FR3106596A1 - Procede de genotypage hla simple et rapide - Google Patents
Procede de genotypage hla simple et rapide Download PDFInfo
- Publication number
- FR3106596A1 FR3106596A1 FR2000775A FR2000775A FR3106596A1 FR 3106596 A1 FR3106596 A1 FR 3106596A1 FR 2000775 A FR2000775 A FR 2000775A FR 2000775 A FR2000775 A FR 2000775A FR 3106596 A1 FR3106596 A1 FR 3106596A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- seq
- primers
- hla
- sequence
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 52
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 27
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 22
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010022941 Iridocyclitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010041347 Somnambulism Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 201000004612 anterior uveitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 201000003631 narcolepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L’invention a trait à un procédé de génotypage du système HLA permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage HLA comportant une première étape d’amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique. L’invention est plus particulièrement appliquée au génotypage avec une résolution G groupe du locus HLA-DRB, un gène majeur dans la détermination du typage HLA.
Description
L’invention a trait à un procédé de génotypage du système HLA permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage HLA comportant une première étape d’amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique. L’invention est plus particulièrement appliquée au génotypage avec une résolution G groupe du locus HLA-DRB, un gène majeur dans la détermination du typage HLA.
Le systèmehu man leucocyte antigen(HLA), aussi appelé complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), est constitué par un ensemble de gènes très polymorphes. Il est situé sur la bras court du chromosome 6 et s’étend sur une distance comprise entre 3 et 4 mégabases, divisée en trois régions: (i) la région de Classe I télomérique (loci HLA A, B, C), (ii) la région de Classe II centromérique (loci HLA DRB, DQB et DPB) et (iii). Des dizaines de nouveaux allèles de ces gènes sont décrits chaque année; ils sont nommés et répertoriés dans une classification internationale identifiée sous le nom de «Nomenclature HLA».
Le génotypage du HLA est associé à la préparation et au suivi de greffe mais permet également l’identification de marqueurs de prédisposition à certaines maladies autoimmunes, telles que le lupus érythémateux, la myasthénie acquise, le syndrome de Sjögren et la sclérose en plaques, mais aussi à différents cancers, au diabète de type I, et à d’autres maladies moins fréquentes comme l’hépatite chronique active, l’uvéite antérieure, le somnanbulisme, la narcolepsie …
Les méthodes actuelles de génotypage HLA sont principalement basées sur la biologie moléculaire, notamment le séquençage à haut débit, et des kits commerciaux facilitent leur mise en œuvre.
Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Generation Sequencing) permet d’opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant: Les séquences à analyser sont tout d’abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise.
Afin de permettre un multiplexage élevé et dans ce contexte assurer la stabilité des duplex d’ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, des bases LNA™(Locked Nucleix Acid) sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé.
Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple.
Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d’enrichir la librairie en séquences d’intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR).
Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélanger des échantillons provenant de patients différents. Afin d’identifier les séquences provenant d’un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l’étape d’amplification par l’ajout de séquences étiquettes ou «index». La méthode de PCR indexée est connue de l’homme du métier et décrite par exemple dans l’article de Stahlberg A.et al.(Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11)
Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l’aide d’un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l’ADN est mise en œuvre pour augmenter l’amplitude de lecture des séquences. Cette méthode est appliquée au génotypage HLA, en particulier des gènes HLA-A, B, HLA-C et HLA-DQB1.
Le document EP 1964929 B1 décrit un procédé et un kit de génotypage par PCR en temps réel au moyen d'amorces et de sondes spécifiques qui permettent d'obtenir un niveau élevé de sous-typage du locus completHLA-B. Cette méthode repose sur une étape d’amplification par PCR de séquences d’intérêt en utilisant une batterie de conteneurs contenant chacun un couple d’amorces spécifiques d’une séquence à amplifier et un couple de sondes marquées avec un marqueur fluorescent, suivie d’une étape de détection des signaux fluorescents des sondes et une analyse des températures de fusion des sondes hybridées et enfin d’une étape de comparaison du motif des températures de fusion par rapport à un référentiel de sorte à déterminer l’allèle amplifié. L’interprétation de l’allèle en présence est obtenue en 65 minutes.
Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d’un génotypage depuis la préparation de l’échantillon jusqu’à l’obtention du résultat qui s’étale sur plusieurs jours.
