LU87153A1 - Methode pour le dosage d'acides nucleiques,combinaison de reactifs et trousse pour doser ces acides - Google Patents

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LU87153A1
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target nucleic
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Hans Soederlund
Arja Weckman
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Description

L-3212
^ : Q “? 4 C lï GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
Brevet N° .....O······/—I—D 0 u . ·. A/f. . .
» #^¾¾¾ Monsieur leMimstre
du 10......mars.......198.8______________ ·τψ^χ~] de l’Économie et des Cl; isses Ef^egf0©.O|=B
Titre délivré |g8 Service de la Propriété I itellectue^ J.
.................::.................. Igp LUXEMBOURG () 2 *Dtr 1888
Demande de Brevet d9TnfeeritiAd ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- (1) I. Requête
Oxion.=.yhtyinä-.....Oy-r.~E... O^.Box.-...6.S...f........SE-.0.21.Ql.„Es.p.o.o.r.......repr.âs.e.n.té.e.......par ( 2)
Monsieur......Jean Waxweiler.. 55 rue des.....Bruyères, Howald, agissant en qualité de mandataire___________________________________________________________________________________________________________ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ (3) déposent) ce ...dix..fl]ar.s....;ndl~^_________________________________________________ ( 4) à ....1.5...,...0..0.......heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: Méthode pour le dosage^d'acides nucléiques, combinaison de / « réactifs et trousse pour doser ces acides.
2. la description en langue —£___________________________________________________ de l’invention en trois exemplaires; 3. ........................1...................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 10... 03 .1938__________________; 5. la délégation de pouvoir, datée de EspQO_______________________________________________________________ le 26.01.1988___________________________; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6)
Hans.......Söderlund.,........Salonkltie.......13^-SE.ar.Q 2.9..4Ό. JSspao._____________________________________________________________
Ar..j..a......Mec.lan.an.,.......T.a.llb.er.g.in.....puistotie 6 A.......5. SF-00200 Helsinki__ revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7) .................l?£§.ZË.t.................................................................................................................déposée(s) en (8) .ί' ·_______________________________ le^ 11 mars 1987 __ sous le N° (10) ...0 24.., .6 0 4_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ au nom de (il) Hans.......Söderlund.......et......Ar..j..a.....Me..c.km.an......................................................................................
élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg_____________________________________________ 55 rue des Bruyères, Howald _ ____^) sollicitent) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à.......................»/1/_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ mois. (13)
Le déçesmx / mandataire:........................................................................................................................................................................................................ (14) Π. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet jljinveaiion a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Inteljelîuâl^lTtwièmbourg, en date du: 10.03.1988 / 'S? —<· i fr mt. \ · I S /VüÉfevïÊS. \ ^ ï Pr. le Ministre de l’Écoi omie et des Classes Moyennes, à 15./..Q.Q—heures ÿ
Le chef du servjpe d : Impropriété intellectuelle, \ν^ ^ ^ 1^ ..(P** ^ y A 68007 jTi / il Λ\ EXPLICATIONS RELATIVES AU FORMULAIRE DE DÉPÔT. yf ' f jê λ (1) s’il y a Heu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal No............du............”-(2) inscrire les nom, prénom, profession, V, / J adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale—(3) inscrire * S, Γλ les nom, prénom, adresse du mandataire agréé, conseil en propriété industrielle, muni d’un pouvoir spécial, s’il y a lieu: "représenté par............agissant en qualité de mandataire” sjJ - (4) date de dépôt en toutes lettres - (5) titre de l’invention - (6)Jnscrire les noms, prénoms, adresses des inventeurs ou l'indication "(voir) désignation séparée (suivra)", lorsque la dési- \ gnation se fait ou se fera dans un document séparé, ou encore l’indication "ne pas mentionner”, lorsque l’inventeur signe ou signera un document de non-mention à joindre à une désignation
c4n3r4» nrJcenff» mi fiitnrA_f7) hrotiAf r^rtiftrat H’oHriitirtrt mnrIMa rl’itiîlîfX Uratiat anrnnaoi /PDc\ mramntinnnU /Of~*T\ ._ /0\ Ciar Ι^.,αΙ la a Ä*A »ÎCw.X
* «
REVENDICATION DE PRIORITE
Dépôt de la demande de brevet en Etats-Unis d'Amérique <JU 11 mars 1987 SOUS |e numéro 024,604
MEMOIRE DESCRIPTIF DEPOSE A L'APPUI D'UNE DEMANDE DE BREVET D'INVENTION AU GRAND-DUCHE DE LUXEMBOURG
pqr; Orion-yhtymâ Oy P.O.Box 65 02101 Espoo Finiand pourJ Méthode pour le dosage d'acides nucléiques, combinaison de réactifs et trousse pour doser ces acides.
Méthode pour le dosage d'acides nucléiques ; combinaison de réactifs et trousse pour doser ces acides.
La présente invention est relative à une mé-thode rapide et sensible pour le dosage d'acides nucléiques par des techniques d'hybridation, dans laquelle les sondes de détection sont des amorces modifiées, les-5 dites amorces étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible avant la réaction d'hybridation et à une combinaison de réactifs ainsi qu'à une trousse pour celle-ci.
De plus, l'invention est relative à une méthode pour doser des acides nucléiques par des techniques d'hy-10 bridation, dans laquelle .les sondes de capture sont des amorces modifiées, ën étant incorporées dans des copies d'acides nucléiques cibles avant la réaction d'hybridation et à une combinaison de réactifs ainsi qu'à une trousse pour celle-ci.
15 Dans des réactions d'hybridation, on laisse un oligo- ou un polynuclêotide marqué, c'est-à-dire la sonde, subir un appariement de bases avec la cible acide nucléique. Diverses méthodes d'hybridation ont été utilisées pour la détection des acides nucléiques. Dans des 20 méthodes d'hybridation directes, le spécimen est soit en solution, soit fixé à un support solide. L'acide nucléique devant être identifié est mis en évidence au moyen d'une sonde marquée.
