JP2006230342A - 一本鎖核酸の分離方法および装置並びにマイクロアレイおよびｄｎａチップ。 - Google Patents
一本鎖核酸の分離方法および装置並びにマイクロアレイおよびｄｎａチップ。 Download PDFInfo
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- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Abstract
【課題】 遺伝子情報解析の際に用いられる一本鎖核酸を、簡易に短時間で提供できる技術を提供する。
【解決手段】 第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする一本鎖核酸の分離方法、及び、該１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部１と、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部２と、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部３とを有することを特徴とする一本鎖核酸の分離装置である。
【選択図】 図２
【解決手段】 第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする一本鎖核酸の分離方法、及び、該１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部１と、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部２と、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部３とを有することを特徴とする一本鎖核酸の分離装置である。
【選択図】 図２
Description
本発明は、一本鎖核酸の分離方法および装置並びに得られた一本鎖核酸を用いたマイクロアレイおよびＤＮＡチップに関するものである。
ＤＮＡや、ＲＮＡ、ＤＮＡに付加したタンパクなどの生体高分子（以下ＤＮＡを例にとって説明する）の遺伝子配列を測定する際には、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等が使用される。
このようなＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際には、被検サンプルから解析に必要十分な量の一本鎖核酸からなるターゲットを調製する必要がある。
このようなターゲットの調製は、例えば非特許文献１に記載のように、アマシャムバイオサイエンス（株）のＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｂｉｏａｒｒａｙでは、ターゲットとしてビオチン標識ｃＲＮＡを用いるが、このビオチン標識ｃＲＮＡの調製には、遠心分離処理等が複数回必要で処理が煩雑であり、また所要時間も１．５日と比較的長時間になり、総合的に高コストとなる。
このようなＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際には、被検サンプルから解析に必要十分な量の一本鎖核酸からなるターゲットを調製する必要がある。
このようなターゲットの調製は、例えば非特許文献１に記載のように、アマシャムバイオサイエンス（株）のＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｂｉｏａｒｒａｙでは、ターゲットとしてビオチン標識ｃＲＮＡを用いるが、このビオチン標識ｃＲＮＡの調製には、遠心分離処理等が複数回必要で処理が煩雑であり、また所要時間も１．５日と比較的長時間になり、総合的に高コストとなる。
アマシャムバイオサイエンス（株）、"高性能 Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｙｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｂｉｏａｒｒａｙ"、［online］、［平成１７年１月１４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.jp.amershambiosciences.com/technologies/microarrays/pdf/codelink.pdf＞
従って、本発明の目的は、上記問題点を解決することであり、遺伝子情報解析の際に用いられる一本鎖核酸を、簡易に短時間で提供できる技術を提供することである。
本発明は、
第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする一本鎖核酸の分離方法、
を提供する。
第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする一本鎖核酸の分離方法、
を提供する。
本発明の方法の１つでは、前記２本鎖核酸の一本鎖への解離が、アルカリ処理により行なわれる。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質がアビジンであり、前記第２物質がビオチンである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質が抗原であり、前記第２物質が抗体である。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質が金であり、前記第２物質がチオールである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質がアミノ基を有するものであり、前記第２物質がアミノ基と共有結合する基を有するものである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質に担体が結合された。
本発明の方法の１つでは、前記担体が磁性粒子、ビーズ、基板または繊維である。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質がアビジンであり、前記第２物質がビオチンである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質が抗原であり、前記第２物質が抗体である。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質が金であり、前記第２物質がチオールである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質がアミノ基を有するものであり、前記第２物質がアミノ基と共有結合する基を有するものである。
本発明の方法の１つでは、前記第１物質に担体が結合された。
本発明の方法の１つでは、前記担体が磁性粒子、ビーズ、基板または繊維である。
本発明の方法の１つでは、前記第２プライマは標識物質を有する。
本発明の方法の１つでは、前記標識物質が蛍光物質である。
本発明の方法の１つでは、前記核酸増幅で用いられるヌクレオチドは、標識物質を有する。
本発明の方法の１つでは、前記標識物質が蛍光物質である。
本発明の方法の１つでは、前記標識物質が蛍光物質である。
本発明の方法の１つでは、前記核酸増幅で用いられるヌクレオチドは、標識物質を有する。
本発明の方法の１つでは、前記標識物質が蛍光物質である。
また本発明の１つでは、
第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部と、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部と、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部とを有することを特徴とする一本鎖核酸の分離装置、
を提供する。
第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部と、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部と、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部とを有することを特徴とする一本鎖核酸の分離装置、
を提供する。
また本発明の１つは、前記一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をプローブとして有するマイクロアレイ、を提供する。
また本発明の１つは、前記一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたマイクロアレイ、を提供する。
また本発明の１つは、前記一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたＤＮＡチップ、を提供する。
また本発明の１つは、前記一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたマイクロアレイ、を提供する。
また本発明の１つは、前記一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたＤＮＡチップ、を提供する。
本発明の一本鎖核酸の分離方法および装置は、遺伝子情報解析の際に用いる一本鎖核酸を、簡易に短時間・低コストで提供することを可能とした。
本発明の一本鎖核酸の分離方法は、第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする。
本発明の一本鎖核酸の分離方法を図１のフローチャートを参照して次に説明する。
１）第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う。
２）核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を第１物質に結合させる。
３）第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる。
本発明の一本鎖核酸の分離方法を図１のフローチャートを参照して次に説明する。
１）第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う。
２）核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を第１物質に結合させる。
３）第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる。
また、本発明の一本鎖核酸の分離方法を実施するための装置としては、特に限定されないが、図２に示すような、第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部１と、該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部２と、該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部３とを有することを特徴とするものが挙げられる。
本発明の一本鎖核酸の分離方法および装置において、第１物質および第２物質とは、互いに特異的に結合可能なものであれば、特に限定されない。具体的には、アビジン−ビオチン、抗原（ペプチド等）−抗体、リガンド−レセプタ、金−ＳＨ（チオール基）の組合せや、アミノ基−カルボキシル基／スクシイミド／イソチオシアネート／イソシアネート／ヒドラジド／酸無水物／エポキシ／アルデヒド／トリアジン／ハロゲン化アルキル／イミドエステル、チオール基−マレイミド／ジスルフィド／ヨードアセトアミド／ハロアセチル等の共有結合する関係の組合せが挙げられる。その中でも、アビジン−ビオチンの組合せは、共に生体内物質であり、無害安全であり、取り扱いも容易であるため好ましい。また、その中でも、第１物質がアビジンで、第２物質がビオチンであることが好ましい。これは、アビジンがビオチンの結合サイトを４つ有することにより、アビジン１分子でビオチンが結合した２本鎖核酸を４つ（４分子）結合でき、本発明における２本鎖核酸の補足・回収効率が向上する。
本発明の一本鎖核酸の分離方法および装置において、核酸増幅の手法としては、特に限定されない。具体的には、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮ等の各種の手法が挙げられる。その中でも、一般的なＰＣＲが好ましい。
本発明の一本鎖核酸の分離方法および装置において、第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる手法としては、特に限定されない。具体的には、アルカリ処理、加熱処理、塩濃度操作等の各種の手法が挙げられる。その中でも、アルカリ処理が最も簡易であるため、好ましい。
本発明の一本鎖核酸の分離方法および装置において、第１物質に担体が結合されていてもよい。担体を用いることにより、本発明の一本鎖核酸の分離効果が向上する。
担体としては、特に限定されないが、具体的には、磁性体、ビーズ、基板、繊維等が挙げられる。磁性体としては、磁性粒子が好ましい。磁性粒子であれば、得られた２本鎖核酸（第２物質が結合）または得られた２本鎖核酸を一本鎖に解離させた後の一本鎖核酸（第２物質が結合）が存在する液中に、該磁性粒子を分散させたあと、磁力を印加することにより、該２本鎖核酸または一本鎖核酸を効果的に固定・補足・回収・分離できる。
また、担体としてビーズを用いる場合は、フィルター濾過やゲル濾過により固定・補足・回収・分離できる。
以上のように、本発明においては、磁性粒子を用いて効率的に一本鎖核酸を調製できるが、磁性粒子を用いることで、ＰＣＲ等の反応液中のタンパク質の除去や未回収の２本鎖核酸の除去など精製操作が可能であるという利点も有する。
担体としては、特に限定されないが、具体的には、磁性体、ビーズ、基板、繊維等が挙げられる。磁性体としては、磁性粒子が好ましい。磁性粒子であれば、得られた２本鎖核酸（第２物質が結合）または得られた２本鎖核酸を一本鎖に解離させた後の一本鎖核酸（第２物質が結合）が存在する液中に、該磁性粒子を分散させたあと、磁力を印加することにより、該２本鎖核酸または一本鎖核酸を効果的に固定・補足・回収・分離できる。
また、担体としてビーズを用いる場合は、フィルター濾過やゲル濾過により固定・補足・回収・分離できる。
以上のように、本発明においては、磁性粒子を用いて効率的に一本鎖核酸を調製できるが、磁性粒子を用いることで、ＰＣＲ等の反応液中のタンパク質の除去や未回収の２本鎖核酸の除去など精製操作が可能であるという利点も有する。
以下、本発明のより好ましい実施形態について説明する。
〔実施形態１〕
図３に示すように、第１プライマ１１としてビオチン２１が結合したプライマを、第２プライマ１２として蛍光物質２２を有するプライマを用いて核酸であるＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う（第１１ステップ：第１１−１〜１１−３ステップ）。ＰＣＲ増幅で得られた２本鎖ＤＮＡを磁性粒子４に結合させたアビジン２３に結合させる（第１２ステップ）。磁石５で２本鎖ＤＮＡが結合した磁性粒子４を回収・固定し、アルカリ処理により該２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離する（第１３ステップ）。蛍光物質２２で標識された１本鎖ＤＮＡは液中に存在し、上清を回収することにより容易に分離・回収でき、そのまま、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際の、蛍光標識ターゲットとして用いることができる。
〔実施形態１〕
図３に示すように、第１プライマ１１としてビオチン２１が結合したプライマを、第２プライマ１２として蛍光物質２２を有するプライマを用いて核酸であるＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う（第１１ステップ：第１１−１〜１１−３ステップ）。ＰＣＲ増幅で得られた２本鎖ＤＮＡを磁性粒子４に結合させたアビジン２３に結合させる（第１２ステップ）。磁石５で２本鎖ＤＮＡが結合した磁性粒子４を回収・固定し、アルカリ処理により該２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離する（第１３ステップ）。蛍光物質２２で標識された１本鎖ＤＮＡは液中に存在し、上清を回収することにより容易に分離・回収でき、そのまま、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際の、蛍光標識ターゲットとして用いることができる。
〔実施形態２〕
図４に示すように、第１プライマ１１としてビオチン２１が結合したプライマを、第２プライマ１２として修飾なしのプライマを、ヌクレオチドとして蛍光物質２２を有するｄＮＴＰ１３を用いてＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う（第２１ステップ：第２１−１〜２１−３ステップ）。ＰＣＲ増幅で得られた２本鎖ＤＮＡを磁性粒子４に結合させたアビジン２３に結合させる（第２２ステップ）。磁石５で２本鎖ＤＮＡが結合した磁性粒子４を回収・固定し、アルカリ処理により該２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離する（第２３ステップ）。蛍光物質２２で標識された１本鎖ＤＮＡは液中に存在し、上清を回収することにより容易に分離・回収でき、そのまま、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際の、蛍光標識ターゲットとして用いることができる。
図４に示すように、第１プライマ１１としてビオチン２１が結合したプライマを、第２プライマ１２として修飾なしのプライマを、ヌクレオチドとして蛍光物質２２を有するｄＮＴＰ１３を用いてＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う（第２１ステップ：第２１−１〜２１−３ステップ）。ＰＣＲ増幅で得られた２本鎖ＤＮＡを磁性粒子４に結合させたアビジン２３に結合させる（第２２ステップ）。磁石５で２本鎖ＤＮＡが結合した磁性粒子４を回収・固定し、アルカリ処理により該２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離する（第２３ステップ）。蛍光物質２２で標識された１本鎖ＤＮＡは液中に存在し、上清を回収することにより容易に分離・回収でき、そのまま、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いてハイブリダイゼーションによる遺伝子情報の解析を行う際の、蛍光標識ターゲットとして用いることができる。
なお、上記実施形態１および２では、蛍光標識されたプライマまたは蛍光標識されたヌクレオチドを用いて核酸増幅を行い、蛍光標識一本鎖核酸が得られ、この蛍光標識一本鎖核酸がそのままターゲット等として利用できるものであるが、本発明は、核酸増幅時に、必ずしも蛍光標識されたプライマおよび蛍光標識されたヌクレオチド等を用いて、標識一本鎖核酸を得るものではない。核酸増幅時に、非標識のプライマまたはヌクレオチドを用いて非標識一本鎖核酸を得、この非標識一本鎖核酸をターッゲット等に用いてハイブリダイゼーションを行った後、２本鎖核酸を特異的に認識し該２本鎖間に入り込む、所謂、インターカレーション作用を有する標識物質または検出試薬を用いることもできる。
また、核酸増幅時に、標識物質を用いない別の測定形態としては、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を、基板上に多数の電極を有するものとし、各電極にそれぞれ異なるプローブ核酸を固定し、かつ電流源を接続した構造のものとし、ターゲットがハイブリダイゼーションした電極とハイブリダイゼーションしていない電極での電流量の差を測定することにより検出できるものがある。
また、核酸増幅時に、標識物質を用いない別の測定形態としては、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を、基板上に多数の電極を有するものとし、各電極にそれぞれ異なるプローブ核酸を固定し、かつ電流源を接続した構造のものとし、ターゲットがハイブリダイゼーションした電極とハイブリダイゼーションしていない電極での電流量の差を測定することにより検出できるものがある。
〔実験データ〕
一方のプライマのみ（第１プライマ）にビオチン（第２物質）を結合させたものを用いたＰＣＲ産物（２本鎖ＤＮＡ）をサンプルとした。
該ＰＣＲ産物を、ストレプトアビジン（第１物質）を結合させた磁性粒子（担体）と混合し、２本鎖ＤＮＡを磁性粒子と結合させた。
該磁性粒子を磁気固定後に上清を除去し、該上清にＮａＯＨを添加（処理）して、２本鎖ＤＮＡの１本鎖化を行なった。
該ＮａＯＨ添加後の上清に、１本鎖ＤＮＡ検出試薬（ＯｌｉＧｒｅｅｎ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）を添加し、その蛍光強度を測定した。その測定結果を図５に示す。
図５に示すように、ＮａＯＨ処理を行なわずに１本鎖ＤＮＡ検出試薬で染色したサンプルと比較すると、ＮａＯＨ処理を行なったサンプルは、蛍光強度で５倍の差が得られた。従って、アルカリ処理により、上清に１本鎖ＤＮＡが分離できたことがわかる。
一方のプライマのみ（第１プライマ）にビオチン（第２物質）を結合させたものを用いたＰＣＲ産物（２本鎖ＤＮＡ）をサンプルとした。
該ＰＣＲ産物を、ストレプトアビジン（第１物質）を結合させた磁性粒子（担体）と混合し、２本鎖ＤＮＡを磁性粒子と結合させた。
該磁性粒子を磁気固定後に上清を除去し、該上清にＮａＯＨを添加（処理）して、２本鎖ＤＮＡの１本鎖化を行なった。
該ＮａＯＨ添加後の上清に、１本鎖ＤＮＡ検出試薬（ＯｌｉＧｒｅｅｎ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）を添加し、その蛍光強度を測定した。その測定結果を図５に示す。
図５に示すように、ＮａＯＨ処理を行なわずに１本鎖ＤＮＡ検出試薬で染色したサンプルと比較すると、ＮａＯＨ処理を行なったサンプルは、蛍光強度で５倍の差が得られた。従って、アルカリ処理により、上清に１本鎖ＤＮＡが分離できたことがわかる。
本発明の一本鎖核酸の分離方法は、ＤＮＡチップまたはマイクロアレイを用いた遺伝子情報解析を行う際の、ターゲットの作成に用いられる。換言すれば、本発明の方法で得られた一本鎖核酸は、ＤＮＡチップまたはマイクロアレイ等を用いた遺伝子情報解析を行う際の、ターゲットして用いられる。
また、本発明の一本鎖核酸の分離方法は、遺伝子情報解析を行うためのマイクロアレイを作成するためのプローブの作成に用いられる。換言すれば、本発明の方法で得られた一本鎖核酸は、遺伝子情報解析を行うためのマイクロアレイを作成するためのプローブして用いられる。
また、本発明の一本鎖核酸の分離方法は、遺伝子情報解析を行うためのマイクロアレイを作成するためのプローブの作成に用いられる。換言すれば、本発明の方法で得られた一本鎖核酸は、遺伝子情報解析を行うためのマイクロアレイを作成するためのプローブして用いられる。
