FR2718461A1 - Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. - Google Patents
Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2718461A1 FR2718461A1 FR9404097A FR9404097A FR2718461A1 FR 2718461 A1 FR2718461 A1 FR 2718461A1 FR 9404097 A FR9404097 A FR 9404097A FR 9404097 A FR9404097 A FR 9404097A FR 2718461 A1 FR2718461 A1 FR 2718461A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sep
- hybrid
- target sequence
- detection
- digestion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'Invention est relative à un procédé de détection de la présence d'un site de restriction spécifique d'une enzyme dans une séquence-cible d'ADN, lequel procédé comprend: - l'hybridation en phase liquide d'une séquence-cible et d'une sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible; - la fixation dudit hybride sur un support; - le traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée; - la détection ou le dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique.
Description
PROCZDZ DE DETECTION D'UN SITE DE RESTRICTION DANS UNE SéQUENCE D'ADN.
La présente Invention est relative à un procédé de détection de fragments d'ADN comprenant un site de restriction défini, et de quantification de la proportion de ces fragments dans un échantillon d'acide nucléique.
La détection de la présence ou de l'absence, chez tout ou partie d'une population de molécules d'ADN, d'un site de restriction déterminé à un locus donné peut être un élément de diagnostic de certaines pathologies, concernant en particulier le développement cancéreux de certains tissus.
Il a été ainsi montré dans plusieurs pathologies cancéreuses, qu'intervenaient de fréquentes mutations et pertes d'hétérozygotie associées à un polymorphisme de restriction au niveau des séquences d'acide nucléique d'anti-oncogènes.
Pour l'étude notamment de la perte d'hétérozygotie, on procède donc fréquemment à l'analyse du polymorphisme de restriction. Selon une technique de base, après digestion par une enzyme de restriction de 1ADN à analyser, les différents fragments de digestion sont séparés sur un gel d'électrophorèse, et analysés par transfert de Southern avec une sonde longue (plusieurs centaines de bases).
Différents perfectionnements de cette technique de base ont été proposés : en particulier, une méthode dénommée PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction
Restriction Fragment Length Polymorphism), a été récemment décrite [MERLO et al., Biotechniques, 11, p. 166-170, (1991)]. Après amplification par ACP de la portion du génome à analyser, le produit d'amplification est digéré par l'enzyme concernée, et le produit de la digestion est analysé par électrophorèse ; les homozygotes, pour l'un ou l'autre allèle, et les hétérozygotes sont distingués par le nombre et la taille des fragments de restriction. Cette méthode est rapide et reproductible. Elle présente en outre, du fait de l'amplification par PCR, l'avantage de pouvoir être effectuée à partir de très peu de matériel biologique.
Restriction Fragment Length Polymorphism), a été récemment décrite [MERLO et al., Biotechniques, 11, p. 166-170, (1991)]. Après amplification par ACP de la portion du génome à analyser, le produit d'amplification est digéré par l'enzyme concernée, et le produit de la digestion est analysé par électrophorèse ; les homozygotes, pour l'un ou l'autre allèle, et les hétérozygotes sont distingués par le nombre et la taille des fragments de restriction. Cette méthode est rapide et reproductible. Elle présente en outre, du fait de l'amplification par PCR, l'avantage de pouvoir être effectuée à partir de très peu de matériel biologique.
Cependant, elle implique, comme pour la technique de base, la mise en oeuvre d'une étape d'analyse par électrophorèse qui ne convient pas à la détection en nombre, ou aux analyses de routine dans les laboratoires médicaux.
Le Brevet US 4 775 619 (Inventeur: URDEA) décrit un procédé de détection de séquences d'ADN dans lequel on procède à une hybridation sur support solide, entre un fragment d'ADN (analyte) susceptible de contenir la séquence d'intérêt, et un ou plusieurs oligonucléotides (sonde) dont l'un au moins est marqué, cette hybridation entraînant l'apparition d'un site de clivage spécifique, qui peut être en particulier un site de restriction. Le clivage de l'hybride au niveau de ce site entraîne la libération de la portion marquée, et l'hybridation est révélée par la détection du signal en résultant.
I1 est indiqué dans ce document que ce procédé permet de réduire le bruit de fond entraîné par la fixation non-spécifique de la sonde marquée sur le support solide. Toutefois, le signal résultant du clivage de l'hybride apparaît en fait comme relativement faible par exemple, dans une des expérimentations décrites dans le Brevet US 4 775 619 (Essai V et tableau II, page 20), qui a été effectuée sur un système modèle ne comprenant que des fragments de séquence définie, il apparaît que tous les hybrides formés comprennent un site BamHI et devraient être coupés lors du traitement par l'enzyme correspondante, ce qui aboutirait théoriquement au relargage de la quasi-totalité du marquage dans le milieu réactionnel ; or, en pratique, moins de 15% du marquage fixé au support est libéré dans le milieu après 18 heures de traitement par BamHI. La sensibilité de cette méthode ne paraît donc pas suffisante pour qu'elle puisse être appliquée dans le cas d'analyses telles que la détection d'hétérozygotie, où il faut pouvoir obtenir des variations de signal significatives, afin non seulement de détecter l'existence d'un site de restriction dans les hybrides formés, mais également évaluer quantitativement, dans la population d'hybrides, la proportion de ceux qui portent le site.
Les Inventeurs ont maintenant mis au point une méthode d'analyse d'un polymorphisme de restriction, pouvant être mise en oeuvre sur support solide, dans un tube à essai, ce qui permet de supprimer l'étape d'électrophorèse sur gel, et suffisamment sensible pour permettre de détecter la présence ou l'absence d'hétérozygotie.
La présente Invention a pour objet un procédé de détection de la présence d'un site de restriction spécifique d'une enzyme dans une séquence cible d'ADN, lequel procédé comprend au moins
- une étape au cours de laquelle on met en présence, en phase liquide, un fragment d'acide nucléique portant la séquence-cible et une sonde oligonucléotidique s'hybridant avec ladite séquence-cible, dans des conditions entrainant la formation d'un hybride entre ladite séquence cible et ladite sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible, et porte en outre un marquage permettant sa détection
- une étape au cours de laquelle on procède à la fixation dudit hybride sur un support solide, de manière à ce que le site de restriction éventuellement formé soit situé entre l'extrémité fixée au support et la portion de l'hybride portant le marquage
- une étape au cours de laquelle on procède au traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée
- une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique.
- une étape au cours de laquelle on met en présence, en phase liquide, un fragment d'acide nucléique portant la séquence-cible et une sonde oligonucléotidique s'hybridant avec ladite séquence-cible, dans des conditions entrainant la formation d'un hybride entre ladite séquence cible et ladite sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible, et porte en outre un marquage permettant sa détection
- une étape au cours de laquelle on procède à la fixation dudit hybride sur un support solide, de manière à ce que le site de restriction éventuellement formé soit situé entre l'extrémité fixée au support et la portion de l'hybride portant le marquage
- une étape au cours de laquelle on procède au traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée
- une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique.