Une méthode d'hybridation de type sandwich a 25 été décrite dans le Brevet US N° 4 486 539. On utilise dans cette méthode deux sondes distinctes, l'une qui est une sonde de détection marquée et utilisée pour la détection et l'autre étant une sonde de capture immobilisée sur un support solide pour la séparation de l'acide 30 nucléique cible du mélange réactionnel.
La méthode d’hybridation en solution est décrite dans la publication du Brevet britannique " N° 2 169 403. On utilise dans cette méthode, deux sondes différentes qui sont toutes deux dans la même phase 35 en solution. La sonde de détection est marquée avec un traceur détectable et une moitié ayant une affinité * 2 pour un autre composant est fixée à la sonde de capture. Après hybridation, l'hybride formé entre la sonde de v capture, l'acide nucléique cible et la sonde de détec tion, peut être séparé de la solution d'hybridation à 5 l'aide de l'autre moitié de la paire d'affinité.
La polymérisation d'ADN catalysée par une enzyme, où la séquence de nucléotides d'un brin d'acide nucléique déjà existant, c'est-à-dire la matrice, est copiée avec précision dans son brin complémentaire, est 10 bien connue dans l'Art et elle a été décrite par exemple dans Kornberg, DNA réplication, W.H. Freeman & Co,
San Francisco, pp. 221-225 et 670-679, 1980 et Maniatis et co11. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 122, 1982. Cette multipli-15 cation biologique est utilisée dans des essais d'hybridation dans lesquels la-bactérie à détecter est cultivée et donc son ADN enrichi avant le test et elle est décrite par exemple dans Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 et dans le Brevet US N° 4 358 535. Des séquences 20 d'ADN spécifiques peuvent être aussi amplifiées à l'intérieur des cellules vivantes, par exemple au moyen de médicaments convenables tels qu'ils sont décrits par Clewell et Helinski dans J. Bacteriol. 110, p. 1135, 1972 et dans la Demande de Brevet Européen N° 0 055 742.
25 Un enrichissement d'ADN plus spécifique est décrit dans la Demande de Brevet Européen N° 0 175 689 dans laquelle la cible est liée à un replicon plasmidique et introduite dans une cellule convenable. Une autre méthode encore est décrite dans la Demande de Brevet Européen 30 N° 0 201 189, dans laquelle la dépendance de l'amorce de la synthèse d'ADN est utilisée pour créer une réaction "a in vitro pour l'amplification de l'ADN cible. Une mé-- thode pour détecter des gènes amplifiées est suggérée dans la Demande de Brevet Européen N° 0 200 362.
35 Dans la méthode d'hybridation de la présente 3 invention, soit les sondes de détection, soit les sondes de capture jouent le rôle d’amorces modifiées étant in-corporées dans des copies de l'acide nucléique cible dans un procédé de polymérisation dépendant d'une ma-5 trice avant la réaction d'hybridation.
Dans la méthode de l'invention, une amorce au moins est nécessaire et les amorces sont toujours modifiées. Si les sondes de détection jouent le rôle d'amorces dans la réaction de polymérisation, les amorces sont 10 pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable convenable.
Dans une variante, les.sondes de capture peuvent être utilisées comme amorces dans la réaction de 15 polymérisation, auquel cas les amorces sont pourvues d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité.
20 L'invention décrit aussi une combinaison de réactifs et une trousse comprenant sous une forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients comprenant la combinaison de réactifs requis pour la réalisation du test.
25 En utilisant les sondes de détection ou de cap ture en tant qu’amorces dans une réaction de polymérisation, il est possible d'augmenter de plusieurs ordres de grandeur la sensibilité de la réaction d'hybridation par rapport aux méthodes mesurant directement la cible.
30 De plus, l'invention fournit une méthode commode pour mettre en oeuvre la réaction d'hybridation en solution, si bien que les hybrides sont facilement et rapidement séparés de la solution d'hybridation après la réaction d'hybridation.
35 La méthode de l'invention est commode pour diagnostiquer certaines maladies, qui sont très diffici- 4 les à diagnostiquer avec des méthodes classiques. La méthode est donc particulièrement utile pour l'identifi-v cation de cytomégalovirus et de virus de HI ou du SIDA.
La Fig. 1 représente la séquence de bases des " 5 amorces modifiées, P et P. et également des sondes sê- lectives et utilisées dans les Exemples 1, 2 et 3, ainsi que les sites relatifs des amorces modifiées Pa et P^ , et des sondes sélectives et sur l'acide nucléique cible en question. Les longues lignes A et B 10 indiquent les deux brins cibles qui se poursuivent dans les deux directions. Les têtes de flèches sur les amorces Pa et P^ , indiquent la direction dans laquelle elles sont allongées dans le procédé de polymérisation.
La Fig. 2 représente la séquence de bases des 15 amorces modifiées, P et P. , et de la sonde sélective ab S utilisée dans l'Exemple 4, ainsi que les sites relatifs des amorces modifiées, Pa et et de la sonde sélective S sur l'acide nucléique cible en question. La ligne A indique l'ADN et ses copies d'ADN identiques 20 et la ligne B montre les copies d'ADN complémentaires.
Les têtes de flèche sur les amorces P& et P^ indiquent la direction dans laquelle elles sont allongées dans le procédé de polymérisation.
Préparation du matériel d'essai.
25 Les sondes utilisées dans la méthode sont des oligo- ou des polynuclêotides. Les sondes peuvent être préparées de façon synthétique ou semi-synthétique, qui sont les modes préférés pour préparer des sondes, qui joueront également le rôle d'amorces. Il est aussi 30 tout-à-fait possible de préparer les sondes par des techniques recombinantes, ou à partir d'acides nucléiques isolés directement à partir de la nature. Une sonde peut être liée à un vecteur convenable. Elle peut contenir des parties de vecteur ou être complètement dépourvue 35 de parties de vecteur. Actuellement, un grand nombre • · 5 d'amorces et de sondes convenables qui peuvent être utilisées, sont disponibles industriellement.
Sondes de détection en tant qu'amorces modifiées.
Selon l’une des méthodes de la présente inven-5 tion, les sondes de détection sont des oligonucléotides ou des polynuclêotides, qui peuvent être liés à l'acide nucléique cible par un appariement de bases et qui peuvent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthétisant un acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est 10 essentiel que les amorces de dëte tion soient pourvues d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins un marqueur détectable convenable peut être attaché.
