WO1997046700A1 - Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 - Google Patents

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WO1997046700A1
WO1997046700A1 PCT/FR1997/000980 FR9700980W WO9746700A1 WO 1997046700 A1 WO1997046700 A1 WO 1997046700A1 FR 9700980 W FR9700980 W FR 9700980W WO 9746700 A1 WO9746700 A1 WO 9746700A1
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Bruno Mougin
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Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method, probes and kits for determining the HLA DQ beta genotype (DQB) of an individual.
  • DQB HLA DQ beta genotype
  • the methods, probes and kits of the invention relate more particularly to the detection of the HLA DQB1 polymorphic genes. These methods, probes and kits of the invention are notably applicable to HT A typing in transplantation, to medical diagnosis, to forensic medicine, but the presence or absence of HLA DQB 1 alleles can also serve as an indicator of sensitivity. certain diseases, such as insulin-dependent diabetes.
  • the HLA system (cell antigen "humans) is encoded by the major dTiistocompat Chromatocompat Chromatomatix complex in humans. It is a very important constraint during organ transplantations between individuals by making a distinction between self and non Soil HLA antigens have therefore been used in typing methods to determine the characteristics between donor and recipient during organ transplants, as well as an individual's predisposition to certain diseases.
  • the HLA system is well characterized and consists of a set of more or less polymorphic loci located in an interval of about 2 centimeters on the short arm of chromosome 6.
  • Three loci in this system (HLA- A, B and C) code for a class of co-dominant allo-antigens (Class I).
  • Another region (HLA-D) which actually contains several genes codes for a second class of allo-antigens expressed in a co-dominant manner with a significant degree of polymorphism (Class H).
  • Hl Several other loci which control in particular the components C 2, C 4 and the factor Bf of the complement cascade also belong to the HLA system (Class Hl).
  • HLA typing must be as exact as possible.
  • This need mainly concerns kidney transplants and bone marrow transplants.
  • the perfect identity in terms of HLA Class U antigens represents a determining factor for the success of the transplant, ie to avoid rejection of the graft or the development of a disease.
  • graft-counter host The polymorphism of the expression products of the HLA-D region genes was usually defined by serological techniques based on the analysis by allo-antisera of the HLA gene products expressed on the surface of the cells. However, even under the best conditions, a large number of existing alleles cannot be detected by these serological techniques.
  • Genotypic analysis is a new approach for analyzing the diversity of the HLA Class II system, and in particular HLA DQ, directly at the gene level.
  • the genotypic analysis is based on the principle of molecular hybridization and the first approach which was proposed is the technique known as "RFLP" which consists in fragmenting DNA by using restriction enzymes and in analyzing the size of the fragments obtained. ; see for example US Patent 4,582,788.
  • the RFLP approach can be used for the identification of 7 specificities
  • RFLP analysis only recognizes some of the allelic differences undetectable by serology, and the possibilities offered by this technique are limited. Indeed, an allele is identifiable only if the mutation which characterizes it is located in the recognition site of the restriction enzyme used and thus a large number of alleles are not recognized by this analysis. In addition, the RFLP analysis rarely highlights a change in a coding sequence and does not provide information on the exact nature of the modification. Finally, this technique is long and difficult to implement.
  • oligonucleotide typing Another technique for genotypic analysis of HLA Class II has been proposed, which is the so-called "oligonucleotide typing" method: thanks to the knowledge of the DNA sequences of the HLA Class II genes and in particular of the DQ B genes, uses as tracers for the analysis of polymorphism oligonucleotides which specifically hybridize at a given site of the gene sequence. These oligonucleotides are chosen so that their hybridization or their absence of hybridization provides as much information as possible and allows the identification of the different alleles, on the basis of their sequence differences. Any difference in sequence, even those involving a single nucleotide, must be detectable.
  • oligonucleotide typing technique can be applied to DNA as well, as described in the publication by ANGELINI et al Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol. 83: 4489-4493 (1986), than at TARN (see C. UCLA, J. J. VAN ROOD, J. GORSKI, B. MACH (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155).
  • Nucleic acid amplification methods have facilitated the analysis of an individual's HLA Class II DNA.
  • the first typing application by oligonucleotides for HLA Class II was presented by ANGELINI et al in the previously cited publication, using the so-called "SOUTHERN" technique according to which the target DNA is deposited on a nylon membrane and detection is carried out using a labeled oligonucleotide probe. The technique was then applied to the detection of HLA Class II alleles not identifiable by routine serology (See JM TIERCY, J. GORSKI, M. JEANNET and B. MACH (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 198 and JM TIERCY, J.
  • Short probes are used for this, generally of less than 30 nucleotides, which give the test high specificity, while retaining good sensitivity.
  • the use of short oligonucleotides provides a wide range of selectivity.
  • the present invention relates to a method, as well as probes and kits for HLA DQB1 typing which meet these requirements.
  • the method of the invention can be used to type heterozygous samples of various origins, including cDNA arrays, and can be used to detect allelic variants which cannot be distinguished by conventional serological methods.
  • the probes of the invention which will be defined below, can be used in the form of detection probes (labeled with a usual tracer) in the Southern type techniques, or, preferably, in the form of capture probes (Sandwich or Reverse Dot Blot technique) immobilized on a solid support.
  • the typing system of the present invention preferably uses the so-called "sandwich" protocol, as originally described by DUNN AR, HASSEL JA (Cell, 12, 23, 1977) and which consists in using a first nucleotide probe, called capture probe, fixed on a solid support, and specific for the target gene of the sample, as well as a second, labeled probe, called detection probe, complementary to another region of the target and allowing the detection of a revelation hybridization using the marker.
  • the marker is for example an enzyme such as horseradish peroxidase, it being understood that any other suitable marker can be used.
  • the method of the invention is based on the selection of ohgonucleotide probes whose length and composition have been chosen not only to give them the necessary specificity and sensitivity, but also so as to allow their use at a determined temperature.
  • the typing system of the present invention has the particular advantage of making it possible to operate at a single temperature of 37 ° C ⁇ 2 ° C. It is however obvious that, even in the case of probes intended to detect, at a given temperature, point mutations, it is possible to envisage the use of probes whose length can vary to a certain extent, thanks in particular to the use of buffer solutions which more or less promote the stability of the hybridization complexes.
  • the probes of the invention are therefore defined by a sequence the length of which can generally be considered as maximum, in particular if it is desired to work at a temperature in the region of 37 ° C, but different from 37 ° C (which is often the case in (taking into account temperature calibration errors), with the indication of an optimum sequence for a temperature of 37 ° C. It is obvious to specialists that to each particular oligonucleotide probe there corresponds a complementary probe which, of course, is capable of playing the same role as a capture or detection probe. The invention therefore extends to probes having a sequence complementary to that of the probes described below, and to methods using these complementary.
  • the subject of the invention is probes having a nucleotide sequence chosen to meet the above requirements.
  • the present invention relates to new probes, the combined use of which makes it possible to discriminate between different alleles and even to identify if necessary the different specificities HLA DQ known to date (Nomenclature for factors of the HLA System, 1995, Bodmer Julia G et al. Tissue Antigens 1995, 46, 1-18).
  • the nucleotide probes of the invention are chosen in particular among those shown below (the sequence read from left to right goes from the 5 'end to the 3' end).
  • the letters represent the nucleotides (or bases) according to the usual nomenclature.
  • the sequence under consideration represents the optimal sequence under the operating conditions recommended according to the invention.