La sonde oligonucléotidique doit former un hybride stable avec la séquence cible, que celle-ci comprenne ou non le site de restriction et, bien entendu, doit comprendre une séquence strictement homologue de celle du site de restriction recherché.
D'autre part, les Inventeurs ont constaté que la taille de la sonde oligonucléotidique jouait un rôle important pour la sensibilité et la reproductibilité du procédé de l'Invention. Pour obtenir les meilleurs résultats, cette taille doit être comprise entre 10 et 100 bases, de préférence inférieure à 50 bases, et très avantageusement inférieure à 30 bases. Par exemple, les
Inventeurs ont observé que l'utilisation d'une sonde de longueur comprise entre 15 et 25 bases permettait d'obtenir un hybride stable, et un rendement de digestion très élevé.
Inventeurs ont observé que l'utilisation d'une sonde de longueur comprise entre 15 et 25 bases permettait d'obtenir un hybride stable, et un rendement de digestion très élevé.
Avantageusement, le procédé conforme à l'Invention comprend une étape préalable d'amplification du fragment d'ADN portant la séquence cible. Cette amplification est effectuée in vitro par ACP (Amplification en Chaîne par Polymérase), ou toute autre méthode d'amplification, à partir de l'échantillon d'ADN à analyser.
Outre le fait que cette amplification préalable permet d'obtenir une quantité de matériel suffisant pour procéder à l'analyse dans de bonnes conditions, et ce, même à partir d'une faible quantité d'échantillon, les Inventeurs ont observé que, de façon surprenante, elle améliorait très significativement la reproductibilité des résultats obtenus d'un échantillon à 1' autre.
L'une des extrémités de l'hybride est pourvue d'un moyen de fixation au support solide ; ce moyen doit permettre d'opérer la fixation de l'hybride au support dans des conditions n'induisant pas la dénaturation dudit hybride ; il s'agira par exemple d'une molécule, telle que la biotine, capable d'établir une liaison d'affinité avec une autre molécule, telle que l'avidine, avec laquelle on aura préalablement recouvert le support.
Outre le couple biotine/avidine, d'autres moyens de fixation peuvent être envisagés il peut s'agir par exemple de l'un des composants d'un couple d'affinité tel qu'un couple de type haptène anticorps anti haptène.
Avantageusement, ledit moyen de fixation est associé (par exemple lié par liaison covalente), au fragment d'ADN portant la séquence cible. Cette association peut être effectuée en même temps que l'étape d'amplification ; par exemple, le fragment d'ADN portant la séquence-cible peut être amplifié en utilisant au moins une amorce biotinylée.
La sonde ou le fragment d'ADN portant la séquence cible sont marqués pour permettre la détection de l'hybride formé ; ce marquage doit être régiospécifique, afin d'être limité à la partie de l'hybride qui est détachée du support après coupure par l'enzyme de restriction.
N'importe quel type de marquage, radioactif ou non, peut être utilisé ; parmi les marqueurs radioactifs, on citera par exemple l'iode 125, le phosphore 32, etc parmi les marqueurs non radioactifs, on citera par exemple la biotine, ou l'un des composants d'un couple d'affinité (à condition, bien entendu, que le couple d'affinité utilisé comme moyen de marquage soit différent de celui utilisé comme moyen de fixation).
La digestion par l'enzyme de restriction s'effectue dans les conditions habituelles pour ce type de réaction. Les conditions à utiliser, qui dépendent de l'enzyme concernée, sont décrites dans de nombreux ouvrages techniques, tel par exemple celui de SAMBROOK,
FRISTSCH, et MANIATIS, [Molecular cloning : A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, (1989)].
FRISTSCH, et MANIATIS, [Molecular cloning : A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, (1989)].
Le résultat de la réaction enzymatique peut être évalué en déterminant soit le marquage relargué dans le milieu réactionnel, soit le marquage restant lié au support.
Le procédé conforme à l'Invention peut comprendre en outre une étape, consécutive à l'étape de fixation de l'hybride sur le support solide et précédant l'étape de digestion par l'enzyme de restriction, au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage de l'hybride marqué fixé au support. Dans ce cas, le résultat de la réaction enzymatique peut être évalué par rapport au marquage initial correspondant à l'hybride lié au support avant digestion.
Cette étape n'est toutefois pas indispensable : en effet, les Inventeurs ont constaté que grâce à la reproductibilité qui découle de l'amplification préalable du fragment d'ADN portant la séquence-cible, les résultats de la réaction de digestion par l'enzyme de restriction pouvaient être obtenus, et clairement interprétés, sans qu'il soit nécessaire de procéder préalablement à la détermination de la quantité d'hybride fixé au support.
Ceci permet de simplifier encore la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention.
La présente Invention englobe également des nécessaires de diagnostic comprenant l'ensemble des réactifs permettant la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'Invention.
Le procédé conforme à l'Invention présente l'avantage de ne pas nécessiter la mise en oeuvre d'une étape d'électrophorèse, et en outre permet d'obtenir des données numériques quantifiables. Il s'agit d'une technique fiable, bien adaptée à l'analyse rapide d'un grand nombre d'échantillons car elle est aisément automatisable, en utilisant un matériel similaire à celui mis en oeuvre pour les immuno-analyses courantes. Cette méthode peut donc aisément être mise en pratique dans des laboratoires d'analyses médicales.
En outre, de par sa sensibilité et sa reproductibilité, il convient tout particulièrement à la détection de la présence ou de l'absence d'hétérozygotie au niveau d'un locus d'intérêt. En effet, la variation de signal observée entre les trois possibilités (homozygote a/a, hétérozygote a/b, homozygote b/b) est suffisamment importante pour permettre de les différencier clairement.
En outre, les résultats sont reproductibles d'un échantillon à l'autre. Ceci permet d'observer directement les résultats de l'analyse, en s'affranchissant de la nécessité de procéder à un dosage précis, ce qui facilite la mise en oeuvre du procédé selon l'Invention avec très peu de matériel, par exemple, dans le cadre d'analyses sur le terrain.
L'exemple qui suit illustre l'application d'un procédé conforme à l'Invention pour détecter une perte d'hétérozygotie au niveau du gène P53 dans des échantillons de prélèvements colorectaux chez l'homme.
Une perte d'hétérozygotie à ce niveau a fréquemment été mise en évidence dans certains cancers du trac tus digestif chez l'homme.
Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont il ne constitue en aucune manière une limitation.
EXWPLE
Prélèvements de tissus
Les échantillons ont été obtenus à partir de prélèvements chirurgicaux effectués sur des patients atteints de cancer colorectal. Les tissus cancéreux et la muqueuse saine adjacente ont été prélevés sur le même patient. A partir de chaque biopsie, des fragments ont été prélevés pour l'analyse histologique. Le reste de tissu a été immédiatement congelé dans l'azote liquide et est conservé dans l'azote liquide en vue de l'extraction d'ADN.
