なくとも１つは
１種もしくはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマ
ーから調製され、それらはアビジンと反応するためのカ
ルボキシル基、活性ハロゲン原子、活性２−エチルスル
ホニル基もしくはビニルスルホニル基を持っている。
【００２１】有用なポリマー粒子は、一般に少なくとも
０．０１μｍの平均径を持ち、０．１〜５μｍの範囲内
の径が好ましい。粒子はすべて同じポリマーで構成され
ることができ、あるいはそれらは、シェルポリマーが必
要な反応性基を持った場合、例えば米国特許第 ４，７
０３，０１８号およびヨーロッパ特許公開第 ０２８０
５５６号明細書に記載されるようなコアー−シェルポリ
マーであることができる。
０．０１μｍの平均径を持ち、０．１〜５μｍの範囲内
の径が好ましい。粒子はすべて同じポリマーで構成され
ることができ、あるいはそれらは、シェルポリマーが必
要な反応性基を持った場合、例えば米国特許第 ４，７
０３，０１８号およびヨーロッパ特許公開第 ０２８０
５５６号明細書に記載されるようなコアー−シェルポリ
マーであることができる。
【００２２】一度アビジン−ビオチン複合体が形成され
ると、それにより標的核酸を固定し、未複合体化物質は
、遠心、濾過、洗浄および当該技術分野で知られている
他の技術のような適当な方法を用いて混合物から分離さ
れる。種々の洗浄段階および塩類を含んだ洗浄溶液類、
混沌とした試薬類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドもし
くはジメチルスルホキシドを初めとする洗浄液もまた当
該技術分野で知られている。好ましくは、分離は微孔質
濾過膜を使用して実行され、例えばＢｉｏｄｙｎｅ（商
標） 、ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標） もしくはＵｌｔ
ｉｐｏｒｅ （商標） 微孔質膜としてＰａｌｌ Ｃｏ
ｒｐ により上市されているものが挙げられる。これら
の膜は、便利さおよび分析的測定のためにフィルターも
しくは試験デバイス、例えばイーストマンコダック社よ
り市販されているＳｕｒｅｃｅｌｌ （商標） 試験キ
ッドのような商業上入手できる使い捨て試験デバイス内
に取りつけられる。
ると、それにより標的核酸を固定し、未複合体化物質は
、遠心、濾過、洗浄および当該技術分野で知られている
他の技術のような適当な方法を用いて混合物から分離さ
れる。種々の洗浄段階および塩類を含んだ洗浄溶液類、
混沌とした試薬類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドもし
くはジメチルスルホキシドを初めとする洗浄液もまた当
該技術分野で知られている。好ましくは、分離は微孔質
濾過膜を使用して実行され、例えばＢｉｏｄｙｎｅ（商
標） 、ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標） もしくはＵｌｔ
ｉｐｏｒｅ （商標） 微孔質膜としてＰａｌｌ Ｃｏ
ｒｐ により上市されているものが挙げられる。これら
の膜は、便利さおよび分析的測定のためにフィルターも
しくは試験デバイス、例えばイーストマンコダック社よ
り市販されているＳｕｒｅｃｅｌｌ （商標） 試験キ
ッドのような商業上入手できる使い捨て試験デバイス内
に取りつけられる。
【００２３】次に、固定した複合体は、アビジン−ビオ
チン結合を開裂するのに十分な時間加熱され、目的のビ
オチニル化核酸を解離する。時間と温度は反比例的に変
化するであろう。より高い温度では、より少ない時間が
結合を開裂するために必要だろう。一般に、６５℃の温
度は、合理的な時間 （３０分間） で結合を開裂する
ための最低温度である。好ましくは、その操作は、複合
体を９０℃より高温で少なくとも５分間加熱することに
より、一層簡略化され、そしてより好ましくは、９５℃
より高温で５〜３０分間加熱することにより簡略化され
る。 １００℃を越える温度も使用できるが、通例それ
は実用的ではなく、より高い温度により小さな効率しか
得られない。核酸が損傷を受ける上限高温は、かなり高
い（３００℃） 。日常的な実験を行ってビオチニル化
核酸を解離するための最適時間および最適温度を見いだ
すことができる。次に、解離したビオチニル化標的物が
採取されるか、または種々の研究もしくは診断方法にお
いてさらに処理される。それは、例えば、相補的なオリ
ゴヌクレオチドを担持する捕捉プローブを用いて採取す
ることができる。より一般的に、解離したビオチニル化
核酸は診断の目的で使用して、感染症もしくは癌細胞を
検出する。
チン結合を開裂するのに十分な時間加熱され、目的のビ
オチニル化核酸を解離する。時間と温度は反比例的に変
化するであろう。より高い温度では、より少ない時間が
結合を開裂するために必要だろう。一般に、６５℃の温
度は、合理的な時間 （３０分間） で結合を開裂する
ための最低温度である。好ましくは、その操作は、複合
体を９０℃より高温で少なくとも５分間加熱することに
より、一層簡略化され、そしてより好ましくは、９５℃
より高温で５〜３０分間加熱することにより簡略化され
る。 １００℃を越える温度も使用できるが、通例それ
は実用的ではなく、より高い温度により小さな効率しか
得られない。核酸が損傷を受ける上限高温は、かなり高
い（３００℃） 。日常的な実験を行ってビオチニル化
核酸を解離するための最適時間および最適温度を見いだ
すことができる。次に、解離したビオチニル化標的物が
採取されるか、または種々の研究もしくは診断方法にお
いてさらに処理される。それは、例えば、相補的なオリ
ゴヌクレオチドを担持する捕捉プローブを用いて採取す
ることができる。より一般的に、解離したビオチニル化
核酸は診断の目的で使用して、感染症もしくは癌細胞を
検出する。
【００２４】理解されるべきことは、ビオチニル化核酸
が一本鎖もしくは二本鎖の分子であることができること
である。もし、それが二本鎖分子であれば、それらの鎖
の一本もしくは両方の鎖がビオチニル化される。本発明
はまた、ポリメラーゼ連鎖反応およびビオチニル化プラ
イマーを用いて標的核酸を増幅するためにも使用するこ
とができ、そして増幅されたビオチニル化標的核酸は前
記の分離、加熱および採取工程を用いて単離することが
できる。
が一本鎖もしくは二本鎖の分子であることができること
である。もし、それが二本鎖分子であれば、それらの鎖
の一本もしくは両方の鎖がビオチニル化される。本発明
はまた、ポリメラーゼ連鎖反応およびビオチニル化プラ
イマーを用いて標的核酸を増幅するためにも使用するこ
とができ、そして増幅されたビオチニル化標的核酸は前
記の分離、加熱および採取工程を用いて単離することが
できる。
【００２５】より具体的には、被検体（例えば、生物学
的な流体）中の標的核酸は例えば、米国特許第 ４，６
８３，１９５号同 第 ４，６８３，２０２号明細書
に詳細に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用い
て増幅される。下記の例１は、代表的なポリメラーゼ連
鎖反応の増幅方法を具体的に説明する。
的な流体）中の標的核酸は例えば、米国特許第 ４，６
８３，１９５号同 第 ４，６８３，２０２号明細書
に詳細に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用い
て増幅される。下記の例１は、代表的なポリメラーゼ連
鎖反応の増幅方法を具体的に説明する。
【００２６】プライマーに言及する際に本明細書で使用
されている、語の「オリゴヌクレオチド」は、二個もし
くはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド類もしくはリ
ボヌクレオチド類から成る分子を示し、３個以上のもの
が好ましい。正確なサイズは、重要ではないが（下記に
述べたプローブを除く）、最終的な用途もしくはオリゴ
ヌクレオチドの機能を含む多くのファクターに依存する
。オリゴヌクレオチドは合成的にもしくは当該技術分野
で知られている他の方法により誘導されてもよい。
されている、語の「オリゴヌクレオチド」は、二個もし
くはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド類もしくはリ
ボヌクレオチド類から成る分子を示し、３個以上のもの
が好ましい。正確なサイズは、重要ではないが（下記に
述べたプローブを除く）、最終的な用途もしくはオリゴ
ヌクレオチドの機能を含む多くのファクターに依存する
。オリゴヌクレオチドは合成的にもしくは当該技術分野
で知られている他の方法により誘導されてもよい。
【００２７】語「プライマー」は、天然物かまたは合成
産物であるかを問わず、オリゴヌクレオチドを示し、そ
れはある核酸鎖に相補的なプライマーエクステンション
産物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に合成開
始点として作用しうるものである。そのような条件とし
ては、ヌクレオチド類（例えば、４種の標準デオキシリ
ボヌクレオサイド三リン酸）およびＤＮＡポリメラーゼ
のようなポリメリゼーション用試薬の存在、ならびに適
当な温度とｐＨが挙げられる。
産物であるかを問わず、オリゴヌクレオチドを示し、そ
れはある核酸鎖に相補的なプライマーエクステンション
産物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に合成開
始点として作用しうるものである。そのような条件とし
ては、ヌクレオチド類（例えば、４種の標準デオキシリ
ボヌクレオサイド三リン酸）およびＤＮＡポリメラーゼ
のようなポリメリゼーション用試薬の存在、ならびに適
当な温度とｐＨが挙げられる。
【００２８】プライマー類の混合物は増幅において使用