  • the probes therefore contain at least the sequence under consideration, and may also contain one or two additional bases chosen from the bases not underlined, that is to say, depending on the case (and of course respecting the continuity of the sequence) , either one or two additional bases at the 5 'end, or one or two additional bases at the 3' end, or even an additional base at the 5 'end and an additional base at the 3' end.
  • probes of the invention are notably chosen from the following (for each probe, the recognized specificities have been indicated), or their complementary:
  • the probes of the invention are also probes 23a, 23B, 26c, 26f 37C, 37a, 45a, 57D, 57E, 57F and 70C whose nucleotide sequences are defined below and whose recognized specificities are given in table 4 Annex.
  • the new probes of the invention also include the HRP 1 and HRP 2 probes which will be defined below.
  • I symbolize inosine.
  • Inosine is an unnatural nucleotide used in certain probes of the invention, to increase the discriminating power of a probe by further destabilizing the hybrids formed by this probe with nucleic acid sequences not strictly identical to that of the target. looked for in the sample with this probe.
  • the arbitrary designations comprising a number followed by a letter, such as 23A, 26A, 26B, etc., or letters followed by a number (such as HRP1), globally designate all the probes thus defined (those comprising only the souhg Avenue sequence and those comprising in addition one or two additional bases not underlined), except in the experimental part below and in the annexed tables where these designations designate only the probes having the optimal souhg Avenue sequence.
  • the present invention also relates to a method for determining at least partially the DQB1 typing of a nucleic acid present in a sample, in which hybridization tests are carried out, according to known methods, of said nucleic acid of the sample with ohgonucleotide probes, and in which the tests for which the hybridization is actually observed at a positive temperature equal to 37 ⁇ 2 ° C are retained as positive tests, said ohgonucleotide probes comprising at least one probe chosen from the group consisting of:
  • probes contain at least the sequence under consideration and may also contain one or two additional bases chosen, respecting the continuity of the sequence, from the bases not underlined.
  • the invention relates in particular to a method as defined above, in which one uses: - at least one of the probes 26D, 26E, 49 A, 70 A and 70B,
  • the invention also relates to a method as defined above, in which hybridization tests of the nucleic acid of the sample are carried out with at least one of the following probes:
  • a GAG GAG GAC GTG CGC TT (37A); recognized DQBl specificities: 06011, 06012; or their complementary.
  • the invention relates in particular to a method as defined above, in which the three probes 57D, 57E and 57F are used, in combination with at least one of the probes 57A, 57B and 57C.
  • the tests retained as positive are still those indicated above.
  • the hybridization conditions used are obviously predetermined conditions such that hybridization with each probe does not occur, at the chosen single temperature, unless the target contains a sequence perfectly complementary to that of said said probe. These conditions can be determined by simple routine experiments.
  • the target is of course the nucleic acid present in the sample and containing polymorphic regions of an individual's HLA DQ genes.
  • probes that can be used in the process of the invention can be, depending on the techniques chosen, either labeled probes or probes coupled to a ligand intended to facilitate their attachment to a solid support, or even probes already fixed on a sohde support.
  • the probes can be either immobilized or irremobihsable, according to known methods, on solid supports, and are then usable as capture probes.
  • the hybridization tests are carried out using the probes indicated above as capture probes, that is to say fixed to a solid support.
  • a labeled detection probe capable of hybridizing with a region of the target other than that recognized by said probe. capture. It is possible in particular to use detection probes chosen from the following (the portion referred to corresponds as before to the minimum sequence): GG ACG GAG CGC GTG CG (HRPR
  • the identification of an allele can be deduced from a binding model of a set of probes, each individual probe of the set being specific for different parts of the HLA DQ gene. Thanks to the choice of several probes, the oligonucleotide typing method of the present invention makes it possible to identify, if desired, all the DQB1 alleles. In the event that new alleles are discovered, these will then be listed in a HLA Class ⁇ sequence register, making it possible to activate the collection of specific probes using additional probes, and therefore to adapt the methodology to the detection of any new allele.
  • the present invention also allows a second step of DQB typing which, with a larger number of probes, makes it possible to recognize all of the HLA DQB specificities known to date.
  • the analysis of the HLA DQB specificities by the oligonucleotide typing technique of the present invention can be applied in the laboratory of compatibility for routine DQB typing, replacing serology, in particular for performing the DQB typing of patients on the list of waiting for a renal transplant or typing of potential kidney donors, DQB typing of leukemia patients, for whom a bone marrow transplant is envisaged, as well as typing of their family members or unrelated potential donors, DQB typing on a large scale for the constitution of registers of voluntary marrow donors, or to determine associations between diseases and the HLA system, for example in the case of insulin-dependent diabetes, for apphcations in predictive medicine or for research of paternity and other judicial identifications.
  • tissue containing HLA DQB nucleic acid can be used as a sample in the method of the invention. It is also possible to use nucleic acid fragments (DNA or RNA) obtained after chemical, enzymatic or analog cleavage of the nucleic acid present in a sample. However, in practice, a prior step of DNA or RNA amplification must be carried out.
  • a subject of the invention is also a kit for HLA DQB1 typing of an individual, said kit comprising at least one of the following probes: 26B, 26C, 26D, 26F, 26E, 23A, 49A, 55A, 70A, 70B , 23a, 23B, 26c, 26f, 37C, 37a, 45a,
  • the invention relates in particular to a kit comprising the probes
  • capture probes following: 26B, 26C, 26D, 26E, 26F, 23A, 49A,
  • This kit can also contain one or more detection probes chosen from HRP1, HRP2 and HRP3.
  • the invention also relates to a kit comprising:
  • probes 26E, 49A, 70A, and 70B are - or at least one of probes 26E, 49A, 70A, and 70B,
  • the invention relates in particular to a kit comprising the following probes:
  • the probes used in the present invention are sequence specific ohgonucleotides (OSS) which, under appropriate conditions, can specifically link to their complementary sequence. If a particular probe can be used to identify only an allele, the probe is then called OSA, that is to say an oligonucleotide specific for an allele. As already noted above, it is possible that a single probe may not be able to identify a specific DQ B allele on its own.
  • OSS sequence specific ohgonucleotides
  • Gene refers to the characteristics of the genome of an individual as opposed to the "phenotype” which is a characteristic of an individual as it emerges from the analysis of gene expression products, especially proteins.
  • Allele refers to the different alternative forms of the same gene which have differences in the nucleic sequence. These differences manifest themselves in DNA, RNA and their translation into proteins.
  • Polymorphism characterizes the diversity introduced into a population by the existence of different alleles for the same gene.
  • Olionucleotide as used herein means primers, probes or nucleic acid fragments to be detected ...
  • the ohgonucleotides can be prepared by any suitable known method.
  • the mutations on the DNA most often used correspond to the non-silent mutations, which are obviously the most important, but it is possible to detect a silent type mutation, for example in order to differentiate two very close alleles.
  • Tables 1 and 2 show the nucleotide and amino acid alignments of the DQB1 gene for all the alleles known and published in the literature known to this day.
  • Table 3 appended summarizes the correspondence between the probes and the recognized specificities: when on a range, a box is blackened, this means that the specificity mentioned in this range is recognized by the probe of the corresponding column.
  • Table 4 appended shows the correspondence between probe and HLA DQB 1 specificities with, in addition, the indication of the silent mutations or of the variant amino acids.
  • the following examples illustrate the invention.
  • the coupling of the hgand to an oligonucleotide is carried out according to the following general protocol:
  • An ohgonucleotide is synthesized on an automatic 381 A device from the company Apphed Biosystems using the chemistry of phosphoramidites according to the manufacturer's protocol.