Prélèvements de tissus
Les échantillons ont été obtenus à partir de prélèvements chirurgicaux effectués sur des patients atteints de cancer colorectal. Les tissus cancéreux et la muqueuse saine adjacente ont été prélevés sur le même patient. A partir de chaque biopsie, des fragments ont été prélevés pour l'analyse histologique. Le reste de tissu a été immédiatement congelé dans l'azote liquide et est conservé dans l'azote liquide en vue de l'extraction d'ADN.
Extraction d'ADN
Les tissus normaux ou tumoraux ont été homogénéisés. L'ADN a alors été extrait après digestion à la protéinase K en utilisant des techniques classiques [SAMBROOK, FRISTSCH, et MANIATIS, Molecular cloning A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)].
Les tissus normaux ou tumoraux ont été homogénéisés. L'ADN a alors été extrait après digestion à la protéinase K en utilisant des techniques classiques [SAMBROOK, FRISTSCH, et MANIATIS, Molecular cloning A laboratory manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)].
Chaque échantillon d'ADN extrait a été analysé en triple, en utilisant le procédé conforme à l'Invention. Une analyse par PCR-RFLP a également été effectuée à titre de comparaison.
Analyse de la perte d'hétérozygotie par la méthode conforme à l'invention
Amplification par ACP
L'amplification par ACP est effectuée à l'aide d'un jeu d'amorces dont l'une est biotinylée, qui encadrent le site du codon 72 de la protéine P53 (arginine CGC-proline CCC).
Amplification par ACP
L'amplification par ACP est effectuée à l'aide d'un jeu d'amorces dont l'une est biotinylée, qui encadrent le site du codon 72 de la protéine P53 (arginine CGC-proline CCC).
Les réactions d'amplification d'ADN ont été réalisées dans un volume total de 50 1, contenant 0,5g d'ADN génomique, 0,24 SM de chaque amorce, 200 CLAM de chaque déoxynucléotide triphosphate, 10 WM de Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM de MgC12, 50 mM de KC1 and 0,01% p/v de gélatine.
Préalablement à l'amplification, les échantillons ont été chauffés à 95 C pendant 5 minutes, puis 2,5 unités d'ADN polymérase Taq (PERKIN ELMER CETUS, Emeryville, CA) ont été ajoutés. L'ADN a ensuite été soumis à 30 cycles d'amplification (94 C, 1,50 minute 55 C, 1,50 minute ; 72 C, 2 minutes) en utilisant un "480
DNA Thermal Cycler" (PERKINS ELMER CETUS).
DNA Thermal Cycler" (PERKINS ELMER CETUS).
L'amplification a été effectuée dans des conditions expérimentales permettant d'éviter les faux positifs.
[KWOK et al., Nature, 339, p. 237-238, (1989)].
Synthèse et marquage des oligonucléotides
Les amorces oligonucléotidiques ainsi que les sondes, ont été synthétisées par la méthode classique des phosphoramidites et purifiées par chromatographie en phase inverse (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF-SUR-YVETTE,
France). Les amorces utilisées encadrent une région de 267 paires de bases comprenant le codon 72 dans l'exon 4 de la P53 [MERLO et al.]. La sonde oligonucléotidique de détection est complémentaire du brin antisens, et comprend le site de restriction BstUI (5'CGCG3').
Les amorces oligonucléotidiques ainsi que les sondes, ont été synthétisées par la méthode classique des phosphoramidites et purifiées par chromatographie en phase inverse (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF-SUR-YVETTE,
France). Les amorces utilisées encadrent une région de 267 paires de bases comprenant le codon 72 dans l'exon 4 de la P53 [MERLO et al.]. La sonde oligonucléotidique de détection est complémentaire du brin antisens, et comprend le site de restriction BstUI (5'CGCG3').
La séquence des différents oligonucléotides est la suivante
Amorce amont P53 5' TTGCCGTCCCAAGCAATGGAT3';
Amorce aval P 53 (biotinylée)
Bio 5' AGTCACAGACTTGGCTGTCCCAGA 3'
Afin d'éviter l'analyse de produits d'ACP non spécifiques, et afin d'introduire un marquage permettant la détection, les segments amplifiés ont été hybridés à une oligosonde, marquée à l'iode 125I, contenant la séquence de reconnaissance de BstUI.
Amorce amont P53 5' TTGCCGTCCCAAGCAATGGAT3';
Amorce aval P 53 (biotinylée)
Bio 5' AGTCACAGACTTGGCTGTCCCAGA 3'
Afin d'éviter l'analyse de produits d'ACP non spécifiques, et afin d'introduire un marquage permettant la détection, les segments amplifiés ont été hybridés à une oligosonde, marquée à l'iode 125I, contenant la séquence de reconnaissance de BstUI.
Sonde de détection 125I 5' GCTCCCCGCGTGGCCCCTGCA 3'.
Le marquage régio-spécifique des oligonucléotides par la biotine ou l'iode 125I a été effectué comme décrit par SAWAIGO et al. [Nucleic Acids
Res., 18, p. 3175-3183]. L'activité spécifique obtenue pour la sonde P53 marquée à l'iode 125I est d'approximativement 107 cpm par picomole d'oligonucléotides.
Res., 18, p. 3175-3183]. L'activité spécifique obtenue pour la sonde P53 marquée à l'iode 125I est d'approximativement 107 cpm par picomole d'oligonucléotides.
Hybridation en phase liquide
La sonde (21 bases) marquée à l'iode 125I (62 fmol, 500 000 cpm) a été hybridée au produit d'ACP biotinylé (20 R1) dans un volume final de 35 1. La réaction a été effectuée dans un appareillage "DNA
Thermal Cycler" dans les conditions suivantes 98'C pendant 10 minutes, associé à une étape à 58 C pendant 20 minutes.
La sonde (21 bases) marquée à l'iode 125I (62 fmol, 500 000 cpm) a été hybridée au produit d'ACP biotinylé (20 R1) dans un volume final de 35 1. La réaction a été effectuée dans un appareillage "DNA
Thermal Cycler" dans les conditions suivantes 98'C pendant 10 minutes, associé à une étape à 58 C pendant 20 minutes.
Après l'hybridation de l'oligosonde, l'analyse est effectuée dans le même tube par un procédé à deux étapes. Dans une première étape, la radioactivité totale liée (C1) est mesurée. Dans une seconde étape, les hybrides fixés sont mis en présence de l'enzyme BstUI, et la radioactivité restante, correspondant aux produits non digérés : (C2) est comptée. Les individus homozygotes b/b, homozygotes a/a, et hétérozygotes a/b (b est l'allèle contenant le site BstUI, et a est l'allèle dépourvu du site BstUI) peuvent ainsi être distingués.
