FI94429B - Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi sekä menetelmässä käytettävä reagenssiyhdistelmä ja reagenssipakkaus - Google Patents
Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi sekä menetelmässä käytettävä reagenssiyhdistelmä ja reagenssipakkaus Download PDFInfo
- Publication number
- FI94429B FI94429B FI880994A FI880994A FI94429B FI 94429 B FI94429 B FI 94429B FI 880994 A FI880994 A FI 880994A FI 880994 A FI880994 A FI 880994A FI 94429 B FI94429 B FI 94429B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- probe
- primers
- affinity pair
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
-94429
Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi sekä menetelmässä käytettävä reagenssiyhdistelmä ja reagenssipakkaus
Keksinnön kohteena on nopea ja herkkä menetelmä nukleiini-05 happojen määrittämiseksi hybridisaatiotekniikoilla, joissa käytetään detektorikoettimia kohdenukleiinihappomolekyylin kopioihin ennen hybridisaatiota integroituneina modifioituina alukkeina.
10 Keksinnön kohteena on myös menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi hybridisaatiotekniikoilla, joissa kiinnitin-koettimet toimivat kohdenukleiinihappomelekyyleihin ennen hybridisaatioreaktiota integroituneina modifioituina alukkeina.
15
Edelleen keksintö koskee yllä mainituissa menetelmissä käytettäviä reagenssiyhdistelmiä sekä reagenssipakkauksia.
Hybridisaatioreaktioissa leimatun oligo- tai polynukleotidin 20 ts. koettimen emästen annetaan pariutua kohdenukleiinihapon emästen kanssa. Nukleiinihappojen detektoinnissa on käytetty useita hybridisaatiomenetelmiä. Suorissa hybridisaatiomene-telmissä näyte on joko liuoksessa tai kiinitettynä kiinteään kantajaan. Nukleiinihappo tunnistetaan yhtä koetinta käyt-25 täen.
Suomalaisessa patentissa Fl 63596 on kuvattu kerroshybridi-saatiomenetelmä, jossa käytetään kahta, erillistä koetinta. Toinen koettimista on leimattu detektorikoetin, jota 30 käytetään nukleiinihapon osoittamiseen, toinen on kiinteään kantajaan immobilisoitu kiinnitinkoetin, jonka avulla kohdenukleiinihappo erotetaan reaktioseoksesta.
Liuoshybridisaatiomenetelmä on kuvattu suomalaisessa paten-35 tissa FI 850004. Tässä menetelmässä käytetään kahta erilaista koetinta, jotka ovat molemmat samassa liuosfaasissa. Detektorikoetin on varustettu detektoitavalla leimalla ja kiin-nitinkoettimeen on kiinnitetty komponentti, jolla on 2 -.94429 affiniteettia toiseen komponenttiin. Kun hybridisaatio on tapahtunut, kiinnitinkoettimen, kohdenukleiinihapon ja detektorikoettimen välille muodostunut hybridi voidaan erottaa hybridisaatioliuoksesta affiniteettiparin toisen 05 osapuolen avulla.
DNA:n entsymaattisesti katalysoitu polymerisaatio, jossa mallinukleiinihapposäikeen eli ns. templaatin nukleotidi-sekvenssi kopioidaan tarkkaan vastinsäikeeksi, on alalla 10 tunnettu. Menetelmä on kuvattu mm. teoksissa Kornberg, DNA
replication, W.H. Freeman & Co, San Francisco, ss. 221-225 ja 670-679, 1980 ja Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 122, 1982. Tätä biologista monistumista on käytetty hybridisaatio-15 analyyseissa, joissa tunnistettavaa mikrobia viljellään ja sen DNA:ta rikastetaan ennen testiä kuten on kuvattu teoksessa Woo, Methods Enzymol. 68, s. 389, 1979 ja US patentissa No. 4,358,535. Määrättyjä DNA-sekvenssejä voidaan myös amplifioida elävien solujen sisällä, esimerkiksi käyttämällä 20 sopivia lääkeaineita, kuten on kuvattu julkaisussa Clewell ja Helinski J. Bacteriol. 110, s. 1135, 1972 ja patenttihakemuksessa EP 55 742. Vielä spesifisempi DNA:n rikastusmenetetelmä on kuvattu patenttihakemuksessa EP 175 689, jossa kohdenuk-leiinihappo on liitetty plasmidin itsenäisesti replikoituvaan 25 DNA-yksikköön ja viety tämän jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Patenttihakemuksessa EP 201 184 on kuvattu vielä menetelmä, jossa on käytetty hyväksi DNA-synteesin riippuvaisuutta sopivasta alukkeesta amplifioimalla kohde-DNA in vitro reaktiolla. Patenttihakemuksessa EP 200 362 on esitetty 30 menetelmä amplifioitujen geenien havaitsemiseksi.
Keksinnön mukaisessa hybridisaatiomenetelmässä joko detektori- tai kiinnitinkoettimet toimivat modifioituina alukkeina, jotka integroituvat ennen hybridisaatiota kohdenukleiinihapon 35 kopioihin templaatista riippuvassa polymerisaatioreaktiossa.
Keksinnön kohteena olevassa menetelmässä tarvitaan vähintäin 3 -94429 yksi aluke ja alukkeet ovat aina modifioituja. Mikäli detek-torikoettimet toimivat alukkeina polymerisointireaktiossa, alukkeet on varustettu vähintäin yhdellä sopivalla, detek-toitavalla leimalla tai vähintäin yhdellä spesifisellä 05 kohdalla, johon voidaan liittää vähintäin yksi sopiva detektoitava leima.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kiinnitinkoettimia modifioituina alukkeina polymerisaatioreaktiossa. Tässä tapauksessa 10 alukkeet on varustettu vähintäin yhdellä sopivalla affini-teettiparin komponentilla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi sopiva affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää.
15 Keksintö kohdistuu myös reagenssiyhdistelmään ja reagenssi-pakkaukseen, johon kuuluu testin suorittamisessa käytettävä reagenssiyhdistelmä säiliöineen.
Käyttämällä detektori- tai kiinnitinkoettimia alukkeina 20 polymerisaatioreaktiossa on mahdollista lisätä hybridi- saatioreaktion herkkyyttä usealla suuruusluokalla verrattuna menetelmiin, joissa mitataan suoraan kohdenukleiinihapon määrää. Lisäksi keksintö mahdollistaa hybridisaatioreaktion suorittamisen kätevästi liuoksessa, jolloin hybridit voidaan 25 erottaa helposti ja nopeasti hybridisaatioliuoksesta hybridisaatioreaktion jälkeen.
Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu hyvin sellaisten sairauksien diagnostisoimiseen, joita on erittäin vaikea 30 diagnostisoida perinteisiä menetelmiä käyttäen. Näin ollen menetelmä on erityisen hyödyllinen cytomegalo- ja HI- tai AIDS-virusten tunnistamisessa.
Seuraavassa kuvataan keksinnön toteuttamistapa yksityis-35 kohtaisemmrn.
Kuvassa 1 on esitetty esimerkeissä 1, 2 ja 3 käytettyjen 4 - 94429 modifioitujen alukkeiden Pg ja sekä selektiivisten koetti-mien ja S2 emäsjärjestys. Samoin on kuvattu modifioitujen alukkeiden PQ ja P^ ja selektiivisten koettimien ja S2 keskinäinen sijainti kohdenukleiinihappoon nähden. Pitkät 05 viivat A ja B esittävät kohdenukleiinihapon vastinsäikeitä, jotka jatkuvat molempiin suuntiin. Alukkeissa Pa ja P^ olevat nuolenpäät osoittavat suunnan, johon ne pidentyvät polymeri-saatioprosessissa.
10 Kuvassa 2 on esitetty esimerkissä 4 käytettyjen modifioitujen alukkeiden P ja P^ sekä selektiivisen koettimen S emäsjärjestys ja vastaavasti näiden keskinäinen sijainti kohdenukleiinihappoon nähden. Viiva A esittää kohde-RNA:ta ja sille identtisiä DNA-kopioita ja viiva B esittää RNA:lie komplemen-15 taarista DNA-kopiota. Alukkeissa Pa ja P^ olevat nuolenpäät osoittavat suunnan, johon ne pidentyvät polymerisaatioproses-sissa.
Menetelmässä voidaan käyttää koettimena sekä oligo- että 20 polynukleotideja. Koettimet voidaan valmistaa synteettisesti tai semisynteettisesti. On edullista valmistaa myös alukkeina toimivat koettimet tällä tavoin. Tietenkin on myös mahdollista valmistaa koettimet yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tai suoraan luonnosta eristetyistä nukleiinihapoista. Koetin 25 voidaan liittää sopivaan vektoriin. Se voi sisältää vektorin osia tai olla kokonaan vapaa vektoriosista. Lukuisia sopivia alukkeita ja koettimia, joita voidaan käyttää, on kaupallisesti saatavissa.
30 Eräässä keksinnön mukaisessa menetelmässä detektorikoettimet ovat oligo- tai polynukleotideja, jotka sitoutuvat kohdenukleiinihappoon emäspariutumisella ja jotka voivat toimia alukkeina templaatista riippuvalle nukleiinihappoja syntetisoivalle entsyymille. On olennaista, että nämä ns.
35 detektorialukkeet on varustettu vähintäin yhdellä sopivalla detektoitavalla leimalla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon voidaan kiinnittää vähintäin yksi sopiva • . 94429 detektoitava leima.