  • the hgand phosphoramidite dissolved in anhydrous acetonitrile at a concentration of 0.2M is placed in position X of the synthesizer and the addition of the hgand is done by the 5 'end of the ohgonucleotide according to the standard protocol of automatic synthesis. when the synthesis of the ohgonucleotide is completed.
  • the modified ohgonucleotide (hey with hgand) is dried under vacuum and taken up in 1 ml of water.
  • the modified oligonucleotide at its 5 ′ end is purified by high performance liquid chromatography in reverse phase on a column of Brownlee RP 18 (10mm-25cm).
  • Buffer B 50% Buffer A + 50% CH3CN.
  • the purification protocol is identical: the conjugate is stored at -20 ° C in a Tris HCl buffer, pH 7, containing 40% glycerol.
  • Example 3 Amplification of the target DNA.
  • the amplification is carried out by PCR using the following primers: - primer 1: 5 'C ATG TGC TAC TTC ACC AAC GG 3'
  • the capture probe which is used as a positive control (designated by C +) is present on all the alleles known to date. Its sequence is as follows:
  • a capture probe is used as a negative control (designated by C-) and has the following sequence: 5 'TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC 3'.
  • the plate is washed three times with 300 ⁇ l of PBS Tween (0.15 M
  • the amplification product is denatured in 10 ⁇ l of 2N NaOH for 5 min at room temperature. 10 ⁇ l of 2N acetic acid then 2.3 ml of hybridization buffer (PEG: 0.1 M sodium phosphate, pH 7, 0.5 M NaCl, 0.65% Tween 20, salmon sperm DNA (Sigma D 9156) 0.14 mg / ml, PEG 4000 (Merck 807490 2%) and 0.25 ml of a labeled detection probe (oligonucleotide-peroxidase conjugate) are added successively to this solution. The final solution is distributed in each well 0.1 ml per well.
  • DNAs are amplified according to the PCR technique. Then we do the typing.
  • the typing protocol generally conforms to that described above. Hybridizations are carried out according to the sandwich method.
  • the typing protocol uses the capture probes indicated below and, as appropriate, the HRP1, HRP2 or HRP3 detection probes.
  • the patient is DQB 1 * 0201 or 0202/0302 or 0303
  • the patient is DQB 1 * 0502/0401

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Abstract

Sonde nucléotidique choisie notamment parmi les suivantes: TG CGT TAT GTG ACC AGA; GTG CGT CTT GTG ACC AGA; GT CTT GTA ACC AGA CAC AT; CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT; CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT; GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G; G TAC CGG GCA GTG ACG C; G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G; G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G; G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T; G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T; TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C; GG ACG GAG CGC GTG CG; C ATC TAT AAC CGA GA; et leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes ont au minimum la séquence soulignée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées. Ces sondes sont utilisables pour déterminer le génotype HLA DQ bêta d'un individu. Elles présentent notamment l'avantage d'être utilisables à une température d'hybridation unique, en particulier 37 °C.

Description

Sondes nucléotidiques et procédé pour déterminer le typage HLA DQB1 .
La présente invention a pour objet un procédé, des sondes et des kits pour déterminer le génotype HLA DQ bêta (DQB) d'un individu.
Les procédés, sondes et kits de l'invention se rapportent plus particulièrement à la détection des gènes polymorphes HLA DQB1. Ces procédé, sondes et kits de l'invention sont notamment applicables au typage HT A en transplantation, au diagnostic médical, à la médecine légale, mais la présence ou l'absence d'allèles HLA DQB 1 peut également servir comme indicateur de la sensibilité à certaines maladies, telles que le diabète insulino-dépendant.
Le système HLA (antigène des lymphocytes "humains) est codé par le complexe dTiistocompatibilité majeur chez l'homme. Il constitue une contrainte très importante au cours des transplantations d'organes entre les individus en effectuant une distinction entre le soi et le non sol Les antigènes du système HLA ont donc été utilisés dans des procédés de typage pour déterminer les caractéristiques entre donneur et receveur lors de transplantations d'organes, ainsi que la prédisposition d'un individu à certaines maladies.
D'un point de vue génétique, le système HLA est bien caractérisé et consiste en un ensemble de loci plus ou moins polymorphes situés dans un intervalle d'environ 2 centimorgans sur le bras court du chromosome 6. Trois loci dans ce système (HLA-A, B et C) codent pour une classe d'allo-antigènes exprimés de façon co-dominante (Classe I). Une autre région (HLA-D) qui contient en fait plusieurs gènes code pour une seconde classe d'allo-antigènes exprimés de façon co-dominante avec un degré important de polymorphisme (Classe H). Plusieurs autres loci qui contrôlent notamment les composants C 2, C 4 et le facteur Bf de la cascade du complément appartiennent également au système HLA (Classe Hl). Le succès des greffes d'organes dépend dans une grande mesure de l'identité HT A (Classes I et U) entre receveur et donneur. En conséquence, le typage HLA doit être le plus exact possible. Ce besoin concerne principalement les transplantations de reins et les greffes de moelle osseuse. Dans le cadre de la greffe de moelle osseuse, l'identité parfaite au niveau des antigènes HLA Classe U représente un facteur déteπninant pour le succès de la greffe, c'est à dire pour éviter un rejet du greffon ou le développement d'une maladie greffon- contre-hôte. Le polymorphisme des produits d'expression des gènes de la région HLA-D était défini habituellement par des techniques sérologiques basées sur l'analyse par des allo-antisera des produits des gènes HLA exprimés à la surface des cellules. Cependant, même dans les meilleures conditions, un grand nombre d'alleles existants ne sont pas détectables par ces techniques sérologiques.
Les polymorphismes au niveau du locus HLA DQB1 ont été détectés en utilisant des réactifs de typage sérologique qui définissent les spécificités DQ wl, 2, 3 et 4 (WHO Nomenclature Comrnittee, 1990). La spécificité DQ wl a été ensuite subdivisée en sous-types sérologiques DQ w5 et 6, et DQ w3 a été subdivisée en DQ w7, 8 et 9. Cependant, avec les techniques de sérotypage utilisées en routine, seulement les spécificités DQ wl, DQ w2 et DQ w3 peuvent être distinguées.
Grâce à la biologie moléculaire, on sait maintenant qu'il existe un plus grand nombre de gènes HLA qu'on ne le supposait auparavant et, surtout, beaucoup plus d'alleles différents. Cette diversité est maintenant caractérisée au niveau des séquences d'ADN des différents gènes et allèles. Les structures, séquences et polymorphismes connus dans la région HLA-D ont été répertoriés par TROWSDALE ét al, 1985. Immunol. Rev. 85 : 5-43.
L'analyse génotypique est une nouvelle approche permettant d'analyser la diversité du système HLA Classe II, et en particulier HLA DQ, directement au niveau des gènes. L'analyse génotypique est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire et la première approche qui fut proposée est la technique dite "RFLP" qui consiste à fragmenter l'ADN par utilisation d'enzymes de restriction et à analyser la taille des fragments obtenus ; voir par exemple le brevet US 4 582 788. L'approche RFLP est utilisable pour l'identification de 7 spécificités
DQ. Cependant, l'analyse par RFLP ne permet de reconnaître que certaines des différences alléliques indétectables par la sérologie, et les possibilités offertes par cette technique sont limitées. En effet, un allèle est identifiable seulement si la mutation qui le caractérise est située dans le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction utilisée et ainsi un grand nombre d'alleles ne sont pas reconnus par cette analyse. De plus, l'analyse RFLP met rarement en évidence une modification dans une séquence codante et ne fournit pas d'informations sur la nature exacte de la modification. Enfin, cette technique est longue et difficile à mettre en oeuvre.