Capture sur support solide car affinité
Les hybrides obtenus sont fixés par affinité sur des tubes recouverts d'avidine, selon le protocole suivant
30 111 du produit de la réaction d'hybridation ont été dilués dans 500 ,ul de tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, contenant 0,6 M de NaCl, puis incubés dans des tubes recouverts d'avidine (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF
SUR YVETTE, FRANCE). Après 1 heure à 37 C, les tubes ont été lavés deux fois dans le même tampon pendant 5 minutes et la radioactivité liée a été mesurée directement dans un compteur gamma.
Les hybrides obtenus sont fixés par affinité sur des tubes recouverts d'avidine, selon le protocole suivant
30 111 du produit de la réaction d'hybridation ont été dilués dans 500 ,ul de tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, contenant 0,6 M de NaCl, puis incubés dans des tubes recouverts d'avidine (CIS BIO INTERNATIONAL, GIF
SUR YVETTE, FRANCE). Après 1 heure à 37 C, les tubes ont été lavés deux fois dans le même tampon pendant 5 minutes et la radioactivité liée a été mesurée directement dans un compteur gamma.
Dans ces conditions, le signal C1 était de l'ordre de 25000 à 30000 cpm pour tous les ADN testés. Le signal non spécifique, déterminé sur une solution dépourvue de matrice d'ADN était toujours en dessous de 150 cpm.
Conditions d'hybridation et de diaestion enzvmatioue : Influence de la lonaueur de l'oliaosonde et de la quantité d'enzvme de restriction
Afin de définir les conditions de réaction permettant d'obtenir un signal reproductible et fiable, indépendant de la quantité d'ADN analysée, une étude de l'influence de la longueur de l'oligosonde et de la quantité d'enzyme de restriction a également été menée.
Afin de définir les conditions de réaction permettant d'obtenir un signal reproductible et fiable, indépendant de la quantité d'ADN analysée, une étude de l'influence de la longueur de l'oligosonde et de la quantité d'enzyme de restriction a également été menée.
L'étude de ces deux paramètres s'est faite sur trois types d'échantillon d'ADN (mesure en triple pour chaque échantillon), obtenus respectivement à partir d'un homozygote b/b, d'un hétérozygote b/a, et d'un homozygote a/a.
La stabilité de l'hybride et la radioactivité résiduelle liée au support après digestion ont été déterminées.
La digestion enzymatique a été effectuée directement sur les hybrides fixés par affinité au tube la quantité d'enzyme de restriction a été augmentée jusqu'à atteindre 200 unités par essai. Les hybrides fixés par affinité ont été mis à réagir en présence de 20\li de BstUI, pendant 2 heures, à 37 C, dans un volume final de 500tel de tampon de restriction. Après deux étapes de lavage comme décrit précédemment, la radioactivité correspondant aux hybrides non digérés a été mesurée.
La stabilité est évaluée par le pourcentage de radioactivité résiduelle liée au support après incubation de l'hybride dans les conditions de digestion, mais en l'absence d'enzyme de restriction.
Les résultats de ces expériences sont illustrés dans les tableaux I, II, III, IV, V, VI, et VII ci-après.
TABLEAU I
TABLEAU I
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 17953 <SEP> 14283 <SEP> 3118 <SEP> 21,83%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 16700 <SEP> 13287 <SEP> 3016 <SEP> 22,70%
<tb> Moyenne <SEP> 13785 <SEP> 3067 <SEP> 22,25%
<tb> <SEP> 12028 <SEP> 9569 <SEP> 2327 <SEP> 24,32%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 17447 <SEP> 13881 <SEP> 3310 <SEP> 23,85%
<tb> Moyenne <SEP> 11725 <SEP> 2818,5 <SEP> 24,04%
<tb> <SEP> 17322 <SEP> 13781 <SEP> 3345 <SEP> 24,27%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 20102 <SEP> 15993 <SEP> 4818 <SEP> 30,13%
<tb> Moyenne <SEP> 14887 <SEP> 4081,5 <SEP> 27,42%
<tb> <SEP> 12993 <SEP> 10337 <SEP> 3075 <SEP> 29,75%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16966 <SEP> 13498 <SEP> 3960 <SEP> 29,34%
<tb> Moyenne <SEP> 11918 <SEP> 3517,5 <SEP> 29,51%
<tb> <SEP> 18325 <SEP> 14579 <SEP> 5139 <SEP> 35,25%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 17227 <SEP> 13706 <SEP> 5337 <SEP> 38,94%
<tb> Moyenne <SEP> 14143 <SEP> 5238 <SEP> 37,04%
<tb>
Sonde de 21 bases
Homozygote b/b
Stabilité : 79,56%
TABLEAU II
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 17953 <SEP> 14283 <SEP> 3118 <SEP> 21,83%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 16700 <SEP> 13287 <SEP> 3016 <SEP> 22,70%
<tb> Moyenne <SEP> 13785 <SEP> 3067 <SEP> 22,25%
<tb> <SEP> 12028 <SEP> 9569 <SEP> 2327 <SEP> 24,32%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 17447 <SEP> 13881 <SEP> 3310 <SEP> 23,85%
<tb> Moyenne <SEP> 11725 <SEP> 2818,5 <SEP> 24,04%
<tb> <SEP> 17322 <SEP> 13781 <SEP> 3345 <SEP> 24,27%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 20102 <SEP> 15993 <SEP> 4818 <SEP> 30,13%
<tb> Moyenne <SEP> 14887 <SEP> 4081,5 <SEP> 27,42%
<tb> <SEP> 12993 <SEP> 10337 <SEP> 3075 <SEP> 29,75%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16966 <SEP> 13498 <SEP> 3960 <SEP> 29,34%
<tb> Moyenne <SEP> 11918 <SEP> 3517,5 <SEP> 29,51%
<tb> <SEP> 18325 <SEP> 14579 <SEP> 5139 <SEP> 35,25%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 17227 <SEP> 13706 <SEP> 5337 <SEP> 38,94%
<tb> Moyenne <SEP> 14143 <SEP> 5238 <SEP> 37,04%
<tb>
Sonde de 21 bases
Homozygote b/b
Stabilité : 79,56%
TABLEAU II
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 18530 <SEP> 14652 <SEP> 7803 <SEP> 53,26%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17405 <SEP> 13762 <SEP> 7568 <SEP> 54,99%