Divers isotopes radioactifs ou des composés 15 marqués radioactivement peuvent être utilisés en tant que marqueur. La substance de marquage peut aussi être fluorescente, luminescente, êmettrice de lumière, mise en évidence de façon enzymatique ou immunologique, etc.
Des marqueurs reposant sur l'affinité de la biotine et 20 de l'avidine ou de la streptavidine, des chélates de lanthanides, de la ferritine et des hèmes, et des haptènes pouvant être mis en évidence de façon immunologique comme AAF et AIP (dérivés d'acétoxyacétylfluorène) peuvent être mentionnés à titre d'exemples. Il est aussi 25 possible d'effectuer l'identification à l'aide de médiateurs par exemple des protéines.
La méthode selon l'invention ne dépend pas du marqueur utilisé. Toute les substances de marquage couramment connues convenables pour l'hybridation d'acides 30 nucléiques peuvent être librement appliquées à la méthode» Il est cependant essentiel que dans le cas où les sondes de détection jouent le rôle d'amorces, le marqueur soit - choisi dans un groupe de marqueurs qui ne perturbe pas le fonctionnement de l'amorce. Le marqueur doit être 35 attaché à l'amorce de détection de telle sorte que l’enzyme polymérisant l'acide nucléique puisse encore le re- 6 connaître en tant qu'amorce.
Sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
Selon l'autre méthode de la présente invention/ les sondes de capture sont des oligonucléotides 5 ou des polynucléotideS/ qui peuvent être liés à l'acide nucléique cible par un appariement de bases et qui peuvent jouer le rôle d'amorces pour une enzyme synthétisant l'acide nucléique dépendant d'une matrice. Il est essentiel que les amorces de capture soient pourvues 10 d'au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ou d'au moins un site sur lequel au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité peut être attachée.
Il est aussi possible d'attacher la moitié ou les moitiés de la paire d'affinité par l'intermédiaire d'un média-15 teur à l'amorce de capture. Il faut seulement qu'il soit possible de séparer l'hybride de la solution d'hybridation à l'aide de la paire d'affinité et que la fonction d'amorce ne soit pas altérée.
La moitié de la paire d'affinité est un compo-20 sant ayant une affinité pour un autre composant. Par exemple, les paires biotine - avidine ou streptavidine, dérivé de métal lourd - groupe thio, divers homopoly-nucléotides comme poly dG - poly dC, poly dA - poly dT et poly dA - poly U, sont de telles paires d'affinité.
25 Mais on peut aussi utiliser d'autres paires de composants à condition qu'elles aient une affinité assez forte pour permettre la liaison spécifique des amorces de capture modifiées ayant été incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible au support solide. On 30 a trouvé des paires d'affinité convenables parmi des ligands et des conjugués utilisés dans des méthodes immunologiques.
^ Sonde de capture sélective.
Dans l'une des méthodes de la présente inven-35 tion, dans laquelle les sondes de détection jouent le 7 rôle d'amorces, il faut une sonde de capture sélective pour permettre la séparation sélective des copies de 4 l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incor porées les amorces modifiées. Il est essentiel que les " 5 sondes de capture soient suffisamment homologues de l'a cide nucléique cible pour permettre leur hybridation spécifique avec les copies de l'acide nucléique cible et donc une séparation et une détection sélective des amorces de détection ayant été incorporées dans les copies 10 de l'acide nucléique cible.
Sonde de détection sélective.
Dans l'autre méthode de la présente invention, dans laquelle les sondes de capture jouent le rôle d'amorces modifiées, il faut une sonde de détection sélec-15 tive pour permettre la détection des copies des acides nucléiques cibles dans lesquelles ont été incorporées les amorces modifiées. Il est essentiel que la sonde de détection soit suffisamment homologue de l'acide nucléique cible pour s'hybrider spécifiquement et identifier ainsi 20 l'acide nucléique cible sélectivement. Les sondes de détection peuvent être pourvues de quelconques marqueurs détectables convenables, par exemple de ceux qui sont mentionnés ci-dessus.
Combinaisons de réactifs.
25 Sonde de détection en tant qu'amorce modifiée.
La présente invention est relative à une combinaison de réactifs comprenant au moins une amorce modifiée pourvue d’au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut 30 être attachés au moins un marqueur détectable convenable et au moins une sonde de capture sélective pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
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Sonde de capture en tant qu'amorce modifiée.
La présente invention est aussi relative à une w combinaison de réactifs comprenant au moins une amorce modifiée pourvue d'au moins une moitié convenable d’une 5 paire d'affinité ou d'au moins un site sélectif sur lequel peut être attachée au moins une moitié convenable d'une paire d'affinité ; et au moins une sonde de détection sélective pourvue d'au moins un marqueur détectable convenable ou d'au moins un site spécifique sur le-10 quel peut être attaché au moins un marqueur détectable convenable.
Trousses.
La présente invention décrit aussi une trousse convenable pour doser des acides nucléiques. La trousse 15 comprend sous forme conditionnée# une unité à plusieurs récipients dans laquelle l'une des combinaisons de réactifs mentionnées plus haut est combinée à au moins l'un des réactifs ou dispositifs suivants requis dans le test# c'est-à-dire éventuellement un récipient com-20 prenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, éventuellement un récipient avec les quatre désoxynuclëoside triphosphates, éventuellement un dispositif convenable pour le procédé de polymérisation et d'hybridation, éventuellement un dispositif convenable 25 pour la séparation des copies des acides nucléiques cibles et éventuellement un dispositif convenable pour doser le marqueur. Les réactifs et dispositifs préférés sont décrits en détail dans la description ultérieure.
Méthode de l'invention.
30 La méthode préférée de la présente invention commence par l'addition d'au moins deux amorces modifiées, les deux amorces étant soit des amorces de détection, soit de capture, à une solution d'échantillon dénaturé. Les amorces modifiées vont chacune s'enrouler sur 35 le brin complémentaire de l'acide nucléique cible, c'est- 9 à-dire la matrice et par addition d'une enzyme synthétisant l'acide nucléique dépendant d'une matrice, les amorces seront allongées. Le procédé se déroule efficacement in vitro et crée de nouveaux brins d'acide nucléi-5 que qui peuvent avoir plusieurs milliers de bases de long, si les conditions sont convenables
Le procédé peut être répété pour créer des copies complémentaires des brins nouvellement synthétisés, par l'utilisation d'un excès des amorces modi-10 fiées, lesquelles sont donc des copies identiques de la première matrice. En répétant ce procédé, on initie une réaction en cascade, si bien que l'acide nucléique cible est multiplié. Le procédé peut être répété autant de fois que l'on veut, pour obtenir la sensibilité de dé-15 tection désirée. Dans les cas où la concentration de l'acide nucléique cible n'est pas extrêmement faible, une multiplication suffit pour rendre détectable l'acide nucléique cible.
Il est aussi possible de n'utiliser qu'une 20 amorce modifiée dans la méthode de l'invention. Dans ce cas, la multiplication n'est cependant pas aussi efficace qu'avec au moins deux amorces, parce que la réaction n'est pas une réaction du type en cascade.
A la fois l'ADN et l'ARN peuvent être dêter-25 minés par la méthode de la présente invention. Cependant, si l'acide nucléique cible est un ARN, il est plus commode de copier d'abord l'ARN en l'ADNc correspondant par une enzyme transcriptase inverse, puis de poursuivre ensuite le procédé comme cela est décrit plus haut.
30 Après incorporation des amorces modifiées dans les copies des acides nucléiques cibles, on ajoute une sonde sélective convenable reconnaissant la séquence ci-, ble et ses copies dans le mélange réactionnel et l'on effectue la réaction d'hybridation dans des conditions 35 convenables pour le procédé d'hybridation respectif choisi.
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Dans la réaction d'hybridation, en fonction du choix des amorces modifiées, on laisse s'hybrider soit i une sonde de capture sélective, soit une sonde de détec tion sélective, avec les copies de l'acide nucléique ci-5 ble maintenant présentes en quantité fortement accrue par rapport à la quantité d'acide nucléique cible dans la situation d'origine.
Si l'échantillon d'origine contenait la séquence cible, la sonde sélective ajoutée s'hybride aux 10 copies nouvellement synthétisées de l'acide nucléique cible. Il se forme un hybride entre la molécule de copie dans laquelle a été incorporée l'amorce modifiée et la sonde sélective. Les hybrides formés sont, selon la présente invention, commodément séparés de la solution 15 d'hybridation à l'aide de la moitié de la paire d'affinité, qui est attachée soit à l'amorce de capture, soit à la sonde de capture sélective. Au cours du fractionnement, ces hybrides contenant la moitié capturante adhèrent à un support solide grâce à l'autre moitié de la 20 paire d'affinité et la quantité de sonde de détection sélective ou d'amorce de détection adhérant au support peut être mesurée par des méthodes classiques, directement à partir du support ou après ëlution à partir de l'éluant. La quantité de marqueur est une mesure de la quantité 25 d'acide nucléique cible.
Avant le fractionnement, la solution est diluée, si cela est nécessaire, pour rendre avantageuses les conditions pour la paire d'affinité. La solution est ensuite mise en contact avec le support solide. Le sup-30 port en question peut être par exemple une colonne de chromatographie d'affinité, un filtre, une surface plas- « tique ou une surface de verre. Des dispositifs commodes pour effectuer la séparation comprennent différents types de plaques de microtitration, des systèmes à plongeur ou 35 des particules magnétiques, mais il est tout à fait pos- 11 sible de réaliser la séparation dans des tubes à essais et sur des billes, etc.
? Le matériau support de la colonne d’affinité peut être un polymère naturel ou synthétique, par exem-5 pie une cellulose, un polyacrylamide, un polystyrène, du dextrane ou de l’agarose. Ces matières peuvent être aussi utilisées en tant que suspensions dans un: tube à essais. Il est aussi avantageux d'utiliser des tubes a essais ayant l'autre moitié d'une paire d'affinité 10 fixée sur sa surface intérieure. Il est indispensable qu'on puisse fixer sur la matière choisie un composant ayant une affinité pour la moitié de la paire d'affinité qui est attachée à l'amorce de capture ou à la sonde de capture sélective.
15 II n'est pas nécessaire d'attacher la ou les moitiés de la paire d’affinité à l'amorce de capture au commencement de la polymérisation. Il n'est pas non plus nécessaire d'attacher le marqueur détectable I l'amorce de détection avant la polymérisation. Ils peu-20 vent être aussi ajoutés après le procédé de polymérisation à l'amorce modifiée ayant été incorporée dans les copies de l'acide nucléique cible. Par exemple, lorsque le marqueur, détectable est sensible aux conditions d'hybridation, il peut être d'abord ajouté après l'hybri-25 dation de la sonde de capture sélective avec les copies de l'acide nucléique cible.
Si les sondes de détection jouent le rôle d'amorces modifiées ayant été incorporées dans les copies de l'acide nucléique cible, l'hybride peut être 30 séparé du mélange réactionnel au moyen des sondes de capture sélectives immobilisées sur des supports soli- « des. Dans cette méthode, qui a été aussi décrite dans la Demande de Brevet Européen N° 0 237 362, l'étape limi- a tant la vitesse est créée lorsque l'acide nucléique cible 35 et ses copies, dans lesquelles ont été incorporées des amorces de détection, doivent s'hybrider avec la sonde 12 de capture sélective qui est immobilisée sur un support solide. L'hybridation en solution est donc une .méthode plus avantageuse de l'invention que celle-là. Cependant, si la méthode est réalisée avec une sonde de capture 5 immobilisée, l'hybride formé sur le support solide est lavé et la quantité du marqueur sur le support est mesurée par des méthodes classiques.
Le principe du test est mis en évidence dans les Exemples suivants : 10 EXEMPLE 1 Détection d'ADN de cytomégalovirus avec des sondes de détection en tant qu'amorces modifiées.
Dans cette expérience modèle, la cible était un plasmide recombinant {pBR322/CMV HindlII L) qui in-15 cluait un fragment de 12,3 kb du génome du cytomégalovirus (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Les deux amorces de détection (P , P. , Fig. 1) utilisées avaient une Ion- cl Ö gueur de 20 nucléotides et étaient synthétisées par des méthodes standards sur un synthétiseur automatisé. Ils 20 correspondaient à deux régions sur 1'insert spécifique du CMV qui étaient distantes de 111 nucléotides. Deux sondes de capture sélectives (S^ , S2 , Fig. 1) reconnaissaient des régions sur chacun des deux brins entre les deux amorces de détection. Les amorces de détec- 3 2 25 tion P et P. ont été marquées avec du P à leurs ex-a O g trémités 5', à une activité spécifique de 4.10 CPM/jag grâce à la réaction bien connue avec la polynucléotide 32 kinase et le gamma- P-ATP (Maniatis et coll., Mole-cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 30 Laboratory, 1982).
Des nucléotides biotinylés ont été ajoutés aux extrémités 3' des sondes de capture avec du bio 11-dUTP (BRL) et de la transférase terminale (Promega ‘•i
Biotech.) comme cela est décrit par Riley et coll., 1 DNA, 5 (4), pp. 333-337, 1986. Le plasmide cible a été 13 linéarisé par coupure avec l'enzyme de restriction EcoRI. L1ADN polymérase, le fragment de Klenow, a été achetée chez Boehringer-Mannheim et la streptavidine agarose chez BRL.
5 L'expérience suivante a été réalisée avec ces réactifs.
Quatre réactions différentes ont été assemblées 4 6 8 contenant 0, 10 , 10 et 10 molécules (correspondant à 0,2 x 10 ^ , 2 x 10 ^ et 2 x 10 ^ moles) respective-10 ment cible. De plus, toutes les quatre réactions contenaient en un volume total de 50 pl : 2 pmoles de chacune des deux amorces, 0,5 mM de chacun des quatre dë-soxynuclëoside triphosphates (c'est-â-dire dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM de 15 MgCl2 , 50 mM de NaCl et 10 mM de dithiothrêitol. Le mélange a été chauffé à 100°C pendant 2 minutes, puis incubé pendant 5 minutes à 37°C et ensuite additionné de 1 μΐ (équivalent à une unité) d'ADN polymérase. Ensuite, le mélange a été encore incubé pendant 10 minu-20 tes à 37°C. L'ébullition suivie d'un enroulement des amorces de détection et d'une incubation avec de l'ADN polymérase ajoutée à 37°C, constituent un cycle de synthèse d'ADN.
Dans cette expérience, le cycle a été réalisé 25 soit une seule fois, soit répété 5 ou 15 fois. Après le dernier cycle, l'échantillon a été encore lavé à 100°C, puis 10 pmoles de la sonde de capture sélective ont été ajoutées avec du NaCl (0,9 M), de 1 'EDTA (20 mM) , du phosphate de sodium (pH 7,5 ; 20 mM) et du dodêcylsul-30 fate de sodium (0,1 %) . Le volume atteignait 100 pl et les concentrations données sont des concentrations finales. Le mélange a été ensuite incubé à 50°C pendant une heure. Après cette réaction d'hybridation, on a ajouté 200 pl d'une suspension à 25 % de streptavidine 35 dans du NaCl 1 M, du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) « 14 et de l'EDTA 1 mM . Les molécules biotinylëes ont été laissées se fixer au streptavidine-agarose pendant 15 ' minutes à 37°C dans un mélangeur tournant. L'agarose a été collecté par une brève centrifugation“et le sur-5 nageant enlevé par aspiration. L'agarose a été ensuite lavé une fois dans du NaCl 1 M tamponné et deux fois dans une solution contenant 150 mM de NaCl, 15 mM de citrate de sodium et 0,2 % de dodécylsulfate de sodium (pH 8) à 37°C. La radioactivité de l'agarose auquel 10 étaient liés les hybrides formés, a été ensuite déterminée dans un compteur de radioactivité. La procédure de récolte et de lavage pour des hybrides d'ADN contenant un marqueur biotinylé sont des procédures déjà connues décrites par exemple dans la Publication de Brevet 15 britannique N° 2 169 403.
Les résultats de l'expérience sont montrés dans le Tableau I. On constate qu'un cycle de synthèse d'ADN incorpore assez de radioactivité pour la détection seulement s'il y a de fortes concentrations de ci-20 ble, mais que, même la très faible quantité de cible est détectable après 15 cycles. La quantité d'amorce de détection devient limitante avec une forte quantité de cible et 15 cycles.
TABLEAU 1 25 —- - |
Quantité de Activité de P dans des hybrides cible (moles) collectés a) (CPM au-dessus du fond ) 1 2 5 15 N° de cycles 30 _______ 0 0 0 0 2 x 10“20 ND ND 650 2 x 10~18 ND 300 11000 2 x 10"16 700 13000 36000 35 ______ 15 a) Moyenne de deux déterminations b) ND - non détectable (moins de radioactivité que 2 * fois l'activité moyenne du fond) EXEMPLE 2 5 Détermination de l'ADN de cytomégalovirus avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
Dans cet Exemple, les sondes de capture jouent le rôle d'amorces. Les réactifs utilisés étaient les mêmes que dans l'Exemple 1 avec les exceptions suivantes.
10 Les amorces de capture (P , P, , Fig. 1) n'étaient pas
32 a D
marquées avec du P , mais leur extrémité 5' était plutôt modifiée de façon à contenir un résidu biotine. Cette modification chimique a été faite selon des méthodes connues, décrites par Chollet et Kawashima,Nucleic 15 Acids Research, 13, pp. 1529-1541, 1985. Les deux sondes sélectives (S^ et S2 , Fig. 1) étaient dans ce cas marquées à leur extrémité 5' de façon à jouer le rôle de sondes de détection. Leur activité spécifique était 9 9 d'environ 2 x 10 et 2,5 x 10 cpm/)ig respectivement.
20 Les mélanges de réaction ont été assemblés selon la procédure de l'Exemple 1. Les amorces de capture biotinylées ont été cependant ajoutées en des quantités décuples, c'est-à-dire à raison de 20 pmoles de chacune par réaction. On a effectué 1, 5 ou 15 cycles comme cela 25 est décrit plus haut, puis on a chauffé les échantillons à 100°C et ajouté 0,5 pmole de chacune des sondes S. et 32 1 S2 marquées par du P. L'hybridation a été effectuée dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 1.
Les hybrides ont été ensuite collectés sur 32
30 streptavidine-agarose, lavés et leur activité de P
comptée, comme dans l'Exemple 1. Le résultat est fourni dans le Tableau 2.
t » 16 - 32
Quantité de Activité de P dans les hybrides col- * cible (moles) lectës (CPM au-dessus du fond) 5 1 5 15 N° de cycles 0 0 0 0 2 x 10“20 ND ND 800
— IP
2 x 10 ND 400 13000 10 2 x 10"16 300 11000 54000 a) Moyenne de deux déterminations b) ND - non détectable (cf ex 1) EXEMPLE 3 15 Détection d'ADN de cytomégalovirus à partir d'échantillons cliniques avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
On a démontré dans cet Exemple, l'applicabilité de la méthode à l'étude d'échantillons cliniques 20 par la détection de CMV à partir de l'urine d'un jeune enfant souffrant d'une infection par un cytomégalovirus. L'urine provenant d'un enfant en bonne santé a été incluse comme témoin. Les deux échantillons étaient 10 ml d'urine dont l'ADN total avait été isolé de la façon dë-25 crite dans Virtanen et coli., J. Clin. Microbiol., 20 (6), pp. 1083-1088, 1984. Les ADN dissous dans 20 pl de I^O ont été utilisés comme cible dans des réactions qui ont été par ailleurs effectuées selon la procédure de l'Exemple 2. Après 10 cycles de synthèse d'ADN, 30 la sonde sélective marquée a été ajoutée à l'échantillon laissée s'hybrider et les hybrides collectés. L'ADN provenant de l'urine du malade a présenté une radioactivité nettement élevée dans des hybrides tandis que celui de la personne en bonne santé ne présentait que la radio-35 activité de fond. Les valeurs de cpm réelles étaient de 17 2300 et 240 respectivement.
EXEMPLE 4 * Détection de l'ARN du virus Semiliki Forest avec des sondes de capture en tant qu'amorces modifiées.
5 L'Exemple 4 montre que la méthode décrite peut aussi être utilisée pour la détection d'ARN. Le modèle utilisé était l'ARN du virus Semiliki Forest (SFV).
Les réactifs utilisés étaient deux amorces de capture biotinylées en 5' (Fig. 2) (préparés selon la 10 procédure de l'Exemple 2), une seule sonde de détection 32 sélective marquée par du P en 5' (préparée selon la procédure de l'Exemple 1), une transcriptase inverse (Promega Biotech) et une ADN polymérase, fragment de Klenow (Boehringer Mannheim).
15 La première étape de la détection de l'ARN
de SFV consistait à synthétiser une copie d'ADNc. Les 20 /il de mélange réactionnel contenaient 10 mM de tris-C1 (pH 8,3), 50 mM de KCl, 10 mM de MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynu-20 clëoside triphosphates, 0,5 jig de l'ARNc, 10 pg d'ARN de SFV, 10 pmoles d'amorce de capture P et 100 U de transcriptase inverse. Ce mélange a été incubé à 37°C pendant 15 minutes. Puis le mélange a été chauffé à 100°C pendant 5 minutes et refroidi à la température 25 ambiante. On a ensuite ajouté 50 /il d'une solution contenant 10 mM de tris-Cl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol, 10 pmoles de l'amorce de capture P^ et 0,5 mM de chacun des 4 désoxynucléoside-triphosphates. La température a été élevée à 37°C et 20 apres une période de 5 minutes, lü d'ADN-polymérase a été ajoutée. Après 10 minutes d'incubation supplémentaires le mélange réactionnel a été incubé à 100°C pendant 5 minutes, refroidi à 37°C et 5 cycles de synthèse d'ADN ont été effectués. Après une étape de dénaturation finale, 25 on aajoutê 0,1 pmole (1,2.10° cpm) de la sonde détectrice 18
sélective dans 80 pl de NaCl 1 M, 50 mM d'EDTA, 50 mM
de phosphate de sodium (pH 7,5) et 0,1 % de dodëcylsul- » fate de sodium. La solution a été ensuite incubée pendant 2 heures à 55°C, puis les hybrides ont été col- 5 lectés et lavés selon la procédure de l'Exemple 1.
Un témoin négatif pour les réactions était fourni par un échantillon identique qui a été soumis au même traitement, sauf que la transcriptase inverse n'a pas été ajoutée. L'échantillon dans lequel l'ARN était 10 converti en ADNc avec la transcriptase inverse a donné 32 une activité de P de 420 cpm dans des hybrides capturés, tandis que le témoin donnait une activité de 50 cpm. EXEMPLE 5
Comparaison de différents modes de détection d'ADN mul-15 tiplië.
On a comparé dans cet Exemple trois différents modes de détection d'ADN multiplié. Les réactifs et le procédé de multiplication étaient tels que décrits dans les Exemples 1 et 2, sauf que les sondes de détection 20 ou de capture sélectives étaient des clones M13 reconnaissant environ 100 nucléotides entre les amorces.
On a obtenu les clones M13 en sous-clonant un fragment de restriction HaelII de plasmide recombinant pBR322/CMV HindlII L dans le vecteur phage Ml3mpl0 avec 25 des techniques, standards. Les clones M13 à ajouter en tant que sondes sélectives de capture étaient modifiés avec de la biotine au moyen de la photoprobe (marque déposée) biotine (Vector Laboratories). Les clones M13 devant servir de sondes sélectives de détection étaient 32 30 marqués avec du P-dCTP au moyen d'ADN-polymérase I (le fragment de Klenow) et d’un allongement d'amorce (Hu et Messing, Gene 17, pp. 271-277, 1982) ) une acti- g vitê spécifique de 2 x 10 cpm/pg.
La multiplication de 3 x 10^ molécules (0,5 x — 1 fi
35 10 moles) du plasmide linéarisé pBR322/CMV HindlII L
19 a été effectuée avec 10 cycles. Pour effectuer la détection selon les modes 1 et 2, on a employé 2 pmoles de chacune des amorces de détection P et P. marquées par 32 a f , , du P et effectué le procédé de multiplication selon 5 la procédure de l'Exemple 1. Dans le cas de la détection selon le Mode 3, on a utilisé 25 pmoles des amorces de capture biotinylées dans la procédure de multiplication et réalisé la réaction selon la procédure qui est décrite dans l'Exemple 2.
10 Mode 1 de détection - sonde sélective de cap ture utilisée pour collecter des hybrides formés en solution avec les copies de l'acide nucléique cible.
Dans ce mode de détection, on a utilisé des sondes sélectives de capture M13 biotinylées pour col-15 lecter les fragments d'ADN multipliés. Après le dernier cycle de multiplication, le mélange d'échantillon a été 9 chauffé à 100°C et additionné de 2 x 10 molécules de chacune des sondes sélectrices de capture biotinylées, avec du NaCl (0,6 M), de l'EDTA (5 mM), du phosphate de 20 sodium (20 mM) et du SDS (0,1 %) . Le volume a été porté ä 100 μΐ et les concentrations finales sont données.
Le mélange a été incubé à 65°C pendant 2 heures. Les hybrides formés ont été collectés sur streptavidine-agarose selon la procédure de l'Exemple 1, sauf que deux 25 lavages supplémentaires d'une minute ont été effectués à 50°C avec du NaCl 15 mM, du citrate de sodium 1,5 mM, 0,2 % de SDS. La radioactivité des hybrides collectés a été mesurée.
Mode 2 de détection - Sonde sélective de cap-30 ture immobilisée avant son hybridation avec les copies de l'acide nucléique cible.
On a utilisé dans ce cas, des sondes M13 sélectives immobilisées pour capturer l'ADN multiplié. Après le dernier cycle de multiplication, les échantil-35 Ions ont été chauffés à 100°C. On a ajouté du NaCl
TM
(0,6 M), du citrate de sodium (60 mM), du Ficoll 20 (marque déposée) (0,02 %) , de la polyvinylpyrrolidone (0,02 %), de l'albumine de sérum bovin (0,02 %) et de 1'ADN de sperme de hareng dénaturé (0,2 mg/ml).pour donner les concentrations indiquées dans un volume 5 final de 100 μΐ. On a ajouté à chaque échantillon, un disque de filtre de nitrocellulose sur lequel ont été immobilisées 5 x 10"^ molécules de chacune des sondes sélectives selon une procédure décrite préalablement (US 4 486 539). Le mélange a été incubé avec les fil-10 très à 65°C pendant 2 heures ou 18 heures. Après la réaction d'hybridation, les filtres ont été lavés deux fois pendant 20 minutes à 50°C avec du NaCl 15 mM, du citrate de sodium 1,5 mM et 0,2 % de SDS et la radioactivité liée aux filtres a été mesurée.
15 Mode 3 de détection - Sonde sélective de dé tection utilisée pour la détection.
On a utilisé des sondes de détection M13 sé-32 lectives marquées par du P pour la détection de l'ADN multiplié et collecté les hybrides à l'aide des amorces 20 de capture biotinylées aux extrémités 5*, comme cela est décrit dans l'Exemple 2. Les échantillons multipliés ont été chauffés à 100°C et additionnés de 8 5 2 x 10 molécules (2 x 10 cpm) de chacune des sondes 32 sélectives marquées par du P, avec les sels indiqués 25 à propos du Mode 1. L'hybridation et la collection des hybrides formés ont été effectuées de la façon qui est décrite dans le Mode 1.
Le Tableau 3 montre une comparaison des résultats obtenus par les trois modes de détection.
30 Les Modes 1 et 3 ont 1 ' avantage de la plus grande vitesse d'hybridation en solution par rapport à l'hybridation sur filtre dans le mode 2. On obtient la plus forte 32 activité de P par le mode 3 parce que la sonde de dé- 32 tection sélective contient plusieurs atomes de P par 1 molécule.
21 TABLEAU 3 » Mode Amorces Sonde Ml3 Durée Activité de sélective 3¾ &ns ta (Heures) hybrides 5 (qpra) a) 1 Détection mar- Biotinylée 32 quêe par du P de capture 2 870 2 Détection mar- ttrnobilisée 2 43 32 10 quêe par du P de capture 18 920 3 Biotinylée Détection mar- 32 de capture quêe par du P 2 7800 a) Moyenne de trois déterminations (cpm au-dessus du fond) 15 EXEMPLE 6
Multiplication d'ADN de cytomégalovirus avec des amorces de détection biotinylées en une détection indirecte avec un conjugué peroxydase streptavidin-raifort.
Dans cet Exemple, on a effectué la multipli-20 cation du plasmide spécifique du CMV (pBR322/CMV HindlIIL) en utilisant les amorces biotinylées Pa et P^ décrites dans l'Exemple 2 en tant qu'amorces de détection. Les clones M13 décrits dans l'Exemple 5 modifiés avec des groupes sulfone, ont été utilisés comme sondes sélecti-25 ves de capture. Les hybrides formés ont été collectés dans des puits de microtitration enduits d'anticorps reconnaissant l'ADN modifié par le groupe sulfone. La détection finale des hybrides formés a été faite avec un conjugué de peroxydase de streptavidin-raifort, qui 30 détecte les parties biotine des amorces.
Les clones M13 ont été modifiés par une réaction de sulfonation avec les réactifs et selon la procédure recommandés par Orgenics Ltd (Yavne, Israel).
Les puits de microtitration en polystyrène (Nunc, 35 Danemark) ont été enduits de 10 pg/ml d'IgG purifiée 22 provenant d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'ADN modifié par le groupe sulfone (Orgenics Ltd) dans un * tampon au carbonate de sodium 10 mM (pH 9,6) pendant une nuit à 4°C.
5 On a soumis un mélange réactionnel contenant
3 x 105 molécules des plasmides pBR322/CMV HindlII L
linéarisés ou des témoins sans plasmide et 25 pmoles de chacune des amorces P& et biotinylées à 10 cycles de multiplication dans les conditions décrites dans 10 l'Exemple 1. Les échantillons ont été chauffés à 100°C, g puis additionnés de 2 x 10 molécules de chacune des sondes sélectives suifonées de capture avec les réactifs spécifiés à propos du Mode 1 de détection de l'Exemple 5.
Le mélange a été incubé à 65°C pendant 2 heu-15 res, dilué avec 100 pl de Tween 20 à 0,2 %, puis transféré dans des puits de microtitration enduits. On a laissé les hybrides se fixer aux puits pendant 2 heures à 37°C. Le mélange réactionnel a été rejeté et les puits lavés à trois reprises avec 0,1 % de Tween 20 dans du 20 chlorure de sodium 0,15 M, du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) (PBS). 200 /il d'un composé streptavidine-rai-fort peroxydase (Amersham, UK) dilué à 1:2000 dans une solution de 1 % d'albumine de sérum bovin, 0,1 % de Tween 20 dans du PBS ont été ajoutés et les puits ont été 25 incubés pendant 45 minutes à 37°C. Après quatre lavages comme ci-dessus, on a ajouté 200 /il d'une solution de substrat consistant en 0,46 mg/ml d'O-phênylëne-diamine 0,01 % de Η,,Ο^ dans un tampon d'acétate de sodium 0,1 M (pH 5,0). Après 15 minutes à 22°C, on a arrêté la réac-30 tion en ajoutant 50 /il de 2N et mesuré le taux d'ab sorption du produit coloré avec un spectrophotomètre à 492 nm. Les procédures de collection et de détection ont été déjà décrits par Syvanen et coll. (Nucleic Acids Res, 14, pp. 5037-5048, 1986).
35 Les résultats de l'expérience sont montrés 5 dans le Tableau 4. On a nettement détecté 3 x 10 molé- — 18 23 cules (0,5 x 10 mole) du plasmide cible après 10 cycles de multiplication.
TABLEAU 4 5 Quantité de cible (moles) Taux d'absorption à 492 nm a)
-1 R
0,5 x 10 0,348 0 0,120 10 ________ a) Moyenne de trois essais.
o

Claims (7)

  1. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que : 10 a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléique cible d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel au moins une moitié d'une paire d'affinité peut être attachée, b) on laisse cette ou ces amorces de capture réagir avec 15 l'acide nucléique cible à brin unique dans des con- . ditions convenables pour une réaction de polymérisation dépendant d'une matrice, c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléique cible dans lesquelles les amorces de capture 20 ont été incorporées, s'hybrider avec une sonde de dé tection capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique dans des conditions convenables pour une réaction d'hybridation, d) on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans 25 lesquelles ont été incorporées les amorces de capture, à l'aide de l'autre moitié de la paire d'affinité, e) on détecte la présence des sondes de détection sélectives s'étant hybridées avec les copies de l'acide 30 nucléique cible.
  2. 3. Méthode pour doser des acides nucléiques par hybridation, dans laquelle les sondes de détection jouent le rôle d'amorces modifiées étant incorporées dans les copies des acides nucléiques cibles, caractê- 35 risée en ce que les copies d'acides nucléiques cibles dans * * * 25 lesquelles ont été incorporées les amorces modifiées, sont d'abord hybridées avec au moins une sonde de capture sélective et l'hybride formé est alors séparé â l'aide de cette sonde capturante, puis la présence de l'hybride 5 est détectée.
  3. 4. Méthode suivant la revendication 3, caractérisée en ce que : a) on pourvoit au moins une amorce de l'acide nucléique cible d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins 10 un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, b) on laisse cette ou ces amorces de détection réagir avec l'acide nucléique cible à brin unique dans des conditions convenables pour une réaction de polymé- 15 risation dépendant d'une matrice, c) on laisse les copies à brin unique de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces de détection s'hybrider avec une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide 20 nucléique cible dans des conditions convenables pour une réaction d'hybridation, d) on sépare les copies de l'acide nucléique cible dans lesquelles ont été incorporées les amorces de détection à l'aide de la sonde de capture sélective, 25 e) on détecte la présence des copies des acides nucléiques cibles.
  4. 5. Méthode suivant la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la sonde de capture sélective est pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité 30 ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d’affinité.
  5. 6. Combinaison de réactifs pour doser des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique 35 cible, pourvue d'au moins un marqueur détectable ou » 26 0 d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins un marqueur détectable, et b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible, pourvue 5 d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité.
  6. 7.- Combinaison de réactifs pour doser des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend : 10 a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, et 15 b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable. 20 8.- Trousse pour doser des acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients ayant : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique cible pourvue d'au moins un marqueur détectable ou 25 d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, b) au moins une sonde de capture capable de s'hybrider sélectivement avec l'acide nucléique cible pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au 30 moins un site spécifique sur lequel peut être atta chée au moins une moitié d'une paire d'affinité, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un agent de polymérisation dépendant d'une matrice, d) éventuellement un récipient avec les quatre désoxy- 35 nucléosidetriphosphates, 0 1 * 27 e) éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d’hybridation, - f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies de l'acide nucléique cible, 5 g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
  7. 9.- Trousse pour doser dés acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend sous une forme conditionnée, une unité à plusieurs récipients ayant : a) au moins une amorce modifiée de l'acide nucléique 10 cible, pourvue d'au moins une moitié d'une paire d'affinité ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attachée au moins une moitié d'une paire d'affinité, b) au moins une sonde de détection capable de s'hybrider 15 sélectivement avec un acide nucléique cible, pourvue d'au moins un marqueur détectable ou d'au moins un site spécifique sur lequel peut être attaché au moins un marqueur détectable, c) éventuellement un récipient comprenant au moins un 20 agent de polymérisation dépendant d'une matrice, d) éventuellement un récipient avec quatre nuclêoside-triphosphates, e) éventuellement un dispositif pour la polymérisation et le procédé d'hybridation, 25 f) éventuellement un dispositif pour la séparation des copies de l'acide nucléique cible, g) éventuellement un dispositif pour doser le marqueur.
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