本発明の一本鎖核酸の分離方法は、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等を用いる遺伝子情報解析の際に用いるターゲット等の一本鎖核酸を、遠心分離を行なわずに、調製・分離が可能であるため、本発明の方法を実施するための器具のカートリッジ化が可能である。
本発明の方法を実施するためのカーットリッジの形態としては、特に限定されないが、精製済核酸の増幅→補足・回収・固定→一本鎖化までの最小限の工程のみ行なうものであっても良く、また、血液・生体組織等からの核酸の抽出からＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等へのターゲットのハイブリダイゼーション、さらには、読取装置による検出まで可能な態様としても良い。
本発明の方法を実施するためのカーットリッジの形態としては、特に限定されないが、精製済核酸の増幅→補足・回収・固定→一本鎖化までの最小限の工程のみ行なうものであっても良く、また、血液・生体組織等からの核酸の抽出からＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等へのターゲットのハイブリダイゼーション、さらには、読取装置による検出まで可能な態様としても良い。
１ 核酸増幅部
２ 結合部
３ 解離部
４ 磁性粒子
５ 磁石
１１ 第１プライマ
１２ 第２プライマ
１３ ｄＮＴＰ
２１ ビオチン
２２ 蛍光物質
２３ アビジン
２ 結合部
３ 解離部
４ 磁性粒子
５ 磁石
１１ 第１プライマ
１２ 第２プライマ
１３ ｄＮＴＰ
２１ ビオチン
２２ 蛍光物質
２３ アビジン
Claims (16)
- 第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行い、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させ、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させることを特徴とする一本鎖核酸の分離方法。 - 前記２本鎖核酸の一本鎖への解離が、アルカリ処理により行なわれることを特徴とする請求項１記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第１物質がアビジンであり、前記第２物質がビオチンであることを特徴とする請求項１または２記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第１物質が抗原であり、前記第２物質が抗体であることを特徴とする請求項１または２記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第１物質が金であり、前記第２物質がチオールであることを特徴とする請求項１または２記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第１物質がアミノ基を有するものであり、前記第２物質がアミノ基と共有結合する基を有するものであることを特徴とする請求項１または２記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第１物質に担体が結合されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記担体が磁性粒子、ビーズ、基板または繊維であることを特徴とする請求項７記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記第２プライマは標識物質を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項９記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記核酸増幅で用いられるヌクレオチドは、標識物質を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１１記載の一本鎖核酸の分離方法。
- 第１物質と特異的に結合可能な第２物質が結合された第１プライマと、該第２物質が結合されていない第２プライマを用いて核酸増幅を行う核酸増幅部と、
該核酸増幅によって得られた２本鎖核酸を該第１物質に結合させる結合部と、
該第１物質に結合させた２本鎖核酸を一本鎖に解離させる解離部とを有することを特徴とする一本鎖核酸の分離装置。 - 請求項１〜１２のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をプローブとして有するマイクロアレイ。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたマイクロアレイ。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の一本鎖核酸の分離方法で得られた一本鎖核酸をターゲットとしてハイブリダイゼーションさせたＤＮＡチップ。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JPH03503001A (ja) * | 1988-06-01 | 1991-07-11 | アメリカ合衆国 | Ｄｎａの配列決定；ポリメラーゼ鎖反応の改良 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH03503001A (ja) * | 1988-06-01 | 1991-07-11 | アメリカ合衆国 | Ｄｎａの配列決定；ポリメラーゼ鎖反応の改良 |
| JPH04228076A (ja) * | 1990-05-04 | 1992-08-18 | Eastman Kodak Co | アビジン−ビオチン開裂による一本鎖ビオチニル化核酸の調製および単離 |
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