することができ、一組のプライマー類が増幅せしめる各
々の核酸配列を増幅するのに通常使用される。各々のプ
ライマーは、標的ＤＮＡの核酸配列に対し実質上相補的
である。「実質上相補的」とは、プライマーが標的ＤＮ
Ａ配列とハイブリッド形成しうるようにその標的ＤＮＡ
中の対応する塩基とマッチする十分な数の塩基がそのプ
ライマー上に存在することを意味する。しかしながら、
すべての塩基対がマッチするであろうことを意味しない
。
することができ、一組のプライマー類が増幅せしめる各
々の核酸配列を増幅するのに通常使用される。各々のプ
ライマーは、標的ＤＮＡの核酸配列に対し実質上相補的
である。「実質上相補的」とは、プライマーが標的ＤＮ
Ａ配列とハイブリッド形成しうるようにその標的ＤＮＡ
中の対応する塩基とマッチする十分な数の塩基がそのプ
ライマー上に存在することを意味する。しかしながら、
すべての塩基対がマッチするであろうことを意味しない
。
【００２９】プライマー類は、一般に一本鎖である。各
々のプライマーの正確なサイズは、予期される用途、標
的配列の複雑さ、反応温度およびプライマー起源に応じ
て変動するであろう。一般に、本発明において使用され
たプライマー類は、１５〜５０個のヌクレオチドを含み
、そして好ましくは、それらが２０〜３０個のヌクレオ
チドを含むことである。
々のプライマーの正確なサイズは、予期される用途、標
的配列の複雑さ、反応温度およびプライマー起源に応じ
て変動するであろう。一般に、本発明において使用され
たプライマー類は、１５〜５０個のヌクレオチドを含み
、そして好ましくは、それらが２０〜３０個のヌクレオ
チドを含むことである。
【００３０】本発明において有用なプライマー類は、多
くの起源から得ることができるか、あるいは、例えば、
ＡＢＩ ＤＮＡ シンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ） 〔アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能〕またはバイオ
サーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ） ８６００シリーズもし
くは８８００シリーズシンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ）（ミリゲン−バイオサーチ社から入手可能）
およびそれらの使用法についての既知の方法を初めとす
る既知の技術および装置を用いて調製することができる
。生物学的な起源から単離された天然に見い出されるプ
ライマー類もまた有用である（例えば、制限エンドヌク
レアーゼ消化物）。
くの起源から得ることができるか、あるいは、例えば、
ＡＢＩ ＤＮＡ シンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ） 〔アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能〕またはバイオ
サーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ） ８６００シリーズもし
くは８８００シリーズシンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ）（ミリゲン−バイオサーチ社から入手可能）
およびそれらの使用法についての既知の方法を初めとす
る既知の技術および装置を用いて調製することができる
。生物学的な起源から単離された天然に見い出されるプ
ライマー類もまた有用である（例えば、制限エンドヌク
レアーゼ消化物）。
【００３１】本方法で使用されるプライマー類の少なく
とも１種は、ビオチニル化されており、すなわち、それ
はプライマーに共有結合したビオチン成分を有している
。そのようなプライマーとビオチンの結合体は、既知の
方法、で容易に調製することができ、その方法は、例え
ばＣｏｎｎｏｌｌｙによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５（７），３１３１（１９８
７）に記載されている。プライマーをビオチニル化する
好ましい方法は、国際公開第８９／０２９３１ 号 （
前記） 公報に記載されている。
とも１種は、ビオチニル化されており、すなわち、それ
はプライマーに共有結合したビオチン成分を有している
。そのようなプライマーとビオチンの結合体は、既知の
方法、で容易に調製することができ、その方法は、例え
ばＣｏｎｎｏｌｌｙによりＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５（７），３１３１（１９８
７）に記載されている。プライマーをビオチニル化する
好ましい方法は、国際公開第８９／０２９３１ 号 （
前記） 公報に記載されている。
【００３２】標的核酸の変性した鎖は、プライマーと標
的ＤＮＡ鎖のハイブリッド産物混合物が形成されるよう
な条件下で適当なプライマーと接触される。そのような
条件は、米国特許第 ４，６８３，２０２号明細書に記
載されているような増幅にふつうに使用されるものであ
る。次に、プライマーエクステンション産物は、少なく
とも１種のハイブリッド産物により形成され、続いて追
加のプライミングおよびエクステンション産物形成によ
りさらに形成される。変性（すなわち、相補的な産物の
分離）後、複製ビオチニル化核酸は、今や目的の標的で
あり、アビジン−ビオチン反応、加熱、前記の採取工程
を用いて単離することができる。
的ＤＮＡ鎖のハイブリッド産物混合物が形成されるよう
な条件下で適当なプライマーと接触される。そのような
条件は、米国特許第 ４，６８３，２０２号明細書に記
載されているような増幅にふつうに使用されるものであ
る。次に、プライマーエクステンション産物は、少なく
とも１種のハイブリッド産物により形成され、続いて追
加のプライミングおよびエクステンション産物形成によ
りさらに形成される。変性（すなわち、相補的な産物の
分離）後、複製ビオチニル化核酸は、今や目的の標的で
あり、アビジン−ビオチン反応、加熱、前記の採取工程
を用いて単離することができる。
【００３３】本発明はまた、二種の相補的な鎖を持つ特
定の核酸の増幅にも有用である。大抵の目的の核酸配列
は、既に二本鎖であり、例えばＤＮＡ中にそれらは見い
出される。しかしながら、一本鎖核酸の配列、例えばｍ
ＲＮＡは、逆転写酵素を用いて二本鎖配列に転換された
後同様に検出される。
定の核酸の増幅にも有用である。大抵の目的の核酸配列
は、既に二本鎖であり、例えばＤＮＡ中にそれらは見い
出される。しかしながら、一本鎖核酸の配列、例えばｍ
ＲＮＡは、逆転写酵素を用いて二本鎖配列に転換された
後同様に検出される。
【００３４】特定の核酸配列は、鋳型のような核酸配列
を含んでいる核酸を用いて複製される。核酸が二つの鎖
を含む場合には、その鎖を分離工程としてまたはプライ
マーエクステンション産物形成と同時に分離することが
必要である。変性は、従来技術文献に記載されているよ
うな、いずれかの適当な物理的、化学的もしくは酵素的
な方法を用いてなし遂げられる。適当な温度で加熱する
ことが好ましい方法である。
を含んでいる核酸を用いて複製される。核酸が二つの鎖
を含む場合には、その鎖を分離工程としてまたはプライ
マーエクステンション産物形成と同時に分離することが
必要である。変性は、従来技術文献に記載されているよ
うな、いずれかの適当な物理的、化学的もしくは酵素的
な方法を用いてなし遂げられる。適当な温度で加熱する
ことが好ましい方法である。
【００３５】一度分離した鎖が使用に供され、付加核酸
鎖の合成は、一般にｐＨ７〜９の緩衝水性溶液中プライ
マーを用いて実行される。好ましくは、１モル濃度を超
過するプライマーが緩衝液に加えられ、その具体的な量
は従来技術（例えば、米国特許第 ４，６８３，２０２
号） で教示されている。デオキシリボヌクレオサイド
三リン酸類ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐは、また、十分な量を合成混合物に加えられ、得られ
た溶液は９０〜１００ ℃で１０分間以内、好ましくは
１〜４分間加熱される。この加熱後、その溶液は、好ま
しくは室温に冷却され、プライマーエクステンション産
物の形成を誘導する（または触媒する）適切な試薬が導
入される。この誘導化試薬は、当該技術分野で一般にポ
リメリゼーション試薬として知られている。これらの産
物を形成する反応は、既知の条件下（一般に、室温から
もはやポリメリゼーションが生じない温度まで）で実行
される。
鎖の合成は、一般にｐＨ７〜９の緩衝水性溶液中プライ
マーを用いて実行される。好ましくは、１モル濃度を超
過するプライマーが緩衝液に加えられ、その具体的な量
は従来技術（例えば、米国特許第 ４，６８３，２０２
号） で教示されている。デオキシリボヌクレオサイド
三リン酸類ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐは、また、十分な量を合成混合物に加えられ、得られ
た溶液は９０〜１００ ℃で１０分間以内、好ましくは
１〜４分間加熱される。この加熱後、その溶液は、好ま
しくは室温に冷却され、プライマーエクステンション産
物の形成を誘導する（または触媒する）適切な試薬が導
入される。この誘導化試薬は、当該技術分野で一般にポ
リメリゼーション試薬として知られている。これらの産
物を形成する反応は、既知の条件下（一般に、室温から
もはやポリメリゼーションが生じない温度まで）で実行
される。
【００３６】ポリメリゼーション試薬は、プライマーエ
クステンション産物の合成を成し遂げる機能を発揮しう
るどのような化合物、もしくは試薬の配合でもよく、酵
素類（例えば、大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ
ポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で知られ
ている他のもの） が挙げられる。特に有用な酵素は、
熱安定性酵素であり、クローン化されるか、もしくは種
々のサーマス （Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌種から得られ
るような天然に見い出されるものである。このポリメリ
ゼーション試薬は米国特許第 ４，６８３，２０２号明
細書に記載されている。
クステンション産物の合成を成し遂げる機能を発揮しう
るどのような化合物、もしくは試薬の配合でもよく、酵
素類（例えば、大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ
ポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で知られ
ている他のもの） が挙げられる。特に有用な酵素は、
熱安定性酵素であり、クローン化されるか、もしくは種
々のサーマス （Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌種から得られ
るような天然に見い出されるものである。このポリメリ
ゼーション試薬は米国特許第 ４，６８３，２０２号明
細書に記載されている。
【００３７】好ましい熱安定性酵素は、ヨーロッパ特許
公開第 ０，２５８，０１７号および国際公開第８９／
０６６９１ 号公報に記載されているサーマス・アクア
ティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由
来のＤＮＡポリメラーゼ類である。有用なポリメラーゼ
類はまた、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＨＢ−８株
） の菌株からも得られ、それらは、例えばＲｕｔｔｉ
ｍａｎｎ 他の、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４９
， ４１〜４６ページ（１９８５）、Ｈｕｄｓｏｎ他
の、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３２ ，
５３１〜５４０ ページ（１９８６）およびＣｏｓｔａ
他の、Ｐｒｏｃ．Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．， ８２〜９７ページ（１９８
８）に記載されている。さらに他の有用な酵素類は、Ｒ
ｏｓｓｉ 他のＳｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ． ７（２−３） 、 ３３７〜３４１ ページ、
１９８６に記載されている。幾つかの有用なポリメラー
ゼ類は市販されている。一般に、エクステンション産物
の合成は各々のプライマーの３′末端から開始され、合
成が停止するまで鋳型に沿って５′から３′方向へ進め
られるであろう。あるポリメリゼーション試薬（例えば
、逆転写酵素）は、鋳型に沿って３′から５′方向へ進
むかも知れない。
公開第 ０，２５８，０１７号および国際公開第８９／
０６６９１ 号公報に記載されているサーマス・アクア
ティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由
来のＤＮＡポリメラーゼ類である。有用なポリメラーゼ
類はまた、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＨＢ−８株
） の菌株からも得られ、それらは、例えばＲｕｔｔｉ
ｍａｎｎ 他の、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４９
， ４１〜４６ページ（１９８５）、Ｈｕｄｓｏｎ他
の、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３２ ，
５３１〜５４０ ページ（１９８６）およびＣｏｓｔａ
他の、Ｐｒｏｃ．Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．， ８２〜９７ページ（１９８
８）に記載されている。さらに他の有用な酵素類は、Ｒ
ｏｓｓｉ 他のＳｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ． ７（２−３） 、 ３３７〜３４１ ページ、
１９８６に記載されている。幾つかの有用なポリメラー
ゼ類は市販されている。一般に、エクステンション産物
の合成は各々のプライマーの３′末端から開始され、合
成が停止するまで鋳型に沿って５′から３′方向へ進め
られるであろう。あるポリメリゼーション試薬（例えば
、逆転写酵素）は、鋳型に沿って３′から５′方向へ進
むかも知れない。
【００３８】新たに合成された鎖とそれらの対応するプ
ライマーを含んでなる新たに形成されたプライマーエク
ステンション産物は、本方法の次の工程で使用される初
めの標的鎖と二本鎖分子を形成する。これらの鎖は、次
に前記のような変性により分離され、一本鎖分子を与え
、前記のように新たな核酸はその上で合成される。さら
なる試薬が増幅方法の進行を保つのに必要であるかも知
れないが、その後、ほとんどのエクステンション産物は
プライマー類により制限された特定の核酸配列（すなわ
ち、相補的な産物）から成るだろう。
ライマーを含んでなる新たに形成されたプライマーエク
ステンション産物は、本方法の次の工程で使用される初
めの標的鎖と二本鎖分子を形成する。これらの鎖は、次
に前記のような変性により分離され、一本鎖分子を与え
、前記のように新たな核酸はその上で合成される。さら
なる試薬が増幅方法の進行を保つのに必要であるかも知
れないが、その後、ほとんどのエクステンション産物は
プライマー類により制限された特定の核酸配列（すなわ
ち、相補的な産物）から成るだろう。
【００３９】鎖分離およびエクステンション産物合成の
工程は、必要とされる回数繰り返して使用（例えば、検
出）のために必要な特定の核酸を必要量生産する。一般
に、一連の工程は、少なくとも一度は繰り返され、好ま
しくは少なくとも１０〜５０回繰り返される。
工程は、必要とされる回数繰り返して使用（例えば、検
出）のために必要な特定の核酸を必要量生産する。一般
に、一連の工程は、少なくとも一度は繰り返され、好ま
しくは少なくとも１０〜５０回繰り返される。
【００４０】標的核酸は前記のような、植物、微生物、
動物、ヒトを初めとするいずれかの起源から得ることが
できる。特に、ヒト白血病抗原（ＨＬＡ）のＤＮＡもし
くはＨＩＶ−Ｉのようなレトロウイルスと関係したＤＮ
Ａを増幅することが好ましい。当業者は、他の一本鎖も
しくは二本鎖核酸を本発明で増幅することができるであ
ろう。
動物、ヒトを初めとするいずれかの起源から得ることが
できる。特に、ヒト白血病抗原（ＨＬＡ）のＤＮＡもし
くはＨＩＶ−Ｉのようなレトロウイルスと関係したＤＮ
Ａを増幅することが好ましい。当業者は、他の一本鎖も
しくは二本鎖核酸を本発明で増幅することができるであ
ろう。
【００４１】
【実施例】以下の例はこの発明をより具体的に説明する
目的で提供する。発明の範囲をそのように限定すること
を意図しない。別に指摘しない限り、すべてのパーセン
テージは重量による。
目的で提供する。発明の範囲をそのように限定すること
を意図しない。別に指摘しない限り、すべてのパーセン
テージは重量による。
【００４２】例１ ビオチニル化ＨＬＡ ＤＮＡ の
増幅および単離 この例では、標的ＨＬＡ ＤＮＡ をビオチニル化プラ
イマーを用いて増幅するようなこの発明の使用法、およ
びアビジン−ビオチン複合体と変性を用いて増幅した核
酸の単離を具体的に示す。 材料：ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチ
ルスルホニルメチル）スチレン〕（モル比、９５．５：
４．５） のポリマー粒子からなる試薬を増幅した核酸
の固定化に使用した。アビジンをそれらの粒子に共有結
合し、以下のような試薬を形成した。
増幅および単離 この例では、標的ＨＬＡ ＤＮＡ をビオチニル化プラ
イマーを用いて増幅するようなこの発明の使用法、およ
びアビジン−ビオチン複合体と変性を用いて増幅した核
酸の単離を具体的に示す。 材料：ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチ
ルスルホニルメチル）スチレン〕（モル比、９５．５：
４．５） のポリマー粒子からなる試薬を増幅した核酸
の固定化に使用した。アビジンをそれらの粒子に共有結
合し、以下のような試薬を形成した。
【００４３】卵白アビジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ 、脱イオン蒸留水６ｍｌ中に溶解したアビジン６
ｍｇを含む溶液６ｍｌ）にポリプロピレン遠心管中、０
．０１％マーシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）
を含むホウ酸緩衝液 （０．０５モル濃度溶液５０ｍｌ
、ｐＨ８．５）を加えた。この管にふたをし、激しく振
盪した。ポリマー粒子の懸濁液（平均粒子径２．５４μ
ｍの１５．５％固体、１．３５ｍｌ） を管に加え、再
びふたをし２４時間回転した。得られた懸濁液をマーシ
オレート （０．０１％） を含むグリシン緩衝液 （
０．１モル濃度、ｐＨ８．５）で洗浄し、新たなグリシ
ン緩衝溶液で再懸濁し、所望の試薬（固体０．３％を含
む）を含んだ貯蔵溶液を生産した。
ａｌ 、脱イオン蒸留水６ｍｌ中に溶解したアビジン６
ｍｇを含む溶液６ｍｌ）にポリプロピレン遠心管中、０