Erilaisia radioaktiivisia isotooppeja tai radioaktiivisesta leimattuja yhdisteitä voidaan käyttää leimoina. Leimat voivat 05 olla myös fluoresoivia, luminesoivia, valoa emittoivia, entsymaattisesti tai immunologisesta osoitettavia jne. Esimerkkinä voidaan mainita leimat, jotka perustuvat biotiinin ja avidiinin tai streptavidiinin affiniteettiin, lantanidike-laatteihin, ferritiiniin ja hemiyhdisteisiin, ja immunologi-10 sesti osoitettaviin hapteeneihin kuten AAF ja AIF (asetoksi-asetyylifluoreeniderivaattoihin). On myös mahdollista käyttää välittäjien, esim. proteiinien avulla tapahtuvaa tunnistusta.
Keksinnön mukainen menetelmä ei ole riippuvainen käytetystä 15 leimasta. Kaikkia tunnettuja leimoja, jotka soveltuvat nukleiinihappohybridisaatioon, voidaan käyttää menetelmässä.
On kuitenkin olennaista että mikäli detektorikoettimet toimivat alukkeina, leima valitaan sellaisten leimojen joukosta, jotka eivät häiritse alukkeen toimintaa. Leima 20 tulee kiinnittää detektorialukkeeseen siten että nukleiinihappoa polymerisoiva entsyymi voi vielä tunnistaa sen alukkeena.
Toisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kiinnitinkoettimet 25 ovat oligo- tai polynukleotideja, jotka sitoutuvat kohde-nukleiinihappoon emäspariutumisella ja jotka voivat toimia alukkeina templaatista riippuvaiselle nukleiinihappoja syntetisoivalle entsyymille. On olennaista, että nämä ns. kiinnitinalukkeet on varustettu vähintäin yhdellä sopivalla 30 affiniteettiparin komponentilla tai spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi sopiva affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää. On myös mahdollista kiinnittää affini-teettiparin komponentti tai komponentit välittäjän avulla kiinnitinalukkeeseen. Ainoa edellytys on, että on mahdollista 35 erottaa hybridi hybridisaatioliuoksesta affiniteettiparin avulla ja että alukkeen toiminta ei häiriydy.
94429
Affiniteettiparin komponentilla tarkoitetaan tässä komponenttia, jolla on affiniteettia toiseen komponenttiin. Esimerkiksi biotiini - avidiini tai streptavidiini, raskasmetalli -tioryhmä, erilaiset homopolynukleotidit kuten poly dG - poly 05 dc, poly dA - poly dT, ja poly dA - poly U ovat tällaisia affiniteettipareja. Mutta myös muita komponenttipareja voidaan käyttää, edellyttäen että niillä on riittävän vahva affiniteetti mahdollistaakseen kohdenukleiinihapon kopioihin integroituneiden modifioitujen kiinnitinalukkeiden sitoutumi-10 sen kiinteään kantajaan.
Yhdessä keksinnönmukaisessa menetelmässä, jossa detektori-koettimet toimivat modifioituina alukkeina, tarvitaan selektiivinen kiinnitinkoetin. Tämä mahdollistaa sen, että 15 kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot, joihin modifioidut alukkeet ovat integroituneet, voidaan erottaa selektiivisesti. On olennaista, että kiinnitinkoettimet ovat riittävän homologisia kohdenukleiinihapon kanssa, jotta niiden spesifinen hybridisaatio kohdenukleiinihappomolekyylien 20 kopioiden kanssa on mahdollista ja samalla mahdollistetaan modifioitujen alukkeiden, jotka ovat integroituneet kohdenukleiinihapon kopioihin, selektiivinen erottaminen ja detektointi.
25 Toisessa keksinnönmukaisessa menetelmässä, jossa kiinnitinkoettimet toimivat modifioituina alukkeina, tarvitaan selektiivinen detektorikoetin. Tämä mahdollistaa sen, että kohdenukleiinihappomolekyylien kopiot, joihin modifioidut alukkeet ovat integroituneet, voidaan detektoida. On 30 olennaista, että detektorikoetin on riittävän homologinen kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituakseen spesifisesti ja näin ollen identifioidakseen kohdenukleiinihapon selektiivisesti. Detektorikoettimet voivat olla varustettuja millä tahansa sopivilla, detektoitavilla leimoilla, esimerkiksi 35 yllä mainituilla leimoilla.
Keksinnön kohteena on reagenssiyhdistelmä, johon kuuluu - 94429 vähintäin yksi modifioitu aluke varustettuna vähintäin yhdellä sopivalla detektoitavalla leimalla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi sopiva, detektoitava leima voidaan kiinnittää ja vähintäin yksi 05 selektiivinen kiinnitinkoetin varustettuna vähintäin yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää.
10 Keksinnön kohteena on myös reagenssiyhdistelmä, johon kuuluu vähintäin yksi modifioitu aluke varustettuna vähintäin yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää ja vähintäin yksi selektiivi-15 nen detektorikoetin varustettuna vähintäin yhdellä sopivalla, detektoitavalla leimalla tai vähintäin yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintäin yksi sopiva, detektoitava leima voidaan kiinnittää.
20 Keksinnön kohteena on niin ikään nukleiinihappojen määrityksessä käytettävä reagenssipakkaus. Pakkaukseen kuuluu useita säiliöitä käsittävä yksikkö, jossa jokin yllä kuvatuista reagenssiyhdistelmistä on yhdistettynä vähintäin yhden, testissä tarvittavan reagenssin tai välineen kanssa.
25 Tämä voi olla esimerkiksi säiliö, jossa on vähintäin yksi templaatista riippuvainen polymerisaatioaine, säiliö, jossa on neljä deoksinukleosiditrifostaattia, sopiva väline käytettäväksi polymerisaatio- tai hybridisaatiprosessissa, sopiva väline käytettäväksi kohdenukleiinihapon kopioiden 30 erottamisessa tai sopiva väline leiman määrittämiseksi.
Edulliset välineet ja reagenssit on kuvattu yksityiskohtaisemmin seuraavassa.
Keksinnön mukaisen menetelmän edullinen sovellutusmuoto 35 aloitetaan lisäämällä denaturoituun näyteliuokseen vähintäin kaksi modifioitua aluketta, jotka ovat joko detektori- tai kiinnitinalukkeita. Kukin modifioiduista alukkeista 8 - 94429 hybridisoituu kohdenukleiinihapon vastinsäikeen ts. temp-laatin kanssa ja pidentyy lisättäessä templaatin läsnäolosta riippuvaa nukleiinihappoa syntetisoivaa entsyymiä. Prosessi etenee tehokkaasti in vitro synnyttäen uusia nukleiinihappo-05 säikeitä, jotka voivat olla usean tuhannen emäksen pituisia, edellyttäen että olosuhteet ovat sopivia.
Prosessi voidaan toistaa lisäämällä ylimäärä modifioitua aluketta ja näin luodaan juuri syntetisoiduille säikeille 10 uusia komplementaarisia kopioita, jotka ovat niin muodoin ensimmäisen templaatin identtisiä kopioita. Toistamalla tätä prosessia saadaan aikaan kaskadireaktio, jossa kohdenukleiinihapon määrä moninkertaistuu. Prosessia voidaan toistaa niin monta kertaa kuin halutaan tarvittavan havaitsemisherk-15 kyyden saavuttamiseksi. Tapauksissa, joissa kohdenukleiinihapon konsentraatio ei ole äärimmäisen alhainen, yksi monistus riittää kohdenukleiinihapon havaittavaksi tekemiseen.
20 On myös mahdollista käyttää vain yhtä modifioitua aluketta keksinnönmukaisessa keksinnössä. Tässä tapauksessa monistus ei kuitenkaan ole yhtä tehokas kuin käytettäessä vähintäin kahta aluketta, koska reaktio ei ole kaskadityyppinen.
25 Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan määrittää sekä DNA:ta että RNA:ta. Jos kohdenukleiinihappo on RNA:ta, on kuitenkin kätevintä kopioida RNA ensin vastaavaksi komplementaariseksi DNA:ksi käyttämällä käänteiskopioijaentsyymiä, jonka jälkeen prosessi jatkuu kuten edellä on kuvattu.
30
Kun modifioidut alukkeet ovat integroituneet kohdenukleiinihapon kopioihin, rekatioseokseen lisätään sopiva selektiivinen koetin, joka tunnistaa kohdenukleiinihappo-sekvenssin ja tämän kopiot ja hybridisaatioreaktio suorite-35 taan olosuhteissa, jotka ovat sopivat kulloinkin valitulle hybridisaatioprosessille.
- 94429
Hybridisaatioreaktiossa, riippuen modifioitujen alukkeiden valinnasta, joko selektiivisen kiinnitinkoettimen tai selektiivisen detektorikoettimen annetaan hybridisoitua kohdenukleiinihapon kopioiden kanssa. Kohdenukleiinihapon 05 kopioiden määrä on tässä vaiheessa moninkertainen verrattuna kohdenukleiinihapon määrään alkutilanteessa.
Mikäli alkuperäinen näyte on sisältänyt kohdenukleiinihappo-sekvenssin, lisätty selektiivinen koetin hybridisoituu 10 äskettäin syntetisoitujen kohdenukleiinihapon kopioiden kanssa. Molekyylin, johon modifioitu aluke on integroitunut, ja selektiivisen koettimen välille muodostuu hybridi.
Muodostuneet hybridit voidaan keksinnön mukaisesti erottaa kätevästi hybridisaatioliuoksesta affiniteettiparin komponen-15 tin avulla, joka on kiinnitetty joko kiinnitinalukkeeseen tai selektiiviseen kiinnitinkoettimeen. Fraktioinnin aikana nämä kiinnitinkomponentin sisältävät hybridit kiinnittyvät kiinteään kantajaan affiniteettiparin toisen komponentin avulla ja kantajalle kiinnittyvän selektiivisen detektorikoettimen 20 tai detektorialukkeen määrä voidaan mitata konventionaalisin menetelmin suoraan kantajasta tai eluoinnin jälkeen eluaatis-ta. Leiman määrä on kohdenukleiinihapon määrän mitta.