<tb> Moyenne <SEP> 14207 <SEP> 7685,5 <SEP> 54,10%
<tb> <SEP> 19858 <SEP> 15702 <SEP> 8840 <SEP> 56,30%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 19417 <SEP> 15353 <SEP> 7919 <SEP> 51,58%
<tb> Moyenne <SEP> 15527 <SEP> 8379,5 <SEP> 53,97%
<tb> <SEP> 22184 <SEP> 17541 <SEP> 9754 <SEP> 55,61%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 26443 <SEP> 20908 <SEP> 12336 <SEP> 59,00%
<tb> Moyenne <SEP> 19225 <SEP> 11045 <SEP> 57,45%
<tb> <SEP> 19477 <SEP> 15400 <SEP> 8663 <SEP> 56,25%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16839 <SEP> 13315 <SEP> 10326 <SEP> 77,55%
<tb> Moyenne <SEP> 14358 <SEP> 9494,5 <SEP> 66,13%
<tb> <SEP> 21377 <SEP> 16903 <SEP> 7795 <SEP> 46,12%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 19111 <SEP> 15111 <SEP> 9206 <SEP> 60,92%
<tb> Moyenne <SEP> 16007 <SEP> 8500,5 <SEP> 53,11%
<tb>
Sonde de 21 bases
Hétérozygote a/b
Stabilité : 79,07%
TABLEAU III
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 18530 <SEP> 14652 <SEP> 7803 <SEP> 53,26%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17405 <SEP> 13762 <SEP> 7568 <SEP> 54,99%
<tb> Moyenne <SEP> 14207 <SEP> 7685,5 <SEP> 54,10%
<tb> <SEP> 19858 <SEP> 15702 <SEP> 8840 <SEP> 56,30%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 19417 <SEP> 15353 <SEP> 7919 <SEP> 51,58%
<tb> Moyenne <SEP> 15527 <SEP> 8379,5 <SEP> 53,97%
<tb> <SEP> 22184 <SEP> 17541 <SEP> 9754 <SEP> 55,61%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 26443 <SEP> 20908 <SEP> 12336 <SEP> 59,00%
<tb> Moyenne <SEP> 19225 <SEP> 11045 <SEP> 57,45%
<tb> <SEP> 19477 <SEP> 15400 <SEP> 8663 <SEP> 56,25%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16839 <SEP> 13315 <SEP> 10326 <SEP> 77,55%
<tb> Moyenne <SEP> 14358 <SEP> 9494,5 <SEP> 66,13%
<tb> <SEP> 21377 <SEP> 16903 <SEP> 7795 <SEP> 46,12%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 19111 <SEP> 15111 <SEP> 9206 <SEP> 60,92%
<tb> Moyenne <SEP> 16007 <SEP> 8500,5 <SEP> 53,11%
<tb>
Sonde de 21 bases
Hétérozygote a/b
Stabilité : 79,07%
TABLEAU III
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 20413 <SEP> 16457 <SEP> 16322 <SEP> 99,18%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17506 <SEP> 14113 <SEP> 13568 <SEP> 96,14%
<tb> Moyenne <SEP> 15285 <SEP> 14945 <SEP> 97,77%
<tb> <SEP> 15317 <SEP> 12349 <SEP> 11923 <SEP> 96,55%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 17753 <SEP> 14312 <SEP> 14610 <SEP> 102,08%
<tb> Moyenne <SEP> 13331 <SEP> 13266,5 <SEP> 99,52%
<tb> <SEP> 15789 <SEP> 12729 <SEP> 12188 <SEP> 95,75%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 13305 <SEP> 10726 <SEP> 10894 <SEP> 101,56%
<tb> Moyenne <SEP> 11728 <SEP> 11541 <SEP> 98,41%
<tb> <SEP> 16397 <SEP> 13219 <SEP> 13273 <SEP> 100,41%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 17079 <SEP> 13769 <SEP> 13586 <SEP> 98,67%
<tb> Moyenne <SEP> 13494 <SEP> 13429,5 <SEP> 99,52%
<tb> <SEP> 15574 <SEP> 12556 <SEP> 12102 <SEP> 96,39%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 18023 <SEP> 14530 <SEP> 14597 <SEP> 100,46%
<tb> Moyenne <SEP> 13543 <SEP> 13349,5 <SEP> 98,57%
<tb>
Sonde de 21 bases
Homozygote a/a
Stabilité : 80,62%
TABLEAU IV
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 20413 <SEP> 16457 <SEP> 16322 <SEP> 99,18%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17506 <SEP> 14113 <SEP> 13568 <SEP> 96,14%
<tb> Moyenne <SEP> 15285 <SEP> 14945 <SEP> 97,77%
<tb> <SEP> 15317 <SEP> 12349 <SEP> 11923 <SEP> 96,55%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 17753 <SEP> 14312 <SEP> 14610 <SEP> 102,08%
<tb> Moyenne <SEP> 13331 <SEP> 13266,5 <SEP> 99,52%
<tb> <SEP> 15789 <SEP> 12729 <SEP> 12188 <SEP> 95,75%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 13305 <SEP> 10726 <SEP> 10894 <SEP> 101,56%
<tb> Moyenne <SEP> 11728 <SEP> 11541 <SEP> 98,41%
<tb> <SEP> 16397 <SEP> 13219 <SEP> 13273 <SEP> 100,41%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 17079 <SEP> 13769 <SEP> 13586 <SEP> 98,67%
<tb> Moyenne <SEP> 13494 <SEP> 13429,5 <SEP> 99,52%
<tb> <SEP> 15574 <SEP> 12556 <SEP> 12102 <SEP> 96,39%
<tb> 10 <SEP> U <SEP> 18023 <SEP> 14530 <SEP> 14597 <SEP> 100,46%
<tb> Moyenne <SEP> 13543 <SEP> 13349,5 <SEP> 98,57%
<tb>
Sonde de 21 bases
Homozygote a/a
Stabilité : 80,62%
TABLEAU IV
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%) <SEP>
<tb> <SEP> 14865 <SEP> 9414 <SEP> 3741 <SEP> 39,74%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 12732 <SEP> 8063 <SEP> 3304 <SEP> 40,98%
<tb> Moyenne <SEP> 8739 <SEP> 3522,5 <SEP> 40,31%
<tb> <SEP> 13362 <SEP> 8462 <SEP> 4448 <SEP> 52,56%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15490 <SEP> 9810 <SEP> 4777 <SEP> 48,70%
<tb> Moyenne <SEP> 9136 <SEP> 4612,5 <SEP> 50,49%
<tb> <SEP> 12467 <SEP> 7895 <SEP> 4335 <SEP> 54,91%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 13848 <SEP> 8770 <SEP> 5069 <SEP> 57,80%
<tb> Moyenne <SEP> 8333 <SEP> 4702,5 <SEP> 56,43%
<tb> <SEP> 11526 <SEP> 7299 <SEP> 3352 <SEP> 45,92%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 13911 <SEP> 8810 <SEP> 3933 <SEP> 44,64%
<tb> Moyenne <SEP> 8055 <SEP> 3642 <SEP> 45,22%
<tb>
Sonde de 31 bases
Homozygote b/b
Stabilité : 63,33%
TABLEAU V
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestif <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%) <SEP>
<tb> <SEP> 14865 <SEP> 9414 <SEP> 3741 <SEP> 39,74%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 12732 <SEP> 8063 <SEP> 3304 <SEP> 40,98%
<tb> Moyenne <SEP> 8739 <SEP> 3522,5 <SEP> 40,31%
<tb> <SEP> 13362 <SEP> 8462 <SEP> 4448 <SEP> 52,56%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15490 <SEP> 9810 <SEP> 4777 <SEP> 48,70%
<tb> Moyenne <SEP> 9136 <SEP> 4612,5 <SEP> 50,49%
<tb> <SEP> 12467 <SEP> 7895 <SEP> 4335 <SEP> 54,91%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 13848 <SEP> 8770 <SEP> 5069 <SEP> 57,80%
<tb> Moyenne <SEP> 8333 <SEP> 4702,5 <SEP> 56,43%
<tb> <SEP> 11526 <SEP> 7299 <SEP> 3352 <SEP> 45,92%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 13911 <SEP> 8810 <SEP> 3933 <SEP> 44,64%
<tb> Moyenne <SEP> 8055 <SEP> 3642 <SEP> 45,22%
<tb>
Sonde de 31 bases
Homozygote b/b
Stabilité : 63,33%
TABLEAU V
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 14300 <SEP> 9495 <SEP> 7291 <SEP> 76,79%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 15098 <SEP> 10025 <SEP> 7106 <SEP> 70,88%
<tb> Moyenne <SEP> 9760 <SEP> 7198,5 <SEP> 73,75%
<tb> <SEP> 13506 <SEP> 8968 <SEP> 7139 <SEP> 79,61%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15206 <SEP> 10097 <SEP> 7695 <SEP> 76,21%
<tb> Moyenne <SEP> 9532 <SEP> 7417 <SEP> 77,81%
<tb> <SEP> 18727 <SEP> 12435 <SEP> 8849 <SEP> 71,16%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 17107 <SEP> 11359 <SEP> 8249 <SEP> 72,62%
<tb> Moyenne <SEP> 11897 <SEP> 8549 <SEP> 71,86%
<tb> <SEP> 18703 <SEP> 12419 <SEP> 8988 <SEP> 72,37%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16431 <SEP> 10910 <SEP> 7092 <SEP> 65,00%
<tb> Moyenne <SEP> 11664 <SEP> 8040 <SEP> 68,93%
<tb>
Sonde de 31 bases
Hétérozygote a/b
Stabilité : 66,40%
TABLEAU VI
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 14300 <SEP> 9495 <SEP> 7291 <SEP> 76,79%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 15098 <SEP> 10025 <SEP> 7106 <SEP> 70,88%
<tb> Moyenne <SEP> 9760 <SEP> 7198,5 <SEP> 73,75%
<tb> <SEP> 13506 <SEP> 8968 <SEP> 7139 <SEP> 79,61%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15206 <SEP> 10097 <SEP> 7695 <SEP> 76,21%
<tb> Moyenne <SEP> 9532 <SEP> 7417 <SEP> 77,81%
<tb> <SEP> 18727 <SEP> 12435 <SEP> 8849 <SEP> 71,16%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 17107 <SEP> 11359 <SEP> 8249 <SEP> 72,62%
<tb> Moyenne <SEP> 11897 <SEP> 8549 <SEP> 71,86%
<tb> <SEP> 18703 <SEP> 12419 <SEP> 8988 <SEP> 72,37%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 16431 <SEP> 10910 <SEP> 7092 <SEP> 65,00%
<tb> Moyenne <SEP> 11664 <SEP> 8040 <SEP> 68,93%
<tb>
Sonde de 31 bases
Hétérozygote a/b
Stabilité : 66,40%
TABLEAU VI
<tb> Quantité <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> CPM <SEP> Radioactivité
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 17054 <SEP> 11460 <SEP> 12631 <SEP> 110,22%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17107 <SEP> 11496 <SEP> 13868 <SEP> 120,63%
<tb> Moyenne <SEP> 11478 <SEP> 13249,5 <SEP> 115,43%
<tb> <SEP> 12824 <SEP> 8618 <SEP> 9771 <SEP> 113,38%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15927 <SEP> 10703 <SEP> 12132 <SEP> 113,35%
<tb> Moyenne <SEP> 9660 <SEP> 10951,5 <SEP> 113,37%
<tb> <SEP> 15177 <SEP> 10199 <SEP> 12785 <SEP> 125,36%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 9442 <SEP> 6345 <SEP> 6446 <SEP> 101,59%
<tb> Moyenne <SEP> 8272 <SEP> 9615,5 <SEP> 116,24%
<tb> <SEP> 14312 <SEP> 9618 <SEP> 8831 <SEP> 91,82%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 11842 <SEP> 7958 <SEP> 7587 <SEP> 95,34%
<tb> Moyenne <SEP> 8788 <SEP> 8209 <SEP> 93,41%
<tb>
Sonde de 31 bases
Homozygote a/a
Stabilité : 67,20%
TABLEAU VII
<tb> d'enzyme <SEP> avant <SEP> corrigés <SEP> après <SEP> résiduelle
<tb> <SEP> digestion <SEP> digestion <SEP> après
<tb> <SEP> digestion <SEP> (%)
<tb> <SEP> 17054 <SEP> 11460 <SEP> 12631 <SEP> 110,22%
<tb> 200 <SEP> U <SEP> 17107 <SEP> 11496 <SEP> 13868 <SEP> 120,63%
<tb> Moyenne <SEP> 11478 <SEP> 13249,5 <SEP> 115,43%
<tb> <SEP> 12824 <SEP> 8618 <SEP> 9771 <SEP> 113,38%
<tb> 100 <SEP> U <SEP> 15927 <SEP> 10703 <SEP> 12132 <SEP> 113,35%
<tb> Moyenne <SEP> 9660 <SEP> 10951,5 <SEP> 113,37%
<tb> <SEP> 15177 <SEP> 10199 <SEP> 12785 <SEP> 125,36%
<tb> 50 <SEP> U <SEP> 9442 <SEP> 6345 <SEP> 6446 <SEP> 101,59%
<tb> Moyenne <SEP> 8272 <SEP> 9615,5 <SEP> 116,24%
<tb> <SEP> 14312 <SEP> 9618 <SEP> 8831 <SEP> 91,82%
<tb> 25 <SEP> U <SEP> 11842 <SEP> 7958 <SEP> 7587 <SEP> 95,34%
<tb> Moyenne <SEP> 8788 <SEP> 8209 <SEP> 93,41%
<tb>
Sonde de 31 bases
Homozygote a/a
Stabilité : 67,20%
TABLEAU VII
<tb> <SEP> HOMOZYGOTES <SEP> HETEROZYGOTES <SEP> HOMOZYGOTES
<tb> <SEP> b/b <SEP> b/a <SEP> a/a
<tb> Quantité <SEP> Digestion <SEP> CV <SEP> Digestion <SEP> CV <SEP> Digestif <SEP> CV
<tb> Enzyme
<tb> (unités) <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> <SEP> 200 <SEP> 79,8 <SEP> 3,6 <SEP> 49,3 <SEP> 4,2 <SEP> 0,4 <SEP> 2,9
<tb> <SEP> 100 <SEP> 76,0 <SEP> 4,2 <SEP> 46,2 <SEP> 3,9 <SEP> 0,4 <SEP> 2,4
<tb> <SEP> 50 <SEP> 72,6 <SEP> 3,9 <SEP> 42,5 <SEP> 5,1 <SEP> 1,6 <SEP> 1,9
<tb> <SEP> 25 <SEP> 70,5 <SEP> 5,7 <SEP> 33,8 <SEP> 6,2 <SEP> 0,4 <SEP> 1,8
<tb> <SEP> 10 <SEP> 63,0 <SEP> 9,0 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 1,4 <SEP> 2,9
<tb>
Sonde de 21 bases
Le pourcentage de digestion pour des échantillons homozygotes a/a varie de 0,4% à 1,6%, pour des hétérozygotes b/a, de 33,8% à 49,3%, et pour des homozygotes b/b, de 63% à 79,8%. Le coefficient de variation (CV), est défini comme étant le rapport (écart-type/moyenne) x 100 des pourcentages de digestion mesures.