Une autre technique d'analyse génotypique de HLA Classe II a été proposée, qui est la méthode dite "de typage par oligonucléotides" : grâce à la connaissance des séquences d'ADN des gènes HLA Classe II et en particulier des gènes DQ B, on utilise comme traceurs pour l'analyse du polymorphisme des oligonucléotides qui sliybrident spécifiquement en un site donné de la séquence du gène. Ces oligonucléotides sont choisis de façon que leur hybridation ou leur absence d'hybridation fournisse le plus grand nombre possible d'informations et permette l'identification des différents allèles, sur la base de leurs différences de séquence. Toute différence de séquence, même celles portant sur un seul nucléotide, doit pouvoir être détectée.
La technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la pubhcation d' ANGELINI et al Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol. 83 : 4489-4493 (1986), qu'à TARN (voir C. UCLA, J. J. VAN ROOD, J. GORSKI, B. MACH (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155).
Les méthodes d'amplification d'acides nucléiques, telles que la PCR, ont facilité l'analyse de l'ADN HLA Classe II d'un individu. La première application de typage par oligonucléotides pour le HLA Classe II a été présentée par ANGELINI et al dans la publication précédemment citée, avec utilisation de la technique dite "SOUTHERN" selon laquelle l'ADN cible est déposé sur une membrane de nylon et la détection est effectuée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique marquée. La technique a ensuite été appliquée à la détection d'alleles HLA Classe II non identifiables par sérologie de routine (Voir J.M. TIERCY, J. GORSKI, M. JEANNET et B. MACH ( 1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 198 et J.M. TIERCY, J. GORSKI, H. BETUEL, A.C. FREIDEL, L. GEBUHRER, M. JEANNET et B. MACH (1989) Human Immunol. 24, 1). Une autre application directe au typage HLA Classe II est celle décrite dans la demande de brevet PCT WO 89/11547 utilisant la technique dite "Dot Blot". La méthode dite "Reverse Dot", qui consiste à fixer sur une membrane de papier ou de nitrocellulose, une sonde nucléotidique et à effectuer la détection d'une hybridation avec une cible marquée, a été appliquée au typage HLA DQ A et à la détection des mutations de la bêta-thalassémie méditerranéenne (R.K.SAJKI et al Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol : 86, p. 6230-6234 ; (1989)).
Le typage cellulaire nécessite la détection de mutations ponctuelles dans le génome et implique la mise au point de sondes suffisamment sensibles pour détecter et différencier des séquences homologues à un nucléotide près. On utilise pour cela des sondes de courte taille, généralement de moins de 30 nucléotides, qui confèrent au test une grande spécificité, tout en conservant une bonne sensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides de courte taille permet de disposer d'un grand éventail de sélectivité.
Par ailleurs, il est souhaitable de mettre au point un procédé de typage qui non seulement présente une grande spécificité et une bonne sensibilité, mais qui de plus soit simple à mettre en oeuvre, d'exécution rapide, peu onéreux et facilement automatisable. La présente invention concerne un procédé, ainsi que des sondes et des kits pour le typage HLA DQB1 qui répondent à ces exigences.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour typer des échantillons hétérozygotes d'origines diverses, incluant des matrices d'ADNc, et peut être utilisé pour détecter des variants alléliques qui ne peuvent pas être distingués par les méthodes sérologiques conventionnelles.
Les sondes de l'invention qui seront définies ci-après, peuvent être utilisées sous la forme de sondes de détection (marquées avec un agent traceur usuel) dans les techniques de type Southern, ou, de préférence, sous la forme de sondes de capture (technique Sandwich ou Reverse Dot Blot) immobilisées sur un support solide.
Le système de typage de la présente invention utilise de préférence le protocole dit "sandwich", tel que décrit à l'origine par DUNN A.R , HASSEL J. A. (Cell, 12, 23, 1977) et qui consiste à utiliser une première sonde nucléotidique, appelée sonde de capture, fixée sur un support solide, et spécifique du gène cible de l'échantillon, ainsi qu'une deuxième sonde, marquée, appelée sonde de détection, complémentaire d'une autre région de la cible et permettant la détection d'une hybridation par révélation à l'aide du marqueur. Dans le système de la présente invention, le marqueur est par exemple une enzyme telle que la peroxydase de raifort, étant entendu que tout autre marqueur approprié peut être utilisé.
Le procédé de l'invention est fondé sur la sélection de sondes ohgonucleotidiques dont la longueur et la composition ont été choisies non seulement pour leur conférer la spécificité et la sensibilité nécessaires, mais aussi de façon à permettre leur utilisation à une température déteπninée. Ainsi, le système de typage de la présente invention présente notamment l'avantage de permettre d'opérer à une température unique de 37°C ± 2°C. II est toutefois évident que, même dans le cas de sondes destinées à détecter, à une température donnée, des mutations ponctuelles, il est possible d'envisager l'utilisation de sondes dont la longueur peut varier dans une certaine mesure, grâce notamment à l'emploi de solutions tampons favorisant plus ou moins la stabilité des complexes d'hybridation. Les sondes de l'invention sont donc définies par une séquence dont la longueur pourra généralement être considérée comme maximum, en particulier si on souhaite travailler à une température avoisinant 37°C, mais différente de 37°C (ce qui est souvent le cas en pratique compte tenu des erreurs d'étalonnage de la température), avec en outre l'indication d'une séquence optimum pour une température de 37°C. E est évident pour les spécialistes qu'à chaque sonde oligonucléotidique particulière correspond une sonde complémentaire qui, bien entendu, est capable de jouer le même rôle en tant que sonde de capture ou de détection. L'invention s'étend donc aux sondes ayant une séquence complémentaire de celle des sondes décrites ci-après, et aux procédés utilisant ces complémentaires. L'invention a pour objet des sondes ayant une séquence nucléotidique choisie pour répondre aux exigences précitées. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des sondes nouvelles, dont l'utilisation combinée permet d'effectuer la discrimination entre différents allèles et même d'identifier si nécessaire les différentes spécificités HLA DQ connues à ce jour (Nomenclature for factors of the HLA System, 1995, Bodmer Julia G et al. Tissue Antigens 1995, 46, 1-18).
Les sondes nucléotidiques de l'invention sont choisies notamment parmi celles qui sont représentées ci-après (la séquence lue de gauche à droite va de rextrémité 5' à l'extrémité 3'). Les lettres représentent les nucléotides (ou bases) selon la nomenclature habituelle. La séquence souhgnée représente la séquence optimale dans les conditions opératoires préconisées selon l'invention. Les sondes contiennent donc au minimum la séquence souhgnée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies parmi les bases non soulignées, c'est-à- dire, selon les cas (et en respectant bien entendu la continuité de la séquence), soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 5', soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 3', soit encore une base supplémentaire à l'extrémité 5' et une base supplémentaire à l'extrémité 3'. On sait en effet qu'il est possible de modifier la longueur des sondes utilisées en fonction des conditions opératoires qui permettent de faire varier les forces de liaison d'hybridation, telles que les températures d'hybridation et de lavage, et la nature des tampons d'hybridation et/ou de lavage. L'introduction dans les sondes de bases modifiées (par exemple inosine) peut jouer un rôle analogue. Les sondes de l'invention sont notamment choisies parmi les suivantes (pour chaque sonde, on a indiqué les spécificités reconnues), ou leurs complémentaires :
TG CGT TAT GTG ACC AGA (26B), qui reconnaît les spécificités DQB 1 0601 1, 06012, 0301, 0304, GTG CGT CTT GTG ACC AGA (26C) : spécificités DQB1 0602,
0302, 03032
GT CTT GTA ACC AGA CAC AT (26D) : spécificités DQB1 0603, 0604, 0607, 0608,
CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT (26F) : spécificités DRQB1 06051, 06052, 0606 et 0609,
CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT (26E) : spécificités 0201, 0202, GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G (23A) : spécificité DQB1 0401,
G TAC CGG GCA GTG ACG C (49A): spécificité DQB1 0501, G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G (55A) : spécificités DQB1 0301,
0302, 03032, 0304, 0305, G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G (55'A) : spécificités DQB1 0301, 0302, 03032, 0304, 0305,
G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T (70A) : spécificités DQB1 0602, 0603, 0608, G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T (70'A) : spécificités DQB1
0602, 0603, 0608,
TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C (70B) : spécificités DQB1 0401, 0402.
Les sondes de l'invention sont également les sondes 23a, 23B, 26c, 26f 37C, 37a, 45a, 57D, 57E, 57F et 70C dont les séquences nucléotidiques sont définies ci-après et dont les spécificités reconnues sont indiquées dans le tableau 4 annexé.
Bien entendu, la distinction entre certaines spécificités pourra être effectuée, si désiré, à l'aide d'autres sondes utilisées comme sondes supplémentaires, comme le montre par exemple l'examen des tableaux 1 et 2 annexés.
Les nouvelles sondes de l'invention comprennent aussi les sondes HRP 1 et HRP 2 qui seront définies ci-après.
Dans les séquences des sondes ohgonucleotidiques décrites ci-dessus, I symbohse l'inosine. L'inosine est un nucléotide non naturel utihsé dans certaines sondes de l'invention, pour augmenter le pouvoir discriminant d'une sonde en déstabilisant davantage les hybrides que forme cette sonde avec des séquences d'acide nucléique non strictement identiques à celle de la cible recherchée dans l'échantillon avec cette sonde. Dans la description de la présente demande, les appellations arbitraires comprenant un nombre suivi d'une lettre, telles que 23A, 26A, 26B, etc., ou des lettres suivies d'un chiffre (telles que HRP1), désignent globalement toutes les sondes ainsi définies (celles comprenant uniquement la séquence souhgnée et celles comprenant en outre une ou deux bases supplémentaires non soulignées), sauf dans la partie expérimentale ci-après et dans les tableaux annexés où ces appellations désignent uniquement les sondes ayant la séquence optimale souhgnée. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour déteπniner au moins partiellement le typage DQBl d'un acide nucléique présent dans un échantillon, dans lequel on effectue des essais d'hybridation, selon les méthodes connues, dudit acide nucléique de l'échantillon avec des sondes ohgonucleotidiques, et dans lequel on retient comme essais positifs les essais pour lesquels on observe effectivement une hybridation à une température unique égale à 37±2°C, lesdites sondes ohgonucleotidiques comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe consistant en :
TGCGTTATGTGACCAGA(26B\ GTGCGTCTTGTGACCAGA(26C1
GTCTTGTAACCAGACACAT(26D),
CGTCTTGTAACCAGATACAT(26F),
CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT(26E),
GGACCGAGCTCGTGCGGGGTG(23A), GTACCGGGCAGTGACGC(49A),
GACGCCGCTGGGICCGCCTG(55A),
GGAGGGIACCCIGGCIGAGT(70A),
TCGGTGGACACCGTATGCAGAC(70B),
GGACCGAGITIGTGCGGGGTG(23a), CAACGGGACCGAGIGIGTGCGf23B1
GTGCGTCTTITGACCAGATA(26c),
CGTCTTGTAACCAGITACAT(26f),
TAACCGAGAAGAGTACGTGC(37C),
CGAGGAIGACGTGCGCTT(37a), GCGACGTGIAIGTGTACCG(45a),
GGGGIGICCTIACGICGAGTACT(57D),
GGGCCGCCTIACICCGAG(57E),
GGGCCICCTGCCGCCGA(57F),
TG GAG GGG GCC CGG GCG TCG G (70C), ou leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes contiennent au minimum la séquence souhgnée et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées.
L'invention concerne en particulier un procédé tel que défini précédemment, dans lequel on utihsé : - l'une au moins des sondes 26D, 26E, 49 A, 70 A et 70B,
- ou l'une au moins des sondes 26E, 49 A, 70A, et 70B,
- et/ou l'une au moins des sondes 57D, 57E et 57F,
- et/ou l'une au moins des sondes 23a, 23B, 26c, 26f, 37C, 37a, 45a et 70C. L'invention concerne également un procédé tel que défini précédemment, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec au moins une des sondes suivantes :
ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG (26A) ; spécificités DQBl reconnues : 0501, 0502, 05031, 05032, 0603, 0604, 0607, 0608 ; GG CCT GTT GCC GAG TAC T (57A) ; spécificités DQBl reconnues : 0501, 0604, 06051, 0606, 0608, 0609 ;
CGG CCT AGC GCC GAG TAC T (57B) ; spécificités DQBl reconnues : 0502, 0504 ;
CGG CCT GAT GCC GAG TAC (57C) ; spécificités DQBl reconnues : 05032, 0602, 0603, 0607 ; et éventuellement :
GC GAC GTG GAG GTG TAC CG (45A) ; spécificités DQBl reconnues : 0301, 0304 ;
A GAG GAG GAC GTG CGC TT (37A) ; spécificités DQBl reconnues : 06011, 06012 ; ou leurs complémentaires.
L'invention concerne notamment un procédé tel que défini précédemment, dans lequel on utihsé les trois sondes 57D, 57E et 57F, en combinaison avec l'une au moins des sondes 57A, 57B et 57C. Bien entendu, les essais retenus comme positifs sont encore ceux indiqués précédemment.
Dans le procédé de l'invention, les conditions d'hybridation utilisées sont évidemment des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produise, à la température unique choisie, que si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde. Ces conditions peuvent être déterminées par de simples expériences de routine. La cible est bien entendu l'acide nucléique présent dans l'échantillon et contenant des régions polymorphes de gènes HLA DQ d'un individu.
Les spécialistes comprendront aisément que les diverses sondes utihsables dans le procédé de l'invention peuvent être, selon les techniques choisies, soit des sondes marquées, soit des sondes couplées à un ligand destiné à faciliter leur fixation sur un support solide, soit encore des sondes déjà fixées sur un support sohde. En particulier, les sondes peuvent être soit immobilisées, soit irnmobihsables, selon les méthodes connues, sur des supports sohdes, et sont alors utihsables comme sondes de capture.
Selon un mode de réalisation particulier, on effectue les essais d'hybridation en utilisant les sondes indiquées ci-dessus comme sondes de capture, c'est-à-dire fixées à un support sohde.
Pour révéler la présence éventuelle d'acide nucléique, fixé sur le support solide par hybridation avec une sonde de capture donnée, on peut utiliser une sonde de détection marquée capable de s'hybrider avec une région de la cible autre que celle reconnue par ladite sonde de capture. On peut utiliser notamment des sondes de détection choisies parmi les suivantes (la partie souhgnée correspond comme précédemment à la séquence minimale) : GG ACG GAG CGC GTG CG (HRPR
CATCTATAACCGAGA(HRP2),
CGCTTCGACAGCGACGTGG(HRP3).