Ennen fraktiointia liuos laimennetaan, jos on tarpeen, jotta 25 saataisiin olosuhteet edullisiksi affiniteettiparille. Tämän jälkeen liuos saatetaan kosketuksiin kantajan kanssa. Käytet-tävä kantaja voi olla esimerkiksi affiniteettikromatografia-pylväs, suodatin, muovi- tai lasipinta. Käteviä välineitä erotuksen suorittamiseen ovat erityyppiset mikrotiitteri-30 levyt, dipsticksysteemit tai magneettiset partikkelit, mutta on aivan mahdollista suorittaa erotus myös koeputkissa ja helmiä käyttäen jne.
Kantajan materiaali voi olla luonnon tai synteettinen 35 polymeeri, esimerkiksi selluloosa, polyakryyliamiini, polystyreeni, dekstraani tai agaroosi. Näitä materiaaleja, voidaan myös käyttää suspensioina koeputkessa. On myös • · - 94429 edullista käyttää koeputkia, joiden sisäpintaan affini-teettiparin toinen komponentti on kiinnitetty. Valitulle materiaalille on edellytyksenä, että siihen voidaan kiinnittää komponentti, jolla on affiniteettia affiniteettiparin 05 toiseen komponenttiin, joka on kiinnitetty kiinnitinaluk-keeseen tai selektiiviseen kiinnitinkoettimeen.
Ei ole välttämätöntä kiinnittää affiniteettiparin komponenttia tai komponentteja kiinnitinalukkeeseen ennen polymeri-10 saatioreaktiota. Se voidaan myös lisätä modifioituun aluk-keeseen polymerisaatioprosessin jälkeen, jolloin modifioitu aluke on jo valmiiksi integroitunut kohdenukleiinihapon kopioihin. Ei ole myöskään välttämätöntä kiinnittää detektoi-tavaa leimaa detektorialukkeeseen ennen polymerisaatiota.
15 Esimerkiksi silloin kun detektoitava leima on herkkä hybridisaatio-olosuhteille, se voidaan lisätä sen jälkeen kun selektiivinen kiinnitinkoetin on hybridisoitunut kohdenukleiinihapon kopioiden kanssa.
20 Jos detektorikoettimet toimivat modifioituina alukkeina, jotka ovat integroituneet kohdenukleiinihapon kopioihin, hybridi voidaan erottaa reaktioseoksesta selektiivisten koettimien avulla, jotka on immobilisoitu kiinteille kantajille. Tässä menetelmässä, joka on kuvattu myös 25 patenttihakemuksessa EP 237 362, nopeutta rajoittava vaihe syntyy kun kohdenukleiinihapon ja sen kopioiden, joihin modifioitu detektorialuke on integroitunut, täytyy hybridi-soitua selektiivisen kiinnitinkoettimen kanssa, joka on immobilisoitunut kiinteälle kantajalle. Tämän vuoksi 30 hybridisaatio liuoksessa on paljon edullisempi menetelmä kuin kyseinen menetelmä. Mikäli käytetään immobilisoitua kiinni-tinkoetinta, kiinteälle kantajalle muodostunut hybridi pestään ja leiman määrä kantajalla mitataan perinteisin menetelmin.
Testin periaate esitetään seuraavissa esimerkeissä.
35 11 .. 94429
Esimerkki 1
Sytomegaloviruksen DNA:n detektoiminen käyttäen detektori-koettimia modifioituina alukkeina 05 Tässä malliesimerkissä kohdenukleiinihappo oli yhdistelmä-plasmidi (pBR322/CMV Hindlll L), johon oli kloonattu 12,3 kiloemäksen pituinen fragmentti cytomegaloviruksen genomista (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Käytetyt detektorialukkeet (P , d 10 Pj^, kuva 1) olivat 20 nukleotidin pituisia ja ne syntetisoitiin standardimenetelmin automaattista syntetisaattoria käyttäen. Ne vastasivat kahta sytomegalovirukselle spesifisen kloonin aluetta, jotka olivat 111 nukleotidin etäisyydellä toisistaan. Kaksi selektiivistä kiinnitinkoetinta (S^, S2, 15 kuva 1) tunnistivat kumpikin detektorialukkeiden välissä sijaitsevan alueen kohdenukleiinihapon vastinsäikeistä.
32
Detektorialukkeiden P ja P. 5'-päät leimattiin P:lla α D ς spesifiseen aktiviteettiin 4x10 CPM/>g käyttäen alalla 32 tunnettua polynukleotidikinaasin ja gamma- P-ATP:n välistä 20 reaktiota (Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Kiinnitinkoettimien 3'-päihin lisättiin biotinyloidut nukleotidit käyttäen bio ll-dUTP:tä (Bethesda Research 25 Laboratories, BRL) ja terminaalista transferaasia (Promega Biotech.) kuten Riley et ai. ovat kuvanneet julkaisussa DNA, 1. 5 (4), ss. 333-337, 1986. Kohdeplasmidi linearisoitiin katkaisemalla restriktioentsyymillä EcoRI. DNA-polymeraasi ja Klenowin fragmentti oli ostettu Boehringer-Mannheimilta ja 30 streptavidiiniagaroosi BRL:stä.
Näitä reagensseja käyttäen suoritettiin seuraava koe.
4 6
Suoritettiin neljä eri reaktiota käyttämällä 0, 10 , 10 ja 35 10® molekyyliä (vastaten 0, 2xl0-^®, 2xl0-*® ja 2xl0-*® moolia) kohdepasmidia. Tämän lisäksi kaikissa neljässä reaktiossa oli 50 μ1:η kokonaistilavuudessa seuraavat 12 - 94429 reagenssit: 2 pmol kumpaakin aluketta, 0,5 mM kutakin neljää deoksinukleosiditrifosfaattia (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP), 10 mm Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM mgC^» 50 mM NaCl ja 10 mM ditiotreitolia. Seosta kuumennettiin 100°C:ssa kahden 05 minuutin ajan, inkuboitiin viiden minuutin ajan 37°C:ssa, jonka jälkeen lisättiin 1 μΐ (vastaten yhtä yksikköä) DNA-polymeraasia. Seuraavaksi seosta inkuboitiin jälleen 10 minuuttia 37°C:ssa. DNA:ta syntetisoiva sykli muodostui siis kuumennuksesta, sitä seuraavasta detektorialukkeiden hybridi-10 soitumisesta ja inkubaatiosta lisäämällä DNA-polymeraasia 37°C:ssa.
Tässä kokeessa sykli suoritettiin joko vain kerran tai se toistettiin 5 tai 15 kertaa. Viimeisen syklin jälkeen näyte 15 kuumennettiin vielä 100°C:een, jonka jälkeen lisättiin 10 pmol selektiivistä kiinnitinkoetinta ja NaCl (0,9 M), EDTA:a (20 mM), natriumfosfaattia (pH 7,5; 20 mM) ja natriumdodekyylisulfaattia (0,1 %), Tilavuus laimeni 100 pl:aan. Ilmoitetut konsentraatiot ovat loppukonsentraati-20 oita. Seosta inkuboitiin tämän jälkeen 50°C:ssa yhden tunnin ajan. Tämän hybridisaatioreaktion jälkeen lisättiin 200 μΐ, jossa oli 25 % streptavidiiniagaroosia suspendoituna liuokseen, jonka koostumus oli seuraava: 1 M NaCl, 20 mM natriumfosfaattia, (pH 7,5), 1 mM EDTA. Biotinyloitujen 25 molekyylien annettiin sitoutua streptavidiini-agaroosiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa rotaatiosekoittajassa. Agaroosi kerättiin lyhyen sentrifugaation avulla ja supernatantti poistettiin imua käyttäen. Tämän jälkeen agaroosia pestiin kerran puskuroidussa 1 M NaCl-liuoksessa ja kahdesti 30 liuoksessa, jossa oli 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitraattia, 0,2 % natriumdodekyylisulfaatti (pH 8) 37°C:ssa. Seuraavaksi määritettiin radioaktiivisuuslaskurilla radioaktiivisuus agaroosista, johon muodostuneet hybridit olivat sitoutuneet. Biotinyloidut markkerit sisältävien DNA-hybridien keräys- ja 35 pesumenettelyt ovat entuudestaan tunnettuja ja ne on kuvattu mm. suomalaisessa patenttihakemuksessa FI 850004.
13 - 94429
Kokeen tulokset on esitetty taulukossa 1. Siitä näkyy, että ydellä DNA-synteesisyklillä saadaan aikaan detektoinnissa tarvittava määrä radioaktiivisuutta vain silloin kun läsnäolevan kohdenukleiinihapon konsentraatio on korkea, 05 mutta että jopa hyvin alhainen kohdenukleiinihappomäärä on detektoitavissa 15 syklin jälkeen. Kun kohdenukleiinihapon määrä oli suuri ja syklejä oli 15, detektorialukkeen määrä tuli rajoittavaksi.
10 Taulukko 1
Kohdenukleiinihapon P-aktiivisuus kerätyissä hybrideissä a) määrä (mooleja) (taustan ylittävä cpm) b) 15 1 5 15 Syklien lukumäärä.