．０１％マーシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）
を含むホウ酸緩衝液 （０．０５モル濃度溶液５０ｍｌ
、ｐＨ８．５）を加えた。この管にふたをし、激しく振
盪した。ポリマー粒子の懸濁液（平均粒子径２．５４μ
ｍの１５．５％固体、１．３５ｍｌ） を管に加え、再
びふたをし２４時間回転した。得られた懸濁液をマーシ
オレート （０．０１％） を含むグリシン緩衝液 （
０．１モル濃度、ｐＨ８．５）で洗浄し、新たなグリシ
ン緩衝溶液で再懸濁し、所望の試薬（固体０．３％を含
む）を含んだ貯蔵溶液を生産した。
【００４４】サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離され、約４Ｉ．Ｕ
．／μｌの活性を持つＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い
た。ＨＬＡホモ接合のセルラインＦＰＦ（Ｃａｍｄｅｎ
， Ｎ．Ｊ．に寄託されたヒト遺伝子変異細胞に由来）
をＨＬＡ−ＤＱα座（１０６個）からのＤＮＡの起源
とした。
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離され、約４Ｉ．Ｕ
．／μｌの活性を持つＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い
た。ＨＬＡホモ接合のセルラインＦＰＦ（Ｃａｍｄｅｎ
， Ｎ．Ｊ．に寄託されたヒト遺伝子変異細胞に由来）
をＨＬＡ−ＤＱα座（１０６個）からのＤＮＡの起源
とした。
【００４５】増幅方法に使用した、プライマーは以下の
核酸配列を持つ。 プライマー１： ５′−Ｙ−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡ
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧ−３ ′ プライマー２： ５′−ＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡ
ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴ−３′上記のＹは、国際公
開第８９／０２９３１ 号 （前記） 公報に記載され
た方法を用いて調製しそして結合した、ビオチンテトラ
エチレングリコールリンカーを意味する。ポリメラーゼ
連鎖反応において使用するｄＮＴＰは、トリチウムで標
識した。
核酸配列を持つ。 プライマー１： ５′−Ｙ−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡ
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧ−３ ′ プライマー２： ５′−ＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡ
ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴ−３′上記のＹは、国際公
開第８９／０２９３１ 号 （前記） 公報に記載され
た方法を用いて調製しそして結合した、ビオチンテトラ
エチレングリコールリンカーを意味する。ポリメラーゼ
連鎖反応において使用するｄＮＴＰは、トリチウムで標
識した。
【００４６】塩洗浄溶液は、塩化ナトリウム（１７．６
ｇ） 、リン酸ナトリウム （１７ミリモル濃度） 、
エチレンジアミン四酢酸（２ミリモル濃度）、ドデシル
硫酸ナトリウム（０．５％）を水１リットル中に含めた
（ｐＨ７．４）。
ｇ） 、リン酸ナトリウム （１７ミリモル濃度） 、
エチレンジアミン四酢酸（２ミリモル濃度）、ドデシル
硫酸ナトリウム（０．５％）を水１リットル中に含めた
（ｐＨ７．４）。
【００４７】方法：２種の標的核酸の試料をトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノエタンヒドロクロライド（６７
ミリモル濃度、ｐＨ８．８）、硫酸アンモニウム（１６
．６ミリモル濃度） 、塩化マグネシウム （２．５ミ
リモル濃度）およびゼラチン（１０μｇ）を含む緩衝液
（１００μｌ）に加えた。前記のプライマーを加え（各
々２０ピコモル） 、続いてトリチウム化ｄＮＴＰ （
各々 ０．１７５ミリモル濃度） 、以前に特定したＤ
ＮＡポリメラーゼ（１２ユニット） および前記のＤＮ
Ａセグメントを添加した。
ドロキシメチル）アミノエタンヒドロクロライド（６７
ミリモル濃度、ｐＨ８．８）、硫酸アンモニウム（１６
．６ミリモル濃度） 、塩化マグネシウム （２．５ミ
リモル濃度）およびゼラチン（１０μｇ）を含む緩衝液
（１００μｌ）に加えた。前記のプライマーを加え（各
々２０ピコモル） 、続いてトリチウム化ｄＮＴＰ （
各々 ０．１７５ミリモル濃度） 、以前に特定したＤ
ＮＡポリメラーゼ（１２ユニット） および前記のＤＮ
Ａセグメントを添加した。
【００４８】増幅は以下のような連続的なサイクルで３
５回実行した。 ７０℃から９５℃まで加温
１分間 ９５℃
０
．５分間（変性） ９５℃から６５℃まで冷却
１．２５分間
６５℃
０．５分間（ハイブリッド形成）
６５℃から７０℃まで加温
１．７５分間 ７０℃
１分間（プライマー伸長）
５回実行した。 ７０℃から９５℃まで加温
１分間 ９５℃
０
．５分間（変性） ９５℃から６５℃まで冷却
１．２５分間
６５℃
０．５分間（ハイブリッド形成）
６５℃から７０℃まで加温
１．７５分間 ７０℃
１分間（プライマー伸長）
【００４９】得られた核
酸混合物を各々濾過し、未伸長ビオチニル化プライマー
および過剰のトリチウム化ｄＮＴＰを取り除いた。こう
して得られた混合物（１００μｌ）をアビジンを結合し
たポリマー粒子（２ｍｇ）と各々混合し、最終容量を
２００μｌとし、３７℃で１時間インキュベートし、次
いでアビジン−ビオチン複合体を形成した。
酸混合物を各々濾過し、未伸長ビオチニル化プライマー
および過剰のトリチウム化ｄＮＴＰを取り除いた。こう
して得られた混合物（１００μｌ）をアビジンを結合し
たポリマー粒子（２ｍｇ）と各々混合し、最終容量を
２００μｌとし、３７℃で１時間インキュベートし、次
いでアビジン−ビオチン複合体を形成した。
【００５０】混合物の一種を２５℃で上記の塩溶液で３
回洗浄し、トリチウム標識の量を測定した。結果は両方
の相補的な標的核酸鎖が粒子上に固定されたことを示し
た。第二の混合物を水酸化ナトリウム（０．１規定）で
３回洗浄し、固定された二本鎖核酸を変性した。遠心後
、水−可溶性物質を取り除き、水−不溶性残渣中のトリ
チウム標識の量を測定し、総カウントの約５０％が存在
することを見いだされ、このことは、粒子上の鎖は首尾
よく変性したと示している。
回洗浄し、トリチウム標識の量を測定した。結果は両方
の相補的な標的核酸鎖が粒子上に固定されたことを示し
た。第二の混合物を水酸化ナトリウム（０．１規定）で
３回洗浄し、固定された二本鎖核酸を変性した。遠心後
、水−可溶性物質を取り除き、水−不溶性残渣中のトリ
チウム標識の量を測定し、総カウントの約５０％が存在
することを見いだされ、このことは、粒子上の鎖は首尾
よく変性したと示している。
【００５１】粒子上の一本鎖核酸は、次に固定化した物
質の懸濁液（前記塩溶液中、全量 １００μｌ）を９５
℃で３０分間加熱し、アビジン−ビオチン結合を開裂す
ることにより単離した。アビジンを結合した粒子は遠心
により取り除き、目的のＨＬＡ核酸を含む上清を採取し
た。上清中のトリチウムの測定値は一本鎖核酸の完全な
回収を示した。
質の懸濁液（前記塩溶液中、全量 １００μｌ）を９５
℃で３０分間加熱し、アビジン−ビオチン結合を開裂す
ることにより単離した。アビジンを結合した粒子は遠心
により取り除き、目的のＨＬＡ核酸を含む上清を採取し
た。上清中のトリチウムの測定値は一本鎖核酸の完全な
回収を示した。
【００５２】例２：着色検出を用いた標的ＨＬＡ ＤＮ
Ａ の検出 この例では、色素生成検出組成物を用いてＨＬＡ ＤＮ
Ａ を検出する本発明の実例を具体的に説明する。材料
：ｄＮＴＰがトリチウム化されていないことを除き、前
の例１に記載した試薬を用いた。次の追加の試薬もまた
使用した：以下の配列を持つ標的核酸に相補的なオリゴ
ヌクレオチドから調製したプローブ：５′−Ｘ−ＡＧＴ
ＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＧＧＣ−３′上記Ｘは、国際公
開第８９／０２８３１ 号 （前記） 公報の方法に従
って調製およびオリゴヌクレオチドと結合した１６個の
エチレングリコール単位を持つアミノテトラエチレング
リコールリンカーを意味する。
Ａ の検出 この例では、色素生成検出組成物を用いてＨＬＡ ＤＮ
Ａ を検出する本発明の実例を具体的に説明する。材料
：ｄＮＴＰがトリチウム化されていないことを除き、前
の例１に記載した試薬を用いた。次の追加の試薬もまた
使用した：以下の配列を持つ標的核酸に相補的なオリゴ
ヌクレオチドから調製したプローブ：５′−Ｘ−ＡＧＴ
ＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＧＧＣ−３′上記Ｘは、国際公
開第８９／０２８３１ 号 （前記） 公報の方法に従
って調製およびオリゴヌクレオチドと結合した１６個の
エチレングリコール単位を持つアミノテトラエチレング
リコールリンカーを意味する。
【００５３】オリゴヌクレオチドを平均径２．１μｍの
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比、７０：３
０）の粒子と共有結合し以下のようにプローブを形成し
た。粒子の水溶液（１ｍｌ中粒子３０ｍｇ） を遠心し
、上清を取り除いた。次に、粒子は激しく攪拌すること
によってガラス蒸留した水（１ｍｌ）中で再懸濁した。 懸濁液を再び遠心し、上清を取り除き、粒子をメチルイ
ミダゾール（０．２モル濃度）および塩化ナトリウム（
３規定、ｐＨ７）の溶液（１ｍｌ）中で再懸濁した。
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比、７０：３
０）の粒子と共有結合し以下のようにプローブを形成し
た。粒子の水溶液（１ｍｌ中粒子３０ｍｇ） を遠心し
、上清を取り除いた。次に、粒子は激しく攪拌すること
によってガラス蒸留した水（１ｍｌ）中で再懸濁した。 懸濁液を再び遠心し、上清を取り除き、粒子をメチルイ
ミダゾール（０．２モル濃度）および塩化ナトリウム（
３規定、ｐＨ７）の溶液（１ｍｌ）中で再懸濁した。
【００５４】この懸濁液に上記の修飾オリゴヌクレオチ
ド（２．５ナノモル）を加え、得られた混合物をよく混
合した。活性化合物１−（３−ジメチルアミノプロピル
）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（５ｍ
ｇ）を加え、攪拌して十分に混合した後、反応混合物を
室温で時々混合しながら少なくとも２時間（一般に約１
５時間） インキュベートした。
ド（２．５ナノモル）を加え、得られた混合物をよく混
合した。活性化合物１−（３−ジメチルアミノプロピル
）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（５ｍ
ｇ）を加え、攪拌して十分に混合した後、反応混合物を
室温で時々混合しながら少なくとも２時間（一般に約１
５時間） インキュベートした。
【００５５】遠心後最初に上清を取り除き、固体は遠心
分離により液体で洗浄し、溶液間の上清をピペットで取
った： ａ）ガラス蒸留した水（１ｍｌ）で３回、次いでｂ）塩
化ナトリウム（０．０１８モル濃度） 、リン酸ナトリ
ウム（１ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（０
．１ミリモル濃度）およびドデシル硫酸（０．５％、ｐ
Ｈ７．４）の緩衝溶液（１ｍｌ）で３回。緩衝液はあら
かじめ７０℃に加温した。
分離により液体で洗浄し、溶液間の上清をピペットで取
った： ａ）ガラス蒸留した水（１ｍｌ）で３回、次いでｂ）塩
化ナトリウム（０．０１８モル濃度） 、リン酸ナトリ
ウム（１ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（０
．１ミリモル濃度）およびドデシル硫酸（０．５％、ｐ
Ｈ７．４）の緩衝溶液（１ｍｌ）で３回。緩衝液はあら
かじめ７０℃に加温した。
【００５６】最終洗浄の固体をガラス蒸留した水で再懸
濁し、使用するまで４℃で貯蔵されていた３％の粒子懸
濁液、最終容量１ｍｌとして調製した。セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼとアビジンの結合体は市販のＳｅｅ−
Ｑｕｅｎｃｅ （商標） ＨＬＡ−Ｄ キット（Ｅａｓ
ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．） より得た。
濁し、使用するまで４℃で貯蔵されていた３％の粒子懸
濁液、最終容量１ｍｌとして調製した。セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼとアビジンの結合体は市販のＳｅｅ−
Ｑｕｅｎｃｅ （商標） ＨＬＡ−Ｄ キット（Ｅａｓ
ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．） より得た。
【００５７】検出可能な色素を提供するロイコ染料組成
物は以下のように調製した：固体２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．１％
溶液を調製）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル
濃度）中ポリ（ビニルピロリドン）（２０％） の溶液
に溶解した。次に、この溶液にリン酸ナトリウム緩衝液
中、過酸化水素 （１０ミリモル濃度） 、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度） を含
む溶液を加え、最終濃度１％ポリマーおよび ０．００
５％のロイコ染料を調製した。
物は以下のように調製した：固体２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．１％
溶液を調製）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル
濃度）中ポリ（ビニルピロリドン）（２０％） の溶液
に溶解した。次に、この溶液にリン酸ナトリウム緩衝液
中、過酸化水素 （１０ミリモル濃度） 、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチ
レントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度） を含
む溶液を加え、最終濃度１％ポリマーおよび ０．００
５％のロイコ染料を調製した。
【００５８】アッセイ：標的核酸を増幅し、アビジン−
ポリマー試薬と反応させて前記例１に記載したようにア
ビジン−ビオチン複合体を形成した。次に、混合物を水
酸化ナトリウム（０．１規定）で３回洗浄し、固定した
二本鎖核酸を変性した。遠心後、可溶性物質を取り除き
、一本鎖核酸は固定した核酸の懸濁液（前記の塩溶液で
全量 １００μｌとした）を９５℃で３０分間加熱し、
アビジン−ビオチン結合を開裂することにより単離した
。アビジンを結合した粒子は遠心により取り除いた。上
清は目的の一本鎖ＨＬＡ核酸を含んでいた。
ポリマー試薬と反応させて前記例１に記載したようにア
ビジン−ビオチン複合体を形成した。次に、混合物を水
酸化ナトリウム（０．１規定）で３回洗浄し、固定した
二本鎖核酸を変性した。遠心後、可溶性物質を取り除き
、一本鎖核酸は固定した核酸の懸濁液（前記の塩溶液で
全量 １００μｌとした）を９５℃で３０分間加熱し、
アビジン−ビオチン結合を開裂することにより単離した
。アビジンを結合した粒子は遠心により取り除いた。上
清は目的の一本鎖ＨＬＡ核酸を含んでいた。
【００５９】単離した核酸溶液（１０μｌ）を、リン酸
ナトリウム（０．１２５モル濃度） 、塩化ナトリウム
（２．５ナノモル濃度）およびエチレンジアミンテト
ラ酢酸（５ミリモル濃度）を含むｐＨ６．８の溶液中で
プローブ（２００μｇ）と混合した。最終容量は３０μ
ｌとした。この溶液を１０分間３８℃でインキュベート
してプローブを単離した一本鎖核酸とハイブリッド形成
を行った。
ナトリウム（０．１２５モル濃度） 、塩化ナトリウム
（２．５ナノモル濃度）およびエチレンジアミンテト
ラ酢酸（５ミリモル濃度）を含むｐＨ６．８の溶液中で
プローブ（２００μｇ）と混合した。最終容量は３０μ
ｌとした。この溶液を１０分間３８℃でインキュベート
してプローブを単離した一本鎖核酸とハイブリッド形成
を行った。
【００６０】この溶液をＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）
微孔質濾過膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を底部に含むＳ
ｕｒｅｃｅｌｌ（商標） 使い捨て試験デバイス（Ｅａ
ｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．） の試験ウェルに注
ぐと、流体は直ちに膜を通して排液された。プローブと
標的核酸のハイブリッド形成産物は膜の表面上に残存し
た。その産物をリン酸ナトリウム（０．８５ミリモル濃
度） 、塩化ナトリウム （１５ミリモル濃度） およ
びドデシル硫酸ナトリウム （０．５％）を含み、あら
かじめ５５℃に加温した溶液（３００μｌ）で洗浄した
。ペルオキシダーゼ−アビジン試薬（試薬２．３ｎｇを
含有３０μｌ）を加え、Ｓｕｒｅｃｅｌｌ （商標）
試験デバイスを室温で２分間インキュベートした。
微孔質濾過膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を底部に含むＳ
ｕｒｅｃｅｌｌ（商標） 使い捨て試験デバイス（Ｅａ
ｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．） の試験ウェルに注
ぐと、流体は直ちに膜を通して排液された。プローブと
標的核酸のハイブリッド形成産物は膜の表面上に残存し
た。その産物をリン酸ナトリウム（０．８５ミリモル濃
度） 、塩化ナトリウム （１５ミリモル濃度） およ
びドデシル硫酸ナトリウム （０．５％）を含み、あら
かじめ５５℃に加温した溶液（３００μｌ）で洗浄した
。ペルオキシダーゼ−アビジン試薬（試薬２．３ｎｇを
含有３０μｌ）を加え、Ｓｕｒｅｃｅｌｌ （商標）
試験デバイスを室温で２分間インキュベートした。
【００６１】過剰のペルオキシダーゼ−アビジン試液を
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（５０ミリモ
ル濃度） 、ドデシル硫酸ナトリウム（２．４％）、塩
化ナトリウム（０．５規定）および１−メチル−２−ピ
ロリジノン（１０％、ｐＨ８．８）を含む溶液（２００
μｌ）でフィルターを通して洗浄した。ロイコ染料組成
物（５０μｌ）を、次に試験ウェルに加え、５分間での
膜上の赤色色素の出現が標的ＨＬＡ核酸の存在を示した
。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（５０ミリモ
ル濃度） 、ドデシル硫酸ナトリウム（２．４％）、塩
化ナトリウム（０．５規定）および１−メチル−２−ピ
ロリジノン（１０％、ｐＨ８．８）を含む溶液（２００
μｌ）でフィルターを通して洗浄した。ロイコ染料組成
物（５０μｌ）を、次に試験ウェルに加え、５分間での
膜上の赤色色素の出現が標的ＨＬＡ核酸の存在を示した
。
【００６２】
【発明の効果】この発明は、ビオチニル化核酸の捕捉、
単離もしくは調製のための単純で比較的費用のかからな
い方法を提供する。文献に記載されている苛酷な化学的
変性条件を避け、さらに高価なビオチニル化試薬の調製
もしくは購入もまた必要としない。これらの利点は、複
合体を開裂するのに十分な時間６５℃より高温で加熱す
ることによりアビジン−ビオチン複合体の開裂が可能に
なることである。しかしながら、このような操作によっ
て、結合した核酸は損傷を受けない（不必要に高温が用
いられないからであろう）。一般に、８５〜１００ ℃
の範囲の温度で数秒間から数分間で十分である。
単離もしくは調製のための単純で比較的費用のかからな
い方法を提供する。文献に記載されている苛酷な化学的
変性条件を避け、さらに高価なビオチニル化試薬の調製
もしくは購入もまた必要としない。これらの利点は、複
合体を開裂するのに十分な時間６５℃より高温で加熱す
ることによりアビジン−ビオチン複合体の開裂が可能に
なることである。しかしながら、このような操作によっ
て、結合した核酸は損傷を受けない（不必要に高温が用
いられないからであろう）。一般に、８５〜１００ ℃
の範囲の温度で数秒間から数分間で十分である。
Claims (4)
- 【請求項１】 核酸混合物からのビオチニル化標的核
酸の単離方法であって、 Ａ．少なくとも核酸の一種がビオチニル化標的核酸であ
る核酸の水性混合物とアビジンもしくはその誘導体の分
子を共有結合した支持体を接触し、支持体上にアビジン
もしくはその誘導体と少なくとも一種のビオチニル化標
的核酸の水不溶性複合体を形成させる工程、Ｂ．水不溶
性複合体から未複合体化物質を分離する工程、 Ｃ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上に分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｄ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法。 - 【請求項２】 標的核酸の増幅方法であって、Ａ．ポ
リメラーゼ連鎖反応と少なくとも一種のビオチニル化プ
ライマーを用いて被検体中の標的核酸を増幅してビオチ
ニル化標的核酸を形成する工程、 Ｂ．ビオチニル化標的核酸とアビジンもしくはその誘導
体の分子を共有結合した支持体を接触し、支持体上にア
ビジンもしくはその誘導体とビオチニル化標的核酸の水
不溶性複合体を形成させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上に分離した水不溶
性複合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解
離する工程、ならびに Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸を採取する工程、を
含んでなる方法。 - 【請求項３】 一本鎖ＤＮＡの調製方法であって、Ａ
．ポリメラーゼ連鎖反応およびプライマー類の１つだけ
がビオチニル化されている一組のプライマーを用いて被
検体中の標的核酸を増幅し、混合物として標的核酸のビ
オチニル化鎖および標的核酸の未ビオチニル化鎖を形成
する工程、 Ｂ．その混合物とアビジンもしくはその誘導体の分子を
共有結合した支持体を接触し、支持体上にアビジンもし
くはその誘導体と標的核酸のビオチニル化鎖の水不溶性
複合体を形成させる工程、 Ｃ．洗浄により水不溶性複合体から未ビオチニル化鎖を
分離する工程、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃以上に分離した水不溶
性複合体を加熱して標的核酸のビオチニル化鎖を解離す
る工程、ならびに Ｅ．解離した標的核酸のビオチニル化鎖を採取する工程
、を含んでなる方法。 - 【請求項４】 標的核酸の測定方法であって、Ａ．ポ
リメラーゼ連鎖反応と少なくとも１種のビオチニル化プ
ライマーを用いて被検体中の標的核酸を増幅し、ビオチ
ニル化標的核酸を形成させる工程、 Ｂ．ビオチニル化標的核酸とアビジンもしくはその誘導
体の分子を共有結合した支持体を接触し、支持体上にア
ビジンもしくはその誘導体とビオチニル化標的核酸の水
不溶性複合体を形成させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体から未複合体化物質を分離する工程
、 Ｄ．複合体中の実質上すべてのアビジン−ビオチン結合
を開裂するのに十分な時間６５℃で分離した水不溶性複
合体を加熱して得られたビオチニル化標的核酸を解離す
る工程、 Ｅ．解離したビオチニル化標的核酸と、少なくとも１種
の前記ビオチニル化鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ローブを接触して水不溶性ハイブリッド生成物を形成さ
せる工程、 Ｆ．水不溶性ハイブリッド生成物からハイブリッド生成
物を形成していない水可溶性物質を分離する工程、Ｇ．
水不溶性ハイブリッド生成物と酵素−アビジン結合体を
接触して前記結合体とハイブリッド生成物間に水不溶性
複合体を形成させる工程、ならびにＨ．被検体中の標的
核酸量の測度として水不溶性複合体を検出する工程、を
含んでなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/519,533 US5387505A (en) | 1990-05-04 | 1990-05-04 | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage |
| US519533 | 1990-05-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228076A true JPH04228076A (ja) | 1992-08-18 |
Family
ID=24068718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3100792A Pending JPH04228076A (ja) | 1990-05-04 | 1991-05-02 | アビジン−ビオチン開裂による一本鎖ビオチニル化核酸の調製および単離 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5387505A (ja) |
| EP (1) | EP0456304B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04228076A (ja) |
| KR (1) | KR910020180A (ja) |
| AT (1) | ATE130048T1 (ja) |
| CA (1) | CA2039222A1 (ja) |
| DE (1) | DE69114353T2 (ja) |
| FI (1) | FI912141A (ja) |
| HK (1) | HK38296A (ja) |
| IE (1) | IE911508A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006219399A (ja) * | 2005-02-09 | 2006-08-24 | Noguchi Inst | 水溶性糖鎖プローブ |
| JP2006230342A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 一本鎖核酸の分離方法および装置並びにマイクロアレイおよびｄｎａチップ。 |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| US5976789A (en) * | 1991-07-17 | 1999-11-02 | Bio Merieux | System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes |
| FR2679252B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-12-10 | Bio Merieux | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes. |
| US5401632A (en) * | 1992-07-16 | 1995-03-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Triple helix purification and sequencing |
| US6194144B1 (en) | 1993-01-07 | 2001-02-27 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
| US7803529B1 (en) | 1995-04-11 | 2010-09-28 | Sequenom, Inc. | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US5616465A (en) | 1995-08-09 | 1997-04-01 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes |
| US6027879A (en) * | 1995-08-09 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe |
| WO1997020070A1 (en) * | 1995-11-29 | 1997-06-05 | The Anthony Nolan Bone Marrow Trust | Methods for separating and/or identifying dna molecules |
| US6022688A (en) | 1996-05-13 | 2000-02-08 | Sequenom, Inc. | Method for dissociating biotin complexes |
| EP1457496B1 (en) | 1996-11-06 | 2014-01-15 | Sequenom, Inc. | High density immobilization of nucleic acids |
| US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| US6046005A (en) * | 1997-01-15 | 2000-04-04 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group |
| GB9701425D0 (en) | 1997-01-24 | 1997-03-12 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| IL120337A0 (en) * | 1997-02-27 | 1997-06-10 | Gesher Israel Advanced Biotecs | Method for joining DNA fragments |
| US6268131B1 (en) | 1997-12-15 | 2001-07-31 | Sequenom, Inc. | Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids |
| US6723564B2 (en) | 1998-05-07 | 2004-04-20 | Sequenom, Inc. | IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices |
| US6432290B1 (en) | 1999-11-26 | 2002-08-13 | The Governors Of The University Of Alberta | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7611869B2 (en) * | 2000-02-07 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7955794B2 (en) * | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| DK1259643T3 (da) * | 2000-02-07 | 2009-02-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming |
| US8076063B2 (en) * | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US20030082549A1 (en) * | 2000-08-30 | 2003-05-01 | Xiangjun Liu | Method for determining alleles |
| US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US20020086292A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Shigeaki Harayama | Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules |
| GB0102568D0 (en) * | 2001-02-01 | 2001-03-21 | Magnetic Biosolutions Sweden A | Method |
| JP2002333446A (ja) * | 2001-05-09 | 2002-11-22 | Fuji Photo Film Co Ltd | 生物学的素材チップ |
| US20050003360A1 (en) * | 2001-11-13 | 2005-01-06 | Ruo-Pang Huang | Array systems and methods |
| CA2467814A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-06-12 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US9388459B2 (en) * | 2002-06-17 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| US7108976B2 (en) * | 2002-06-17 | 2006-09-19 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification |
| US20040259105A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-12-23 | Jian-Bing Fan | Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples |
| US7459273B2 (en) * | 2002-10-04 | 2008-12-02 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US8114978B2 (en) | 2003-08-05 | 2012-02-14 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US20060134612A1 (en) * | 2004-02-10 | 2006-06-22 | Frederic Bushman | Methods and compositions for retroviral preintegration complex-based assays |
| US20070248958A1 (en) * | 2004-09-15 | 2007-10-25 | Microchip Biotechnologies, Inc. | Microfluidic devices |
| US20060134650A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-22 | Illumina, Inc. | Methylation-sensitive restriction enzyme endonuclease method of whole genome methylation analysis |
| US7452671B2 (en) * | 2005-04-29 | 2008-11-18 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping with selective adaptor ligation |
| US11306351B2 (en) | 2005-12-21 | 2022-04-19 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| EP1979079A4 (en) | 2006-02-03 | 2012-11-28 | Integenx Inc | MICROFLUIDIC DEVICES |
| US20080255004A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-10-16 | Invitrogen Dynal As | Methods of reversibly binding a biotin compound to a support |
| US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
| JP5437639B2 (ja) * | 2006-12-28 | 2014-03-12 | 日本たばこ産業株式会社 | 耐熱性ビオチン結合性タンパク質の利用法、および当該タンパク質が結合した固体担体 |
| SG177228A1 (en) | 2006-12-28 | 2012-01-30 | Japan Tobacco Inc | Use of heat-resistant biotin-binding protein, and solid support having the protein attached thereto |
| KR20100028526A (ko) | 2007-02-05 | 2010-03-12 | 마이크로칩 바이오테크놀로지스, 인크. | 마이크로유체 및 나노유체 장치, 시스템 및 응용 |
| US8652780B2 (en) | 2007-03-26 | 2014-02-18 | Sequenom, Inc. | Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection |
| US20080293589A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-11-27 | Affymetrix, Inc. | Multiplex locus specific amplification |
| WO2009032779A2 (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the size-specific seperation of nucleic acid from a sample |
| ATE549419T1 (de) * | 2007-08-29 | 2012-03-15 | Sequenom Inc | Verfahren und zusammensetzungen für die universelle grössenspezifische polymerasekettenreaktion |
| US9388457B2 (en) * | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| KR20110030415A (ko) | 2008-01-22 | 2011-03-23 | 인터젠엑스 인크. | 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도 |
| US9074244B2 (en) | 2008-03-11 | 2015-07-07 | Affymetrix, Inc. | Array-based translocation and rearrangement assays |
| AU2009228312B2 (en) | 2008-03-26 | 2015-05-21 | Sequenom, Inc. | Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection |
| KR20110111449A (ko) * | 2008-12-31 | 2011-10-11 | 인터젠엑스 인크. | 미세유체 칩을 갖는 기구 |
| EP2408936A4 (en) * | 2009-03-18 | 2013-01-30 | Sequenom Inc | USE OF HEAT-STAINED ENDONUCLEASES FOR THE PREPARATION OF REPORTER MOLECULES |
| WO2010141326A1 (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-09 | Integenx Inc. | Fluidic devices with diaphragm valves |
| CN102803147B (zh) | 2009-06-05 | 2015-11-25 | 尹特根埃克斯有限公司 | 通用样品准备系统以及在一体化分析系统中的用途 |
| US8584703B2 (en) * | 2009-12-01 | 2013-11-19 | Integenx Inc. | Device with diaphragm valve |
| US8512538B2 (en) | 2010-05-28 | 2013-08-20 | Integenx Inc. | Capillary electrophoresis device |
| EP2606242A4 (en) | 2010-08-20 | 2016-07-20 | Integenx Inc | MICROFLUIDIC DEVICES HAVING MECHANICALLY SEALED DIAPHRAGM VALVES |
| EP2606154B1 (en) | 2010-08-20 | 2019-09-25 | Integenx Inc. | Integrated analysis system |
| US20150136604A1 (en) | 2011-10-21 | 2015-05-21 | Integenx Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
| US10865440B2 (en) | 2011-10-21 | 2020-12-15 | IntegenX, Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
| US10191071B2 (en) | 2013-11-18 | 2019-01-29 | IntegenX, Inc. | Cartridges and instruments for sample analysis |
| WO2015179098A1 (en) | 2014-05-21 | 2015-11-26 | Integenx Inc. | Fluidic cartridge with valve mechanism |
| WO2016065073A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Integenx Inc. | Systems and methods for sample preparation, processing and analysis |
| CN114144523A (zh) * | 2020-02-03 | 2022-03-04 | 因美纳有限公司 | 生物素-链霉抗生物素蛋白裂解组合物和文库片段裂解 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4772691A (en) * | 1985-06-05 | 1988-09-20 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Chemically cleavable nucleotides |
| EP0286642A4 (en) * | 1985-12-17 | 1990-06-27 | Genetics Inst | TEST PROCEDURE BY MEANS OF POLYNUCLEOTIDE DISPLACEMENT AND REAGENT COMPLEX. |
| US4818680A (en) * | 1985-12-18 | 1989-04-04 | Mary Collins | Method and kit involving displacement and rehybridization of labeled polynucleotide |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| JPH07107537B2 (ja) * | 1987-08-03 | 1995-11-15 | イーストマン コダック カンパニー | アビジン−及びビオチン−固定試薬，分析要素並びにその使用法 |
| US4914210A (en) * | 1987-10-02 | 1990-04-03 | Cetus Corporation | Oligonucleotide functionalizing reagents |
| DE3888653T2 (de) * | 1987-12-21 | 1994-07-07 | Applied Biosystems | Verfahren und Testsatz zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz. |
| SE8801070D0 (sv) * | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
| WO1990002205A1 (en) * | 1988-08-25 | 1990-03-08 | Angenics, Inc. | Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination |
| CA2002076A1 (en) * | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
-
1990
- 1990-05-04 US US07/519,533 patent/US5387505A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-03-27 CA CA002039222A patent/CA2039222A1/en not_active Abandoned
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- 1991-05-02 JP JP3100792A patent/JPH04228076A/ja active Pending
- 1991-05-03 KR KR1019910007206A patent/KR910020180A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-05-03 FI FI912141A patent/FI912141A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-05-03 IE IE150891A patent/IE911508A1/en unknown
-
1996
- 1996-03-07 HK HK38296A patent/HK38296A/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006219399A (ja) * | 2005-02-09 | 2006-08-24 | Noguchi Inst | 水溶性糖鎖プローブ |
| JP2006230342A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 一本鎖核酸の分離方法および装置並びにマイクロアレイおよびｄｎａチップ。 |
Also Published As
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