L'examen du tableau 1 annexé permet de déterminer aisément lesquelles, parmi ces sondes de détection, sont utihsables avec une sonde de capture donnée.
Selon le procédé de l'invention, l'identification d'un allèle peut être déduite à partir d'un modèle de liaison d'un ensemble de sondes, chaque sonde individuelle de l'ensemble étant spécifique de différentes parties du gène HLA DQ. Grâce au choix de plusieurs sondes, le procédé de typage par oligonucléotides de la présente invention permet d'identifier si désiré tous les allèles DQBl. Au cas où de nouveaux allèles seraient découverts, ceux-ci seraient alors répertoriés dans un registre de séquence HLA Classe π, permettant d'actuahser la collection de sondes spécifiques à l'aide de sondes supplémentaires, et donc d'adapter la méthodologie à la détection de tout nouvel allèle.
Pour rationahser le typage HLA Classe II complet, on peut effectuer tout d'abord une première étape de typage DQB, lequel permet, avec un nombre déteiminé de sondes, d'identifier les principales spécificités HLA DQB.
Cette étape est souvent suffisante pour un grand nombre d'apphcations cliniques. Toutefois, la présente invention permet également une deuxième étape du typage DQB qui, avec un nombre plus important de sondes, permet de reconnaître toutes les spécificités HLA DQB connues à ce jour.
L'analyse des spécificités HLA DQB par la technique de typage par oligonucléotides de la présente invention peut être apphquée dans les laboratoires dliistocompatibilité pour le typage DQB de routine, en remplacement de la sérologie, notamment pour effectuer le typage DQB de patients en liste d'attente pour une gieffe rénale ou le typage de donneurs de reins potentiels, le typage DQB de patients leucémiques, pour lesquels une greffe de moelle osseuse est envisagée, ainsi que le typage des membres de leur famille ou des donneurs potentiels non apparentés, les typages DQB à grande échelle pour la constitution de registres de donneurs de moelle volontaires, ou pour déterminer des associations entre des maladies et le système HLA, par exemple dans le cas du diabète insulino- dépendant, pour des apphcations en médecine prédictive ou encore pour des recherches de paternité et autres identifications judiciaires.
Tout type de tissu contenant de l'acide nucléique HLA DQB peut être utihsé comme échantillon dans le procédé de l'invention. Il est aussi possible d'utihser des fragments d'acides nucléiques (ADN ou ARN) obtenus après coupure chimique, enzymatique ou analogue de l'acide nucléique présent dans un échantillon. Cependant, en pratique, une étape préalable d'amplification de l'ADN ou de l'ARN doit être effectuée.
L'invention a également pour objet un kit pour le typage HLA DQBl d'un individu, ledit kit comprenant l'une au moins des sondes suivantes : 26B, 26C, 26D, 26F, 26E, 23A, 49A, 55A, 70A, 70B, 23a, 23B, 26c, 26f, 37C, 37a, 45a,
57D, 57E, 57F, 70C, HRP1 et HRP2, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi 26A, 57B, 57C, 37A, 45A, 57A et HRP3.
Dans le procédé de l'invention, et dans le kit correspondant, on peut bien entendu remplacer les sondes indiquées par leurs complémentaires. L'invention concerne en particulier un kit comprenant les sondes
(notamment sondes de capture) suivantes : 26B, 26C, 26D, 26E, 26F, 23A, 49A,
55A, 70A, 70B , 26A, 57B, 57C, 57A et éventuellement l'une au moins des sondes
45A et 37A. Ce kit peut contenu- en outre une ou plusieurs sondes de détection choisies parmi HRP1, HRP2 et HRP3. L'invention concerne également un kit comprenant :
- l'une au moins des sondes 26D, 26E, 49A, 70A et 70B,
- ou l'une au moins des sondes 26E, 49A, 70A, et 70B,
- et/ou l'une au moins des sondes 57D, 57E et 57F,
- et/ou l'une au moins des sondes 23a, 23B, 26c, 26f, 37C, 37a, 45a et 70C.
L'invention concerne en particulier un kit comprenant les sondes suivantes :
23a, 23B, 26c, 26D, 26E, 26f, 37a, 37C, 45a, 49A, 57A, 57B, 57C, 57D, 57E, 57F, 70A, 70B et 70C. Les informations recueillies grâce à l'emploi de ces sondes sont ensuite utilisées pour déterminer le typage en fonction d'un plan de typage établi, tenant compte des sondes utilisées et de la connaissance des types HLA DQB et/ou sous types associés répertoriés. Ce travail est simplifié par l'utilisation d'un plan de typage, c'est à due un tableau donnant directement les types et/ou sous types en fonction des réponses positives (hybridations) observées. Des exemples de plans de typage sont représentés dans les tableaux 3 et 5 annexés.
Les sondes utilisées dans la présente invention sont des ohgonucléotides spécifiques d'une séquence (OSS) qui, dans des conditions appropriées, peuvent se her spécifiquement à leur séquence complémentaire. Si une sonde particuhère peut être utilisée pour identifier uniquement un allèle, la sonde est alors appelée OSA c'est à dire oligonucléotide spécifique d'un allèle. Comme déjà remarqué précédemment, il est possible qu'une seule sonde ne soit pas capable d'identifier à elle seule un allèle spécifique DQ B.
On donne ci-après quelques définitions de termes utilisés dans la présente demande :
"Génotypique" fait référence aux caractéristiques du génome d'un individu par opposition au "phénotype" qui est une caractéristique d'un individu telle qu'elle ressort de l'analyse des produits d'expression des gènes, notamment les protéines. "Allèle" désigne les différentes formes alternatives d'un même gène qui présente des différences au niveau de la séquence nucléique. Ces différences se manifestent au niveau de l'ADN, de l'ARN et de leur traduction en protéines.
"Polymorphisme" caractérise la diversité introduite dans une population par l'existence d'alleles différents pour un même gène. "Oligonucléotide" tel qu'utilisé ici désigne des amorces, des sondes ou des fragments d'acide nucléique devant être détectés... Les ohgonucléotides peuvent être préparés par toute méthode appropriée connue.
Dans la présente description et dans la partie expérimentale qui suit, il est fait référence aux tableaux 1 à 4 annexés. D convient d'attirer l'attention sur le fait qu'une même appellation de sonde (telle que 26A, HRP3, etc.) peut désigner non seulement une séquence permettant de définir plusieurs sondes avec indication d'une séquence minimum souhgnée (comme c'est le cas dans la description ci- dessus), mais aussi une séquence correspondant à la séquence minimum souhgnée (comme c'est le cas dans les exemples ci-après et dans les tableaux 1 à 4 annexés). On a représenté dans le tableau 1 annexé les alignements de l'ADN des différents allèles du gène DQB dans le but de définir les positions des mutations correspondant à des mutations d'acides aminés (désignés à l'aide du code à une lettre) représentées dans le tableau 2, par rapport à la séquence consensus choisie, qui est DQB 1*0501. Les mutations de l'ADN peuvent être des mutations non silencieuses, c'est à dire des mutations dont la traduction conduit à un changement d'acide aminé.
Dans le cas de typage des différents allèles, on utihsé le plus souvent les mutations sur l'ADN correspondant aux mutations non silencieuses, qui sont évidemment les plus importantes, mais il est possible de détecter une mutation de type silencieux, par exemple dans le but de différencier deux allèles très proches. Dans les tableaux 1 et 2, on a représenté les alignements en nucléotides et acides aminés du gène DQBl pour tous les allèles connus et pubhés dans la littérature connue à ce joui-.
Le tableau 3 annexé résume la correspondance entre les sondes et les spécificités reconnues : lorsque sur une hgne, une case est noircie, cela signifie que la spécificité mentionnée à cette hgne est reconnue par la sonde de la colonne correspondante.
Le tableau 4 annexé reprend la correspondance entre sonde et spécificités HLA DQB 1 avec en outre l'indication des mutations silencieuses ou des acides aminés variants. Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1 :
On a préparé diverses sondes hées à un hgand favorisant leur fixation sur un support sohde. Le hgand utihsé est un composé disponible dans le commerce, dénommé Aminolink 2, et commercialisé par la société Applied Biosystems sous la référence 400808.
Le couplage du hgand à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général suivant : Un ohgonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique 381 A de la société Apphed Biosystems en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Le hgand phosphoramidite dissous dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2M est placé en position X du synthétiseur et l'addition du hgand se fait par l'extrémité 5' de l'ohgonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l'ohgonucléotide est achevée.
Après déprotection une nuit à 55°C dans une solution d'ammoniaque à 33 %, suivie d'une précipitation dans de l'éthanol à -20°C, l'ohgonucléotide modifié (hé au hgand) est séché sous vide et repris dans 1 ml d'eau.
L'ohgonucléotide modifié à son extrémité 5' est purifié par chromatographie liquide haute performance en phase inverse sur une colonne de Brownlee RP 18 ( 10mm-25cm).
Conditions : débit 4,6 ml/min
Gradient 10 % à 35 % de tampon A en 30 min. 35 % à 100 % de tampon B en 3 min. Tampon A : 0,1 molaire Triéthylammom'umacétate
(TEAA), pH 7
Tampon B : 50 % Tampon A + 50 % CH3CN.
Exemple 2 : Préparation des sondes de détection
L'ohgonucléotide utilisé, activé comme à l'exemple 1 et séché, est repris par 1,25.10" 7 mole (5mg) de peroxydase de raifort (Boehringer Mannheim
413470) dans 200 μl de tampon borate de sodium 0,1M, pH 9,3.
Le protocole de purification est identique : le conjugué est stocké à -20°C dans un tampon Tris HCI, pH 7, contenant 40 % de glycérol.
Exemple 3 : Amplification de l'ADN cible.
L'amplification est réalisée par PCR en utilisant les amorces suivantes : - amorce 1 : 5' C ATG TGC TAC TTC ACC AAC GG 3'
- amorce 2 : 5' CTG GTA GTT GTG TCT GCA CAC 3' Ces amorces sont désignées dans le tableau 1 par les appellations DQBAMP-A et DQBAMP-B.
Exemple 4 :
Dans les puits d'une plaque de microtitration (Nunc 43454) sont déposés 100 μl d'une solution d'un ohgonucléotide de capture d'une spécificité DQ donnée (à raison d'un ohgonucléotide de capture par puits) à une concentration de
10 à 400 nM dans du PBS 3 x (0,45 M NaCl, 0,15 M phosphate de sodium, pH 7). On utihsé donc autant de puits que de sondes de captme nécessaires pour le typage. Les plaques sont incubées pendant 2 heures à 37°C ou pendant 15 à 22 heures à température ambiante.
Dans tous les cas un contrôle positif est ajouté afin de vérifier l'étape d'amplification et celle de détection. La sonde de capture qui est utilisée comme contrôle positif (désignée par C+) est présente sur tous les allèles connus à ce jour. Sa séquence est la suivante :
5' GAG TAC TGG AAC AGC CAG AAG GA 3'. Une sonde de capture est utilisée comme contrôle négatif (désignée par C-) et a la séquence suivante : 5' TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC 3'. La plaque est lavée trois fois avec 300 μl de PBS Tween (0, 15 M
NaCl, 0,05M phosphate de sodium, pH 7 ; 0,5 % Tween 20 (Merck 822184). Le produit d'amplification est dénaturé dans 10 μl de NaOH 2N pendant 5 min à température ambiante. 10 μl d'acide acétique 2N puis 2,3 ml de tampon d'hybridation (PEG : Phosphate de sodium 0, 1M, pH 7, NaCl 0,5M, Tween 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156) 0,14 mg/ml, PEG 4000 (Merck 807490 2 %) et 0,25 ml d'une sonde de détection marquée (conjugué oligonucléotide-peroxydase) sont additionnés successivement à cette solution. La solution finale est répartie dans chaque puits à raison de 0,1 ml par puits. Les plaques sont incubées pendant 60 min. à 37°C. Les plaques sont lavées trois fois avec 300 μl de PBS Tween. 100 μl de substrat orthophénylènediamine (OPD) (Cambridge Médical Biotechnology ref 456) dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique, 0, 1 M Na2HPθ4, pH 4,9) à la concentration de 4 mg/ml, auquel est additionné extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30 volumes dilué au 1/1000, sont ajoutés par puits. Après 20 min. de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 μl d'H2S04 IN et la lecture est effectuée à 492 mu
Exemple 5 :
10 ADN sont amplifiés selon la technique PCR. On effectue ensuite le typage. Le protocole de typage est généralement conforme à celui décrit ci-dessus. On effectue les hybridations selon la méthode sandwich.
Le protocole de typage utihsé les sondes de capture indiquées ci-après et, selon les cas, les sondes de détection HRP1, HRP2 ou HRP3.
La méthode décrite permet de typer les 10 ADN testés. Quelques résultats de typage sont donnés ci-après à titre d'illustration.
Cas n° 1 :
Sondes DO x 1000 1
26A 15
49A 12
57B 38
57C 12
37A 12
26B 100
26C 1309
26D 10
26F 18
70A 32
26E **#*
55A 316
70B 12
23A 13
**** signifie : : saturation Résultat : Le patient est DQB 1*0201 ou 0202 / 0302 ou 0303
Cas n° 2 :
Sondes DO x 1000 (
26A 887
49A 12
57B 459
57C 11
37A 57
26B 80
26C 10
26D 14
26F 10
70A 14
26E 11
55A 11
70B 688
23A 302
Résultat : Le patient est DQB 1 *0502 / 0401
Exemple 6 :
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 5, mais en utihsant les sondes de capture mentionnées dans le tableau 5 annexé. Les résultats sont résumés dans le tableau 6 annexé.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Tableau 3
1
1
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Tableau 5
Figure imgf000029_0001
Tableau 6
Figure imgf000030_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Sonde nucléotidique choisie parmi les suivantes :
- TGCGTTATGTGACCAGA. - GTGCGTCTTGTGACCAGA.
- GTCTTGTAACCAGACACAT.
- CGTCTTGTAACCAGATACAT.
- CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT.
- GGACCGAGCTCGTGCGGGGTG. - GTACCGGGCAGTGACGC.
- GACGCCGCTGGGICCGCCTG.
- GACGCCGCTGGGGCCGCCTG.
- GGAGGGIACCCIGGCIGAGT.
- GGAGGGGACCCGGGCGGAGT. - TCGGTGGACACCGTATGCAGAC.
- GGACGGAGCGCGTGCG.
- CATCTATAACCGAGA.
- GGACCGAGITIGTGCGGGGTG.
- CAACGGGACCGAGIGIGTG CG. - GTGCGTCTTITGACCAGATA.
- CGTCTTGTAACCAGITACAT.
- TAACCGAGAAGAGTACGTGC.
- CGAGGAIGACGTGCGCTT.
- GCGACGTGIAIGTGTACCG. - GGGGIGICCTIACGICGAGTACT.
- GGGCCGCCTIACICCGAG.
- GGGCCICCTGCCGCCGA.
- TG GAG GGG GCC CGG GCG TCG G. et leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes ont au minimum la séquence soulignée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées.
2. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, et leurs complémentaires :
- TGCGTTATGTGACCAGA. - GTGCGTCTTGTGACCAGA.
- GTCTTGTAACCAGACACAT.
- CGTCTTGTAACCAGATACAT.
- CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT.
- GGACCGAGCTCGTGCGGGGTG. - GTACCGGGCAGTGACGC.
- GACGCCGCTGGGICCGCCTG.
- GACGCCGCTGGGGCCGCCTG.
- GGAGGGIACCCIGGCIGAGT.
- GGAGGGGACCCGGGCGGAGT. - TCGGTGGACACCGTATGCAGAC.
- GGACCGAGITIGTGCGGGGTG.
- CAACGGGACCGAGIGIGTGCG.
- GTGCGTCTTITGACCAGATA.
- CGTCTTGTAACCAGITACAT. - TAACCGAGAAGAGTACGTGC.
- CGAGGAIGACGTGCGCTT.
- GCGACGTGLAIGTGTACCG.
- GGGGIGICCTIACGICGAGTACT.
- GGGCCGCCTLACICCGAG. - GGGCCICCTGCCGCCGA.
- TGGAGGGGGCCCGGGCGTCGG.
3. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi :
- GTCTTGTAACCAGACACAT.
- CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT. - GTACCGGGCAGTGACGC.
- GGAGGGIACCCIGGCIGAGT. - TCGGTGGACACCGTATGCAGAC. et leurs complémentaires.
4. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi :
- G GGG IGI CCT IAC GIC GAG TAC T. - GGG CCG CCT IAC ICC GAG.
- GGG CCI CCT GCC GCC GA.
5. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi :
- GGACCGAGITIGTGCGGGGTG.
- CAACGGGACCGAGIGIGTGCG. - GTGCGTCTTITGACCAGATA.
- CGTCTTGTAACCAGITACAT.
- TAACCGAGAAGAGTACGTGC.
- CGAGGAIGACGTGCGCTT.
- GCGACGTGLAIGTGTACCG. - TGGAGGGGGCCCGGGCGTCGG.
6. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, et leurs complémentaires :
- GGACGGAGCGCGTGCG.
- CATCTATAACCGAGA.
7. Sondes selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont la séquence correspond à la séquence soulignée, et leurs complémentaires.
8. Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lesdites sondes sont soit marquées, soit couplées à un ligand destiné à facihter leur fixation sur un support solide, soit fixées sur un support solide.
9. Procédé pour déterminer au moins partiellement le typage
HLA DQB 1 d'un acide nucléique cible présent dans un échantillon, dans lequel on effectue des essais d'hybridation, selon les méthodes connues, dudit acide nucléique de l'échantillon avec des sondes ohgonucleotidiques, et dans lequel on retient comme essais positifs les essais pour lesquels on observe effectivement une hybridation à une température unique égale à 37±2°C, lesdites sondes ohgonucléotidiques comprenant au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies dans la revendication 2, ou leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes contiennent au minimum la séquence soulignée et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes :
- ACCAGACACATCTATAACCG. - GGCCTGTTGCCGAGTACT.
- CGGCCTAGCGCCGAGTACT.
- CGG CCT GAT GCC GAG TAC, ou leurs complémentaires.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de la cible nucléique de l'échantillon avec au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes :
- GC GAC GTG GAG GTG TAC CG.
- A GAG GAG GAC GTG CGC TT. ou leurs complémentaires.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel on utihsé au moins une sonde telle que définie dans l'une des revendications 3 à 5.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, dans lequel on utihsé lesdites sondes comme sondes de capture.
14. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel on révèle la présence éventuelle d'acide nucléique, fixé sur un support sohde par hybridation par une sonde de capture, à l'aide d'une sonde de détection marquée capable de sliybrider avec une région de la cible autre que celle reconnue par ladite sonde de capture.
15. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel les sondes de détection sont choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, ou leurs complémentaires :
- GGACGGAGCGCGTGCG.
- CATCTATAACCGAGA. - CGCTTCGACAGCGACGTGG.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé par le fait que lesdites sondes sont définies comme dans la revendication 7.
17. Kit pour le typage HLA DQBl, comprenant au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies dans l'une quelconque des revendications 1 à
6, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes :
- ACCAGACACATCTATAACCG.
- GGCCTGTTGCCGAGTACT. - CGGCCTAGCGCCGAGTACT.
- CGGCCTGATGCCGAGTAC.
- AGAGGAGGACGTGCGCTT.
- GCGACGTGGAGGTGTACCG,
- CGC TTC GAC AGC GAC GTG G. ou leurs complémentaires.
18. Kit selon la revendication précédente, comprenant les sondes définies par les séquences suivantes :
- TGCGTTATGTGACCAGA.
- GTGCGTCTTGTGACCAGA. - GTCTTGTAACCAGACACAT.
- CGTCTTGTAACCAGATACAT.
- CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT.
- GGACCGAGCTCGTGCGGGGTG.
- GTACCGGGCAGTGACGC. - GACGCCGCTGGGICCGCCTG.
- GACGCCGCTGGGGCCGCCTG. - GGAGGGIACCCIGGCIGAGT.
- GGAGGGGACCCGGGCGGAGT.
- TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C. ou leurs complémentaires, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes :
- ACCAGACACATCTATAACCG.
- GGCCTGTTGCCGAGTACT.
- CGGCCTAGCGCCGAGTACT. - CGGCCTGATGCCGAGTAC.
- AGAGGAGGACGTGCGCTT.
- GC GAC GTG GAG GTG TAC CG, ou leurs complémentaires.
19. Kit selon la revendication 17, comprenant les sondes définies par les séquences suivantes :
- TGCGTTATGTGACCAGA.
- GTGCGTCTTGTGACCAGA.
- GTCTTGTAACCAGACACAT.
- CGTCTTGTAACCAGATACAT. - CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT.
- GGACCGAGCTCGTGCGGGGTG.
- GTACCGGGCAGTGACGC.
- GACGCCGCTGGGICCGCCTG.
- GGAGGGIACCCIGGCIGAGT. - TCGGTGGACACCGTATGCAGAC.
- ACCAGACACATCTATAACCG.
- CGGCCTAGCGCCGAGTACT.
- CGGCCTGATGCCGAGTAC.
- GC GAC GTG GAG GTG TAC CG. ou leurs complémentaires, et éventuellement : - AGAGGAGGACGTGCGCTT.
- GGCCTGTTGCCGAGTACT. ou leurs complémentaires.
20. Kit selon la revendication 17, comprenant au moins une sonde telle que définie dans l'une quelconque des revendications 3 à 5.
21. Kit selon la revendication précédente, comprenant les sondes définies dans la revendication 3 et/ou dans la revendication 4, et/ou dans la revendication 5.
22. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, dans lequel lesdites sondes sont utihsables comme sondes de capture.
23. Kit selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, contenant en outre au moins une sonde de détection marquée choisie parmi les suivantes :
- GGACGGAGCGCGTGCG.
- CATCTATAACCGAGA. - CGCTTCGACAGCGACGTGG.
24. Kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans lequel lesdites sondes sont définies comme dans la revendication 7.
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