0 0 0 0 2 x 10-20 EH EH 650 2 x 10"18 EH 300 11000 20 2 x 10-16 700 13000 36000 a) Kahden määrityksen keskiarvo b) EH - ei havaittavissa (vähemmän radioaktiivisuutta kuin 25 kaksi kertaa taustan keskiarvoaktiivisuus)
Esimerkki 2
Sytomegaloviruksen DNA:n määritys käyttäen kiinnitinkoettimia 30 modifioituian alukkeina Tässä esimerkissä kiinnitinkoettimet toimivat modifioituina alukkeina. Käytetyt reagenssit olivat samat kuin esimerkissä 1 lukuunottamatta seuraavia poikkeuksia: Kiinnitinalukkeita 32 35 (P , P^, kuva 1) ei leimattu P:lla vaan niiden 5'-päät modifioitiin liittämällä niihin biotiinitähde. Tämä kemiallinen modifikaatio tehtiin käyttämällä tunnettuja menetelmiä, 14 ’.94429 jotka Chollet ja Kawashima ovat kuvanneet julkaisussa Nucleic Acids Research, 13, ss. 1529-1541, 1985. Kahden selektiivisen koettimen (S^ ja $2» kuva 1) 5'-päät leimattiin tässä tapauksessa, jotta ne voisivat toimia detektorikoettimina. Niiden 9 9 05 spesifiset aktiivisuudet olivat noin 2x10 ja 2,5x10 cpm/1/g.
Reaktioissa tarvittavat reagenssit valmistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 1. Biotinyloituja kiinnitinalukkeita lisättiin kuitenkin 10 kertaisina määrinä, siis 20 pmol 10 kutakin reaktiota kohden. 1, 5 tai 15 sykliä suoritettiin kuten edellä on kuvattu, jonka jälkeen näytteet kuumennettiin 100°C:een ja lisättiin 0,5 pmol kumpaakin 82P:lla leimattua koetinta ja S2- Hybridisaatio suoritettiin samoissa olosuhteissa kuin on kuvattu esimerkissä 1.
15 Tämän jälkeen hybridit kerättiin streptavidiini-agaroosiin, 32 pestiin ja niiden P-aktiivisuus laskettiin kuten esimerkissä 1. Tulos on esitetty taulukossa 2.
20 Taulukko 2
" —1 AA- ----- ’ I
Kohdenukleiinihapon zp-aktiivisuus kerätyissä hybrideissä a) määrä (mooleja) (taustan ylittävä cpm) 25 1 5 15 syklien lukumäärä 0 0 0 0 2 x 10-20 EN EN 800 2 x 10-18 EN 400 13000 30 2 x 10-16 300 11000 54000 a) Kahden määrityksen keskiarvo b) EH - Ei havaittavissa 15 - 94429
Esimerkki 3
Sytomegaloviruksen DNA:n määrittäminen kliinisistä näytteistä käyttäen kiinnitinkoettimia modifioituina alukkeina 05 Tässä esimerkissä osoitetaan menetelmän soveltuvuus kliinisten näytteiden tutkimuksessa määrittämällä CMV sellaisen vastasyntyneen virtsasta, jonka tiedetään kärsivän syto-megalovirusinfektiosta. Terveen lapsen virtsaa käytettiin 10 vertailunäytteenä. Molemmista 10 ml:n näytteistä erotettiin kokonais-DNA kuten Virtanen et ai. ovat kuvanneet julkaisussa J. Clin. Microbiol., 20 (6), ss. 1083-1088, 1984. DNA:t liuotettiin 20 //Iraan vettä ja niille suoritettiin reaktiot esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Kymmenen DNA-synteesisyklin 15 jälkeen näytteeseen lisättiin leimattu selektiivinen koetin, sen annettiin hybridisoitua ja hybridit kerättiin. Potilaan virtsasta peräisin oleva DNA osoitti selvästi kohonnutta radioaktiivisuutta hybrideissä kun taas terveestä henkilöstä otetun DNA:n aktiivisuus oli sama kuin taustan. Mitatut 20 cpm-arvot olivat 2300 sairaalla ja 240 terveellä henkilöllä.
Esimerkki 4
Semiliki Forest viruksen RNA:n ilmaiseminen käyttäen kiinni-25 tinkoettimia modifioituina alukkeina 1 »
Esimerkin 4 tarkoitus on osoittaa, että kuvattua menetelmää voidaan käyttää myös RNA:n havaitsemiseen. Käytetty kohdenuk-leiinihappo oli Semiliki Forest viruksen (SFV) RNA.
30 Käytetyt reagenssit olivat kaksi 5'-biotinyloitua kiinnitin- aluketta (Kuva 2), jotka oli valmistettu kuten esimerkissä 2 32 on kuvattu, yksi 5'-päästään P:lla leimattu selektiivinen detektorikoetin, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 1 on 35 kuvattu, käänteiskopioijaentsyymi (Promega Biotech) ja DNA-polymeraasi sekä Klenowin fragmentti (Boehringer Mannheim).
16 - 94429 SFV-RNA:n detektion ensimmäisessä vaiheessa syntetisoitiin cDNA-kopio. 20 /ul:n reaktioseos sisälsi 10 mM tris-Cl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 raM MgCl2, 10 mM ditriotreitolia, 0,5 /t/g t-RNA:ta, 10 pg SFV-RNA:ta, 10 pmol kiinnitinaluketta Ρ0, 05 0,5 mM kutakin neljää deoksinukleotiditrifosfaattia ja 100 yksikköä käänteiskopioijaa. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 15 minuuttia. Tämän jälkeen seosta kuumennettiin 100°C:ssa viisi minuuttia ja jäähdytettiin huoneenlämpötilaan. Tämän jälkeen lisättiin 50 μΐ liuosta, jossa oli 10 mM Tris-Cl (pH 7,4), 10 50 mM NaCl, 10 mM MgC^» 10 mM ditiotreitolia, 10 pmol kiinnitinaluketta ja 0,5 mM kutakin neljää deoksinukleotiditrifosfaattia. Lämpötila kohotettiin 37°C:een ja 5 minuutin kuluttua lisättiin yksi yksikkö DNA-polymeraasia. 10 minuutin jatkoinkubaation jälkeen reaktioseosta inkuboitiin 100°C:ssa 15 5 minuuttia, seos jäähdytettiin 37°C:een ja suoritettiin 5 DNA-synteesisykliä. Lopullisen denaturaatiovaiheen jälkeen lisättiin 0,1 pmol (1,2x10® cpm) selektiivistä detektorikoe-tinta 80 /ul:ssa IM NaCl, 50 mM EDTA:a, 50 mM natriumfos-faattia (pH 7,5) ja 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia. Liuosta 20 inkuboitiin 2 tuntia 55°C:ssa, jonka jälkeen hybridit kerättiin ja pestiin kuten esimerkissä 1 on kuvattu.
Negatiivisena kontrollina käytettiin identtistä näytettä, jolle suoritettiin sama käsittely lukuunottamatta sitä, että
25 käänteiskopioijaentsyymiä ei lisätty. Näyte, jossa RNA
muutettiin käänteiskopioijän avulla cDNA:ksi, antoi 420 cpm 32 P-aktiivisuuden kerättyihin hybrideihin, kun taas negatiivinen kontrolli antoi 50 cpm.
30 Esimerkki 5
Erilaisten detektointitapojen vertailu Tässä esimerkissä verrattiin monistetun DNA:n kolmea erilais-35 ta detektointitapaa keskenään. Reagenssit ja monistuksessa käytetty menetelmä olivat samat kuin esimerkeissä 1 ja 2 lukuunottamatta sitä että selektiivisinä kiinnitinkoettimina 17 - 94429 ja detektorikoettimina käytettiin M13- klooneja, jotka tunnistavat noin 100 nukleotidia modifioitujen alukkeiden välillä.
05 Ml3-kloonit saatiin kloonaamalla yhdistelmäplasmidin pBR322/CMV Hindlll L restriktiofragmentti Haelll faagivektoriin Ml3mpl0 käyttäen standardimenetelmiä.
Selektiivisinä kiinnitinkoettimina käytetyt Ml3-kloonit modifioitiin biotiinilla käyttäen photoprobe biotiinia 10 (Vector Laboratories). Ml3-kloonit, joita käytettiin 32 selektiivisinä detektorikoettimina, leimattiin P-dCTP:llä g spesifiseen aktiviteettiin 2 x 10 cpm/>g käyttäen DNA-polymeraasia I (Klenowin fragmentti) ja alukkeen pidennystä (Hu ja Messing, Gene 17, ss. 271-277, 1982).
15 e —18 3 x 10 molekyyliä (0,5 x 10~ moolia) linearisoitua plasmi- dia pBR322/CMV Hindlll L monistettiin kymmenellä syklillä.
Tapojen 1 ja 2 mukaisissa detektiomenetelmissä käytettiin 2 32 pmolia kumpaankin P:lla leimattua detektorialuketta PQ ja 20 P^ ja monistusprosessi suoritettiin kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Tavan 3 mukaisessa detektiomenetelmässä käytettiin 25 pmoolia biotinyloituja kiinnitinalukkeita monistusvai-heessa ja reaktio suoritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvattu.
25
Tapa 1 - Selektiivistä kiinnitinkoetinta käytetään kohdenuk-leiinihapon kopioiden kanssa liuoksessa muodostuneiden hybridien keräämiseen 30 Tässä detektointitavassa käytettiin monistettujen DNA-fragmenttien keräämiseen biotinyloituja selektiivisiä Ml3-kiinnitinkoettimia. Viimeisen monistussyklin jälkeen näyteseos kuumennettiin 100°C:n ja lisättiin 2 x 10^ molekyyliä kumpaakin biotinyloitua selektiivistä kiinni-35 tinkoetinta liuoksessa, jonka koostumus oli seuraava: NaCl (0,6 M), EDTA (5 mM), natriumfosfaatti (20 mM) ja natriumdo-dekyylisulfaatti (0,1 %). Tilavuus kasvoi tällöin 100 μl:aan ie - 94429 (lopputilavuudet on annettu). Seosta inkuboitiin 65°C:ssa kaksi tuntia. Muodostuneet hybridit kerättiin streptavi-diini-agaroosiin kuten on kuvattu esimerkissä 1 lukuunottamatta sitä että suoritettiin kaksi yhden minuutin 05 lisäpesua 50°C:ssa 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumsitraattia, 0,2 % natriumdodekyylisulfaattia käyttäen. Kerättyjen hybridien radioaktiivisuus mitattiin.
Tapa 2 - Selektiivinen kiinnitinkoetin immobilisoitu ennen 10 sen hybridisaatiota kohdenukleiinihapon kopioiden kanssa Tässä tapauksessa käytettiin immobilisoituja selektiivisiä Ml3-koettimia monistetun DNA:n keräämiseen. Viimeisen monistussyklin jälkeen näytteet kuumennettiin 100°C:n.
15 NaCl (0,6 M), natriumsitraattia (60 mM), Ficoll™ (0,02 %), polyvinyylipyrrolidonia (0,02 %), sian seerumin albumiinia (0,02 %) ja denaturoitua sillin sperman DNA:ta (0,2 mg/ml) lisättiin siten, että lopputilavuudeksi saatiin 100 μΐ.
Kuhunkin näytteeseen lisättiin nitroselluloosafiltterilevy, 20 johon oli immobilisoitu 5 x 10^ molekyylia kumpaakin selektiivistä koetinta aikaisemmin kuvatun menetelmän (FI 63596) mukaisesti. Seosta inkuboitiin filttereiden kanssa 65°C:ssa 2 ja 18 tunnin ajan. Hybridisaatioreaktion jälkeen filttereitä pestiin kahdesti 20 minuutin ajan 50°C:ssa 25 liuoksessa, jossa oli 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumsitraattia ja 0,2 % natriumdodekyylisulfaattia ja filttereihin sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin.
Tapa 3 - Detektiossa käytetty selektiivistä detektorikoetinta 30 32 .
Tässä esimerkissä käytettiin P leimattuja selektiivisiä
Ml3-koettimia monistetun DNA:n detektointiin ja hybridit kerättiin 5'-päistään biotinyloitujen kiinnitinalukkeiden avulla kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Monistetut näytteet n ft 5 35 kuumennettiin 100 C:een ja 2 x 10 molekyylia (2 x 10 cpm)
O O
kutakin P:lla leimattua koetinta lisättiin yhdessä detek-tiotavassa 1 kuvattujen suolojen kanssa. Hybridisaatio ja
Il i lii I liiti I M Iti t 19 ... 94429 muodostuneiden hybridien keräys suoritettiin kuten tavassa 1.
Taulukossa 3 on esitetty edellä kuvattujen kolmen eri detektiotavan tulosten vertailu.
05
Tavoilla 1 ja 3 on etuna nopeampi hybridisaationopeus liuoksessa verrattuna tavassa 2 esitettyyn filtterillä 32 tapahtuvaan hybridisaatioon. Suurin P-aktiivisuus saatiin tavassa 3 sen ansiosta, että selektiivisessä detektorikoet- 32 10 timessa on useita P-atomeja molekyylia kohden.
Taulukko 3 -„-
Tapa Alukkeet Selektiivinen Hybridi- P-aktiviteetti 15 Ml3-koetin saatioaika hybrideissä a) (tuntia) (cpm) -„- 1 P-leimattu biotinyloitu 2 870 detektorialuke kiinnitinkoetin 20 32 2 P-leimattu immobilisoitu 2 43 detektorialuke kiinnitinkoetin 18 920 3 biotinyloitu 32P-leimattu 2 7800 25 kiinnitinaluke detektorikoetin a) Kolmen määrityksen keskiarvo (taustan ylittävä cpm) 30 Esimerkki 6
Sytomegaloviruksen DNA:n monistus käyttäen biotinyloituja detektorialukkeita ja streptavidiini-piparjuuriperoksidaasin avulla suoritettua epäsuoraa detektiota 35 Tässä esimerkissä CMVrlle spesifisen plasmidin (pBR322/CMV HindiII L) monistus suoritettiin käyttäen biotinyloituja 20 . 94429 alukkeita P ja PK, joiden käyttö detektorialukkeina on kuvattu esimerkissä 2. Esimerkissä 5 kuvattuja Ml3-klooneja, jotka oli modifioitu sulfoniryhmillä käytettiin selektiivisinä kiinnitinkoettimina. Muodostuneet hybridit kerättiin 05 mikrotiitterikuoppiin, jotka oli päällystetty sulfonilla modifioidun DNA:n tunnistavilla antibodeilla. Muodostuneiden hybridien.lopullinen detektio suoritettiin streptavidiini-piparjuuriperoksidaasikonjugaattilla, joka tunnistaa alukkeiden biotiiniosat.
10
Ml3-kloonit modifioitiin sulfonointireaktiolla käyttäen reagensseja ja prosessia, joita Orgenics Ltd (Yavne, Israel) suosittelee. Polystyreenimikrotiitterikuoppia (Nunc, Taska) pidettiin yön yli 4°C:ssa 10 mM natriumkarbonaattipuskurissa 15 (pH 9,6), jossa oli 10 //g/ml igG. Käytetty IgG oli puhdistettu sulfonilla modifioitua DNArta vastaan valmistetusta monoklonaalisesta antibodista (Orgenics Ltd).
5
Reaktioseoksen, jossa oli 3 x 10 molekyyliä linearisoitua 20 plasmidia pBR322/CMV Hindlll L tai kontrolleja ilman plasmidia ja 25 pmoolia kumpaakin biotinyloitua aluketta P_
G
ja P^, annettiin reagoida 10 monistussyklin ajan esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa. Näytteet kuumennettiin 100°C:een, g jonka jälkeen 2 x 10 molekyyliä kumpaakin sulfonoitua 25 selektiivistä kiinnitinkoetinta lisättiin yhdessä esimerkin 5 tavassa 1 spesifioitujen reagenssien kanssa.
Seosta inkuboitiin 65°C:ssa kahden tunnin ajan, laimennettiin 100 //1:11a 0,2 % Tween 20 ja siirrettiin peitettyihin 30 mikrotiitterikuoppiin. Hybridien annettiin sitoutua kuoppiin kahden tunnin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos heitettiin pois ja kuoppia pestiin kolme kertaa liuoksella, jossa oli 0,1 %
Tween 20, 0,15 M natriumkloridia, 20 mM natriumfostaattia (pH 7,5) (PBS). 200 μΐ streptavidiini-piparjuurikonjugaattia 35 (Amersham, UK) liuotettuna 1:2000 liuoksessa, jossa oli 1 % sian seerumin albumiinia, 0,1 % Tween 20 PBS:ssä lisättiin ja kuoppia inkuboitiin 45 minuutin ajan 37°C:ssa. Neljän pesun 2i - 94429 jälkeen, jotka suoritettiin kuten yllä on kuvattu, 200 μΐ substraattiliuosta, jossa oli 0,46 mg/ml O-fenyleeni-diamiinia, 0,01 % ^2°2 M natriumasetaattipuskurissa (pH 5,0) lisättiin. Reaktioseosta pidettiin 15 minuuttia 05 22°C:ssa, jonka jälkeen reaktio pysäytettin lisäämällä 50 μΐ 2 N ja värjätyn tuotteen absorbanssi mitattiin spektrofotometrissa aallonpituutta 492 nm käyttäen. Keräys-ja detektiovaiheet on kuvattu aikaisemmin (Syvänen et ai.,
Nucleic Acids Res., 14, ss. 5037-5048, 1986).
10 5
Kokeen tulokset on esitetty taulukossa 4. 3 x 10 molekyylia — 18 (0,5 x 10” moolia) kohdeplasmidia oli selvästi detektoita-vissa 10 monistussyklin jälkeen.
15 Taulukko 4
Kodenukleiinihapon määrä Absorbanssi 492 nm a) (moolia) 20 0,5 x 10'180,348 0 0,120 25 a) Kolmen määrityksen keskiarvo • c
Claims (10)
1. Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi hybridisaation avulla käyttäen nukleiinihappoja tunnistavia kiinnitin- ja detektiokoettimia, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihapot kopioidaan käyttäen modifioituja polymerisaatioalukkeita, jotka integroiduttu aan kohdenukleiinihapon kopioihin toimivat detektorikoettimina, jonka jälkeen kohdenukleiinihapon kopiot erotetaan vähintään yhden selektiivisen kiinnitinkoettimen avulla, ja tunnistetaan detektorikoettimen avulla.
2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) varustetaan vähintään yksi kohdenukleiinihapon aluke vähintään yhdellä detektoitavalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi detektoitava leima voidaan kiinnittää; (b) annetaan mainitun detektorialukkeen tai -alukkeiden reagoida yksisäikeisen kohdenukleiinihapon kanssa templaatista riippuvalle polymerisaatioreaktiolle sopivissa olosuhteissa; (c) annetaan kohdenukleiinihapon yksisäikeisten kopioiden, joihin detektorialukkeet ovat integroituneet, hybridisoitua sellaisen kiinnitinkoettimen kanssa, joka hybridisoituu selektiivisesti kohdenukleiinihapon kanssa ‘ hybridisaatiolle sopivissa olosuhteissa; (d) erotetaan kohdenukleiinihapon kopiot, joihin detektorialukkeet ovat integroituneet, selektiivisen kiinnitinkoettimen avulla; (e) havaitaan kohdenukleiinihapon kopiot sopivilla menetelmillä.
3. Vaatimuksen 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selektiivinen kiinnitinkoetin on varustettu vähintään yhdellä sopivalla affiniteettiparin komponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä alueella, johon affiniteettiparin osapuoli voidaan kiinnittää. 23 - 94429
4. Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi hybridisaation avulla käyttäen nukleiinihappoja tunnistavia kiinnitin- ja detektiokoettimia, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihapot kopioidaan käyttäen modifioituja pofymerisaatioalukkeita, jotka integroiduttuaan kohdenukleiinihapon kopioihin toimivat kiinnitinkoettimina, jonka jälkeen kohdenukleiinihapon kopiot erotetaan kiinnitinkoettimen avulla, ja tunnistetaan vähintään yhden selektiivisen detektorikoettimen avulla.
5. Vaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä suoritetaan seuraavat vaiheet: (a) varustetaan vähintään yksi kohdenukleiinihapon aluke vähintään yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon affiniteettiparin osapuoli voidaan kiinnittää; (b) annetaan mainitun kiinnitinalukkeen tai -alukkeiden reagoida yksisäikeisten kohdenukleiinihapon kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia templaatista riippuvalle polymerisaatioreaktiolle; (c) annetaan yksisäikeisen kohdenukleiinihapon kopioiden, joihin kiinnitinalukkeet ovat integroituneet, hybridisoitua sellaisen detektorikoettimen kanssa, joka hybridisoituu selektiivisesti kohdenukleiinihapon kanssa hybridisaatiolle sopivissa olosuhteissa; (d) erotetaan kohdenukleiinihapon kopiot, joihin kiinnitinalukkeet ovat integroituneet, affiniteettiparin toisen osapuolen avulla; (e) havaitaan kohdenukleiinihapon kopiot sopivilla menetelmillä.
6. Vaatimuksen 4 ja 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selektiivinen detektiokoetin on varustettu vähintään yhdellä sopivalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä alueella, johon vähintään yksi detektoiva leima voidaan kiinnittää.
7. Reagenssiyhdistelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siihen kuuluu (a) vähintään yksi modifioitu määritettävää nukleiinihappoa tunnistava polymerisaatioaluke varustettuna vähintään yhdellä detektoivalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi detektoitava leima voidaan kiinnittää: ja 24 - 94429 (b) vähintään yksi selektiivinen määritettävää nukleiinihappoa tunnistava kiinnitinkoetin varustettuna vähintään yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää.
8. Ragenssiyhdistelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siihen kuuluu (a) vähintään yksi modifioitu määritettävää nukleiinihappoa tunnistava polymerisaatioaluke varustettuna vähintään yhdellä affiniteettiparin koponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää; ja (b) vähintään yksi selektiivinen määritettävää nukleiinihappoa tunnistava detektorikoetin varustettuna vähintään yhdellä detektoitavalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi detektoitava leima voidaan kiinnittää.
9. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siinä on useita säiliöitä käsittävä yksikkö, johon kuuluu (a) vähintään yksi modifioitu aluke varustettuna vähintään yhdellä detektoivalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi detektoitava leima voidaan kiinnittää; (b) vähintään yksi selektiivinen kiinnitinkoetin varustettuna vähintään yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää; . (c) mahdollisesti säiliö, jossa on vähintään yksi templaatista riippuva polymerisaatioreagenssi; (d) mahdollisesti säiliö, jossa on neljä deoksiribonukleotiditrifosfaattia; (e) mahdollisesti sopiva väline polymerisaatio- ja hybridisaatioprosesseille; (f) mahdollisesti sopiva väline kohdenukleiinihapon kopioiden i‘; erottamiseksi; (g) mahdollisesti sopiva väline leiman määrittämiseksi!!; * 25 94429
10. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siinä on useita säiliöitä käsittävä yksikkö, johon kuuluu (a) vähintään yksi modifioitu aluke varustettuna vähintään yhdellä affiniteettiparin komponentilla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi affiniteettiparin komponentti voidaan kiinnittää; (b) vähintään yksi selektiivinen detektorikoetin varustettuna vähintään yhdellä detektoitavalla leimalla tai vähintään yhdellä spesifisellä kohdalla, johon vähintään yksi detektoitava leima voidaan kiinnittää; (c) mahdollisesti säiliö, jossa on vähintään yksi templaatista riippuva polymerisaatioreagenssi; (d) mahdollisesti säiliö, jossa on neljä deoksiribonukleotiditrifosfaattia; (e) mahdollisesti sopiva väline polymerisaatio- ja hybridisaatioprosesseille; (f) mahdollisesti sopiva väline kohdenukleiinihapon kopioiden erottamiseksi; (g) mahdollisesti sopiva väline leiman määrittämiseksi. 26 94429
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2460487A | 1987-03-11 | 1987-03-11 | |
| US2460487 | 1987-03-11 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI880994A0 FI880994A0 (fi) | 1988-03-03 |
| FI880994A FI880994A (fi) | 1988-09-12 |
| FI94429B true FI94429B (fi) | 1995-05-31 |
| FI94429C FI94429C (fi) | 1995-09-11 |
Family
ID=21821443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI880994A FI94429C (fi) | 1987-03-11 | 1988-03-03 | Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi sekä menetelmässä käytettävä reagenssiyhdistelmä ja reagenssipakkaus |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5476769A (fi) |
| JP (1) | JP3244500B2 (fi) |
| AT (1) | AT395434B (fi) |
| AU (1) | AU622104B2 (fi) |
| BE (1) | BE1003990A5 (fi) |
| CA (1) | CA1338207C (fi) |
| CH (1) | CH677285A5 (fi) |
| DD (1) | DD272664A5 (fi) |
| DE (1) | DE3807994C2 (fi) |
| DK (1) | DK175384B1 (fi) |
| ES (1) | ES2006377A6 (fi) |
| FI (1) | FI94429C (fi) |
| FR (1) | FR2613077A1 (fi) |
| GB (1) | GB2202328B (fi) |
| GR (1) | GR1000315B (fi) |
| HU (1) | HU202583B (fi) |
| IE (1) | IE61664B1 (fi) |
| IL (3) | IL85480A0 (fi) |
| IT (1) | IT1216048B (fi) |
| LU (1) | LU87153A1 (fi) |
| NL (1) | NL194922C (fi) |
| NO (1) | NO172909C (fi) |
| NZ (1) | NZ223700A (fi) |
| PT (1) | PT86937B (fi) |
| SE (1) | SE500262C2 (fi) |
Families Citing this family (172)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5753433A (en) * | 1909-12-05 | 1998-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
| DE4038804A1 (de) | 1990-10-09 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| FI80476C (fi) * | 1987-10-09 | 1990-06-11 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
| CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
| JPH0775560B2 (ja) * | 1987-12-25 | 1995-08-16 | 湧永製薬株式会社 | 検体中の目的核酸の検出法 |
| WO1989009281A1 (en) * | 1988-03-25 | 1989-10-05 | Akzo N.V. | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid |
| US5817797A (en) * | 1988-06-01 | 1998-10-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| US5858652A (en) * | 1988-08-30 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| GB8827160D0 (en) * | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | Detection & quantitative determination of rna & dna |
| CA2002076A1 (en) * | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
| DK175170B1 (da) * | 1988-11-29 | 2004-06-21 | Sangtec Molecular Diagnostics | Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser |
| DE68928769T2 (de) * | 1988-12-09 | 1999-04-01 | Amrad Corp. Ltd., Kew, Victoria | Amplifizierter dns-assay |
| US5536648A (en) * | 1988-12-09 | 1996-07-16 | Amrad Corporation Limited | Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein |
| CA2004326A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| ATE142272T1 (de) * | 1989-01-19 | 1996-09-15 | Behringwerke Ag | Nukleinsäure-amplifikation unter verwendung eines einzelprimers |
| US5856092A (en) * | 1989-02-13 | 1999-01-05 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| CA2044591C (en) * | 1989-02-13 | 2002-08-13 | James Langham Dale | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| CA2011818A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-09-17 | Fred T. Oakes | Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
| WO1990015881A1 (fr) * | 1989-06-12 | 1990-12-27 | Cis Bio International | Procede de detection de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications |
| GB8920097D0 (en) * | 1989-09-06 | 1989-10-18 | Ici Plc | Amplification processes |
| US5196305A (en) * | 1989-09-12 | 1993-03-23 | Eastman Kodak Company | Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| IL97222A (en) * | 1990-02-16 | 1995-08-31 | Orion Yhtymae Oy | Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide |
| US5387505A (en) * | 1990-05-04 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage |
| NZ240079A (en) * | 1990-10-09 | 1993-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the detection of a nucleic acid or part thereof |
| WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| DE4106251A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation |
| US5888819A (en) * | 1991-03-05 | 1999-03-30 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through primer extension |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| CA2065719A1 (en) * | 1991-04-30 | 1992-10-31 | John B. Findlay | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle |
| US5387510A (en) * | 1991-10-02 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit |
| IT1252295B (it) * | 1991-11-15 | 1995-06-08 | Schiapparelli Diagnostici Ismu | Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico |
| WO1993013227A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| US5863724A (en) * | 1994-04-13 | 1999-01-26 | Baylor College Of Medicine | Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy |
| US5658729A (en) | 1994-10-11 | 1997-08-19 | The University Of British Columbia | Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis |
| DE4421901A1 (de) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial |
| US5705366A (en) * | 1994-09-15 | 1998-01-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| US5654141A (en) * | 1994-11-18 | 1997-08-05 | Thomas Jefferson University | Amplification based detection of bacterial infection |
| US5856096A (en) * | 1995-09-20 | 1999-01-05 | Ctrc Research Foundation | Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities |
| WO1997035033A1 (en) | 1996-03-19 | 1997-09-25 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US6132954A (en) * | 1996-08-20 | 2000-10-17 | Baylor College Of Medicine | Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era |
| US6071493A (en) * | 1996-09-20 | 2000-06-06 | Baylor College Of Medicine | Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation |
| US6043283A (en) * | 1996-09-20 | 2000-03-28 | Baylor College Of Medicine | Tyramine compounds and their neuronal effects |
| US6482795B1 (en) | 1997-01-30 | 2002-11-19 | Myriad Genetics, Inc. | Tumor suppressor designated TS10q23.3 |
| US6262242B1 (en) | 1997-01-30 | 2001-07-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor suppressor designated TS10Q23.3 |
| US6713300B1 (en) | 1997-02-27 | 2004-03-30 | University Of Utah Research Foundation | Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter |
| IL122147A0 (en) * | 1997-11-10 | 1998-04-05 | Technion Res & Dev Foundation | Method for labeling polynucleotides |
| DK1040192T3 (da) | 1997-12-18 | 2006-12-18 | Monsanto Technology Llc | Insekt-resistente transgene planter og fremgangsmåder til forbedring af delta-endotoksin-aktivitet mod insekter |
| US6673914B1 (en) | 1998-01-22 | 2004-01-06 | John Wayne Cancer Institute | Human tumor-associated gene |
| US20020147143A1 (en) | 1998-03-18 | 2002-10-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| DE19824900B4 (de) | 1998-06-04 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex |
| US6743906B1 (en) | 1998-10-02 | 2004-06-01 | Board Of Regents, The University Of Texas | PPP2R1B is a tumor suppressor |
| US6468523B1 (en) | 1998-11-02 | 2002-10-22 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use |
| EP1131633A2 (en) | 1998-11-16 | 2001-09-12 | Board of Regents, The University of Texas System | Hiv-specific t-cell induction |
| US6432642B1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-08-13 | Pe Corporation (Ny) | Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection |
| US6156515A (en) | 1999-02-09 | 2000-12-05 | Urocor, Inc. | Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer |
| JP2002542805A (ja) | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ユニバーシティ オブ フロリダ | アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法 |
| US6838444B1 (en) | 1999-06-01 | 2005-01-04 | Baylor College Of Medicine | Compositions and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence for deafness, osteoarthritis, and abnormal cell proliferation |
| US20040002068A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
| DE60133190T2 (de) | 2000-04-21 | 2009-04-02 | CORIXA CORP., Wilmington | Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen |
| WO2002000174A2 (en) | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| DK1325125T3 (da) | 2000-07-10 | 2013-09-08 | Univ Texas | Tumorundertrykkende gener af chromosomerne 3P21.3 |
| WO2002089747A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| JP4338402B2 (ja) | 2001-05-22 | 2009-10-07 | ユニバーシティ オブ シカゴ | Ｎ４ウイルス一本鎖ｄｎａ依存的ｒｎａポリメラーゼ |
| EP1908851A3 (en) | 2001-09-19 | 2008-06-25 | Intergenetics Incorporated | Genetic analysis for stratification of cancer risk |
| JP2005532780A (ja) | 2001-09-19 | 2005-11-04 | インタージェネティックス インコーポレイテッド | 発癌リスク層別化のための遺伝的解析 |
| ES2205998B1 (es) * | 2001-12-14 | 2005-08-16 | Consejo Sup. Investig. Cientificas. | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). |
| CA2476755C (en) | 2001-12-17 | 2014-08-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| ATE529512T1 (de) | 2002-02-01 | 2011-11-15 | Life Technologies Corp | Doppelsträngige oligonukleotide |
| AU2003304195B8 (en) | 2002-07-15 | 2008-08-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial protein library screening by periplasmic expression |
| EP1578396A4 (en) | 2002-08-12 | 2007-01-17 | David Kirn | METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO POXVIRUS AND CANCER |
| AU2002951411A0 (en) | 2002-09-16 | 2002-09-26 | The University Of Sydney | Genotype screen |
| RU2389732C2 (ru) | 2003-01-06 | 2010-05-20 | Корикса Корпорейшн | Некоторые аминоалкилглюкозаминидфосфатные производные и их применение |
| US7960522B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-06-14 | Corixa Corporation | Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use |
| DE602004029560D1 (de) | 2003-03-07 | 2010-11-25 | Rubicon Genomics Inc | Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden |
| US20050059024A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
| US20050059054A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Richard Conrad | Methods and compositions for preparing RNA from a fixed sample |
| EP2527447A1 (en) | 2004-06-03 | 2012-11-28 | Athlomics Pty Ltd | Agents and methods for diagnosing stress |
| US20080311564A1 (en) * | 2004-08-06 | 2008-12-18 | Fort Thomas L | Sequences and Methods for Detection of Cytomegalovirus |
| WO2006031955A2 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting |
| WO2006081558A2 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Duke University | Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board |
| EP1877581B1 (en) | 2005-05-06 | 2012-03-28 | Gen-Probe Incorporated | Methods and products for nucleic acid target capture |
| EP1910565A4 (en) | 2005-07-07 | 2009-10-28 | Athlomics Pty Ltd | POLYNUCLEOTIDE MARKER GENES AND THEIR EXPRESSION IN THE DIAGNOSIS OF ENDOTOXEMIA |
| US7494788B2 (en) | 2005-07-11 | 2009-02-24 | Molecular Kinetics, Inc. | Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production |
| US8980246B2 (en) | 2005-09-07 | 2015-03-17 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus cancer therapy |
| CN102260742A (zh) | 2005-10-21 | 2011-11-30 | 基因信息股份有限公司 | 用于使生物标志产物水平与疾病相关联的方法和装置 |
| CA2637598A1 (en) | 2006-01-18 | 2007-02-14 | University Of Chicago | Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins |
| WO2007106580A2 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Micronics, Inc. | Rapid magnetic flow assays |
| JP5606067B2 (ja) | 2006-09-15 | 2014-10-15 | オタワ ホスピタル リサーチ インスティテュート | 腫瘍崩壊性ラブドウイルス |
| EP2102239B1 (en) | 2006-11-30 | 2012-04-25 | Research Development Foundation | Improved immunoglobulin libraries |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| ES2714007T3 (es) | 2007-04-09 | 2019-05-24 | Univ Florida | Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso |
| US8629245B2 (en) | 2007-05-01 | 2014-01-14 | Research Development Foundation | Immunoglobulin Fc libraries |
| AU2009302582A1 (en) | 2008-10-06 | 2010-04-15 | University Of Chicago | Compositions and methods related to bacterial Eap, Emp, and/or AdsA proteins |
| KR101773368B1 (ko) | 2009-04-03 | 2017-08-31 | 유니버시티 오브 시카고 | 단백질 Ａ(ＳｐＡ) 변이체와 관련된 조성물 및 방법 |
| US8568730B2 (en) | 2009-04-22 | 2013-10-29 | Indiana University Research & Technology Corporation | Compositions for use in the treatment of chronic obstructive pulmonary diseases and asthma |
| CA2766351C (en) | 2009-06-29 | 2018-02-27 | Luminex Corporation | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same |
| EP2272979A1 (en) | 2009-06-30 | 2011-01-12 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Method for testing a subject thought to be predisposed to having cancer |
| DK3156485T3 (en) | 2009-07-17 | 2019-01-07 | Bioatla Llc | At the same time, integrated selection and development of antibody / protein services and expression in production hosts |
| US9409983B2 (en) | 2009-07-23 | 2016-08-09 | The Board Of Trustess Of The University Of Illinois | Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases |
| WO2011032088A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Arca Biopharma, Inc. | Polymorphisms in the pde3a gene |
| WO2011032180A1 (en) | 2009-09-14 | 2011-03-17 | Jennerex, Inc. | Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy |
| EP2510088B1 (en) | 2009-12-10 | 2016-10-05 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| ES2587191T3 (es) | 2009-12-23 | 2016-10-21 | Arca Biopharma, Inc. | Métodos y composiciones para enfermedades y afecciones cardiovasculares |
| WO2011094577A2 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Micronics, Inc. | Sample-to-answer microfluidic cartridge |
| JP2013523818A (ja) | 2010-04-05 | 2013-06-17 | ザ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ | 免疫反応のエンハンサーとしてのプロテインＡ（ＳｐＡ）抗体に関連する組成物および方法 |
| EA202091105A1 (ru) | 2010-04-23 | 2020-12-30 | Юниверсити Оф Флорида Рисерч Фаундейшн, Инк. | Композиции гуанилатциклазы и способы лечения врожденного амавроза лебера типа 1 (lca1) |
| CN103037885B (zh) | 2010-07-02 | 2015-08-26 | 芝加哥大学 | 与蛋白A(SpA)变体相关的组合物和方法 |
| WO2012009026A2 (en) | 2010-07-16 | 2012-01-19 | Bioatla Llc | Novel methods of protein evolution |
| JP5793194B2 (ja) | 2010-09-09 | 2015-10-14 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ | 感染防御ブドウ球菌抗原が関与する方法および組成物 |
| EP2455485A1 (de) | 2010-11-19 | 2012-05-23 | Anagnostics Bioanalysis GmbH | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| AU2012204467B2 (en) | 2011-01-04 | 2016-08-18 | Sillajen, Inc. | Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus |
| CA2826467C (en) | 2011-02-07 | 2019-11-12 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin fc polypeptides |
| EP2681566A2 (en) | 2011-02-28 | 2014-01-08 | University of Iowa Research Foundation | Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender |
| WO2012120377A2 (en) | 2011-03-08 | 2012-09-13 | King Abdullah University Of Science And Technology | Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer |
| EP3406628A1 (en) | 2011-04-08 | 2018-11-28 | Evaxion Biotech ApS | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| US8945588B2 (en) | 2011-05-06 | 2015-02-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides |
| EP2718427B1 (en) | 2011-06-08 | 2017-01-11 | Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Compositions for glioblastoma treatment |
| AU2012273153A1 (en) | 2011-06-21 | 2013-05-02 | Oncofactor Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer |
| WO2013036799A2 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer |
| US9273102B2 (en) | 2011-10-12 | 2016-03-01 | Niels Iversen Møller | Peptides derived from Campylobacter jejuni and their use in vaccination |
| EP3269820A1 (en) | 2011-12-22 | 2018-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Kit for the amplification of a sequence from a ribonucleic acid |
| WO2013116698A2 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Invenra, Inc. | High throughput screen for biologically active polypeptides |
| EP2844275B1 (en) | 2012-04-26 | 2020-05-13 | University of Chicago | Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use |
| US9416403B2 (en) * | 2012-08-31 | 2016-08-16 | Toray Industries, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
| ES2730690T3 (es) | 2012-12-07 | 2019-11-12 | Suppremol Gmbh | Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática |
| JP2016509206A (ja) | 2012-12-21 | 2016-03-24 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 携帯型蛍光検出システムおよびマイクロアッセイカートリッジ |
| EP3549674B1 (en) | 2012-12-21 | 2020-08-12 | PerkinElmer Health Sciences, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
| US10065186B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-09-04 | Micronics, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
| WO2014116721A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Geminiviral vector for expression of rituximab |
| RU2684211C2 (ru) | 2013-02-21 | 2019-04-04 | Тёрнстоун Лимитед Партнершип | Композиция вакцины |
| US10386377B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-08-20 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
| JP6484222B2 (ja) | 2013-05-07 | 2019-03-13 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 核酸の調製および分析のためのデバイス |
| AU2014262710B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-09-12 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions |
| US20150098940A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity, and Intensity and Flare |
| WO2015082536A1 (en) | 2013-12-03 | 2015-06-11 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| EP3447493B1 (en) | 2014-01-07 | 2020-05-13 | Bioatla, LLC | Proteins targeting orthologs |
| EP3154693B1 (en) | 2014-06-11 | 2021-11-03 | PerkinElmer Health Sciences, Inc. | Method for performing a sample assay with a microfluidic cartridges with integrated assay controls |
| US20180169211A1 (en) | 2014-11-13 | 2018-06-21 | Evaxion Biotech Aps | Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination |
| KR102657306B1 (ko) | 2014-12-08 | 2024-04-12 | 버그 엘엘씨 | 전립선암의 진단 및 치료에서 필라민을 포함하는 마커의 용도 |
| WO2016113252A2 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae |
| CA2976236A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation |
| EP3070178B1 (en) | 2015-03-20 | 2020-02-12 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Method for diagnosing breast cancer |
| WO2017005670A1 (en) | 2015-07-04 | 2017-01-12 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa |
| CN108026575B (zh) | 2015-07-17 | 2022-08-19 | 哈佛学院董事及会员团体 | 扩增核酸序列的方法 |
| US10526408B2 (en) | 2015-08-28 | 2020-01-07 | Research Development Foundation | Engineered antibody FC variants |
| EP3419654B1 (en) | 2016-02-22 | 2022-04-27 | Evaxion Biotech A/S | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| WO2017214068A1 (en) | 2016-06-05 | 2017-12-14 | Berg Llc | Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers |
| EP3565576A1 (en) | 2017-01-05 | 2019-11-13 | Evaxion Biotech ApS | Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa |
| AU2018213315A1 (en) | 2017-01-26 | 2019-07-25 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare |
| EP3867645B1 (en) | 2018-10-18 | 2024-06-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for a systemic lupus erythematosus (sle) disease activity immune index that characterizes disease activity |
| WO2020083904A1 (en) | 2018-10-22 | 2020-04-30 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting m. catharrhalis |
| US20220143168A1 (en) | 2019-02-27 | 2022-05-12 | Evaxion Biotech A/S | Vaccines targeting H. influenzae |
| CA3138566A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Larimar Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy |
| ES2960366T3 (es) | 2019-08-09 | 2024-03-04 | Univ Freiburg Albert Ludwigs | Método para diagnosticar cáncer de mama |
| WO2021077415A1 (en) | 2019-10-25 | 2021-04-29 | Peking University | Methylation detection and analysis of mammalian dna |
| EP4087593A1 (en) | 2020-01-06 | 2022-11-16 | Evaxion Biotech A/S | Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae |
| CN115989415A (zh) | 2020-06-30 | 2023-04-18 | 健肺生命人工智能公司 | 用于检测肺癌的方法 |
| WO2022047359A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Berg Llc | Protein biomarkers for pancreatic cancer |
| IL307528A (en) | 2021-04-06 | 2023-12-01 | Bpgbio Inc | Protein markers for the prognosis of breast cancer progression |
| EP4320440A1 (en) | 2021-04-06 | 2024-02-14 | BPGbio, Inc. | Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer |
| IL307531A (en) | 2021-04-06 | 2023-12-01 | Bpgbio Inc | Protein markers for estrogen receptor (ER)-like and estrogen receptor (ER)-negative breast cancer |
| EP4366762A1 (en) | 2021-07-05 | 2024-05-15 | Evaxion Biotech A/S | Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae |
| WO2023196937A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Larimar Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin replacement therapy |
| WO2023230531A1 (en) | 2022-05-24 | 2023-11-30 | Lunglife Ai, Inc. | Methods for detecting circulating genetically abnormal cells |
| WO2023240201A1 (en) | 2022-06-08 | 2023-12-14 | Larimar Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome |
| WO2023239940A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| BG36086A1 (en) * | 1982-01-19 | 1984-09-14 | Glbov | Method for inducing interferon |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4605735A (en) * | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
| CA1256005A (en) * | 1983-09-26 | 1989-06-20 | W. Peter Hansen | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
| US4749647A (en) * | 1984-06-22 | 1988-06-07 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation assay using recognition pairs |
| US4743562A (en) * | 1984-08-21 | 1988-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Purified human cytomegalovirus protein |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
| US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| CA1278755C (en) * | 1985-03-15 | 1991-01-08 | William J. Knowles | Labelling of oligonucleotides |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
| GB8509367D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Amersham Int Plc | Nucleic acid hybridisation |
| US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
| GB8515276D0 (en) * | 1985-06-17 | 1985-07-17 | Amersham Int Plc | Nucleic acid sequencing |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| EP0238332A2 (en) * | 1986-03-19 | 1987-09-23 | Cetus Corporation | Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
-
1988
- 1988-02-18 AU AU11937/88A patent/AU622104B2/en not_active Expired
- 1988-02-19 IL IL85480A patent/IL85480A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-02-19 IL IL10215488A patent/IL102154A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-03-01 NZ NZ223700A patent/NZ223700A/en unknown
- 1988-03-03 FI FI880994A patent/FI94429C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-09 DD DD88313526A patent/DD272664A5/de unknown
- 1988-03-09 GR GR880100139A patent/GR1000315B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IT IT8819722A patent/IT1216048B/it active
- 1988-03-10 CA CA000561135A patent/CA1338207C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-10 CH CH902/88A patent/CH677285A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 NL NL8800594A patent/NL194922C/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 BE BE8800267A patent/BE1003990A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 PT PT86937A patent/PT86937B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 LU LU87153A patent/LU87153A1/fr unknown
- 1988-03-10 DE DE3807994A patent/DE3807994C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 FR FR8803107A patent/FR2613077A1/fr active Granted
- 1988-03-10 DK DK198801295A patent/DK175384B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 AT AT0064388A patent/AT395434B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 GB GB8805681A patent/GB2202328B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 SE SE8800864A patent/SE500262C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IE IE69788A patent/IE61664B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 JP JP05731088A patent/JP3244500B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 HU HU881159A patent/HU202583B/hu unknown
- 1988-03-10 NO NO881064A patent/NO172909C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 ES ES8800740A patent/ES2006377A6/es not_active Expired
-
1990
- 1990-11-07 US US07/610,470 patent/US5476769A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-10 IL IL102154A patent/IL102154A0/xx unknown
-
1997
- 1997-08-25 US US08/917,404 patent/US5989817A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI94429B (fi) | Menetelmä nukleiinihappojen määrittämiseksi sekä menetelmässä käytettävä reagenssiyhdistelmä ja reagenssipakkaus | |
| EP0420260B1 (en) | Method and kit for detecting a target nucleic acid using a capture probe bound to a polystyrene support via an intermediary protein. | |
| US9134302B2 (en) | Analyte detection utilizing polynucleotide sequences, composition, process and kit | |
| US5328825A (en) | Nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods | |
| CA1272443A (en) | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
| Samiotaki et al. | Dual-color detection of DNA sequence variants by ligase-mediated analysis | |
| PT92420B (pt) | Metodo e combinacao de reagentes para a determinacao de sequencias de nucleotidos | |
| JPH02299600A (ja) | 固相捕捉手段を使用する核酸の検出方法および診断キット | |
| EP0408738A1 (en) | ARTICLE FOR TESTING A NUCLEIC ACID AND ITS USE FOR THE DETECTION OF A PREDETERMINED NUCLEIC ACID. | |
| US20010039012A1 (en) | Methods for diagnostic screening | |
| CA2145957C (en) | Method, test element and kit for semi-quantitative detection of target nucleic acid | |
| EP0406280A1 (en) | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid | |
| JP3448776B2 (ja) | 核酸結合用担体、その調製方法および標的核酸の検出方法 | |
| JPH03123500A (ja) | 核酸の分別方法 | |
| CA2024978A1 (en) | Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction | |
| WO2000011215A2 (en) | Method for diagnostic screening | |
| WO1995030025A1 (en) | Detection or assay of target nucleic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |
|
| MA | Patent expired |