<tb> <SEP> b/b <SEP> b/a <SEP> a/a
<tb> Quantité <SEP> Digestion <SEP> CV <SEP> Digestion <SEP> CV <SEP> Digestif <SEP> CV
<tb> Enzyme
<tb> (unités) <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> <SEP> 200 <SEP> 79,8 <SEP> 3,6 <SEP> 49,3 <SEP> 4,2 <SEP> 0,4 <SEP> 2,9
<tb> <SEP> 100 <SEP> 76,0 <SEP> 4,2 <SEP> 46,2 <SEP> 3,9 <SEP> 0,4 <SEP> 2,4
<tb> <SEP> 50 <SEP> 72,6 <SEP> 3,9 <SEP> 42,5 <SEP> 5,1 <SEP> 1,6 <SEP> 1,9
<tb> <SEP> 25 <SEP> 70,5 <SEP> 5,7 <SEP> 33,8 <SEP> 6,2 <SEP> 0,4 <SEP> 1,8
<tb> <SEP> 10 <SEP> 63,0 <SEP> 9,0 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> 1,4 <SEP> 2,9
<tb>
Sonde de 21 bases
Le pourcentage de digestion pour des échantillons homozygotes a/a varie de 0,4% à 1,6%, pour des hétérozygotes b/a, de 33,8% à 49,3%, et pour des homozygotes b/b, de 63% à 79,8%. Le coefficient de variation (CV), est défini comme étant le rapport (écart-type/moyenne) x 100 des pourcentages de digestion mesures.
Afin d'augmenter le niveau de la digestion, jusqu'à 100% (niveau théorique pour des homozygotes b/b), des expériences ont été effectuées avec des quantités d'enzyme plus importantes, des temps de digestion plus longs, et des températures de réaction plus élevées. Ceci n'a toutefois pas permis d'améliorer le rendement de l'essai. La radioactivité restante pour les homozygotes b/b est sans doute due à une population d'hybrides fixés sur les tubes recouverts d'avidine, et qui ne sont pas accessibles à la digestion par l'enzyme de restriction.
Cependant, le pourcentage de non digestion est constant quel que soit 1'ADN homozygote b/b analysé. Cette digestion enzymatique en phase solide est reproductible, et produit des valeurs de CV qui ne sont pas plus élevées que 9%, dans le cas de 10 U d'enzyme, et inférieures à 4,2% à partir de 100 U d'enzyme.
Détection de perte dZhétérozygotie par technique PCR-RFLP et par la méthode conforme à 1'Invention : Essai comparatif.
Pour l'analyse de la perte d'hétérozygotie par méthode électrophorétique PCR-RFLP, un aliquot de 20 1 du produit d'ACP a été directement incubé avec 30 unités d'enzyme BstUI (SIGMA, St. Louis, MO). Les produits d'amplification digérés obtenus à partir des tissus normaux ou tumoraux ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose.
Dans la technique PCR-RFLP, 1'ADN normal d'un patient hétérozygote montre trois bandes au locus correspondant à l'exon 4 de la P53 : une bande de 267 bp de l'allèle a, dépourvu du site de restriction BstUI, et deux bandes plus faibles, correspondant à l'allèle b. On peut conclure à la perte d'hétérozygotie au niveau du gène de la P53 quand 1'ADN tumoral d'un patient fait apparaître la perte, ou bien de la bande non digérée, ou bien des bandes digérées.
Dans la méthode d'analyse conforme à l'Invention (Tableau VIII), les individus hét sans qu'il soit nécessaire de déterminer au préalable la valeur du signal C1
TABLEAU VIII
TABLEAU VIII
<tb> <SEP> Signal <SEP> "C1" <SEP> Signal <SEP> "C2" <SEP> Perte
<tb> <SEP> d'hétérozy
<tb> <SEP> tie
<tb> Génotype <SEP> cpm <SEP> CV <SEP> % <SEP> cpm <SEP> CV <SEP> %
<tb> a/b <SEP> 26152 <SEP> 4,2 <SEP> 15429 <SEP> 8,4 <SEP> non
<tb> a <SEP> 25528 <SEP> 5,3 <SEP> 24930 <SEP> 4,2 <SEP> oui
<tb> b <SEP> 27187 <SEP> 3,6 <SEP> 5097 <SEP> 6,7 <SEP> oui
<tb>
<tb> <SEP> d'hétérozy
<tb> <SEP> tie
<tb> Génotype <SEP> cpm <SEP> CV <SEP> % <SEP> cpm <SEP> CV <SEP> %
<tb> a/b <SEP> 26152 <SEP> 4,2 <SEP> 15429 <SEP> 8,4 <SEP> non
<tb> a <SEP> 25528 <SEP> 5,3 <SEP> 24930 <SEP> 4,2 <SEP> oui
<tb> b <SEP> 27187 <SEP> 3,6 <SEP> 5097 <SEP> 6,7 <SEP> oui
<tb>
Claims (10)
1) Procédé de détection de la présence d'un site de restriction spécifique d'une enzyme dans une séquence-cible d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins
- une étape au cours de laquelle on met en présence, en phase liquide, un fragment d'acide nucléique portant la séquence-cible et une sonde oligonucléotidique s'hybridant avec ladite séquence-cible, dans des conditions entrainant la formation d'un hybride entre ladite séquence cible et ladite sonde oligonucléotidique, de manière à ce que l'hybride formé comprenne le site de restriction recherché s'il est présent dans la séquence cible, et porte en outre un marquage permettant sa détection
- une étape au cours de laquelle on procède à la fixation dudit hybride sur un support solide, de manière à ce que le site de restriction éventuellement formé soit situé entre l'extrémité fixée au support et la portion de l'hybride portant le marquage
- une étape au cours de laquelle on procède au traitement de l'hybride par l'enzyme de restriction considérée
- une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une sonde oligonucléotidique dont la longueur est comprise entre 10 et 100 bases.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'amplification de la séquence cible.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par
ACP.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fragment d'ADN contenant la séquence-cible porte un marquage permettant la détection de l'hybride.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la sonde oligonucléotique porte un marquage permettant la détection de l'hybride.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à ó, caractérisé en ce que la fixation de l'hybride au support est effectuée par liaison d'affinité.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape consécutive à l'étape de fixation de l'hybride sur le support solide et précédant l'étape de digestion par l'enzyme de restriction, au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage de l'hybride marqué fixé au support.