Il existe un besoin de disposer d’une méthode de séquençage des gènes polymorphes du systèmes HLA précise et rapide à coût raisonnable.
La présente invention concerne un procédé de génotypage du système HLA à partir d’échantillons d’ADN comprenant:
a . une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d’au moins un gène du système HLA, dans laquelle:
- ledit au moins un gène est le HLA-DRB;
- lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA-DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et
- chacune desdites amorces comprend en 3’ une séquence universelle et une séquence stabilisatrice;
b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base ™mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d’une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage.
La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée en système microfluidique et d’un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™.
Avantages de l’invention
La méthode de génotypage selon l’invention présente plusieurs avantages: elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d’échantillons.
Elle combine une PCR indexée réalisée dans un système microfluidique (gain de temps et de matériel) avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité).
Cette méthode est simple car 100% automatisée. Elle est proposée sous la forme d’un kit prêt à l’emploi. Ce format limite les manipulations par l’expérimentateur et donc les risques d’erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer.
Cette méthode est rapide puisque le résultat est obtenu en moins de 48 heures. En effet, il faut compter 6h15 pour la préparation de la banque, 32h pour le séquençage et 3h30 environ pour l’analyse, et ceci quel que soit le nombre de patients diagnostiqués.
Elle est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage efficace et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s’inscrit dans une démarche de maitrise des coûts de santé publique et de productivité.
Cette méthode est flexible, les combinaisons d’amorces peuvent être adaptées au cours du temps pour suivre l’évolution de la nomenclature HLA et assurer une grande précision de génotypage au regard de l’état des connaissances du système HLA.
De plus, la méthode permet de détecter les nouveaux allèles de la nomenclature HLA sans modification, dès lors que ces allèles sont amplifiés par le jeu d’amorces existant, mais également de détecter de nouveaux allèles non encore répertoriés dans la nomenclature HLA mais correspondant à des SNP («Single Nucleotide Polymorphisme» ou mutation ponctuelle).
Grace à ces deux aspects – adaptation des amorces et détection de tous les allèles amplifiés sur les sites polymporphes – la méthode permet l’identification optimisée des allèles constitutifs d’un génotypage HLA
Elle permet le traitement d’un grand nombre d’échantillons en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle du kit, il est possible de génotyper en même temps 48 patients.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Un premier objet de l’invention concerne un procédé de génotypage du système HLA à partir d’échantillons d’ADN comprenant:
a . une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d’au moins un gène du système HLA, dans laquelle:
- ledit au moins un gène est le HLA-DRB;
- lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA-DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et
- chacune desdites amorces comprend en 3’ une séquence universelle et une séquence stabilisatrice;
b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Par «séquence stabilisatrice» au sens de l’invention, on entend une séquence de 8 à 12 nucléotides, à savoir 8, 9, 10, 11 ou 12 nucléotides. De plus, ces séquences sont riches en G et C c’est-à-dire qu’elles contiennent entre 45% et 65% de bases G et/ou C.
Dans un mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices sont des séquences de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, ce sont des séquences de 10 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation particulier, les séquences stabilisatrices contiennent de 50% à 60% de bases G et/ou C. A titre d’exemple, une telle séquence stabilisatrice a 10 nucléotides et contient 5 à 6 bases G et/ou C.
Les conditions de «faible multiplexage» s’entendent de conditions permettant d’amplifier une seule cible, voire 2, 3 ou 4 cibles simultanément dans un même mélange réactionnel.
Par «séquence universelle» au sens de l’invention, on entend une séquence définie qui sera utilisée dans tous les amplicons. La méthode met en réalité en œuvre deux types de séquences universelles, une séquence sens et une séquence antisens de sorte à pouvoir définir l’orientation des séquences amplifiées.
L’étape a. d’amplification des séquences d’intérêt repose sur une technologie de PCR indexée permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l’aide d’une étiquette spécifique de l’échantillon. De plus, elle est mise en œuvre en système microfluidique.
Elle peut être résumée comme suit:
- Conception des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques à amplifier et préparation de mélanges réactionnels pouvant combiner plusieurs couples d’amorces (simplexage ou multiplexage faible)
- Préparation des échantillons biologiques à analyser (normalisation de la concentration)
- Réaction d’amplification des séquences par PCR, de préférence dans un système microfluidique (pour gain de temps et de matériel), et ajout d’étiquettes spécifiques de l’échantillon sur chaque séquence amplifiée. Cette réaction met en œuvre deux types d’amorces simultanément:
- des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces sens et antisens comprenant chacune une séquence universelle située à leur extrémité 3’, caractérisées en ce que les séquences universelles contiennent à l’extrémité 5’ (entre l’amorce spécifique et la séquence universelle) une séquence stabilisatrice d’une dizaine de nucléotides (généralement entre 8 et 12 nucléotides) constituée de 45% à 65% de nucléotides G ou C;
- des couples amorces sens et antisens comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles sens et antisens respectivement et une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
- Récupération, purification et quantification des produits de PCR indexés (amplicons) en vue de leur séquençage.
Une telle technologie peut être par exemple basée sur celle développée par la société Fluidigm («Integrated Fluidic Circuit» ou IFC). Utiliser une telle technologie, outre le gain de temps, permet de travailler dans des conditions standardisées.
Dans un mode de réalisation préféré, les amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.
L’invention fournit 9 couples d’amorces spécifiques de l’exon 2 du gène HLA-DRB. Ces amorces permettent d’amplifier l’ensemble des allèles connus à ce jour pour ce locus. Elles sont représentées par les séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.18.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, l’étape d’amplification met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation des séquences amplifiées (dites «amorces d’indexation») de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.21. Ces amorces comprennent:
- au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et
- une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage,
l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Par «index» au sens de l’invention, on entend une séquence utilisée en tant qu’étiquette ou code-barre. Dans le contexte d’un séquençage NGS, les index sont des séquences courtes polymorphes. Un index particulier unique est associé aux échantillons provenant d’un même patient et permet l’étiquetage des séquences de ce patient lors de l’étape d’amplification. Les échantillons provenant de différents patients étant mélangés lors du séquençage, ces index servent à savoir à quel patient associer les séquences après analyse.
Par «adaptateur nécessaire au séquençage» au sens de l’invention, on entend une séquence permettant la fixation des séquences sur un support en vue de leur séquençage. Des exemples de séquences de fixation nécessaires pour le séquençage utilisables selon l’invention sont les séquences SEQ ID NO.24 et SEQ ID NO.25 Il s’agit des adapteurs «P5» et «P7» proposés par la société Illumina® et adaptés au séquençage NGS. Ces exemples sont non limitatifs car l’homme du métier peut utiliser d’autres systèmes adaptateurs en fonction de la technologie NGS employée.
L’amplification des séquences d’ADN dans un système microfluidique permet de réaliser 48 PCR par échantillon et de traiter 48 échantillons différents simultanément (soit un total de 2304 chambres réactionnelles traitées en une seule fois), les produits PCR portant chacun une étiquette particulière spécifique de l’échantillon. Ainsi, il est possible de regrouper et mélanger tous les produits PCR afin d’effectuer une seule réaction de séquençage. Le résultat du séquençage fournit alors deux informations par séquence: la lecture de la séquence d’intérêt et l’identification de l’échantillon d’où provient cette séquence. Ainsi, il est possible de réaliser un génotypage HLA complet pour 48 patients simultanément.
La méthode de génotypage selon l’invention peut être réalisée indifféremment à partir d’ADN d’origine humaine ou animale.
L’étape b. de séquençage repose sur une technologie de séquençage à haut débit telle que la technologie NGS développée notamment par la société Illumina.
Ce type de technologie implique une Tm déterminée (imposée par la technologie utilisée, en d’autres termes paramétrée par le fournisseur). Cette Tm s’avère trop élevée si l’on souhaite séquencer des amplicons obtenus via une PCR indexée en système microfluidique. En effet, ces amorces configurées pour fonctionner en système microfluidique, et dont les séquences complémentaires sont ensuite utilisées lors de l’étape d’amplification ont généralement une Tm plus faible (notamment parce qu’elles sont courtes), ce qui génèrent des problèmes d’instabilité. Dans un tel cas, il est classiquement recommandé d’intégrer des bases LNA™dans les séquences lors de l’amplification pour que les duplex formés avec les amorces de séquençage et de lecture des index lors du séquençage soient stables. Or, l’ajout de ces bases LNA™est couteux et constituent des étapes supplémentaires dans la méthode.
De manière très intéressante, les inventeurs ont démontré que des séquences d’une dizaine de nucléotides, appelées «séquences stabilisatrices» permettent de conserver un degré d’hybridation suffisant pour que le séquençage NGS se déroule correctement même lorsque la température de demi-hybridation (Tm) est élevée. Ainsi, ils ont montré que l’effet stabilisateur des bases LNA™peut être remplacé par l’ajout d’une séquence stabilisatrice et que cette séquence est suffisante pour le résultat du séquençage soit aussi fiable que lorsque des bases LNA™sont utilisées. Le fait de s’affranchir de l’utilisation de bases LNA™rend la méthode plus simple et moins coûteuse. Ainsi, la présente invention propose pour la première fois de combiner une PCR indexée en système microfluidique avec un séquençage NGS pour la réalisation d ’un génotypage du système HLA dans une méthode simple et rapide à mettre en œuvre, et dont le coût est maitrisé. La simplicité et la rapidité sont d’autant plus remarquables qu’un kit prêt à l’emploi pour la mise en œuvre de ce procédé est proposé.
L’étape b. du procédé selon l’invention est réalisée à l’aide des amorces de séquençage et de lecture d’index, dont aucune ne contient de bases LNA™mais dont chacune contient une séquence stabilisatrice, à savoir:
- un couple d’amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO.22; ces amorces s’hybrident aux séquences universelles et comprennent une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’; elles permettent d’amplifier les séquences d’intérêt pour le séquençage;
- une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID NO.23; elle s’hybride à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice; cette amorce permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.
Il est à noter que les séquences stabilisatrices des amorces de séquençage et de l’amorce de lecture d’index sont complémentaires des séquences stabilisatrices présentes sur les séquences amplifiées en vue du séquençage. En d’autres termes, ces séquences stabilisatrices ont les mêmes séquences que celles présentes dans les amorces spécifiques.
Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, le procédé met en jeu des couples d’amorces spécifiques des autres gènes du système HLA de sorte à obtenir une cartographique complète des allèles du patient. Ainsi, la méthode peut inclure notamment un génotypage d’au moins un gène choisi parmi les gènes HLA A, HLA B, HLA C, DRB, DQA, DQB, DPA et DPB. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la méthode inclut le génotypage de tous les gènes du système HLA selon le même principe que celui décrit précédemment pour le gène DRB, et permet l’amplification de tout ou partie de l’ensemble des allèles connus à un temps t.
Une spécificité du présent procédé réside dans le nombre élevé de cibles amplifiées qui apporte ainsi une grande diversité de séquences amplifiées. Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’utiliser de témoin de diversité de bases lors du séquençage.
Un second objet de l’invention concerne un kit pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™, destiné au génotypage du système HLA comprenant:
- une plaque PCR comprenant au moins les amorces d’indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.20, pré-aliquotées et mélangées au Master mix;
- une plaque PCR comprenant au moins les amorces spécifiquesdes différents allèles du gène HLA-DRB de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 et SEQ ID NO.18;
- un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™comprenant au moins un couple d’amorce pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles de séquence SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO. 22 et au moins une amorce pour la lecture de l’index de SEQ ID NO. 23, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice.
Dans un autre mode de réalisation préféré, ce kit comprend en outre au moins un des éléments suivants:
- une solution tampon, préférentiellement présentée en tubes;
- des mélanges réactionnels pour le séquençage NGS sans base LNA™, préférentiellement présentés en tubes;
- une notice d’utilisation
Par «Master Mix», on entend de manière générique un mélange comprenant de la Taq polymérase, une solution tamponnée contenant du MgCl2, des dNTPs (mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate), une solution de DMSO et un tampon qui réduit l’adhésion des molécules sur le plastique.
De manière tout à fait préférée, les plaques PCR sont disposées sur un même support, ledit support étant une plaque microfluidique comprenant des puits et des nano-chambres de réaction. Il est possible d’utiliser une plaque de type IFC (Integrated Fluidic Circuit) support de la société Fluidigm.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne un kit tel que défini précédemment lequel les plaquesPCR dans lesquellessont déposées les amorces,sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d’une part des amorces spécifiques et d’autre part des amorces permettant l’indexation et des micro-chambres réactionnelles.
Un troisième objet de l’invention concerne un mélange réactionnel pour le séquençage NGS sans utilisation de base LNA™comprenant les amorces suivantes:
- un couple d’amorces de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.22; celui-ci est constitué d’une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’et d’une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’;
- une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID NO.23; celle-ci s’hybride à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprend une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités.
Dans ce mélange, les deux amorces de séquençage aptes à s’hybrider aux séquences universelles situées de part et d’autre de la séquence à analyser permettent l’amplification de cette dernière tandis que l’amorce sens s’hybridant en aval de la séquence à analyser permet l’amplification de l’index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.
La méthode selon l’invention, ainsi que le kit associé sont particulièrement adaptés au génotypage pour traiter en une seule réaction un grand nombre de séquences (entre 48 et 96), notamment en cas de polymorphisme élevé. Toutefois les amplicons ne doivent pas être trop longs (de préférence < 500pb) et le multiplexage doit être modéré (entre 2 et 3 cibles par réaction PCR). Elle permet ainsi de répondre à des questions complexes d’organisation dans les laboratoires en traitant simultanément un grand nombre de patients en vue d’un typage HLA.
Les différents modes de réalisation préférés décrits précédemment peuvent être combinés entre eux, deux par deux ou de manière plus étendue, jusqu’à constituer un mode de réalisation préféré combinant tous les modes préférés.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
EXEMPLE
EXEMPLE 1:
G
énotypage
HLA en particulier
des allèles
de l’exon 2
du gène HLA DRB
en
mettant en œuvre
le procédé
selon l’invention
1. Amplification des séquences d’intérêt par PCR indexée
A partir de la Nomenclature HLA, base de données internationale répertoriant les différents allèles des gènes du système HLA, des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces sont utilisées pour amplifier des séquences d’intérêt, en condition de multiplexage. A cet effet, des mélanges réactionnels combinant plusieurs couples d’amorces sont préparés.
Les échantillons biologiques à analyser (par exemple du sang total) sont préparés en vue de la PCR, l’ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l’homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées.
La réaction d’amplification proprement dite est réalisée dans une plaque microfluidique de type IFC de Fluidigm. Les mélanges réactionnels contenant les amorces spécifiques sont déposées dans une première zone de 48 puits et les amorces destinées à l’indexation ainsi que le Master Mix sont déposés dans une seconde zone de 48 puits.
Les amorces spécifiques permettant d’amplifier les différents allèles décrits de l’exon 2 du gène HLA-DRB utilisées sont les séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.18.
Les amorces d’indexation utilisées sont les séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.20.
La réaction d’amplification se déroule en conditions standard, dans un automate de type Juno de la société Fuidigm par exemple.
Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées.
- Séquençage NGS
Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina.
Le séquençage est réalisé à l’aide du couple d’amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.22 pour amplifier les séquences à analyser et d’une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID NO. 23 pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence.
- Résultat du génotypage
Le résultat d’un génotypage HLA obtenu grâce à la méthodologie selon l’invention est présenté à la Figure 3.
Le typage HLA est présenté en groupe G, c’est-à-dire en présentant les allèles de l’exon 2 pour chacun des gènes de la classe 2 (gènes DRB, DQA, DQB, DPA et DPB).
Tableau 1: Récapitulatif des séquences décrites
Descriptif de la séquence | SEQ ID N o . | Séquence 5’-3’ |
Amorce HLA-DRB N°1 sens | 1 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACTGGATCGTTCGTGTCCC |
Amorce HLA-DRB N°1 antisens | 2 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAGGGACYCAGGCCC |
Amorce HLA-DRB N°2 sens | 3 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATGGTTCGTGTCC |
Amorce HLA-DRB N°2 antisens | 4 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAAGGACCCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°3 sens | 5 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCCTTCGTGTCC |
Amorce HLA-DRB N°3 antisens | 6 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAAGGACCCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°4 sens | 7 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCCTTCGTGTCC |
Amorce HLA-DRB N°4 antisens | 8 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAGGGACCCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°5 sens | 9 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCCTTCGTGTCC |
Amorce HLA-DRB N°5 antisens | 10 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCCTTCGTGTCC |
Amorce HLA-DRB N°6 sens | 11 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCCTTCGTGTACC |
Amorce HLA-DRB N°6 antisens | 12 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAGGGACCCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°7 sens | 13 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGAGCATTCGTGTC |
Amorce HLA-DRB N°7 antisens | 14 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACGGGGACTCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°8 sens | 15 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGGACCGGATCGTTTGTGCC |
Amorce HLA-DRB N°8 antisens | 16 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCGGAGAGACCCAGGCC |
Amorce HLA-DRB N°9 sens | 17 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAGAACCGGATCGTTCTTGTCCC |
Amorce HLA-DRB N°9 antisens | 18 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCCTCACAGGGACTCAGGCCC |
Amorce d’indexation sens | 19 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCACGACATGGTTCTACA |
Amorce d’indexation antisens | 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATCGTCGTTACCGTAGCAGAGACTTGGTCT |
Amorces de séquençage sens | 21 | ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAG |
Amorces de séquençage antisens | 22 | TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCC |
Amorce de lecture d’index | 23 | GGAGTCAACAAGACCAAGTCTCTGCTACGGTA |
Adaptateur de séquençage P5 (Illumina®) | 24 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCT |
Adaptateur de séquençage P7 (Illumina®) | 25 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT |
Claims (9)
- Procédé de génotypage du système HLA à partir d’échantillons d’ADN comprenant:
a . une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d’au moins un gène du système HLA, dans laquelle:- ledit au moins un gène est le HLA-DRB;
- lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA-DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et
- chacune desdites amorces comprend en 3’ une séquence universelle et une séquence stabilisatrice;
- Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite séquence stabilisatrice comprend de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C.
- Procédé selonl’une des revendications 1 à 2 dans lequel ladite séquence universelle est située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice.
- Procédé selon l’une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite étape d’amplification d’ADN met en outre en œuvre au moins un couple d’amorces d’indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.20.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel l’étape de séquençage est réalisée à l’aide des amorces suivantes:
- un couple d’amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO.21 Et SEQ ID NO.22; et
- une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID NO.23.
- Procédé selon l’une des revendications précédentes comprenant en outre des amorces spécifiques permettant l’amplification des différents allèles d’au moins l’un des gènes choisis parmi HLA A, HLA B, HLA C, DRB, DQA, DQB, DPA, DPB, chacune des amorces comprenant en 3’ une séquence universelle et une séquence stabilisatrice.
- Kit pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™, destiné au génotypage du système HLA comprenant:
- une plaque PCR comprenant au moins les amorces d’indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.20, pré-aliquotées et mélangées au Master mix;
- une plaque PCR comprenant au moins les amorces spécifiquesdes différents allèles du gène HLA-DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 et SEQ ID NO.18;
- un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™comprenant au moins un couple d’amorce pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles de séquence SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO. 22 et au moins une amorce pour la lecture de l’index de SEQ ID NO. 23, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice.
- Kit selon la revendication 7 dans lequel lesdites plaques dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d’une part des amorces spécifiques et d’autre part des amorces d’indexation et des micro-chambres réactionnelles.
- Mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes:
- un couple d’ amorces de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.22;
- une amorce de lecture d’index de séquence SEQ ID NO.23.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR2000775A FR3106596B1 (fr) | 2020-01-27 | 2020-01-27 | Procede de genotypage hla simple et rapide |
PCT/FR2021/050145 WO2021152257A1 (fr) | 2020-01-27 | 2021-01-26 | Procede de genotypage hla simple et rapide |
EP21707765.0A EP4097254A1 (fr) | 2020-01-27 | 2021-01-26 | Procede de genotypage hla simple et rapide |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR2000775 | 2020-01-27 | ||
FR2000775A FR3106596B1 (fr) | 2020-01-27 | 2020-01-27 | Procede de genotypage hla simple et rapide |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR3106596A1 true FR3106596A1 (fr) | 2021-07-30 |
FR3106596B1 FR3106596B1 (fr) | 2022-12-02 |
Family
ID=71111503
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR2000775A Active FR3106596B1 (fr) | 2020-01-27 | 2020-01-27 | Procede de genotypage hla simple et rapide |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4097254A1 (fr) |
FR (1) | FR3106596B1 (fr) |
WO (1) | WO2021152257A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117265091B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-06-14 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种用于hla-drb3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1743946A1 (fr) * | 2003-12-17 | 2007-01-17 | Universitat Autonoma De Barcelona | Procede et kit de genotypification de hla-drb fondes sur la reaction de la polymerase en chaine en temps reel |
EP2203567A1 (fr) * | 2007-10-16 | 2010-07-07 | Roche Diagnostics GmbH | Génotypage hla à haute résolution et haut débit par séquençage clonal |
EP1964929B1 (fr) | 2005-12-13 | 2012-02-15 | Universitat Autònoma de Barcelona | Procede et kit de genotypage hla-b par pcr en temps reel |
EP2599877A1 (fr) | 2010-06-30 | 2013-06-05 | BGI Shenzhen Co., Limited | Nouvelle méthode de séquençage par pcr et son utilisation dans le génotypage hla |
-
2020
- 2020-01-27 FR FR2000775A patent/FR3106596B1/fr active Active
-
2021
- 2021-01-26 EP EP21707765.0A patent/EP4097254A1/fr active Pending
- 2021-01-26 WO PCT/FR2021/050145 patent/WO2021152257A1/fr unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1743946A1 (fr) * | 2003-12-17 | 2007-01-17 | Universitat Autonoma De Barcelona | Procede et kit de genotypification de hla-drb fondes sur la reaction de la polymerase en chaine en temps reel |
EP1964929B1 (fr) | 2005-12-13 | 2012-02-15 | Universitat Autònoma de Barcelona | Procede et kit de genotypage hla-b par pcr en temps reel |
EP2203567A1 (fr) * | 2007-10-16 | 2010-07-07 | Roche Diagnostics GmbH | Génotypage hla à haute résolution et haut débit par séquençage clonal |
EP2599877A1 (fr) | 2010-06-30 | 2013-06-05 | BGI Shenzhen Co., Limited | Nouvelle méthode de séquençage par pcr et son utilisation dans le génotypage hla |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ILLUMINA: "An introduction to Next-Generation SequencingTechnology", 1 January 2017 (2017-01-01), XP055734260, Retrieved from the Internet <URL:https://emea.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf> [retrieved on 20200928] * |
STAHLBERG A. ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 44, no. 11, 2016 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR3106596B1 (fr) | 2022-12-02 |
WO2021152257A1 (fr) | 2021-08-05 |
EP4097254A1 (fr) | 2022-12-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2220255B1 (fr) | Procede d'etude de la diversite combinatoire v(d)j | |
FR2863274A1 (fr) | Procede d'evaluation quantitative d'un rearrangement ou d'une recombinaison genetique ciblee d'un individu et ses applications. | |
JP2008517603A (ja) | 輸血レシピエントに対する交差適合用の登録されているドナーを選択するための核酸分類の方法 | |
EP1179091B2 (fr) | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede | |
WO2021152257A1 (fr) | Procede de genotypage hla simple et rapide | |
US20050059035A1 (en) | Methods and compositions for the amplification of mutations in the diagnosis of cystic fibrosis | |
EP0763136B1 (fr) | Procede et sondes pour la detection de marqueurs lies au locus des amyotrophies spinales infantiles | |
US7914996B2 (en) | Polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the polynucleotide | |
KR101686440B1 (ko) | 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 snp 마커 및 이의 용도 | |
US7833710B2 (en) | Polynucleotide associated with breast cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing breast cancer using the same | |
FR2842534A1 (fr) | Amplification multiplex quantitative a l'echelle d'un genome, et applications a la detection de remaniements genomiques | |
EP0910667A1 (fr) | Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 | |
FR3100820A1 (fr) | Procédé de génotypage adapté au traitement d’un grand nombre d’échantillons, notamment en cas de polymorphisme élevé | |
Middleton | HLA typing from serology to sequencing era | |
CA2228694A1 (fr) | Test co-dominant de diagnostic genetique | |
FR3110178A1 (fr) | Procédé de génotypage adapté au traitement simultané d’un grand nombre de patients | |
WO2008059165A2 (fr) | Methodes et outils pour determiner l'origine d'un sujet | |
KR20140140386A (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 atp7b 유전자의 돌연변이 검출 | |
JP2004089057A (ja) | Rhマイナスの判定法 | |
RU2722564C1 (ru) | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации | |
JP4056212B2 (ja) | Gefs+関連遺伝子とgefs+診断方法 | |
US20120237932A1 (en) | Methods and materials for assessing the cis/trans nature of humans having cyp2c19*2 and cyp2c19*17 alleles | |
JP2010246400A (ja) | 多型の識別方法 | |
JP2005110607A (ja) | 高血圧性心肥大素因の検査方法 | |
JP2005270053A (ja) | Urat1遺伝子上の多型を利用した低尿酸レベルに起因する疾患の検査方法、および創薬のための用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20210730 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |