CN108026575B - 扩增核酸序列的方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于核酸扩增的方法，包括使双链核酸和与转座子DNA结合的转座酶接触，其中转座子DNA包括转座酶结合位点和RNA聚合酶启动子序列，其中转座酶/转座子DNA复合物结合沿双链核酸分布的靶位置并且将双链核酸切割成多个双链片段，各双链片段具有结合双链片段各5'端的转座子DNA，沿着转座子DNA延伸双链片段以制备在各末端具有双链RNA聚合酶启动子序列的双链延伸产物，使双链延伸产物与RNA聚合酶接触以制备各双链延伸产物的多个RNA转录物，将RNA转录物逆转录成单链拷贝DNA，形成针对单链拷贝DNA的互补链，以形成对应各双链片段的多个双链DNA扩增子。

Description

扩增核酸序列的方法

相关申请数据

本申请要求于2015年7月17日提交的美国临时申请62/193,733号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的5DP1CA186693-02下于政府资助下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

发明领域

本发明的实施方式通常涉及用于扩增痕量DNA(如来自单个细胞的DNA)的方法和组合物，从而检测其基因序列，特别是整个基因组。

相关技术的描述

在细胞间变异和种群异质性起关键作用的研究中，如肿瘤生长、干细胞重编程、胚胎发育等，进行单细胞基因组测序的能力非常重要。当进行测序的细胞样品非常珍贵或稀有或以微量存在时，单个细胞基因组测序也同样非常重要。准确的单细胞基因组测序的重要性在于基因组DNA(可以是处于微量的)的初始扩增。

多重置换扩增(MDA)是在测序和其它分析之前在采用来自单个细胞的基因组DNA的领域的常用方法。在该方法中，随机引物退火后，利用具有强链置换活性的DNA聚合酶进行延伸。来自单个细胞的原始基因组DNA以级联样的形式指数地扩增，以形成超支化DNA结构。扩增来自单个细胞的基因组DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),单个人细胞的单核苷酸和拷贝数变异的基因组范围检测(Genome-widedetection of single-nucleotide and copy-number variations of a single humancell),Science 338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于环型的扩增循环(MALBAC)。其它用于单个细胞基因组DNA的方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用简并寡核苷酸的全基因组扩增允许成百上千个基因型以少于一纳克的基因组DNA进行(Whole genomeamplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds ofgenotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA),美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America),1996.93(25):14676-9页；Telenius,H.,等.,简并寡核苷酸引发的PCR：通过单个简并引物的常规扩增(Degenerate oligonucleotide-primed PCR:generalamplification of target DNA by a single degenerate primer),Genomics,1992.13(3):718-25页；Zhang,L.,等.,单个细胞的全基因组扩增：对基因分析的启示(Wholegenome amplification from a single cell:implications for genetic analysis).美国国家科学院院刊,1992,89(13):5847-51等；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用单个引物的PCR的全基因组扩增(Whole genome amplification using single-primer PCR),Biotechnology Journal,2008,3(3):378-82页；Dean,F.B.,等.,使用多重置换扩增的完整人基因组扩增(Comprehensive human genome amplification using multipledisplacement amplification),美国国家科学院院刊,2002.99(8):5261-6页；Lage,J.M.,等.,使用超支化链置换扩增和列阵-CGH对小DNA样品中基因变异的全基因组分析(Wholegenome analysis of genetic alterations in small DNA samples usinghyperbranched strand displacement amplification and array-CGH),GenomeResearch,2003,13(2):294-307等；Spits,C.,等.,单细胞全基因组置换扩增的优化和评价(Optimization and evaluation of single-cell whole-genome multipledisplacement amplification),Human Mutation,2006,27(5):496-503页；Gole,J.,等.,使用纳米微微管进行单个细胞大规模平行聚合酶克隆和基因组测序(Massively parallelpolymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanolitermicrowells),Nature Biotechnology,2013.31(12):1126-32页；Jiang,Z.,等.,使用多重置换扩增的单个精子的基因组扩增(Genome amplification of single sperm usingmultiple displacement amplification),Nucleic Acids Research,2005,33(10):e91页；Wang,J.,等.,人静止细胞中重组活性和新生突变比例的基因组范围单细胞分析(Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De NovoMutation Rates in Human Sperm),Cell,2012.150(2):402-12页；Hou,Y.,等.,单细胞外显子组测序和JAK2阴性骨髓增殖性肿瘤的单克隆进化(Single-cell exome sequencingand monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm),Cell,2012,148(5):873-85页；Xu,X.,等.,单细胞外显子测序揭示肾盏肿瘤的单核格式突变特征(Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutationcharacteristics of a kidney tumor,)Cell,2012,148(5):886-95页；Evrony,G.D.,等.,人脑中体细胞突变和l1逆转录转座的单神经元测序分析(Single-neuron sequencinganalysis of l1retrotransposition and somatic mutation in the human brain),Cell,2012.151(3):483-96等；McLean,J.S.,等.,使用高通量单细胞基因组学平台从医院槽中的生物膜中回收牙龈卟啉单胞菌病原体的基因组(Genome of the pathogenPorphyromonas gingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using ahigh-throughput single-cell genomics platform),Genome Research,2013.23(5):867-77页。关于全基因组扩增方面的方法报道于WO 2012/166425、US 7,718,403、US 2003/0108870和US 7,402,386。

然而，存在对于扩增(如由单个细胞或一小群细胞扩增)少量基因组DNA的其它方法的需求。

发明内容

本公开的实施方式是关于扩增DNA的方法，如少量基因组DNA或有限量DNA，如基因组序列或获自单个细胞或相同细胞类型的多个细胞的基因组序列或来自获自个体或底物的组织、液体或血液样品的基因组序列。根据本公开的某些方面，本文所述的方法可以在具有单一反应混合物的单管中进行。根据本公开的某些方面，核酸样品可以在来自单个细胞的未纯化的或未处理的裂解物中。待进行本文所述方法的核酸，在将其与各种试剂接触并且经历本文所述的各种条件之前，不需要被纯化，如通过珠纯化。本文所述的方法可以提供单个细胞整个基因组大量且均匀的覆盖，产生用于高通量测序的扩增DNA。

本发明的实施方式通常涉及制备DNA片段的方法和组合物，例如，来自单个细胞全基因组的DNA片段，随后可对其进行本领域技术人员已知的扩增方法。根据一个方面，作为转座体(transposome)一部分的转座酶用于产生一组双链基因组DNA片段。然后，使用本领域技术人员已知的方法(如PCR扩增)并且如本文所述可以扩增各双链基因组DNA片段。

根据一个具体实施方式，然后将各双链DNA(dsDNA)片段用作制备相应RNA的多个拷贝的模板。根据这个方面，原始dsDNA模板被用于制备相应RNA的多个拷贝中的每一个。然后，将对应原始dsDNA片段模板的RNA的多个拷贝逆转录以产生对应原始dsDNA片段模板的单链DNA的多个拷贝。然后，针对ssDNA的多个拷贝制备互补链，产生对应原始dsDNA片段模板的多个dsDNA拷贝。以该方式，原始dsDNA模板片段已经被线性扩增。也就是说，dsDNA模板片段是对应dsDNA模板片段的dsDNA扩增子的原始来源模板。dsDNA模板片段的扩增子自身并不进行扩增以由扩增子产生扩增子。本公开的dsDNA扩增子由原始dsDNA片段模板线性扩增。

根据某些方面，本文所述制备核酸片段的方法利用转座酶。该转座酶与转座子DNA复合以形成转座酶/转座子DNA复合物，该转座子DNA包括双链转座酶结合位点和包括一个或多个条形码序列和引发位点的第一核酸链。第一核酸序列可以是单链延伸的形式，或者第一核酸序列可以是环的形式，其各末端连接双链转座酶结合位点的对应链。根据某些方面，转座酶具有结合转座子DNA以及当接触时(如将其置于反应容器内时)二聚化，形成转座酶/转座子DNA复合物二聚体的能力，该转座酶/转座子DNA复合物二聚体被称为转座体(transposome)。该转座体具有结合沿双链核酸(如双链基因组DNA)分布的靶位置，形成包括转座体和双链基因组DNA的复合物的能力。转座体中的转座酶切割双链基因组DNA，其中一个转座酶切割上链(upper strand)，一个转座酶切割下链(lower strand)。转座体中的转座子DNA在切割位点连接双链基因组DNA。根据某些方面，例如，多个转座酶/转座子DNA复合物二聚体沿着双链基因组DNA结合相应的多个靶位置，并且然后将双链基因组DNA切割成多个双链片段，其中各片段具有连接于双链片段各末端的转座子DNA。根据一个方面，转座子DNA连接于双链基因组DNA，并且单链缺口存在于基因组DNA的一条链和转座子DNA的一条链之间。根据一个方面，进行缺口延伸以填充缺口并产生双链基因组DNA和双链转座子DNA之间的双链连接。根据一个方面，转座子DNA的转座酶结合位点连接于双链片段各末端。根据某些方面，转座酶连接转座子DNA，所述转座子DNA连接于双链片段各末端。根据一个方面，将转座酶从转座子DNA去除，所述转座子DNA连接于双链基因组DNA片段的各末端。

根据本发明的一个方面，然后用转座子DNA作为模板对通过转座酶产生的双链基因组DNA片段进行填充缺口和延伸，所述转座酶具有连接于双链基因组DNA片段各末端的转座子DNA。相应地，产生双链核酸延伸产物，其包括双链基因组DNA和位于双链基因组DNA各末端的双链转座子DNA。然后，使用本领域技术人员已知的方法(如PCR扩增)可以扩增双链核酸延伸产物。

根据某些其它方面，本文所述制备核酸片段的方法利用转座酶和RNA聚合酶。该转座酶与转座子DNA复合以形成转座酶/转座子DNA复合物，该转座子DNA包括双链转座酶结合位点和包括条形码序列、引发位点和RNA聚合酶启动子序列中的一个或多个的第一核酸链。第一核酸序列可以是单链延伸的形式，或者第一核酸序列可以是环的形式，其各末端连接双链聚合酶结合位点的对应链。根据某些方面，转座酶具有结合转座子DNA以及当接触时(如将其置于反应容器内时)二聚化，形成转座酶/转座子DNA复合物二聚体的能力，该转座酶/转座子DNA复合物二聚体被称为转座体。该转座体具有结合沿双链核酸(如双链基因组DNA)分布的靶位置形成包括转座体和双链基因组DNA的复合物的能力。转座体中的转座酶切割双链基因组DNA，其中一个转座酶切割上链，一个转座酶切割下链。转座体中的转座子DNA在切割位点连接双链基因组DNA。根据某些方面，例如，多个转座酶/转座子DNA复合物二聚体结合沿双链基因组DNA分布的相应的多个靶位置，并且然后将双链基因组DNA切割成多个双链片段，其中各片段具有连接于双链片段各末端的转座子DNA。根据一个方面，转座子DNA连接于双链基因组DNA，并且单链缺口存在于基因组DNA的一条链和转座子DNA的一条链之间。根据一个方面，进行缺口延伸以填充缺口并产生双链基因组DNA和双链转座子DNA之间的双链连接。根据一个方面，转座子DNA的转座酶结合位点连接于双链片段各末端。根据某些方面，转座酶连接转座子DNA，所述转座子DNA连接于双链片段各末端。根据一个方面，将转座酶从转座子DNA去除，所述转座子DNA连接于双链基因组DNA片段的各末端。

根据本发明的一个方面，然后用转座子DNA作为模板对通过转座酶产生的双链基因组DNA片段进行填充缺口和延伸，所述转座酶具有连接于双链基因组DNA片段各末端的转座子DNA。相应地，产生双链核酸延伸产物，其包括双链基因组DNA和位于双链基因组DNA各末端的双链转座子DNA。因为双链转座子DNA可以包括活性双链RNA聚合酶启动子序列，所以其后可以使用RNA聚合酶制备双链核酸延伸产物的许多RNA转录物，其中使用双链核酸延伸产物作为模板，该模板针对许多或多个相应RNA转录物(作为扩增子)中的每一个。因为使用了RNA聚合酶，RNA转录物是由相应原始双链核酸延伸产物模板线性扩增地扩增子。该原始双链核酸延伸产物是针对相应RNA转录物扩增子的唯一模板。该RNA转录物不是指数扩增子。

根据一个方面，然后将RNA转录物逆转录到单链DNA中。然后制备该单链DNA的互补链，形成包括基因组DNA序列并且在上链和下链的两端具有条形码的双链DNA。

根据一个方面，然后使用本技术技术人员已知的方法，对包括基因组DNA并且在上链和下链的两端具有条形码的该双链DNA进行测序。

本公开的实施方式是关于使用本文所述的方法扩增DNA的方法，如少量基因组DNA或有限量DNA，如基因组序列或获自单个细胞或相同细胞类型的多个细胞的基因组序列或来自获自个体或底物的组织、液体或血液样品的基因组序列。根据本公开的某些方面，本文所述的方法可以在具有在合适条件下添加了反应物的单管中进行，以由那些基因组DNA片段产生线性扩增的DNA扩增子。本文所述的方法可以提供单个细胞整个基因组大量的覆盖，产生用于高通量测序的扩增DNA。

根据其它方面，本文提供了进行单个细胞的全基因组扩增的方法，所述方法具有高保真度和对于基因组中不同基因座的扩增均一性或覆盖率，其可用于使用本领域技术人员已知的高通量测序平台进行进一步测序或分析。本文提供的方法使扩增偏倚(amplification bias)最小化，并提供对单个细胞基因组DNA的DNA测序基本完整或完整的基因组覆盖。本文所述方法可以扩增来自单个细胞的大于90％的基因组DNA，而大于70％或75％的基因组DNA可以7x或10x或15x的测序深度进行测序，其具有本质上较少、几乎没有或没有嵌合体序列本文所述方法减少或消除测序人工产物(sequencing artifact)的产生，并促进单个细胞核苷酸多态性、拷贝数变异和结构变异的高级基因组分析。本文所述方法在以高异质细胞群(如肿瘤和神经快)为特征的组织样品或生物系统中具有特定应用。本文所述扩增基因组DNA的方法促进使用本领域技术人员已知以及本文所述的下一代测序技术对这样扩增的DNA的分析。

本公开的DNA扩增方法能够用于扩增少量或有限量DNA，这将允许对DNA样品中的多个位点进行基因分型以用于高通量筛选。此外，本发明将允许针对任何染色体区域快速构建条带特异性涂染探针(band specific painting probe)，并且也可用于在异常染色体组型微观解剖和扩增不可鉴定的染色体区域或标记染色体。本文公开的方法还将允许快速克隆扩增的DNA，用于测序或生成DNA文库。因此，该方法不仅是表型分析的和高通量筛选的有价值的工具，其还将是细胞遗传诊断中有价值的工具。本文所述的方法可以利用不同来源的DNA材料，包括遗传异质性组织(例如，癌症)，稀有和珍贵样品(例如，胚胎干细胞)，和非分裂细胞(例如，神经元)等，以及本领域技术人员一致的测序平台和基因分型方法。

本公开的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图的简要说明

结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明实施方式的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1是转座子DNA的一个实施方式的示意图。

图2是转座体形成、结合基因组DNA，切割和转座子DNA的插入的示意图。

图3是转座酶去除、缺口填充和延伸以形成包括基因组DNA的核酸延伸产物的示意图。

图4是体外转录、逆转录和第二链合成以形成DNA片段的双链扩增子的示意图。

图5描述了显示转座后DNA片段大小分布的图表。

图6是显示了由DNA生物分析仪测定的扩增后DNA片段大小的图表。

图7是显示了扩增后DNA片段大小分布的图表。

图8是比较指数扩增与线性扩增产生错误的示意图。

图9是显示基因组DNA片段上不同条形的示意图。

图10是显示使用具有转座子DNA的转座体的基因组从头组装的示意图，所述转座子DNA包括由切割位点分开的相同形码和引发位点。多个转座体结合基因组DNA，并将基因组DNA切割成片段，各片段在各末端具有不同的条形码。然后可将相同条形码重叠以在不需要参考基因组的情况下将DNA片段组装成基因组。

图11是单个细胞基因组DNA在全基因组扩增以及下一代测序后拷贝数变异(CNV)概况。单细胞选自BJ细胞系(人皮肤成纤维细胞正常细胞系)。每个点的箱(bin)大小为1Mb。该平面CNV概况证明了单细胞基因组DNA扩增方法的均匀性。

图12是总结了来自单个细胞基因组DNA的扩增的DNA的测序参数和结果的表格。

具体实施方式

除非另有说明，某些实施方式的实践或某些实施方式的特征可以采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学和本技术领域内的常规技术。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例如，Sambrook,Fritsch,和Maniatis,《分子克隆：实验室手册(MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL)》,第二版(1989),《寡核苷酸合成(OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS)》(M.J.Gait编著,1984),《动物细胞培养(ANIMAL CELL CULTURE)》(R.I.Freshney编著,1987),《酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)》丛书(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；《哺乳动物细胞的基因转移载体(GENE TRANSFER VECTORSFOR MAMMALIAN CELLS)》(J.M.Miller和M.P.Calos编著.1987),《免疫学实验手册(HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY)》,(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著),《新编分子生物学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)》(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,和K.Struhl编著,1987),《新编免疫学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)》(J.E.coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编著,1991)；《免疫学年鉴(ANNUAL REVIEW OFIMMUNOLOGY)》；以及如《免疫学进展(ADVANCES IN IMMUNOLOGY)》等期刊中的专著。本文上下文中提及的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式用全文纳入本文。

本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如，Kornberg和Baker，DNA Replication(《DNA复制》)，第二版(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman)，纽约，1992)；Lehninger，Biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(Worth Publishers)，纽约，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(《人类分子遗传学》)，第二版(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)；Eckstein编，Oligonucleotides andanalogs:A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1991)；Gait编，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(IRL出版社，牛津，1984)；等。

本发明部分基于使用转座酶或转座体由如基因组DNA制备DNA片段模板的方法的发现。然后可对基因组DNA片段模板进行扩增和测序。使用本文所述转座酶方法制备的DNA片段模板可以使用本领域技术人员已知的的方法进行扩增。在某些方面，扩增使用PCR实现。Mullis(美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188)的术语“聚合酶链反应"”(“PCR”)指用于在未克隆或纯化的核酸序列的混合物中提高靶序列片段浓度的方法。扩增靶序列的方法包括将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需靶序列的核酸序列混合物中，然后在聚合酶(例如，DNA聚合酶)存在的情况下进行准确的一连串热循环。两种引物与双链靶序列各自的链互补。为了进行扩增，将混合物变形，然后将引物退火至靶分子中的其互补序列。退火后，用聚合酶延伸引物，从而形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤可以重复多次(即，变性、退火或延伸组成一个“循环”，可以有许多“循环”)以获得所需靶序列的高浓度扩增区段。所述靶序列的扩增区段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，并且因此，长度是可控参数。由于该过程的重复，该方法被称为“聚合酶链反应”(下文称之为“PCR”)。因为靶序列所需扩增的区段称为混合物中的主要序列(就浓度而言)，所以将其称为“PCR扩增”。

藉由PCR，有可能将基因组DNA中的特定靶序列的单拷贝扩增至通过几种不同方法(例如，与标记探针杂交；纳入生物素化引物，然后进行抗生物素蛋白-酶偶联物检测；将32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸(如dCTP或dATP)纳入扩增区段)可检测的水平。除了基因组DNA，任何寡核苷酸或多核苷酸都可以用适当的引物分子组进行扩增。特别是，通过PCR过程其自身产生的扩增区段本身就是用于后续PCR扩增的有效模板。用于进行PCR的方法和试剂盒是本技术领域已知的。PCR是这样一种反应，其中使用由上游和下游引物组成的一组引物或一对引物和聚合催化剂(如DNA聚合酶)以及热稳定的聚合酶(通常使用)，由靶多核苷酸制备复制拷贝。PCR的方法在本领域是公知的，并且在例如MacPherson等.(1991)PCR 1：使用方法(PCR 1:A Practical Approach)牛津大学出版社(Oxford University Press)IRL出版社(IRL Press)中教导。产生多核苷酸复制拷贝的所有方法(如PCR或基因克隆)在本文中统称为复制。引物还可以用作杂交反应中的探针，如Southern或Northern印迹分析。

“扩增”或“进行扩增”这样的表述指通过通过其将形成特定多核苷酸的额外或多个拷贝的过程。扩增包括诸如PCR、连接扩增(或连接酶链反应，LCR)和其他扩增方法的方法。这些方法在本领域中是已知且广泛应用的。参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202，以及Innis等.,"PCR方法：方法和应用的指南(PCR protocols:a guide to methodand applications)'”学术出版社股份有限公司公司(Academic Press,Incorporated)(1990)(针对PCR)；和Wu等.(1989)Genomics 4:560-569(针对LCR)。通常，PCR过程描述了这样一种基因扩增方法，其包括(i)引物与DNA样品(或文库)中特定基因的序列特异性杂交，(ii)随后的扩增，涉及使用DNA聚合酶地多轮退火、延伸和变性，和(iii)筛选PCR产物以获得正确大小的条带。使用的引物是具有足够长度和适当序列的寡核苷酸以引发聚合，即特异性地涉及各引物，使其与待扩增的基因组基因座的每条链互补。

进行扩增反应的试剂和硬件是市售可得的。用于扩增来自特定基因区域的序列的引物优选与目标区域或其侧接区中的序列互补并与其特异性杂交，并且可以使用本文提供的多核苷酸序列制备。通过扩增生成的核酸序列可以直接进行测序。

当杂交以两个单链多核苷酸之间的反平行构型发生时，该反应被称为“退火”，并且这些多核苷酸被描述为“互补的”。如果杂交可以发生在第一多核苷酸的一条链与第二多核苷酸的链之间，那么双链多核苷酸可以与另一多核苷酸互补或同源。根据普遍接受的碱基配对规则，互补性或同源性(一个多核苷酸与另一个多核苷酸互补的程度)可依据相对链中预计将彼此之间形成氢键的碱基的比例来定量。

术语“逆转录酶PCR”和“RT-PCR”指起始材料是mRNA的一类PCR。使用逆转录酶将起始mRNA酶促转化为互补DNA或“cDNA”。然后将该cDNA用作PCR反应的模板。

术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”指在变性、退火和延伸PCR步骤的两个或更多个循环完成后得到的化合物混合物。这些术语包括已经扩增了一个或多个靶序列的一个或多个片段的情况。

术语“扩增试剂”是指除了引物、核酸模板和扩增酶以外扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸，缓冲液等)。通常，将扩增试剂与其他反应组分一起放置并容纳在反应容器中(试管，微孔等)。扩增方法包括本领域技术人员已知的PCR方法，并且还包括滚环扩增(Blanco等.,J.Biol.Chem.,264,8935-8940,1989)、超支化滚环扩增(Lizard等.,Nat.Genetics,19,225-232,1998)和环介导的等温扩增(Notomi等.,Nuc.Acids Res.,28,e63,2000)，其各自通过引用将其全部内容纳入本文。

对于乳液PCR，通过剧烈振荡或搅拌“油包水”混合物以生成数百万个微米级水性隔室来产生乳液PCR反应。DNA文库以有限稀释度在乳化前与珠混合或直接混入乳液混合物中。使用靶分子和珠的有限稀释和隔室大小的组合来生成平均包含一个DNA分子和珠的隔室(在最佳稀释下，许多隔室将具有没有任何靶标的珠)。为了促进扩增效率，反应混合物中包括上游(低浓度，与珠上的引物序列匹配)和下游PCR引物(高浓度)。基于乳化步骤中生成的水性隔室的大小，可以在同一管中同时进行每μl上至3x109个单独的PCR反应。基本上乳液中各小隔室形成微型PCR反应器。基于乳化条件，乳液中隔室的平均大小的范围从次微米直径到超过100微米。

本公开上下文中特别考虑的其它核酸扩增过程包括基于转录的扩增系统(rAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR，Kwoh等.,Proc Natl Acad Sci USA,86:1173-77,1989；PCT专利申请WO 88/10315等.,1989(其各自通过引用纳入本文)。在NASBA中，用于扩增的核酸可以这样制备，其通过标准苯酚/氯仿提取，临床样品的热变性，裂解缓冲液处理，和用于分离DNA和RNA或RNA的盐酸胍提取物迷你离心(minispin)柱。这些扩增技术涉及使具有靶标特异性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化DNA/RNA杂合体，而双链DNA分子再次进行热变性。在任一情况中，通过在聚合前加入第二靶标特异性引物使单链DNA称为完全双链。然后，双链DNA分子通过如T7或SP6的聚合酶进行多次转录。在等温循环反应中，RNA被逆转录成双链DNA，并再次用如T7或SP6的聚合酶转录。获得的产物，无论其是截短的还是完整的,均表示靶标特异性序列。

其中扩增方法，如英国专利申请号GB 2,202,328以及PCT专利申请号PCT/US89/01025中所述的方法，各自通过引用纳入本文，可以依据本公开使用。在前一申请中，“修饰的”引物被用于PCR样模板和酶依赖性合成中。引物可以通过用捕获部分(例如，生物素)和/或检测器部分(例如，酶)标记来修饰。在后一申请中，将过量的标记探针添加到样品。在靶序列存在的情况中，探针结合并且被催化切割。切割后，靶序列被完整的释放，以被过量的探针结合。标记探针的切割表面靶序列的存在。

Davey等.,欧洲专利申请号329,822(通过引用纳入本文)公开了涉及循环合成单链RNA("ssRNA")、ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增过程，其可以依据本公开使用。ssRNA是第一引物寡核苷酸的第一模板，其通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合)延长。然后通过核糖核酸酶H(RNA酶H，一种对DNA或RNA双链体中RNA具有特异性的RNA酶)的作用将RNA从获得的DNA:RNA双链体去除。所得ssDNA是第二引物的第二模板，其还包括RNA聚合酶启动子(以T7RNA聚合酶为例)的序列，其5'与模板同源。然后通过DNA聚合酶延伸该引物(以大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段为例)，产生双链DNA分子，其具有与引物间原始RNA相同的序列，并且在一个末端还具有启动子序列。通过适当的RNA聚合酶，启动子序列可以用于制备DNA的许多RNA拷贝。然后，这些拷贝可以再次进入循环，导致非常快速的扩增。藉由适当选择的酶，该扩增可以在各循环不添加酶的情况下等温地实现。。因为该过程的循环性质，启示核酸序列可以是DNA或RNA。

Miller等.的PCT专利申请WO 89/06700(通过引用纳入本文)公开了一种核酸序列扩增方案，其基于启动子/引物序列与靶向单链DNA的杂交以及其后序列许多RNA拷贝的转录。该方案不是循环的，即，新的模板并不是从所得RNA转录物产生。

其它合适的扩增方法包括“race”和“单侧PCR”(Frohman，述于《PCR方案：方法和引用的指南(PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications)》,学术出版社,纽约,1990,其各自通过引用纳入本文)。基于在具有所得“二寡核苷酸”序列的核酸存在的情况下连接两个(或多个)寡核苷酸并因此扩增该二寡核苷酸的方法也可以用于根据本公开扩增DNA(Wu等.,Genomics 4:560-569,1989，通过引用纳入本文)。

根据一个方面，DNA片段模板包括RNA聚合酶启动子序列，并且用RNA聚合酶由DNA片段模板制备RNA扩增子并用逆转录酶由RNA扩增子制备单链DNA。然后对单链DNA进行互补以制备双链DNA，产生线性扩增自原始DNA片段模板的扩增子。

根据某些方面，示例性的转座子系统是Tn5转座子系统。其它用用的转座子系统是本领域技术人员已知的，并且包括Tn3转座子系统(参见Maekawa,T.,Yanagihara,K.,和Ohtsubo,E.(1996),Tn3转座的无细胞系统和转座免疫(A cell-free system ofTn3transposition and transposition immunity),Genes Cells 1,1007-1016)、Tn7转座子系统(参见Craig,N.L.(1991),Tn7：靶向位点特异性转座子(Tn7:a targetsite-specific transposon),Mol.Microbiol.5,2569-2573)、Tn10转座子系统(参见Chalmers,R.,Sewitz,S.,Lipkow,K.,和Crellin,P.(2000),Tn10的完整核苷酸序列(Completenucleotide sequence of Tn10),J.Bacteriol 182,2970-2972)、Piggybac转座子系统(参见Li,X.,Burnight,E.R.,Cooney,A.L.,Malani,N.,Brady,T.,Sander,J.D.,Staber,J.,Wheelan,S.J.,Joung,J.K.,McCray,P.B.,Jr.,等.(2013),用于基因工程的PiggyBac转座酶工具(PiggyBac transposase tools for genome engineering),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110,E2279-2287)、睡美人转座子系统(参见Ivics,Z.,Hackett,P.B.,Plasterk,R.H.,和Izsvak,Z.(1997),来自鱼类的睡美人、Tcl样转座子的分子重建及其在人细胞中的转座(Molecular reconstruction of Sleeping Beauty,a Tc1-liketransposon from fish,and its transposition in human cells),Cell 91,501-510)、Tol2转座子系统(参见Kawakami,K.(2007),Tol2：脊椎动物中多功能基因转移载体(Tol2:aversatile gene transfer vector in vertebrates),Genome Biol.8增刊.1,S7.)。

根据某些方面，示例性的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。其它有用的RNA聚合酶是本领域技术人员已知的，并且包括T3RNA聚合么(参见Jorgensen,E.D.,Durbin,R.K.,Risman,S.S.,和McAllister,W.T.(1991)噬菌体T3、T7和SP6RNA聚合酶以及其启动子之间的特异性接触(Specific contacts between the bacteriophage T3,T7,and SP6RNA polymerasesand their promoters),J.Biol.Chem.266,645-651)和SP6RNA聚合酶(参见Melton,D.A.,Krieg,P.A.,Rebagliati,M.R.,Maniatis,T.,Zinn,K.,和Green,M.R.(1984)由包含噬菌体SP6启动子的质粒体外高效合成生物活性RNA和RNA杂交探针(Efficient in vitrosynthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes fromplasmids containing a bacteriophage SP6promoter),Nucleic Acids Res.12,7035-7056.)。

待扩增的DNA可以获得自单个细胞或小细胞群。本文所述方法允许由反应混合物中的任何物种或生物体扩增DNA，如在单个反应容器中进行的单一反应混合物。在一个方面中，本文所述方法包括由任何来源进行DNA的序列非依赖性扩增，所述来源包括但不限于人、动物、植物、酵母、病毒、真核和原核DNA。

根据一个方面，提供了单细胞全基因组扩增和测序的方法，其包括使来自单个细胞细胞的双链基因组DNA与各自结合转座子DNA的Tn5转座酶接触，其中转座子DNA包括双链19bp的转座酶(Tnp)结合位点和第一核酸序列以形成被称之为转座体的转座酶/转座子DNA复合物二聚体，所述第一核酸序列包括条形码序列、引发位点和RNA聚合酶启动子序列中的一个或多个。第一核酸序列可以是单链延伸的形式，或者第一核酸序列可以是环的形式，其各末端连接双链聚合酶结合位点的对应链。根据一个方面，第一核酸序列可以是突出端，如5’突出端，其中该突出端包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列。该突出端可以是任何长度，以适于如所需包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列中的一种或多种。转座体沿着双链基因组DNA结合靶位置并将双链基因组DNA切割成多个双链片段，各双链片段具有通过Tnp结合位点连接上链的第一复合物，以及通过Tnp结合位点连接下链的第二复合物。转座子结合位点连接双链片段各5’末端。根据一个方面，将Tn5转座酶从复合物去除。。沿着转座子DNA延伸双链片段以制备在各末端具有T7启动子的双链延伸产物。根据一个方面，可能是由于Tn5转座酶结合位点与双链基因组DNA片段所导致的缺口可以被填充。双链延伸产物与T7RNA聚合酶接触以制备双链延伸产物的多个RNA转录物。根据一个方面，使用T7RNA聚合酶制备双链延伸产物的多个RNA转录物。将RNA转录物转录到多个相应单链DNA。产生单链DNA的互补链以形成包括基因组DNA序列并且在上链和下链的两端具有条形码的双链DNA。多个双链DNA是由转座酶产生的相应基因组DNA片段线性扩增的扩增子。然后，可以使用例如本领域技术人员已知的高通量测序方法对双链DNA扩增子进行测序。

在一个具体方面中，实施方式是关于在不丧失特异性位点的表现度的情况下扩增基本上整个基因组的方法(本文定义为“全基因组扩增”)。在特定实施方式中，全基因组扩增包括同时扩增基因组文库基本上所有的片段。在另一个特定实施方式中，“基本上整个”或“基本上所有”指基因组中约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、或约99％的所有序列。本领域熟练的技术人员将认识到，在一些实施方式中，全基因组的扩增将包括特定序列而非其它序列的非等效扩增。

根据一个方面，DNA样品是基因组DNA、显微解剖的染色体DNA、酵母人工染色体(YAC)DNA、粘粒DNA、噬菌体DNA、P1衍生的人造染色体(PAC)DNA或细菌人工染色体(BAC)DNA。在另一优选实施方式中，DNA样品是哺乳动物DNA、植物DNA、酵母DNA、病毒DNA或原核生物DNA。在又一优选实施方案中，DNA样品获自人、牛、猪、羊、马、啮齿动物、禽、鱼、虾、植物、酵母、病毒或细菌。优选地，DNA样品是基因组DNA。

根据某些示例性方面，转座系统被用于制备用于如所需进行扩增和测序的核酸片段。根据一个特定的方面，转座系统与RNA聚合酶结合，用于单个细胞基因组扩增。根据一个方面，转座系统被用于将基因组DNA片段化双链基因组DNA片段。使用RNA聚合酶制备RNA扩增子，然后将其逆转录到DNA中。制备DNA的补体并形成双链基因组DNA序列，其是由原始双链基因组DNA片段线性扩增的扩增子。根据某些方面，使用RNA聚合酶以线性的方式制备扩增子有助于实现单个细胞基因组DNA(gDNA)的高质量扩增，减少或避免了(1)扩增偏倚，其将导致噪音单细胞测序数据，这将进一步影响基因组覆盖，以及拷贝数变异(CNV)的低分辨率检测；(2)扩增错误，其将在单个细胞测数据中引起高假阳性率，这将进一步组织单核苷酸变异(SNV)的准确检测；以及(3)扩增期间嵌合体形成，其将覆盖来自原始单个细胞基因组DNA样品结构变异(SV)的信号。这些方面中的一个或多个可以是由于指数扩增产生，如在某些情况与PCR扩增相关联。根据定义，PCR是指数扩增方法，即基于来自之前扩增轮的拷贝制备新的拷贝。因此，扩增子之间轻微的扩增效率差异可能积累，导致许多循环后不同扩增子之间的扩增偏倚。此外，在最初几轮PCR中产生的错误可能会在后续的PCR轮中进一步传播到更多拷贝中，这可能会在许多扩增循环后降低整体扩增准确性。

根据某些方面，当扩增少量DNA(如来自单细胞的DNA)时，不进行DNA柱纯化步骤，从而使可以在扩增前从单细胞内获得的少量(约6pg)基因组DNA最大化。DNA可以从细胞裂解物或其它不存条件直接扩增。相应地，DNA样品可以是不纯的、未纯化的、未分离的。相应地，本方法的方面允许人们使用于扩增的基因组DNA最大并且减少由于纯化的损失。根据其它方面，本文所述方法可以利用粗了PCR以外的扩增方法，如基于RNA聚合酶的扩增方法。本文所述的这种基于RNA聚合酶的扩增方法可以有利地降低扩增偏倚并改善扩增准确性。例如，Tn5转座子DNA被设计为包含强T7启动子序列。在转座反应后，将单个细胞基因组DNA片段化，其中个片段通过位于两端的强T7启动子标记。

根据一个方面，转座子DNA被设计为在一个末端包含双链19bp的Tn5转座酶(Tnp)结合位点，其连接或结合(如通过共价键)长单链突出端，所述突出端包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列，如图1所示。强T7启动子序列位于突出端的末端。转座后，Tnp和转座子DNA相互结合，并且二聚化形成转座体，如图2所示。然后，转座体随机捕获或以其它方式与靶向单个细胞基因组DNA结合成二聚体，如图2所示。代表性转座体用1-3编号。然后，转座体中的转座酶切割基因组DNA，藉由一个转座酶切割上链并且一个转座酶切割下链以产生基因组DNA片段。因此，将转座子DNA随机插入单个基因组DNA，在转座/插入位点的两端留下9bp的缺口。结果是这样的基因组DNA片段，其具有连接上链的5'位置的转座子DNA Tnp结合位点以及连接下链的5'位置的转座子DNA Tnp结合位点。示出由于插入转座子DNA而产生的缺口。

在转座后，进行缺口延伸以填充9bp的缺口并且补充最初设计在转座子DNA中的单链。其结果是，活性双链T7启动子连接各基因组DNA片段的两端，如图3所示。其后，如突4所示，添加T7RNA聚合酶，并且使用体外转录以线性扩增单个细胞基因组DNA片段，生成包含与原始基因组双链DNA模板相同的序列的许多RNA。最终通过逆转录和第二链合成，将扩增的RNA转化回双链DNA分子，其具有最初设计在转座子DNA中连接于各片段两端的条形码区域。然后，可以进一步进行处理DNA片段，用于标准文库制备和测序。

描述了特定的Tn5转座子系统，并且是本领域技术人员可使用的。参见Goryshin,I.Y.和W.S.Reznikoff,Tn5体外转座(Tn5in vitro transposition).The Journal ofbiological chemistry,1998.273(13):7367-74页；Davies,D.R.,等.,Tn5突触复合物转座中间体的三维结构(Three-dimensional structure of the Tn5synaptic complextransposition intermediate).Science,2000.289(5476):77-85页；Goryshin,I.Y.,等.,通过电穿孔释放的Tn5转座复合物的插入转座子突变(Insertional transposonmutagenesis by electroporation of released Tn5transposition complexes).Naturebiotechnology,2000.18(1):97-100等以及Steiniger-White,M.,I.Rayment,和W.S.Reznikoff,Tn5转座的结构/功能研究(Structure/function insights intoTn5transposition).Current opinion in structural biology,2004.14(1):50-7页，其各自通过引用出于所有目的将其全部内容纳入本文。利用Tn5转座系统进行DNA文库制备和其它应用的试剂盒是已知的。参见Adey,A.,等.,通过高密度体外转座来快速、低输入、低偏倚构建鸟枪片段文库(Rapid,low-input,low-bias construction of shotgun fragmentlibraries by high-density in vitro transposition).Genome biology,2010.11(12):R119页；Marine,R.,等.,评估用于从纳克量的DNA快速生成鸟枪高通量测序文库的转座酶方案(Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgunhigh-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA).Appliedand environmental microbiology,2011.77(22):8071-9页；Parkinson,N.J.,等.,由微微克量的靶DNA制备高质量下一代测序文库(Preparation of high-quality next-generation sequencing libraries from picogram quantities of target DNA).Genome research,2012.22(1):p.125-33；Adey,A.和J.Shendure,超低输入、基于标签作用的全基因组亚硫酸氢盐测序(Ultra-low-input,tagmentation-based whole-genomebisulfite sequencing).Genome research,2012.22(6):1139-43页；Picelli,S.,等.,使用Smart-seq2由单个细胞的全长RNA-seq(Full-length RNA-seq from single cellsusing Smart-seq2).Nature protocols,2014.9(1):171-81页，以及Buenrostro,J.D.,等.,天然染色质的转座用于开放染色质、DNA结合蛋白和核小体位置的快速和敏感表观基因组概况(Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomicprofiling of open chromatin,DNA-binding proteins and nucleosome position).Nature methods,2013，其各自通过引用出于所有目的将其全部内容纳入本文。同样参见WO 98/10077、EP 2527438和EP 2376517，其各自通过引用出于所有目的将其全部内容纳入本文。市售可得的转座试剂盒以NEXTERA的名称销售并可从Illumina公司获得。

通过T7RNA聚合酶的体外转座(IVT)可用于产生RNA扩增子。参见Van Gelder,R.N.,等.,由有限量的异质性cDNA合成扩增的RNA(Amplified RNA synthesized fromlimited quantities of heterogeneous cDNA).美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America),1990.87(5):1663-7页；Kawasaki,E.S.,单细胞的基因表达谱和微阵列(Microarrays and the geneexpression profile of a single cell).纽约科学院年报(Annals of the New YorkAcademy of Sciences),2004.1020:92-100页；Livesey,F.J.,有限量RNA的微阵列分析方法(Strategies for microarray analysis of limiting amounts of RNA).功能基因组学和蛋白质组学的简报(Briefings in functional genomics&proteomics),2003.2(1):31-6页；Tang,F.,K.Lao,和M.A.Surani,单个细胞转录组分析的发展和应用(Developmentand applications of single-cell transcriptome analysis).Nature methods,2011.8(4增刊):S6-11页；Hashimshony,T.,等.,CEL-Seq：通过多重线性扩增的单个细胞RNA-Seq(CEL-Seq:single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification).Cellreports,2012.2(3):666-73页；以及Shankaranarayanan,P.,等.,用于使用几千个细胞的基因组范围的单管式线性DNA扩增(Single-tube linear DNA amplification forgenome-wide studies using a few thousand cells).Nature protocols,2012.7(2):328-38页，其各自通过引用出于所有目的将其全部内容纳入本文。根据本公开，IVT有利地提供了线性扩增，其中所有的拷贝都是从原始DNA模板生成的。产生的RNA分子可以被逆转录到单链DNA，然后形成互补链以产生双链DNA，其是由原始DNA模板线性扩增的扩增子。由于使用RNA聚合酶进行线性扩增，不同扩增子之间的扩增偏倚要小得多。此外，扩增准确性更高，因为在线性扩增中，扩增错误不能传播到后续阶段。根据某些方面，RNA启动子序列与DNA连接以有利地使用RNA聚合酶(如T7RNA聚合酶)以产生RNA扩增子，所述RNA扩增子然后被用于产生原始DNA模板的DNA扩增子。

根据一个方面，扩增DNA的方法还包括对扩增的DNA产物进行基因型分析。或者，扩增DNA的方法优选还包括鉴定扩增的DNA产物中的多态性，如单核苷酸多态性(SNP)。在优选实施方式中，SNP可以通过本领域技术人员众所周知的许多方法在生物体的DNA中鉴定，所述方法包括但不限于这样鉴定SNP，通过DNA测序，通过扩增PCR产物和测序PCR产物，通过寡核苷酸连接试验(OLA)，通过Doublecode OLA，通过单碱基延伸试验，通过等位基因特异性引物延伸，或通过错配杂交。优选地，鉴定的SNP与基因型相关联，包括疾病基因型和所需所需表型性状。通过使用公开的DNA扩增方法产生的扩增的DNA也可被优选用于生成DNA文库，包括但不限于基因组DNA文库、显微切割的染色体DNA文库、BAC文库、YAC文库、PAC文库、cDNA文库、噬菌体库和粘粒文库。

本文所用术语“基因组”被定义为由个体、细胞或细胞器携带的总体基因(collective gene)集合。本文所用术语“基因组DNA”被定义为这样的DNA材料，其包含由个体、细胞或细胞器携带的部分或全部集体基因集合。

本文所用术语“核苷”是指具有与核糖或脱氧核糖共价连接的嘌呤或嘧啶碱基的分子。示例性的核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷。其它示例性的核苷包括肌苷、1-甲基肌苷、假尿苷、5,6-二氢尿苷、核糖胸核苷、2N-甲基鸟苷和2,2N,N-二甲基鸟苷(也称为“稀有”核苷)。术语“核苷酸”是指具有一个或多个与糖部分以酯键连接的磷酸基团的核苷。示例性的核苷酸包括核苷单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，并指通过5'和3'碳原子之间的磷酸二酯键连接在一起的任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以进行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，本发明包含多核苷酸的任何实施方式都包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多苷酸由4个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；并且当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)。因此，术语多核苷酸序列是多核苷酸分子的字母表示。可以将该字母表示输入具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。

术语“RNA”、“RNA分子”和“核糖核酸分子”指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”、“DNA分子”和“脱氧核糖核酸分子”指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以自然合成(例如，分别通过DNA复制或DNA转录)。可以对RNA进行转录后修饰。DNA和RNA也可以化学合成。DNA和RNA可以是单链(即分别为ssRNA和ssDNA)或多链(例如，双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。

术语“核苷酸类似物”、“改变的核苷酸”和“修饰的核苷酸”指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在某些示例性实施方式中，在任何位置修饰核苷酸类似物，从而改变核苷酸的某些化学性质，但仍保留核苷酸类似物进行其预期功能的能力。可被衍生化的核苷酸位置的示例包括5位置，例如，5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷，5-丙烯基尿苷等；6位置，例如，6-(2-氨基)丙基尿苷：腺苷和/或鸟苷的8-位，例如，8-溴鸟苷，8-氯鸟苷，8-氟鸟苷等。核苷酸类似物还包括脱氮核苷酸，例如，7-脱氮腺苷；O-和N-修饰的(例如，烷基化的，例如，N6-甲基腺苷，或如本领域其他已知的)核苷酸；以及其他杂环修饰的核苷酸类似物，如Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.,2000年8月10日(4):297-310中所述的那些。

核苷酸类似物还可以包括对于核苷酸糖部分的修饰。例如，2'OH-基团可被选择如下的基团取代：H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、COOR、或OR，其中，R是取代的或未取代的C₁-C₆烷基、链烯基、炔基、芳基等。其它可能的修饰包括在美国专利号5,858,988,和6,291,438中所述的那些。

也可对核苷酸的磷酸基团进行修饰，例如，通过用硫取代磷酸基团的一个或多个氧(例如，硫代磷酸酯)，或通过进行允许核苷酸发挥其预期功能的其他取代方式，如在例如Eckstein,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年4月10日(2):117-21、Rusckowski等.Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年10月10日(5):333-45、Stein,AntisenseNucleic Acid Drug Dev.2001年10月11日(5):317-25、Vorobjev等.Antisense NucleicAcid Drug Dev.2001年4月11日(2):77-85和美国专利号5,684,143中所述。例如，某些上述修饰(例如，磷酸基团修饰)降低了体内或体外包含所示类似物的多核苷酸的水解速率。

术语“体外”具有其本技术领域公认的含义，例如，涉及纯化的试剂或提取物，例如，细胞提取物。术语“体内”还具有其本技术领域公认的含义，例如，涉及活细胞，例如，生物体中的永生化细胞、原代细胞、细胞系和/或细胞。

本文所用术语“互补”和“互补性”用于指通过碱基配对规则相关联的核苷酸序列。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。互补性可以是部分的或完全的。部分互补性发生在当一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则不匹配时。核酸间完全或完整互补性发生在各和每个核酸碱基在碱基配对规则下与另一个碱基匹配时。核酸链间的互补性程度对于核酸链间杂交的效率和强度有显著影响。

术语“杂交”是指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即核酸之间关联的强度)受诸如核酸之间的互补性程度，涉及条件的严谨性，形成的杂交体的T_m和核酸内G：C比例的影响。在其结构中包含互补核酸配对的单个分子是“自交的”。

术语“T_m”指核酸的解链温度。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链的温度。计算核酸T_m的等式是本领域熟知的。如标准参考文献所示，当核酸处于1M Nacl水性溶液中时，通过T_m＝81.5+0.41(％G+C)等式可以简单估计T_m值(参见，例如，Anderson和Young,定量滤膜杂交(Quantitative Filter Hybridization),in Nucleic Acid Hybridization(1985))。其他参考文献包括更复杂的计算，它们将结构以及序列特性考虑到T_m的计算中。

术语“严谨性”指进行核酸杂交的温度，离子强度和存在其他化合物(如有机溶剂)的条件。

当述及核酸杂交时，所用的“低严谨性条件”包括等同于在42℃这样的溶液中结合或杂交的条件，所述溶液由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄(H₂O)和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4with)、0.1％SDS、5x Denhardt试剂(50xDenhardt试剂每500ml含：5gFicoll(400型,法玛西亚公司(Pharmacia))、5g BSA(组分V；西格玛公司(Sigma)))和100□g/ml变性的鲑鱼精DNA组成，然后当使用约500核苷酸长度探针时，在42℃于包括5x SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤。

当述及核酸杂交时，所用的“中严谨性条件”包括等同于在42℃这样的溶液中结合和杂交的条件，所述溶液由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄(H₂O)和1.85g/l EDTA、用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％SDS、5x Denhardt试剂和100□g/ml变性的鲑鱼精组成，然后当使用约500核苷酸长度的探针时，在42℃包括1.0x SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。

当述及核酸杂交时，所用的“高严谨性条件”包括等同于在42℃这样的溶液中结合和杂交的条件，所述溶液由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄(H₂O)和1.85g/l EDTA、用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％SDS、5x Denhardt试剂和100□g/ml变性的鲑鱼精组成，然后当使用约500核苷酸长度的探针时，在42℃包括0.1x SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。

在某些示例性实施方式中，鉴定细胞，然后分离单个细胞或多个细胞。本公开范围内的细胞包括任何类型的细胞，对于其中DNA含量的理解被本领域技术人员认为是有用的。根据本公开的细胞包括任何类型的癌细胞、肝细胞、卵母细胞、胚胎、干细胞、iPS细胞、ES细胞、神经元、红细胞、黑素细胞、星形胶质细、生殖细胞、少突胶质细胞、肾细胞等。根据一个方面，本发明的方法使用来自单个细胞的细胞DNA进行。多个细胞包括约2至约1,000,000个细胞，约2至约10个细胞，约2至约100个细胞，约2至约1,000个细胞，约2至约10,000个细胞，约2至约100,000个细胞，约2个至约10个细胞或约2至约5个细胞。

通过本文所述方法处理的核酸可以是DNA，并且它们可以由任何有用的来源获得，例如人样品。在具体的实施方式中，双链DNA分子被进一步定义为包含基因组，例如从来自人的样品获得的基因组。样品可以是来自人的任何样品，如血液、血清、血浆、脑脊液、脸颊刮擦物、乳头抽吸物、活组织检查、精液(可以称为射精液)、尿液、粪便、毛囊、唾液、汗液、免疫沉淀或物理分离的染色质等。在具体的实施方式中，样品包括单个细胞。

在特定实施方式中，扩增自样品的核酸分子提供诊断或预后信息。例如，由样品制备的核酸分子可提供基因组拷贝数和/或序列信息、等位基因变异信息、癌症诊断、产前诊断、亲子信息、疾病诊断、检测、监测和/或治疗信息、序列信息等。

本文所用“单个细胞”指一个细胞。可用于本文所述方法中的单个细胞可获自感兴趣组织，或活组织检查，血液样本，或细胞培养物。此外，可以获得来自特定器官、组织、肿瘤、赘生物等的细胞并将其用于本文所述的方法中。此外，通常，来自任何群体的细胞都可以用于所述方法中，如原核或真核单细胞生物体的群体，包括细菌或酵母。使用本领域已知的标准方法，可以获得单个细胞悬浮液，包括例如酶促使用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶消化蛋白质，所述蛋白质在组织样品中连接细胞或在培养中释放贴壁细胞，或在样品中机械地分离细胞。可以将单细胞置于任何合适的反应容器中，在其中可以单独处理单个细胞。例如96孔板，从而将各单个细胞置于单个孔中。

用扩操控单个细胞的方法是本领域已知的，并且包括荧光激活细胞分选术(FACS)、流式细胞术(Herzenberg.,PNAS USA 76:1453-55 1979)、显微操纵以及使用半自动细胞选择器(picker)(例如，来自Stoelting有限公司的Quixell^TM细胞转移系统)。例如，可以基于通过显微镜观察可检测的特征(如位置、形态或报告基因表达)单独选择个体细胞。此外，还可以使用梯度离心和流式细胞术的组合来增加分离或分选效率。

一旦鉴定到所需细胞，使用本领域技术人员已知的方法将细胞裂解以释放包括DNA的细胞内容物。细胞内容物被包含在容器内。在本发明的一些方面，细胞内容物(如基因组DNA)可通过裂解细胞从细胞释放。例如，裂解可以通过这样实现，加热细胞，或通过使用洗涤剂或其它化学方法，或通过这些的组合。然而，可以使用本领域已知的任何合适的裂解方法。例如，在存在吐温-20的情况下，于72℃加热细胞2分钟足以将细胞裂解。获自，可以将细胞于65℃水中加热10分钟(Esumi等.,Neurosci Res 60(4):439-51(2008))；或于70℃在补充有0.5％NP-40的PCR缓冲液II(应用生物系统公司(Applied Biosystems))中90秒(Kurimoto等.,Nucleic Acids Res 34(5):e42(2006))；获自裂解可以使用蛋白酶实现，如蛋白酶K，或通过使用离液盐，如异硫氰酸胍(美国公布号2007/0281313)。根据本文所述方法扩增基因组DNA可以直接在细胞裂解物上进行，从而使得可以将反应混合物添加到细胞裂解物。或者，可以使用本领域技术人员已知的方法将细胞裂解物分成两个或更多个体积，如分到两个或更多个容器、管或区域，其中个体积容器、管或区域包含细胞裂解物的一部分。然后，通过本文所述方法或本领域技术人员已知的方法，可以扩增包含在各容器、管或区域中的基因组DNA。

用于本法的核酸还可以包括天然或非天然碱基。就此而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自尿嘧啶，腺嘌呤，胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基。可以包括在核酸中的示例性非天然碱基(不具有天然骨架或类似物结构)包括但不限于，肌苷，黄嘌呤(xathanine)，次黄嘌呤(hypoxathanine)，异胞嘧啶，异鸟嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，2-氨基腺嘌呤，6-甲基腺嘌呤，6-甲基鸟嘌呤，2-丙基鸟嘌呤，2-丙基腺嘌呤，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶，2-硫代胞嘧啶，15-卤代尿嘧啶，15-半胱氨酸，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤，8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤，8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤，8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤，8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤，5-卤代尿嘧啶或胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤，3-脱氮腺嘌呤等。一个特定实施方式可以利用核酸中的异胞嘧啶和异鸟嘌呤以减少非特异性杂交，如美国专利号5,681,702中所述。

本文所用“引物”通常包括这样的天然或合成的寡核苷酸，其与多核苷酸模板形成双链体时能够用作核酸合成的起点(如测序引物)并从其3’末端沿模板延伸以形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列决定。通常，引物通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有这样范围内的长度：3-36个核苷酸、5-24个核苷酸或14-36个核苷酸。本发明范围内的引物还包括正交引物、扩增引物、构建引物等。成对的引物可以侧接于感兴趣的序列或一组感兴趣的序列。引物和探针可以按顺序简并或准简并。本发明范围内的引物结合相连的靶序列。“引物”可以被认为是短多核苷酸，通常具有游离的3'-OH基团，其通过与靶标杂交结合潜在地存在于感兴趣样品中的靶标或模板，并在此后促进与该靶标互补的多核苷酸的聚合。本发明的引物由核苷酸组成，其范围在17-30个核苷酸。在一方面，引物是至少17个核苷酸、又或者至少18个核苷酸、又或者至少19个核苷酸、又或者至少20个核苷酸、又或者至少21个核苷酸、又或者至少22个核苷酸、又或者至少23个核苷酸、又或者至少24个核苷酸、又或者至少25个核苷酸、又或者至少26个核苷酸、又或者至少27个核苷酸、又或者至少28个核苷酸、又或者至少29个核苷酸、又或者至少30个核苷酸、又或者至少50个核苷酸、又或者至少75个核苷酸又或者至少100个核苷酸。

“扩增”或“进行扩增”这样的表达指通过通过其将形成特定多核苷酸的额外或多个拷贝的过程。

术语逆转录酶“PCR”和“RT-PCR”指起始材料是mRNA的一类PCR。使用逆转录酶将起始mRNA酶促转化为互补DNA或“cDNA。”

使用本领域技术人员已知的方法，可以对根据本文所述方法扩增的DNA进行测序和分析。使用本领域已知的多种测序方法可以确定感兴趣的核酸序列的序列，所述方法包括但不限于通过杂交测序(SBH)，通过连接测序(SBL)(Shendure等.(2005)Science 309:1728)，定量增量荧光核苷酸加法测序(QIFNAS)，逐步连接和切割，荧光共振能量转移(FRET)，分子信标，TaqMan报告探针消化，焦磷酸测序，荧光原位测序(FISSEQ)，FISSEQ珠(美国专利号7,425,431)，摇摆测序(PCT/US05/27695)，多重测序(美国序列号12/027,039，提交与2008年2月6日；Porreca等(2007)Nat.Methods 4:931)，聚合菌落(POLONY)测序(美国专利号6,432,360、6,485,944和6,511,803，以及PCT/US05/06425)；纳米网格滚环测序(ROLONY)(美国系列号2008年5月4日提交)、等位基因特异性寡聚体连接试验(例如，寡聚体连接试验(OLA)，使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA，连接的锁式探针，和/或使用连接的环状锁式探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)等。也可以利用高通量测序方法，例如，使用诸如Roche 454、Illumina Solexa、AB-SOLiD、Helicos、Polonator平台等的平台。本领域已知各种基于光的测序技术(Landegren等.(1998)GenomeRes.8:769-76；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1:95-100；以及Shi(2001)Clin.Chem.47:164-172)。

扩增的DNA可以通过任何合适的方法进行测序。具体而言，可以使用高通量筛选方法扩增的DNA进行测序，如应用生物系统公司(Applied Biosystems)的SOLiD测序技术或亿明达公司(Illumina)的基因组分析仪.在本发明的一个方面，可以对扩增的DNA进行鸟枪法测序。读数的数量可以是至少10,000、至少100万、至少1000万、至少1亿或至少10亿。在另一方面，读数的数量可以是10,000-100,000，或者100,000-100万，或者100万-1000万，或者1000万-1亿、或者1亿到10亿。“读数(read)”是通过测序反应获得的连续核酸序列的长度。

“鸟枪法测序”是指用于测序非常大量的DNA(如整个基因组)的方法。在该方法中，首先将待测序的DNA被切成较小的片段，可以对其进行单独测序。然后根据这些片段的重叠序列将这些片段的序列重组为它们的原始顺序，从而产生完整的序列。可以使用多种不同的技术来完成DNA的“切碎”，包括限制酶消化或机械剪切。重叠序列通常由适当编程的计算机对齐。鸟枪法测序cDNA文库的方法和程序在本领域中是公知的。

扩增和测序方法在预测医学领域是有用的，其中诊断试验、预后试验、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。相应地，本发明的一个方面涉及诊断试验，其用于确定基因组DNA以便确定个体是否处于患病症和/或疾病的风险中。这样的试验可用于预后或预测目的，从而因此在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。相应地，在某些示例性实施方式中，提供了使用本文所示一种或多种表达谱方法来诊断和/或预测一种或多种疾病和/或病症的方法。

本文所用术语“生物样品”旨在包括但不限于从对象中分离的组织、细胞、生物液体和分离物，以及对象中存在的组织、细胞和生物液体。

在某些示例性实施方式中，提供了包含本文所述的一种或多种基因组DNA序列的电子设备可读介质。本文所使用“电子设备可读介质”是指用于存储、携带或保持可由电子设备直接读取和访问的数据或信息的任何合适的介质。这样的介质可以包括但不限于磁存储介质、如软盘，硬盘存储介质和磁带；光存储介质，如光盘；电子存储介质，如RAM，ROM，EPROM，EEPROM等；一般硬盘和这些类别的混合物，如磁/光存储介质。介质适用于或被配制成用于以使其上记录有本文描述的一个或多个表达谱。

本文所用术语“电子设备”旨在包括被配置成或适用于存储数据或信息的任何合适的计算或处理设备或其他设备。适合用于本发明的电子设备的示例包括独立计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)互联网、内联网和外联网；电子设备，如个人数字助理(PDA)、蜂窝电话、寻呼机等；和本地和分布式处理系统。

本文所用“记录的”指用于在电子设备可读介质上存储或编码信息的处理。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知用于在已知介质上记录信息的方法来生成包含本文描述的一个或多个表达谱的制品。

可使用各种软件程序和格式来将本发明的基因组DNA信息存储在电子设备可读介质上。例如，核酸序列可以用文字处理文本文件来表示，以如WordPerfect和微软Word等市售可得软件对其进行格式化，或以ASCII文件的形式表示，存储在数据库应用程序，诸如DB2、Sybase、Oracle等，以及以其他形式。可使用任何数量的数据处理器结构格式(例如，文本文件或数据库)，从而获得或创建其上记录有本文所述一个或多个表达谱的介质。

应理解，已描述的本发明的实施方式仅用于说明本发明的一些应用和原理。基于本文的教导，本领域技术人员可进行多种修改而不偏离本发明的真正精神与范围。贯穿本发明中所引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容通过引用全文纳入本文并用于所有目的。

以下实施例是本发明的代表。这些实施例并不构成对本发明范围的限制，因为这些和其他等价实施方式将对于本发明、附图和所附权利要求而言是显而易见的。

实施例1

组合转座酶与转座子DNA

Tn5转座酶(艾比森得公司(Epicentre))与等摩尔数的转座子DNA在含有EDTA的缓冲液中混合，并在室温孵育10-60分钟。最终转座体浓度是0.1-10μM。转座子DNA构建体可以是线性或环形形式，其中双链19bp转座酶结合位点位于一个末端，而单链T7启动子位于另一个末端。在线性形式中，单链T7启动子序列形成5'突出末端；而在环状形式中，单链T7启动子序列形成环并连接19bp结合位点的两条链。具有可变长度和序列复杂性的条形码序列可根据需要设计在19bp结合位点和T7启动子序列之间，与位于条形码和T7启动子之间的特定引发区域一起。转座体可以在50％Tris-EDTA和50％甘油溶液中稀释很多倍并保存在-20℃。

实施例2

细胞裂解

选择细胞，将其从培养皿上切下并使用激光解剖显微镜(LMD-6500，莱卡公司(Leica))以如下方式分配到管中。将细胞铺板到膜包覆的培养皿上，并用10倍物镜明场显微镜(莱卡公司)观察。然后使用UV激光切割单独选择的细胞周围的膜，从而使其落入PCR管的帽中。对管进行短暂离心以使细胞下降至管的底部。向PCR管的侧面添加3-5μl的裂解缓冲液(30mM Tris-Cl PH 7.8、2mM EDTA、20mM KCl、0.2％曲通X-100、500μg/ml凯杰公司(Qiagen)蛋白酶)并向下离心。然后，在PCR仪器上使用如下温度方案对捕获的细胞进行热裂解：50℃3小时，75℃30分钟。或者，将单个细胞用口吸管吸移到含有EDTA和蛋白酶(如10-5000μg/mL浓度的QIAGEN蛋白酶(凯杰公司(QIAGEN)))的低盐裂解缓冲液中。孵育条件根据使用的蛋白酶变化。在QIAGEN蛋白酶的情况中，孵育是37-55℃下进行1–4小时。然后将蛋白酶加热至80℃失活，并进一步通过特异性蛋白酶抑制剂使其失活，如4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)或苯基甲磺酰氟(PMSF)(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))。细胞裂解物保存在-80℃。

实施例3

转座

单细胞裂解物和转座体在含有1–100mM Mg²⁺和任选地含有1–100mM Mn²⁺或Co²⁺或Ca²⁺的缓冲液系统中混合。充分混合并在37-55℃下孵育5-240分钟。反应体积根据细胞裂解物体积变化。反应中添加的转座体的量可根据所需片段化尺寸随时调整。通过使用EDTA和任选地EGTA或其它离子螯合剂来螯合Mg²⁺以停止转座反应。残留转座体通过蛋白酶消化失活，如以1-500μg/mL最终浓度的QIAGEN蛋白酶在37-55℃下进行10-60分钟的蛋白酶消化。然后通过加热和/或蛋白酶抑制剂使蛋白酶失活。

实施例4

填充缺口

转座后，向溶液添加Mg²⁺。添加dNTP混合物和DNA聚合酶(如Bst 2.0Warm StartDNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))以填充由转座反应留下的9bp间隔，并一路向下延伸至各片段的两端以制备T7启动子双链并因此活化。缺口填充孵育温度和时间取决于所用特异性DNA聚合酶。反应后，通过加热和/或蛋白酶处理，如QIAGEN蛋白酶，使DNA聚合酶任选地失活。如果使用蛋白酶，其后通过加热和/或蛋白酶抑制剂使其失活。

实施例5

体外转录线性扩增

体外转录试验通过将体外转录试验组分添加至缺口填充混合物来组装，所述缺口填充混合物包括T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司或艾比森得公司)、NTP混合物和含有Mg²⁺和DTT的T7转录缓冲液。可以任选地添加RNA酶抑制剂，诸如Superase(生命技术公司(Life Technologies))的，以及任选地，无机焦磷酸酶(新英格兰生物实验室公司)。T7体外转录线性扩增反应可以在37℃以20uL-200uL的体积进行1小时至长达16小时。

实施例6

逆转录和第二链合成

转录后，对RNA进行柱纯化(Zymo研发公司(Zymo Research)或凯杰公司)。任选地，DNA酶I(新英格兰生物实验室公司)处理可以作为额外的纯化步骤进行。逆转录通过诸如SuperScript IV(生命科技公司)的逆转录酶在相应缓冲系统存在的情况下进行。通过RNA酶消化，如RNA酶H、RNA酶If和/或RNA酶A(RNA酶来自新英格兰生物实验室公司和赛默科学公司(Thermo Scientific))去除RNA后，通过DNA聚合酶进行第二链合成，如Bst 2.0DNA聚合酶、KAPA DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶等(新英格兰生物实验室公司或KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))。使用特定的引物来启动第二链合成，其可以是单链DNA或RNA。然后，对第二链合成后的双链DNA进行柱纯化(Zymo研发公司或凯杰公司)。纯化的双链DNA是来自单个细胞或其他来源的基因组DNA的线性扩增产物。然后可对DNA进行用于质量控制的各种分析方法，包括DNA BioAnalyzer和定量PCR分析。然后，DNA可供于测序文库制备。文库制备期间，任选地，可以跳过超声、片段化和/或选择步骤。

实施例7

DNA片段大小分析

根据一个方面，Tn5转座体制备和转座反应条件可以变化以产生不同的DNA片段大小。如图5所示，Tn5转座效率和插入密度可以在大范围内任意调整。对单个细胞基因组扩增，可以容易地获得平均约300bp的转座后DNA片段大小。根据图5，x轴是DNA片段大小，y轴是小于给定大小DNA片段的累积百分比。下图是上图x轴的放大，显示了小片段大小区域更精细的细节。转座效率和插入密度可以在高效率和低效率条件之间调整。在高转座效率的条件下，平均DNA片段大小为约300bp，其中>90％的DNA片段<1kb，这对于IVT扩增和测序文库制备是理想的分布。

实施例8

DNA片段大小分析

如本文所述扩增单细胞基因组DNA后，通过DNA BioAnalyzer探测产物大小分布，其结果示于图6。x轴是片段大小，y轴是以任意单位的荧光强度反映的相对量。图像两侧的两个尖峰分别是35bp和10380bp的两个掺入的DNA片段。大部分DNA片段的大小为几百bp，这表明单个细胞gDNA模板上有效的转座反应，随后进行线性IVT扩增。

为了更好地解读片段大小分布，基于DNA BioAnalyzer图像绘制了图7所示的累积图。x轴是DNA片段大小，y轴是小于给定大小DNA片段的累积百分比。超过80％的DNA片段小于1.2kb，超过95％的DNA片段小于2kb。来自人类基因组的8个随机挑选的基因组基因座的定量PCR结果显示出，相较于大量基因组DNA样品，这8个基因座均或多或少地具有等同的表现度，表明使用本文所述的方法进行了相对均匀的扩增。

实施例9

单个细胞SNV检测

使用由本文所述方法生成的扩增DNA可以分析单个细胞中的单核甘酸变异(SNV)。当特定SNV最初出现在单个细胞时，其无法通过批量测序在细胞群中检测。这强调了对于单个细胞SNV的需要。藉由指数扩增，早期扩增轮中产生的错误在后续轮中进一步复制，并因此在如图8所示的测序之前在最终的扩增子库中占优势。这些扩增错误将覆盖原始单个细胞基因组DNA样品中真正的SNV信号。藉由图8左侧所示的PCR方法，在早期扩增轮中的错误“A＝>T”在后续轮中进一步扩增，在最终大量群体中占优势并导致单个细胞SNV判定中的假阳性。

藉由本文所述的线性扩增方法，每个扩增子由原始基因组DNA模板直接拷贝，并且错误仅在特定扩增子中出现一次，并不进一步扩增。藉由图8右侧所示的体外转录方法，各扩增子直接拷贝自原始DNA模板，并且扩增过程中产生的错误随机位于所有位置。因此，在进行测序前的最终大量样品中，不会有扩增错误主导如图8所示的特定基因座，并且相较于指数扩增(如用PCR扩增)，将以较高置信水平读出原始DNA模板的真实序列，从而实现准确的单个细胞SNV检测。通过筛选出随机错误并且仅关注各基因座中的主导碱基对，原始单个细胞DNA模板被如实地扩增并测序，这实现了以高置信水平进行单个细胞SNV检测。

实施例10

高分辨率检测单个细胞CNV

拷贝数变异(“CNV”)是基因区段的插入、缺失或增殖，其大小可以从千碱基到整个染色体变化。经常在几乎所有类别的人肿瘤中观察到它们。来源于单个细胞，CNV产生对于肿瘤发育和进展十分重要的遗传变异。本文所述方法允许在用转座子DNA中设计的独特条形码扩增之前对各基因组DNA片段进行标记，如图9所示。在对所有基因组DNA片段扩增和测序之后，简单地通过对与相同序列模式相关联的不同条形码的数量进行计数，即可对单个细胞CNV进行判定并进行数字计数，其分辨率与转座密度(约1kb)相当。该单个细胞CNV检测的分辨率远高于当前标准，当前标准是0.5-1Mb，并且基本上受到单个细胞扩增噪声的限制。

实施例11

单个细胞SV检测和基因组从头组装

本文所述方法减少或消除扩增期间的嵌合体形成，允许较容易地判定单个细胞结构变异(“SV”)。根据一个方面，用位于两端的两个相同的条形码制备转座体。这允许在没有参照基因组的协助下，通过将各片段两侧的条形码匹配来从头组装单个细胞基因组，如图10所示。转座、扩增和DNA测序后，片段通过将各片段两端的条形码匹配来容易地相互组装，这使得从头合成无需参照基因组的协助。这不仅能够从头组装未知基因组，而且还极大地促进了在当前人参考基因组中充满重复序列的缺口的映射和组装。

实施例12

扩增的单个细胞基因组DNA的测序结果

本文所示方法被用于在采集自正常人皮肤纤维细胞系(BJ细胞系)中扩增基因组DNA。这样采集单个系统，通过将其用吸口管吸移到包含EDTA和QIAGEN蛋白酶的细胞裂解缓冲液中。单个细胞裂解反应在55℃孵育3小时，随后进行75℃蛋白酶热失活。

然后，将单个细胞裂解物与Tn5转座体在含有10mM Mg²⁺的缓冲液系统中混合，并在55℃孵育15分钟。然后加入dNTP混合物和Bst 2.0热启动DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)以填充转座反应期间在各片段两端生成的9bp缺口，并进一步向下游延伸以在各片段两端形成双链T7启动子。反应后，Bst 2.0热启动DNA聚合酶在80℃热失活20分钟。然后，体外转录试验通过向混合物添加必要组分而进行组装，所述必要组分包括T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)，NTP混合物，和含有Mg²⁺、DTT和Superase抑制剂(生命科技公司)的T7转录缓冲液。T7体外转录试验在37℃下进行16小时。

RNA经柱纯化(Zymo研发公司)并由Superscript IV(生命科技公司)逆转录。在通过RNA酶H和RNA酶If(新英格兰生物实验室公司)去除RNA后，通过KAPA DNA聚合酶(KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))使用特定单链DNA引物进行第二链合成。最终双链DNA是来自单个细胞中的原始基因组DNA的线性扩增产物。使用针对亿明达(Illumina)的NEBNextUltra DNA文库制备试剂盒(新英格兰生物实验室公司)制备具有300bp平均片段大小的DNA文库，并通过亿明达HiSeq 2500测序仪进行成对末端测序。

如图11所示，以1Mb的点大小绘制所有22个常染色体和X染色体的拷贝数变异(CNV)图谱。扁平的CNV模式证明了单细胞基因组DNA非常好的扩增均一性，能够进行许多依赖于平坦扩增以及准确检测整个基因组中CNV模式的单个细胞应用。

测序运行的参数总结在图12中。测序数据表明测序深度具有高覆盖，高准确度(由低假阳性率表明)以及低嵌合率。单个细胞基因组扩增期间高准确度是单核苷酸变异(SNV)检测的关键必要要求，并且低嵌合率是结构变异(SV)检测的关键必要条件，两者对于许多基于单个细胞基因组学的应用非常重要。

实施例13

分离技术

扩增后，出于分析的目的或更具体地用于确定是否发生特异性扩增的目的，人们可能希望将几种不同长度的扩增产物彼此分离，与模板分离，和与过量的引物分离。

在一个实施方式中，使用标准方法(Sambrook等.,《分子克隆：实验手册("Molecular Cloning,"A Laboratory Manual)》,第二版.,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),纽约,13.7-13.9:1989)通过琼脂糖、琼脂糖丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。凝胶电泳是本领域众所周知的。

或者，可以采用色谱技术来实现分离。本公开可以使用许多种色谱法：吸附、分配、离子交换和分子筛，以及使用它们的许多专门技术，包括柱、纸、薄层和气相色谱(Freifelder,《物理生物化学应用于生物化学和分子生物学(Physical BiochemstryApplications to Biochemistry and Molecular Biology)》,第二版.WHF公司,纽约州,纽约.,1982)。又或者，例如，分别用包括抗生物素蛋白或抗体的珠捕获用生物素或抗原标记的核酸产物。

微流体技术包括在诸如微毛细管的平台上分离，包括例如由ACLARA BioSciences有限公司设计的那些或由Caliper科技有限公司(Caliper Technologies Inc.)的LabChip.TM.。这些微流体平台只需要纳升体积的样品，不同于其他分离技术所需的微升体积。使用微流体装置已经实现了将遗传分析中涉及的一些过程小型化。例如，Northrup和White的公布的PCT申请号94/05414报道了整合的micro-PCR.TM.装置，用于收集和扩增来自样品的核酸，其通过引用纳入本文。美国专利号5,304,487、5,296,375和5,856,174描述了将核酸分析涉及的各种处理和分析操作纳入的设备和方法，并且通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，人们可能希望提供用于分析扩增的DNA的其它或替代方法。在这些实施方式中，考虑了将微毛细管阵列用于分析。微毛细管阵列电泳通常涉及使用可能填充或不填充特定分离介质的细毛细管或通道。样品经由毛细管的电泳为样品提供了基于尺寸的分离概况。毛细管阵列电泳通常为基于大小的测序(PCR.TM.产品分析)和限制性片段大小提供了一种快速方法。这些些毛细管的高表面积与体积比允许在毛细管上施加更高的电场，而不会导致毛细管上明显的热变化，进而允许更快速的分离。此外，当与共聚焦成像方法结合时，这些方法提供了在埃摩尔(attomole)范围内的灵敏度，这与放射性测序方法的灵敏度相当。微制造包括微毛细管电泳装置的微流体装置已经在例如Jacobson等,Anal Chem,66:1107-1113,1994；Effenhauser等.,Anal Chem,66:2949-2953,1994；Harrison等.,Science,261:895-897,1993；Effenhauser等.,Anal Chem,65:2637-2642,1993；Manz等.,J.Chromatogr 593:253-258,1992；和美国专利号5,904,824中详细讨论，其通过引用纳入本文。通常，这些方法包括在二氧化硅、硅或其他晶体基片或芯片上光刻蚀刻微米级通道，并且可以容易地适用于本公开。

Tsuda等.(Anal Chem,62:2149-2152,1990)描述了矩形毛细管，其是圆柱形毛细玻璃管的替代物。这些系统的一些优点是其高效率的散热，这是由于其高宽比大，以及，因此所得，它们的高表面体积比和它们对光学柱上检测模式的高检测灵敏度。这些平坦的分离通道具有进行二维分离的能力，其中一个锂被施加在分离通道上，并且通过使用多通道阵列检测器检测样品区。

在许多毛细管电泳方法中，用适当的分离/筛分基质填充毛细管，例如熔融硅石毛细管或蚀刻的、机械加工的或压制成平面基片的通道。通常，本领域已知的各种筛分基质可以用于微毛细管阵列中。这种基质的示例包括，例如，羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖等。通常，选择特定的凝胶基质、跑动缓冲液和跑动条件以是特定应用的分离特性最大化，例如，核酸片段的大小、所需的分辨率以及天然或未变性的核酸分子的存在。例如，运行缓冲液可以包括变性剂、离液剂(如尿素)，以使样品中的核酸变性。

质谱通过在真空中电离分子并通过挥发使其“飞行(fly)”提供了“称量”单个分子的方法。在电场和磁场组合的影响下，离子遵循轨道取决于它们各自的质量(m)和电荷(z)。对于低分子量分子，质谱已成为常规物理库的一部分，用于通过测定亲本分子离子的质量来分析和表征有机分子。此外，通过将该亲本分子离子与其他粒子(例如，氩原子)碰撞，该分子离子通过所谓的碰撞诱导解离(CID)破碎形成二次离子。该破碎模式/途径常允许推导详细的结构信息。质谱方法在本领域中的其它应用总结在如下文献中：《酶学方法(Methodsin Enzymology)》193卷：《质谱(Mass Spectrometry)》(编辑：J.A.McCloskey),1990,学术出版社,纽约。

由于质谱在这些方法所具有的明显分析优势，人们对使用质谱法进行核酸结构分析有相当大的兴趣，所述明显分析优势包括其提供高检测灵敏度，质量测量的准确度，通过与MS/MS配置结合的CID的详细结构信息和速度，以及在线数据传输到计算机。总结来领域的综上包括(Schram,Methods Biochem Anal,34:203-287,1990)和(Crain,MassSpectrometry Reviews,9:505-554,1990)，其通过引用纳入本文。将质谱应用于核酸的最大障碍是这些极性非常强的生物聚合物难以挥发。因此，通过测定亲本分子离子的质量，“测序”被限于低分子量合成的寡核苷酸，并且由此确认已知序列，或者经由MS/MS构造的CID利用快速原子轰击(FAB质谱)或等离子体解吸(PD质谱)方法(特别是对于离子化和挥发)通过二级离子(碎片离子)的生成确认已知序列。作为一个示例，已经描述了将FAB用于分析化学合成寡聚脱氧核苷酸的受保护二的聚体嵌段(Koster等.,BiomedicalEnvironmental Mass Spectrometry 14:111-116,1987)。

两种离子化/解吸技术是电喷雾/离子喷雾(ES)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。ES质谱由Fenn等,J.Phys.Chem.88；4451-59,1984介绍；PCT申请号WO 90/14148及其应用在文献综述中总结，例如，Smith等.,Anal Chem 62:882-89,1990，和Ardrey,电子喷雾质谱(Electrospray Mass Spectrometry),Spectroscopy Europe,4:10-18,1992。四极杆质量分析仪是最常用的。由于存在可用于质量计算的多个离子峰，所以飞摩尔量样品中分子量的确定非常精确。

相反，当使用飞行时间(TOF)配置作为质量分析仪时，MALDI质谱法可以特别具有吸引力。MALDI-TOF质谱法由Hillenkamp等.,生物质谱法(Biological MassSpectrometry)Burlingame和McCloskey编,爱思唯尔科学出版社,阿姆斯特丹,49-60页,1990介绍。由于在大多数情况下，该技术不会产生多个分子离子峰，原则上，相较于ES质谱法，质谱看起来更简单。高达410,000道尔顿分子量的DNA分子可以被解吸并挥发(Williams等.,Science,246:1585-87,1989)。最近，在该技术中使用红外激光(IR)(与UV激光相反)已显示为较大的核酸提供质谱，如合成DNA、质粒DNA的限制性酶切片段和上至2180个核苷酸大小的RNA转录物(Berkenkamp等.,Science,281:260-2,1998)。Berkenkamp还描述了如何使用MALDI-TOF IR通过有限的样品纯化分析DNA和RNA样品。

在日本专利号59-131909中描述了一种仪器，其通过电泳、液相色谱或高速凝胶过滤分离检测核酸片段。质谱检测通过在核酸中纳入通常不存在于DNA中的原子实现，如S、Br、I或Ag、Au、Pt、Os、Hg。

用荧光标记标记杂交寡核苷酸探针是本领域熟知的技术，并且是用于促进探针杂交检测的灵敏、非放射性方法。最近开发的检测方法采用荧光能量转移(FET)方法，而不是直接检测荧光强度来检测探针杂交。当一个(受体)的吸收光谱与另一个(供体)的发射光谱重叠并且两种染料非常接近时，FET出现在供体荧光团和受体染料(其可能是或可能不是荧光团)之间。具有这些性质的染料被称为供体/受体染料对或能量转移染料对。供体荧光团的激发态能量通过共振偶极子诱导的偶极相互作用转移至相邻的受体。这导致供体荧光的猝灭。在一些情况中，如果受体也是荧光团，其荧光强度可能会增强。能量转移的效率高度依赖于供体和受体之间的距离，并且预测这些关系的方程式已由Forster,Ann Phys 2:55-75,1948开发。供体和受体染料之间能量转移效率是50％的位置被称为福斯特(Forster)距离(Ro)。其他荧光猝灭机制在本领域中也是已知的，包括例如电荷转移和碰撞猝灭。

能量转移和依靠非常靠近的两种染料相互作用产生猝灭的其他机制对于检测或鉴定核苷酸序列是有吸引力的手段，因为这样的试验可以均相的形式进行。均相试验形式不同于依赖于检测单个荧光标记物荧光的传统的探针杂交试验，因为非均相试验通常需要将杂交的标记与游离的标记分离的额外步骤。非同位素DNA探针技术(Nonisotopic DNAProbe Techniques)(学术出版社有限公司,311-352年,1992)中综述了用于FET杂交试验的几种形式。

还描述了采用能量转移或其他荧光淬灭机制用于检测核酸扩增的均相方法。Higuchi等.(Biotechnology 10:413-417,1992)公开了用于实时检测DNA扩增的方法，其通过监测溴化乙锭结合双链DNA时增加的荧光。该方法的灵敏度有限，因为溴化乙锭的结合不是靶向特异性的，并且也检测到背景扩增产物。Lee等.(Nucleic Acids Res 21:3761-3766,1993)公开了一种实时检测方法，其中在PCR.TM过程中双标记的检测探针以靶向扩增特异性的方式被切割。检测探针在扩增引物的下游杂交，从而使得Taq聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性消化检测探针，是两种荧光染料分离，然后形成能量转移对。当探针被切割时，荧光强度增加。公布的PCT申请WO 96/21144公开了连续荧光试验，其中酶介导的核酸切割导致荧光增加。建议使用荧光能量转移，但仅限于采用通过与靶标杂交淬灭的单一荧光标记的方法。

已经描述了与扩增引物的杂交位点下游的靶序列杂交的信号引物或检测探针用于检测核酸扩增(美国专利号5,547,861)。信号引物以与扩增引物延伸相似的方式通过聚合酶延伸。扩增引物的延伸以靶向扩增依赖性方式替换信号引物的延伸产物，产生可作为靶标扩增指示检测的双链二级扩增产物。可以通过这样的方法检测信号引物生成的二级扩增产物：多种标记物和报告基团、信号引物中被切割产生的特征尺寸的片段的限制性位点，捕获基团和结构特征，如三重螺旋和双链DNA结合蛋白的识别位点。

许多供体/受体染料在本领域中是已知的，并且可以用于本公开中。些包括但不限于：异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明(TALIC)，FITC/德克萨斯红TM.分子探针，N-羟基琥珀酰亚胺1-芘丁酸(PYB)，FITC/曙红异硫氰酸酯(EITC)，N-羟基琥珀酰亚胺基1-芘磺酸盐(PYS)/FITC，FITC/若丹明X，FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)等。特定的供体/受体荧光团对的选择并不重要。对于能量转移猝灭机制，仅需要供体荧光团的发射波长与受体的激发波长重叠，即两种染料之间必须有足够的光谱重叠以允许有效的能量转移、电荷转移或荧光猝灭。P-(二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)是一种非荧光受体染料，其可有效猝灭来自相邻的荧光团的荧光，例如，荧光素或5-(2'-氨基乙基)氨基萘(EDANS)。无论淬灭发生的机理如何，在检测器核酸中产生荧光猝灭的任何染料都适用于本公开的方法。末端和内部标记方法在本领域中都是已知的，并且通常可以用于将供体染料和受体染料连接到检测器核酸中它们各自的位点。

本公开中特别考虑的是通过微阵列和/或基于芯片的DNA技术使用或分析扩增的产物，如(Hacia等.,Nature Genet,14:441-449,1996)和(Shoemaker等.,NatureGenetics,14:450-456,1996)中所述。这些技术涉及用于快速和准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用固定的探针阵列，可以采用芯片技术将靶分子分离为高密度阵列并基于杂交筛选这些分子(Pease等.,Proc Natl Acad Sci USA,91:5022-5026,1994；Fodor等,Nature,364:555-556,1993)。

同样考虑的是使用BioStar的OIA技术对扩增产物进行定量。OIA使用硅晶片的镜面状表面作为基片。薄膜光学涂层和捕获抗体附着在硅晶片上。通过涂层反射的白光显示为金色背景色。这种颜色直到光学分子薄膜的厚度改变才改变。

当将阳性样品应用于晶片时，配体与抗体之间发生结合。当添加基片以完成质量增加时，由于分子薄膜厚度增加产生从金到紫色/蓝色的相应颜色变化。该技术描述于美国专利号5,541,057，其通过引用纳入本文。

使用实时PCR技术可以对扩增的RNA或DNA进行定量(Higuchi等.,Biotechnology10:413-417,1992)。通过确定已经完成相同循环次数并处于其线性范围内的扩增产物的浓度，可以确定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。例如，如果DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNA合成的cDNA，那么可以分别针对组织或细胞确定衍生出靶序列的特定mRNA的相对丰度。扩增产物浓度与相对mRNA丰度之间的这种直接比例仅在扩增反应的线性范围内才是正确的。

曲线平台部分中靶DNA的最终浓度通过反应混合物中试剂的可用性决定，并且不依赖于靶DNA的原始浓度。因此，在RNA或DNA种类的相对丰度可以通过实时PCR确定用于收集RNA或DNA群之前必须满足的第一个条件是，当反应产物处于其曲线线性部分的时候，必须对扩增产物的浓度进行取样。RT-PCR实验成功确定特定mRNA种类的相对丰度所必须满足的第二个条件是，必须将可扩增cDNA的相对浓度标准化至一些单独的标准。实时PCR实验的目标是确定样品中特定RNA或DNA种类的丰度相对于样品中所有RNA或DNA物种的平均丰度。

Luminex技术允许定量固定在颜色编码的微球体上的核酸产物。使用称为报告分子的第二个分子测量生物分子反应的量级。报道分子通过附着于微球上的分子来表示反应的程度。由于微球体和报告分子都是彩色编码的，数字信号处理允许将信号转化为各反应的实时、定量数据。该标准技术述于美国专利号5,736,303和6,057,107，其通过引用纳入本文。

实施例14

鉴定技术

可将扩增产物可视化以确认靶基因序列的扩增。一种典型的可视化方法包括用荧光染料(如溴化乙锭或Vistra绿)对凝胶进行染色并在UV光下观察。或者，如果用放射性或荧光标记的核苷酸整体标记扩增产物，那么可以将扩增产物暴露于X射线胶片或在分离之后将其在适当的刺激光谱下可视化。

在一个实施方案中，使用核酸探针间接实现可视化。扩增产物分离后，将标记的核酸探针与扩增产物接触。探针优选与发色团偶联，但可以被放射性标记。在另一实施方式中，探针与结合伴侣偶联，如抗体或生物素，其中结合对的其它成员包括可检测部分。在其它实施方式中，探针包括荧光染料或标记物。在另外一些实施方式中，探针具有可用于检测分子扩增的质量标签。其它实施方式也考虑使用Taqman.TM和Molecular Beacon.TM.探针。在其它一些实施方式中，可以使用与标准探针组合的固相捕获方法。

纳入DNA扩增产物的标记类型由分析所用的方法决定。当使用毛细管电泳、微流体电泳、HPLC或LC分离时，纳入或插入的荧光染料用于标记和检测扩增产物。动态检测样品，其中荧光由移动经过检测器的标记物质进行定量。如果使用电泳方法、HPLC或LC进行分离，可以通过吸收紫外线来检测产物，这是DNA固有的特性，因此不需要添加标签。如果使用聚丙烯酰胺凝胶或平板凝胶电泳，可用荧光团、发色团或放射性同位素标记，或通过相关的酶促反应标记用于扩增反应的引物。酶促检测涉及酶与引物的结合，例如，通过生物素：抗生物素蛋白相互作用，在凝胶上分离扩增产物之后，然后通过化学反应检测，如用鲁米诺产生的化学发光。荧光信号可以动态监测。用放射性同位素或酶促反应进行检测需要通过凝胶电泳的初步分离，然后在分析之前将DNA分子转移至固体支持物(印迹)。如果产生了印迹，可通过探测、剥离印迹、然后再探测再次对其进行分析。如果使用质谱仪分离扩增产物，则不需要标记物，因为核酸是直接检测的。

可将多种上述分离平台组合以实现基于两种不同属性的分离。例如，一些PCR引物可以与允许亲和力捕获的部分组合，而一些引物保持未修饰。修饰可以包括糖(用于与凝集素柱结合)、疏水基团(用于结合反相柱)、生物素(用于与链霉亲和素柱结合)或抗原(用于与抗体柱结合)。样品在亲和力层析柱上运行。收集流出部分，并洗脱结合部分(通过化学切割、盐洗脱等)。然后根据诸如质量的性质对各样品进行进一步分级以鉴定每个组分。

实施例15

试剂盒

公开的扩增方法所需的材料和试剂可在试剂盒中组装在一起。本公开的试剂盒通常将至少包括与所需引物组进行所要求保护的方法所需的转座体(由转座酶和转座子DNA组成)、RNA聚合酶、核苷酸、逆转录酶和DNA聚合酶。在优选实施方式中，试剂盒还将包括用于由DNA样品扩增DNA的说明。示例性的试剂盒是那些适合用于扩增全基因组DNA的试剂盒。在各种情况中，试剂盒将优选具有对各种不同试剂、酶或反应物不同的容器。通常，将各部分在其各自的容器中适当分装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶或试管。也可以是能够将试剂放置并分装在细颈瓶、瓶子和其他容器装置中。试剂盒的单个容器将优选保持密闭状态以用于商业销售。合适的较大容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小管。优选说明书与试剂盒一起提供。

实施例16

产前诊断

根据本公开的某些方面，提供了用于非侵入性产前诊断的方法，其通过从单个胎儿细胞或胎儿细胞组或母体血液中循环的胎儿DNA扩增遗传物质(例如DNA)然后分析该遗传物质。根据某些方面，可以获得胎儿的全部基因组或基因组的重要部分，并分析例如，胎儿畸型、异常和病症。

根据某些其他方面，提供了用于植入前基因筛选(PGS)和诊断(PGD)的方法。每年美国进行超过100,000次体外受精(IVF)程序，因此需要筛选用于植入的胚胎的技术。当前，可用的PGS方法包括对极体、卵裂球、胚泡等的活检操作，然后通过使用诸如荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链式反应(PCR)的遗传筛选技术来检测特定染色体畸变(21三体等)以及已知将导致严重表型后果的特定遗传变异。在IVF中，胚胎在植入前生长达到2-12个细胞阶段。根据某些方面，提取来自胚胎的单个细胞或几个细胞，然后根据本文所述的方法扩增诸如DNA的遗传物质，从而可以获得胚胎的整个基因组，并分析例如胎儿畸型、异常和病症。

根据某些方面，分离来自母体血液的有核胎儿细胞。诸如DNA的核酸提取自单个有核胎儿细胞或从多个有核胎儿细胞中提取。胞外胎儿核酸可以从母体血液中获得。参见Lo等.,Nature Reviews Genetics,第8卷,71-77页(2007)，以及Lo等.,Sci.Transl.Med.2,61ra91(2010)，其全部内容通过引用纳入。然后，使用转座酶和RNA聚合酶通过本文所述的方法扩增核酸，以提供例如胎儿的全基因组或特定基因组基因座用于分析。然后鉴定遗传变异，并与先天性病症或已知表型后果相关联。

有核细胞以如下所述获得。母体血液通过常规静脉穿刺或手指刺穿获得。获得约0.1ml-100ml的母体血液。最早在妊娠后约8周可分离有核胎儿细胞(包括胎儿有核红细胞、淋巴细胞、滋养层等)。通过多种不同方法可以分离来自母体循环的有核胎儿细胞，包括：通过散射和表面标记的荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选、显微解剖、细胞大小分离方法(例如，通过微流体装置)、细胞密度分离方法(例如，通过离心)等。

使用蛋白酶辅助的细胞裂解如下由有核胎儿细胞提取诸如DNA的核酸。单个细胞通过3ul裂解缓冲液(30mM Tris-Cl pH 7.8、2mM EDTA、20mM KCl、0.3％曲通X-100、30mMdTT、12.5ug/ml Qiagen蛋白酶)裂解。参见。Bianchi等,分离来自母体血液中有核红细胞的胎儿DNA(Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternalblood),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87卷,3279-3283页,1990年5月，以及Wachtel等.,Clin.Genet.2001:59；74-79(2001)，其各自全部内容通过引用纳入本文。诸如碱裂解或冻融裂解的其他方法也可以用于核酸提取，或使用本文所述或本领域技术人员已知的其他方法。

然后，将单个细胞裂解物与Tn5转座体在含有10mM Mg²⁺的缓冲液系统中混合，并在55℃孵育15分钟。再将DNA片段化后，将dNTP混合物和诸如Bst 2.0Warm Start DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)的DNA聚合酶添加以填充由转座反应留下的9bp间隔，并一路向下延伸至各片段的两端以生成双链T7启动子序列。反应后，Bst 2.0热启动DNA聚合酶可以，任选地，通过80℃加热失活。然后，体外转录试验通过向缺口延伸混合物添加必要组分来进行组装，所述必要组分包括T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)，NTP混合物，和含有Mg²⁺和DTT的T7转录缓冲液。可以任选地添加诸如Superase(生命技术公司)的RNA酶抑制剂。T7体外转录线性扩增反应在37℃以30uL-100uL的体积(可以按需进行变化)进行至多16小时。

体外转录后，对RNA进行柱纯化(Zymo研发公司)逆转录，并通过诸如SuperScriptIV(生命科技公司)的逆转录酶在相应缓冲系统存的情况下进行逆转录。在通过诸如RNA酶H和RNA酶If(新英格兰生物实验室公司)的RNA酶去除RNA后，通过诸如KAPA DNA聚合酶(KAPA生物系统公司)的DNA聚合酶进行第二链合成。使用特定单链DNA引物启动第二链合成，然后对得到的双链DNA进行柱纯化(Zymo研发公司)。纯化的双链DNA是来自最初在单个细胞中的微量基因组DNA的线性扩增产物。

对所得扩增核酸进行的遗传分析可以在整个基因组的规模上，在全基因组的选定但重要的部分上或在已知引起畸型的特定基因组基因座上进行。全基因组分析的实例包括通过下一代测序方法(Illumina，SoliD等)的全基因组测序，基于杂交的全基因组基因分型技术，如单核苷酸多态性(SNP)阵列、比较基因组杂交阵列等。分析整个基因组重要部分的示例包括对诸如外显子组、特定染色体等特定基因座区域的靶向重测序和基因型分析。分析特定基因组基因座的实例包括在成像或测序探针之前将核酸探针与产生的全基因组杂交；以及在进一步对全基因组的特定区域测序或基因分型之前使用PCR或多重PCR来扩增这些全基因组的特定区域。

与上述产前筛选和诊断有关的遗传变异具有广泛的范围，包括但不限于单核苷酸变异(SNV)，大小范围为1-100bp的小型插入和缺失(Indel)，约100bp-100Mbp基因组长度的拷贝数变异(CNV)，1bp-10Mbp范围的序列倒位和重复，10bp-100Mbp范围的杂合性丢失(LOH)，以及整个染色体水平异常，如染色体易位、非整倍性、部分或整个染色体缺失或重复。

“先天性病症或已知的表型后果”的示例包括与上述遗传变异相关联的已知病症，如由血红蛋白-β(HBB)基因的密码子41和42中的4bp缺失引起的β-地中海贫血，以及由染色体21重复引起的唐氏综合征(21三体性)。上文提到的“已知的表型后果”包括未被认定为先天性病症的潜在健康状况或身体状况，如某些疾病(诸如癌症)的潜在风险或倾向性或胎儿性别等。对于特定情况，参见Cheung等.,Nature Genetics,14卷,264-268页(1996)(镰状细胞贫血和地中海贫血)，Belroud,等.,The Lancet,Vol.361,pp.1013-1014(2003)(脊髓性肌萎缩症)。

根据模型其它方面，对一个或多个细胞进行活检，或以其它方式从IVF胚胎分离。诸如DNA的核酸提取自单个细胞或从获自IVF胚胎的多个胎细胞中提取。然后，使用转座酶和RNA聚合酶通过本文所述的方法扩增核酸，以提供例如胚胎的全基因组或特定基因组基因座用于分析。然后鉴定遗传变异，并与先天性病症或已知表型后果相关联。

通过显微操纵器的胚胎穿刺可以将一个或多个细胞从IVF胚胎分离。活检或分离涉及来自胚胎的极体；来自胚胎的滋养外胚层；来自胚胎的分裂球等。受精后发育第0天至第6天获取活检组织。

使用蛋白酶辅助的细胞裂解如下由胚胎细胞提取诸如DNA的核酸。单个细胞通过3ul裂解缓冲液(30mM Tris-Cl pH 7.8、2mM EDTA、20mM KCl、0.3％曲通X-100、30mM dTT、12.5ug/mlQiagen蛋白酶)裂解。诸如碱裂解或冻融裂解的其他方法也可以用于核酸提取，或使用本文所述或本领域技术人员已知的其他方法。

然后，将单个细胞裂解物与Tn5转座体在含有10mM Mg²⁺的缓冲液系统中混合，并在55℃孵育15分钟。再将DNA片段化后，将dNTP混合物和诸如Bst 2.0Warm Start DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)的DNA聚合酶添加以填充由转座反应留下的9bp间隔，并一路向下延伸至各片段的两端以生成双链T7启动子序列。反应后，Bst 2.0热启动DNA聚合酶可以，任选地，通过80℃加热失活。然后，体外转录试验通过向缺口延伸混合物添加必要组分来进行组装，所述必要组分包括T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)，NTP混合物，和含有Mg²⁺和DTT的T7转录缓冲液。可以任选地添加诸如Superase(生命技术公司)的RNA酶抑制剂。T7体外转录线性扩增反应在37℃以30uL-200uL的体积(可以按需进行变化)进行至多16小时。

体外转录后，对RNA进行柱纯化(Zymo研究公司)逆转录，并通过诸如SuperScriptIV(生命科技公司)的逆转录酶在相应缓冲系统存的情况下进行逆转录。在通过诸如RNA酶H和RNA酶If(新英格兰生物实验室公司)的RNA酶去除RNA后，通过诸如KAPA DNA聚合酶(KAPA生物系统公司)的DNA聚合酶进行第二链合成。使用特定单链DNA引物启动第二链合成，然后对得到的双链DNA进行柱纯化(Zymo研发公司)。纯化的双链DNA是来自最初处于单个细胞中的微量基因组DNA的线性扩增产物。

对所得扩增核酸进行的遗传分析可以在整个基因组的规模上，在全基因组的选定但重要的部分上或在已知引起畸型的特定基因组基因座上进行。全基因组分析的实例包括通过下一代测序方法(Illumina，SoliD等)的全基因组测序，基于杂交的全基因组基因分型技术，如单核苷酸多态性(SNP)阵列、比较基因组杂交阵列等。分析整个基因组重要部分的示例包括对诸如外显子组、特定染色体等特定基因座区域的靶向重测序和基因型分析。分析特定基因组基因座的实例包括在成像或测序探针之前将核酸探针与产生的全基因组杂交；以及在进一步对全基因组的特定区域测序或基因分型之前使用PCR或多重PCR来扩增这些全基因组的特定区域。

与上述产前筛选和诊断有关的遗传变异具有广泛的范围，包括但不限于单核苷酸变异(SNV)，大小范围为1-100bp的小插入和缺失(Indel)，约100bp-100Mbp基因组长度的拷贝数变异(CNV)，1bp-10Mbp范围的序列倒位和重复，10bp-100Mbp范围的杂合性丢失(LOH)，以及整个染色体水平异常，如染色体易位、非整倍性、部分或整个染色体缺失或重复，和本领域技术人员已知的其它染色体病症和遗传病症。应该理解，本文所例举病症并不旨在穷尽，而仅是示例性的。由于本文描述的方法旨在分析单个细胞的基因组，所以本文包括可以通过分析细胞的基因组进而鉴定的任何和所有病症作为本公开的示例。

进行产前诊断的“先天性病症或已知的表型后果”的示例包括与上述遗传变异相关联的已知病症，如由血红蛋白-β(HBB)基因的密码子41和42中的4bp缺失引起的β-地中海贫血，以及染色体病症，如由染色体21重复引起的唐氏综合征(21三体性)。上文提到的“已知的表型后果”包括未被认定为先天性病症的潜在健康状况或身体状况，如某些疾病(诸如癌症)的潜在风险或倾向性、胎儿性别。可以使用本文所述方法针对胎儿(产前诊断)或胚胎进行诊断的其它病症包括，囊性纤维化，镰状细胞病，泰-萨二氏病，脆性X综合征，脊髓性肌萎缩，血红蛋白病，α-地中海贫血，X连锁病症(通过X染色体上基因确定的病症)，脊柱裂，无脑畸形，先天性心脏缺陷，肥胖症，糖尿病，癌症，胎儿性别，胎儿RHD，胎儿HLA单倍型，父本衍生突变，染色体非整倍性等。

实施例17

癌症诊断

根据本公开的某些方面，提供了对单个癌细胞、少数癌细胞、多个癌细胞或最少量的癌细胞材料进行全基因组遗传分析的方法。本方法在仅存在或能够获取或分离少量癌细胞(即，少量的)的情况下特别有用。这样的癌细胞的示例包括个体血液中的循环肿瘤细胞(CTC)。在肿瘤细胞与血管相互作用以及转移的过程中，诸如肿瘤细胞的癌细胞将侵入血流。当前使用循环肿瘤的诊断方法依赖于对富集的CTC细胞进行计数。由于血液中的CTC细胞的数量非常少(稀有到在109个血细胞中只有1个细胞)以及CTC的异质性，富集效率因情况而异。CTC的计数不太可靠，并且该方法当前正在临床试验中进行评估。CellSearch是FDA唯一批准的CTC富集和计数设备。需要约1百万个细胞的常规基因诊断可能不适用于CTC。

循环肿瘤细胞提供了衍生自原发或转位点的一系列细胞，允许检测和分析癌细胞，进而提供早期诊断。本文所述方法允许将对通常数量上很少或极少的来自循环肿瘤细胞的DNA的分析作为诊断患有癌症个体的方法，而无需诸如通过手术方式获得肿瘤组织样品的侵入技术。本文所述方法允许将通常数量上很少或极少的来自循环肿瘤细胞的DNA的分析作为在个体中早期诊断癌症的方法，所述个体中癌症可能处于非常早期，但癌细胞仍然会在某个时刻进入个体的血流中。本文所述方法提供了可靠的全基因组扩增，其可以均匀扩增单细胞的全基因组，以及约10-100个细胞，而不会引入显著的扩增偏移和等位基因丢失。因为本文所述方法可以扩增单个细胞的全基因组或近乎全基因组，所以本文所述方法对数量相对较少但仍可提供重要的癌症早期检测的循环肿瘤细胞特别有用。

根据一个方面，本文描所述使用转座酶和RNA聚合酶的方法能够对单个癌细胞(如肿瘤细胞，如循环肿瘤细胞)进行全基因组扩增以用于进一步分析。根据一个方面，循环肿瘤细胞可从患者血流富集。肿瘤细胞也可通过诸如细针抽吸(FNA)的非开口手术从原发位点或转移获得，以提供用于最小样本质量诊断(MSMD)的样本。以此方法，获得一个或多个肿瘤细胞可被认为是非入侵的。尽管本文所述方法特别适用于仅有可用癌细胞量极小的情况，但本领域技术人员容易理解是，该方法也适用于存在大量可用癌细胞但需要单个细胞基因分析的情况。

根据一个方面，提供了用于分析来自癌细胞的DNA的方法。术语“癌症”指各种类型的恶性肿瘤，其中大多数可侵入周围组织，并且可能转移至不同部位(参见，例如，《PDR医学字典(PDR Medical Dictionary)》第1版(1995))。术语“赘生物(neoplasm)”和“肿瘤”指这样的异常组织，其通过细胞增殖比正常生长更迅速并且在去除了引发增殖的刺激之后继续生长，引用如上。这样的异常组织显示部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，所述正常组织可能是良性(即良性肿瘤)或恶性(即恶性肿瘤)的。

癌症的一般类别的示例包括但不限于，癌组织(即衍生自上皮细胞的恶性肿瘤，例如，常见形式的乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌)，肉瘤(即衍生自结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤)，淋巴瘤(即衍生自造血细胞的恶性肿瘤)，白血病(即衍生自造血细胞的恶性肿瘤)，生殖细胞肿瘤(即衍生自全能细胞的肿瘤；最常见于成年人的睾丸或卵巢中；在胎儿、婴儿和幼儿中，最常见于身体中线，尤其是在尾骨尖处)，未成熟肿瘤(即类似于未成熟或胚胎组织的典型恶性肿瘤)等。本领域技术人员应当理解，该列表仅是示例性的，并不是穷尽的，因为本领域技术人员能够基于本文公开容易地鉴定其它癌症。

旨在被本发明包括的特定赘生物的示例包括但不限于，急性成淋巴细胞白血病；髓系白血病，急性粒细胞白血病，儿童期；肾上腺皮质癌；与艾滋病有关的癌症；艾滋病相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤(如小脑、大脑)；非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌，骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑肿瘤(例如，脑干胶质瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，中枢神经系统胚胎性肿瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，颅咽管瘤，成神经细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，髓质上皮瘤，中度分化的松果体实质细胞肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤和/或松果体母细胞瘤，视觉通路和/或下丘脑神经胶质瘤，脑和脊髓肿瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌肿瘤(例如，胃肠道)；原发性不明恶性肿瘤；中枢神经系统(例如，非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，胚胎性肿瘤(例如，淋巴瘤，原发性)；小脑星形细胞瘤；大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；脊索瘤；慢性淋巴细胞白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；胚胎性肿瘤，中枢神经系统；子宫内膜癌；成神经细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；尤因家族肿瘤；颅外生殖细胞肿瘤；外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌症(例如，眼内黑素瘤，成视网膜细胞瘤)；胆囊癌；胃癌；胃肠肿瘤(例如，类癌瘤，间质瘤(基质细胞瘤)，基质细胞瘤)；生殖细胞瘤(例如，颅外，性腺外，卵巢)；滋养细胞肿瘤；胶质瘤(例如，脑干，脑星形细胞瘤)；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波西肉瘤；肾癌；大细胞肿瘤；喉癌(例如，急性淋巴细胞、性急性骨髓瘤)；白血病(例如，急性骨髓，慢性淋巴细胞，慢性髓细胞，毛细胞)；唇和/或口腔癌；肝癌；肺癌(例如，非小细胞，小细胞)；淋巴瘤(例如，AIDS相关的，伯基利(Burkitt)，皮肤T细胞，霍奇金，非霍奇金，原发性中枢神经系统)；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦病；骨和/或骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；默克尔细胞癌；间皮瘤；转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样霉菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病；骨髓性白血病(例如，慢性，急性，多发性)；骨髓增生性病症，慢性；鼻腔和/或鼻旁窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌；口腔癌，口咽癌；骨肉瘤和/或骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌(例如，卵巢上皮癌症，卵巢生殖细胞瘤，卵巢低度恶性潜能肿瘤)；胰腺癌(例如，胰岛细胞瘤)；乳头状瘤；鼻旁窦和/或鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；中等分化的松果体实质肿瘤；松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞癌；肾，骨盆和/或输尿管，移行细胞癌症；涉及15号染色体上的坚果基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤(例如，尤因肿瘤家族，卡波西，软组织，子宫)；塞萨里综合征；皮肤癌(例如，非黑素瘤，黑素瘤，默克尔细胞)；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；伴隐匿性原发性鳞状颈部癌，转移性；胃癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和/或胸腺癌；甲状腺癌；肾、骨盆和/或输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；未知原发性位点癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路和/或下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；维尔姆斯肿瘤等。有关综述，参见国家癌症研究所的万维网站(cancer.gov/cancertopics/alphalist)。本领域技术人员应当理解，该列表仅是示例性的，并不是穷尽的，因为本领域技术人员能够基于本文公开容易地鉴定其它癌症和/或赘生物。

根据某些方面，分离来自个体血液的循环肿瘤细胞。由一个或多个循环肿瘤细胞提取核酸。然后，通过本文所述的方法扩增核酸，以提供例如细胞的全基因组或特定基因组基因座用于分析。然后针对与癌症中基因病症相关联的基因变异分析基因组。

循环肿瘤细胞以如下所述获得。环状血液通过常规静脉穿刺获得。获得约10ml血液。循环肿瘤细胞可以通过多种不同方法分离，所述方法包括：商用CellSearch系统(参见Clin.Cancer Res.2004,10,6897–6904和Clin.Cancer Res.2010,16,2634–2645，各自通过引用将其全部内容纳入本文)，基于尺寸的过滤装置(参见Am.J.Pathol.2000,156,57–63和Cancer Res.2010,70,6420–6428，各自通过引用将其全部内容纳入本文)，使用显微光学阵列扫描技术的大视场成像(wild-field imaging)(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004,101,10501–10504，通过引用将其全部内容纳入本文)，定制的微流体装置中基于抗体的表面捕获(参见Lab Chip 2010,10,837–842,Nature 2007,450,1235–1239、Anal.Chem.2011,83,2301–2309、Angew.Chem.2011,123,3140–3144和Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3084–3088，各自通过引用将其全部内容纳入本文)。

根据某些其它方面，通过细针抽吸获得一个或多个细胞以从团块或组织块中分离细胞。诸如DNA的核酸提取自单个细胞或从获自细针抽吸的多个胎细胞中提取。然后，使用转座酶和RNA聚合酶通过本文所述的方法扩增核酸，以提供例如胚胎的全基因组或特定基因组基因座用于分析。然后鉴定遗传变异，并与先天性病症或已知表型后果相关联。

使用细针抽吸如下活检并分离细胞。待活检区域上方的皮肤用消毒液擦拭并用无菌手术巾覆盖定位用于活检的团块后，使用X射线或触诊，将一根直径非常细(22或25号)的特殊针插入团块。将针置于团块后，用注射器抽吸细胞并将其转移到单管中。保存细胞并通过标志物标记。用口腔移液或激光解剖在荧光显微镜下分离单个癌细胞。

使用蛋白酶辅助的细胞裂解如下由CTC细胞或通过细针吸取获得的细胞提取诸如DNA的核酸。单个细胞通过3ul裂解缓冲液(30mM Tris-Cl pH 7.8、2mM EDTA、20mM KCl、0.3％曲通X-100、30mM dTT、12.5ug/ml Qiagen蛋白酶)裂解。诸如碱裂解或冻融裂解的其他方法也可以用于核酸提取，或使用本文所述或本领域技术人员已知的其他方法。

然后，将单个细胞裂解物与Tn5转座体在含有10mM Mg²⁺的缓冲液系统中混合，并在55℃孵育15分钟。再将DNA片段化后，将dNTP混合物和诸如Bst 2.0Warm Start DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)的DNA聚合酶添加以填充由转座反应留下的9bp间隔，并一路向下延伸至各片段的两端以生成双链T7启动子序列。反应后，Bst 2.0热启动DNA聚合酶可以，任选地，通过80℃加热失活。然后，体外转录试验通过向缺口延伸混合物添加必要组分以进行组装，所述必要组分包括T7RNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)，NTP混合物，和含有Mg²⁺和DTT的T7转录缓冲液。可以任选地添加诸如Superase(生命技术公司)的RNA酶抑制剂。T7体外转录线性扩增反应在37℃以30uL-200uL的体积(可以如需要进行变化)进行上至16小时。

体外转录后，对RNA进行柱纯化(Zymo研究公司)逆转录，并通过诸如SuperScriptIV(生命科技公司)的逆转录酶在相应缓冲系统存的情况下进行逆转录。在通过诸如RNA酶H和RNA酶If(新英格兰生物实验室公司)的RNA酶去除RNA后，通过诸如KAPA DNA聚合酶(KAPA生物系统公司)的DNA聚合酶进行第二链合成。使用特定单链DNA引物启动第二链合成，然后对得到的双链DNA进行柱纯化(Zymo研发公司)。纯化的双链DNA是来自最初在单个细胞中的微量基因组DNA的线性扩增产物。

对所得扩增核酸进行的遗传分析可以在整个基因组的规模上，在全基因组的选定但重要的部分上或在已知引起畸型的特定基因组基因座上进行。全基因组分析的实例包括通过下一代测序方法(Illumina，SoliD等)的全基因组测序，基于杂交的全基因组基因分型技术，如单核苷酸多态性(SNP)阵列、比较基因组杂交阵列等。分析整个基因组重要部分的示例包括对诸如外显子组、特定染色体等特定基因座区域的靶向重测序和基因型分析。分析特定基因组基因座的实例包括在成像或测序探针之前将核酸探针与产生的全基因组扩增产物杂交；以及在进一步对全基因组的特定区域测序或基因分型之前使用PCR或多重PCR来扩增这些全基因组的特定区域。

与上述癌症诊断有关的遗传变异具有广泛的范围，包括但不限于单核苷酸变异(SNV)，大小范围为1-100bp的小插入和缺失(Indel)，约100bp-100Mbp基因组长度的拷贝数变异(CNV)，1bp-10Mbp范围的序列倒位和重复，10bp-100Mbp范围的杂合性丢失(LOH)，以及整个染色体水平异常，如染色体易位、非整倍性、部分或整个染色体缺失或重复。

现有的癌症基因组变异的实例在公开可用的数据库中提供，包括来自NIH的癌症基因组解剖学项目(Cancer Genome Anatomy Project,CGAP)和癌症体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer,COSMIC)。

Claims (49)

1.一种非诊断性的核酸扩增的方法，其包括：

使双链核酸和与转座子DNA结合的转座酶接触，其中所述转座子DNA包括转座酶结合位点和RNA聚合酶启动子序列，其中所述转座酶/转座子DNA复合物结合沿所述双链核酸分布的靶位置并且将所述双链核酸切割成多个双链片段，各双链片段具有结合于所述双链片段各5'端的转座子DNA，

沿着所述转座子DNA延伸所述双链片段以制备在各末端具有双链RNA聚合酶启动子序列的双链延伸产物，

使所述双链延伸产物与RNA聚合酶接触以制备各双链延伸产物的多个RNA转录物，

将所述RNA转录物逆转录成单链拷贝DNA，

形成针对所述单链拷贝DNA的互补链，以形成对应各双链片段的多个双链DNA扩增子，其中所述双链DNA扩增子由原始双链片段线性扩增。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸是分离的双链核酸，并且所述转座酶是分离的转座酶。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸是基因组DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸是获自单个细胞的基因组DNA。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸是单个细胞的全基因组。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述转座酶是Tn5转座酶。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA还包括引发位点。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列和引发位点，并且具有位于所述转座子DNA的5'末端的RNA聚合酶启动子序列。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和包括强T7启动子序列的核酸环结构。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和核酸环结构，所述核酸环结构包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列。

14.如权利要求1所述的方法，其中，在延伸所述双链片段之前，将结合的转座酶从所述双链片段去除。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述转座酶是各自与转座子DNA复合的Tn5转座酶，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包含条形码区域、引发位点和强T7启动子序列，其中所述Tn5转座酶/转座子DNA复合物结合沿双链基因组DNA分布的靶位置，将所述双链基因组DNA割成多个双链片段。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA聚合酶启动子序列是T7启动子序列，并且所述双链片段沿着所述转座子DNA延伸，以制备在各末端具有T7启动子的双链延伸产物，并且使所述双链延伸产物与T7 RNA聚合酶接触以制备所述双链延伸产物的RNA转录物。

17.如权利要求1所述的方法，其还包括对所述双链DNA扩增子测序的步骤。

18.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测单核苷酸变异的步骤。

19.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测拷贝数变异的步骤。

20.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测结构变异的步骤。

21.单细胞全基因组扩增和测序的非诊断性方法，其包括：

使来自单个细胞的双链基因组DNA与Tn5转座酶接触，所述Tn5转座酶各自与转座子DNA复合，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包括条形码区域、引发位点和强T7启动子序列，其中所述Tn5转座酶/转座子DNA复合物结合沿所述双链基因组DNA分布的靶位置，将所述双链基因组DNA切割成多个双链片段，各双链片段具有通过Tnp结合位点连接上链的第一复合物以及通过Tnp结合位点连接下链的第二复合物，

从所述复合物去除Tn5转座酶，

沿着所述转座子DNA延伸所述双链片段以制备在各末端具有T7启动子的双链延伸产物，

使所述双链延伸产物与T7 RNA聚合酶接触以制备所述双链延伸产物的多个RNA转录物，

将所述RNA转录物逆转录成单链DNA，

形成针对所述单链DNA的互补链，以形成包括基因组DNA序列并且在所述上链和下链的两端均具有条形码的双链DNA。

22.一种非诊断性的核酸扩增方法，其包括：

使双链核酸和与转座子DNA结合的转座酶接触，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和核酸环结构，所述核酸环结构包括条形码区域和引发位点，其中所述转座酶/转座子DNA复合物结合沿所述双链核酸分布的靶位置并且将所述双链核酸切割成多个双链片段，各双链片段具有结合于所述双链片段各5'端的转座子DNA，

沿着所述转座子DNA延伸所述双链片段以制备在各末端具有双链RNA聚合酶启动子序列的双链延伸产物，

使所述双链延伸产物与RNA聚合酶接触以制备各双链延伸产物的多个RNA转录物，

将所述RNA转录物逆转录成单链拷贝DNA，

形成针对所述单链拷贝DNA的互补链，以形成对应各双链片段的多个双链DNA扩增子，其中所述双链DNA扩增子由原始双链片段线性扩增。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述双链核酸是分离的双链核酸，并且所述转座酶是分离的转座酶。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述双链核酸是基因组DNA。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述双链核酸是获自单个细胞的基因组DNA。

26.如权利要求22所述的方法，其中所述双链核酸是单个细胞的全基因组。

27.如权利要求22所述的方法，其中所述转座酶是Tn5转座酶。

28.如权利要求22所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列。

29.如权利要求22所述的方法，其中所述转座子DNA还包括引发位点。

30.如权利要求22所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列和引发位点。

31.如权利要求22所述的方法，其中所述转座子DNA包括双链的19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包括条形码区域和引发位点。

32.如权利要求22所述的方法，其中，在延伸所述双链片段之前，将结合的转座酶从所述双链片段去除。

33.如权利要求22所述的方法，其中所述转座酶是各自与转座子DNA复合的Tn5转座酶，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包含条形码区域和引发位点，其中所述Tn5转座酶/转座子DNA复合物结合沿双链基因组DNA分布的靶位置，将所述双链基因组DNA割成多个双链片段。

34.如权利要求22所述的方法，其还包括对所述双链DNA扩增子测序的步骤。

35.如权利要求22所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测单核苷酸变异的步骤。

36.如权利要求22所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测拷贝数变异的步骤。

37.如权利要求22所述的方法，其还包括在所述双链DNA扩增子中检测结构变异的步骤。

38.一种从双链核酸制备核酸片段的非诊断性方法，其包括：

使所述双链核酸和与转座子DNA结合的转座酶接触，其中所述转座子DNA包括双链19bp的Tnp结合位点和核酸环结构，所述核酸环结构包括条形码区域和引发位点，其中所述转座酶/转座子DNA复合物结合沿所述双链核酸分布的靶位置并且将所述双链核酸切割成多个双链片段，各双链片段具有结合于所述双链片段各5'端的所述转座子DNA，

沿着所述转座子DNA延伸所述双链片段以制备在各末端具有双链RNA聚合酶启动子序列的双链延伸产物，

使所述双链延伸产物与RNA聚合酶接触以制备各双链延伸产物的多个RNA转录物，

将所述RNA转录物逆转录成单链拷贝DNA，

形成针对所述单链拷贝DNA的互补链，以形成对应各双链片段的多个双链DNA扩增子，其中所述双链DNA扩增子由原始双链片段线性扩增。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述双链核酸是分离的双链核酸，并且所述转座酶是分离的转座酶。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述双链核酸是基因组DNA。

41.如权利要求38所述的方法，其中所述双链核酸是获自单个细胞的基因组DNA。

42.如权利要求38所述的方法，其中所述双链核酸是单个细胞的全基因组。

43.如权利要求38所述的方法，其中所述转座酶是Tn5转座酶。

44.如权利要求38所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列。

45.如权利要求38所述的方法，其中所述转座子DNA还包括引发位点。

46.如权利要求38所述的方法，其中所述转座子DNA还包括条形码序列和引发位点。

47.如权利要求38所述的方法，其中所述转座子DNA包括双链的19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包括条形码区域和引发位点。

48.如权利要求38所述的方法，其中，在延伸所述双链片段之前，将结合的转座酶从所述双链片段去除。

49.如权利要求38所述的方法，其中所述转座酶是各自与转座子DNA复合的Tn5转座酶，其中所述转座子DNA包括双链19 bp的Tnp结合位点和突出端，其中所述突出端包含条形码区域和引发位点，其中所述Tn5转座酶/转座子DNA复合物结合沿双链基因组DNA分布的靶位置，将所述双链基因组DNA切割成多个双链片段。

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