9) Nécessaire de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des réactifs permettant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10) Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour déterminer la présence ou l'absence d'hétérozygotie à un locus donné.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9404097A FR2718461B1 (fr) | 1994-04-07 | 1994-04-07 | Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9404097A FR2718461B1 (fr) | 1994-04-07 | 1994-04-07 | Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2718461A1 true FR2718461A1 (fr) | 1995-10-13 |
| FR2718461B1 FR2718461B1 (fr) | 1996-05-15 |
Family
ID=9461839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9404097A Expired - Fee Related FR2718461B1 (fr) | 1994-04-07 | 1994-04-07 | Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2718461B1 (fr) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998053098A1 (fr) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) | Procede et trousse pour la detection de mutations dans des adn a l'aide d'enzymes de restriction |
| WO2002050305A1 (fr) * | 2000-12-20 | 2002-06-27 | Murdoch Childrens Research Institute | Procede permettant de detecter si un organisme est homozygote ou heterozygote a l'aide d'amorces marquees et du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (rflp) |
| EP1256626A1 (fr) * | 2000-01-27 | 2002-11-13 | Toyo Kohan Co., Ltd. | Support destine a fixer des nucleotides et procede de production correspondant |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0164054A1 (fr) * | 1984-05-29 | 1985-12-11 | Cetus Corporation | Méthode de détection des sites de restriction polymorphiques et des séquences d'acides nucléiques |
| EP0237362A1 (fr) * | 1986-03-13 | 1987-09-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Procédé et nécessaire pour la détection des variations de nucléotides spécifiques et de polymorphismes génétiques dans les acides nucléiques |
| US4775619A (en) * | 1984-10-16 | 1988-10-04 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
| WO1989010414A1 (fr) * | 1988-04-28 | 1989-11-02 | Robert Bruce Wallace | Polymorphismes (asp) a sequences amplifiees |
| EP0530526A1 (fr) * | 1991-08-13 | 1993-03-10 | Bayer Corporation | Nouvelle Méthode d'amplification pour essais de polynucléotides |
-
1994
- 1994-04-07 FR FR9404097A patent/FR2718461B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0164054A1 (fr) * | 1984-05-29 | 1985-12-11 | Cetus Corporation | Méthode de détection des sites de restriction polymorphiques et des séquences d'acides nucléiques |
| US4775619A (en) * | 1984-10-16 | 1988-10-04 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
| EP0237362A1 (fr) * | 1986-03-13 | 1987-09-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Procédé et nécessaire pour la détection des variations de nucléotides spécifiques et de polymorphismes génétiques dans les acides nucléiques |
| WO1989010414A1 (fr) * | 1988-04-28 | 1989-11-02 | Robert Bruce Wallace | Polymorphismes (asp) a sequences amplifiees |
| EP0530526A1 (fr) * | 1991-08-13 | 1993-03-10 | Bayer Corporation | Nouvelle Méthode d'amplification pour essais de polynucléotides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A-C. SYVÄNEN ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 16, no. 23, 1988, ARLINGTON, VIRGINIA US, pages 11327 - 11338 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998053098A1 (fr) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) | Procede et trousse pour la detection de mutations dans des adn a l'aide d'enzymes de restriction |
| EP1256626A1 (fr) * | 2000-01-27 | 2002-11-13 | Toyo Kohan Co., Ltd. | Support destine a fixer des nucleotides et procede de production correspondant |
| EP1256626A4 (fr) * | 2000-01-27 | 2003-06-18 | Toyo Kohan Co Ltd | Support destine a fixer des nucleotides et procede de production correspondant |
| WO2002050305A1 (fr) * | 2000-12-20 | 2002-06-27 | Murdoch Childrens Research Institute | Procede permettant de detecter si un organisme est homozygote ou heterozygote a l'aide d'amorces marquees et du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (rflp) |
| US7459271B2 (en) | 2000-12-20 | 2008-12-02 | Murdoch Childrens Research Institute | Method for detecting whether an organism is homozygous or heterozygous using labelled primers and RFLP |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2718461B1 (fr) | 1996-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5952178A (en) | Methods for disease diagnosis from stool samples | |
| KR101078977B1 (ko) | 유전자 변이 검출법 | |
| EP0664339A1 (fr) | Methode de discrimination des acides nucleiques et necessaire d'essai a cette fin | |
| CA2262403A1 (fr) | Biomarqueurs et cibles de diagnostic, de pronostic et de traitement du cancer de la prostate | |
| EP0203143A1 (fr) | Analyse des sequences d'acide nucleique, notamment des lesions genetiques. | |
| CH647870A5 (fr) | Procede d'analyse d'une sequence ou fragment determine d'acide nucleique et moyens de mise en oeuvre du procede. | |
| JP2003530860A (ja) | 新生又は非新生細胞の検出方法 | |
| CA2362527A1 (fr) | Nouveau gene specifique a la prostate servant au diagnostic, au pronostic et au traitement du cancer de la prostate | |
| Reja et al. | Tyrosine hydroxylase gene expression in ventrolateral medulla oblongata of WKY and SHR: a quantitative real-time polymerase chain reaction study | |
| US8153370B2 (en) | RNA from cytology samples to diagnose disease | |
| TW202305143A (zh) | 用於準確的平行定量核酸的高靈敏度方法 | |
| FR2810677A1 (fr) | Procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate et kit de mise en oeuvre | |
| FR2746413A1 (fr) | Detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal | |
| EP0362042B1 (fr) | Procédé d'analyse d'une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN, réactifs et nécessaires pour sa mise en oeuvre | |
| FR2718461A1 (fr) | Procédé de détection d'un site de restriction dans une séquence d'ADN. | |
| FR2639358A1 (fr) | Sondes d'hybridation et procede pour la detection de la presence ou de l'absence d'au moins une sequence variante en un seul test | |
| FR2679252A1 (fr) | Systeme de sondes permettant d'effectuer le typage hla dr, et procede de typage utilisant lesdites sondes. | |
| WO1997046700A1 (fr) | Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 | |
| EP2235218B1 (fr) | Methode, procede, et kit de diagnostic, pronostic du cancer colorectal | |
| WO2015036705A1 (fr) | Méthode de diagnostic des hémopathies malignes et kit associé | |
| WO2001086288A2 (fr) | Methode et dispositif permettant un diagnostic precoce d'une tumeur de la vessie dans des prelevements d'urine | |
| US20240159742A1 (en) | Epigenetic quantification using dna hybridization-based single-molecule immunofluorescent imaging | |
| US20230408508A1 (en) | System and method for diagnosis of oral disease | |
| JP2905192B2 (ja) | 遺伝子発現の定量方法 | |
| Absalan et al. | 3C based DNA hybridization method for chromosomal translocation screening |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |