WO2021152257A1 - Procede de genotypage hla simple et rapide - Google Patents

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WO2021152257A1
WO2021152257A1 PCT/FR2021/050145 FR2021050145W WO2021152257A1 WO 2021152257 A1 WO2021152257 A1 WO 2021152257A1 FR 2021050145 W FR2021050145 W FR 2021050145W WO 2021152257 A1 WO2021152257 A1 WO 2021152257A1
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hla
sequences
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PCT/FR2021/050145
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Pascal Herve
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Bionobis
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to a method for genotyping the HLA system for simultaneously processing a large number of DNA samples. More particularly, it relates to an HLA genotyping method comprising a first step of amplification by indexed PCR in a microfluidic system then a second step of high throughput sequencing, this method is simple, rapid and less expensive than the methods of the state of the art. the technique.
  • the invention is more particularly applied to genotyping with a G group resolution of the HLA-DRB locus, a major gene in the determination of HLA typing.
  • HLA human leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA genotyping is associated with the preparation and monitoring of transplant but also allows the identification of markers of predisposition to certain autoimmune diseases, such as lupus erythematosus, acquired myasthenia gravis, Sjogren's syndrome and multiple sclerosis, but also to various cancers, type I diabetes, and other less frequent diseases such as chronic active hepatitis, anterior uveitis, somnanbulism, narcolepsy ...
  • High throughput sequencing (also called NGS for Next Generation Sequencing) allows a very large number of short sequences to be operated in parallel.
  • the principle of this technique is as follows: The sequences to be analyzed are first of all prepared by adding adapter sequences to the ends. They are then fixed on a solid support via these adapter sequences and each fragment is enriched to form clonal “clusters” which will be sequenced subsequently. At each cycle, the addition of a nucleotide results in a fluorescent signal associated with each of the four nucleotides of DNA. These signals are then analyzed by a data processing software which restores the result of the reading of the sequences. This method is fast and precise.
  • LNA TM bases for “Locked Nucleix Acid” or “blocked nucleic acid”
  • These bases are modified oligonucleotides which obey Watson-Crick base pairing rules and form duplexes, which are significantly more stable than similar duplexes formed by unmodified oligonucleotides.
  • This technique is particularly suitable when the polymorphism is very high.
  • This NGS technology is widely used in research and diagnostics. It makes it possible to sequence entire genomes. It thus constitutes a very powerful tool and represents an aid in the diagnosis of genetic and oncological diseases for example.
  • a library of sequences is prepared upstream of the sequencing in order to enrich the library with sequences of interest.
  • This sequence amplification is carried out by polymerase chain reaction (PCR).
  • NGS sequencing allows a large number of sequences to be read simultaneously, it is beneficial to mix samples from different patients.
  • these can be labeled during the amplification step by adding label or “index” sequences.
  • the indexed PCR method is known to those skilled in the art and described for example in the article by Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No. 11)
  • Document EP 2599877 describes a sequencing method comprising a first PCR step during which the sequences are marked using an index then a second second generation sequencing step. During sequencing, a strategy of incomplete DNA shearing is implemented to increase the amplitude of the reading of the sequences. This method is applied to HLA genotyping, in particular of the HLA-A, B, HLA-C and HLA-DQB1 genes.
  • the document EP 1964929 B1 describes a method and a kit for genotyping by real-time PCR using specific primers and probes which make it possible to obtain a high level of subtyping of the complete HLA-B locus.
  • This method is based on a step of PCR amplification of sequences of interest using a battery of containers each containing a pair of primers specific for a sequence to be amplified and a pair of probes labeled with a fluorescent label, followed by a step of detecting the fluorescent signals of the probes and an analysis of the melting temperatures of the hybridized probes and finally a step comparison of the pattern of melting temperatures with respect to a benchmark so as to determine the amplified allele. Interpretation of the allele present is obtained in 65 minutes.
  • NGS sequencing although very powerful in terms of sequencing capacity has drawbacks.
  • the main obstacle is the time it takes to perform genotyping from sample preparation to obtaining the result, which takes several days.
  • the present invention relates to a method of genotyping the HLA system from DNA samples comprising: a. a DNA amplification step by an indexed polymerase chain reaction under low multiplexing condition carried out in a microfluidic system, and using specific primer pairs of different alleles of at least one gene of the HLA system, in which: said at least one gene is HLA-DRB; said primers comprise at least the primers specific for HLA-DRB of sequences SEQ ID NO.
  • each of said primers comprises at 3 'a universal sequence and a stabilizer sequence; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain a TM base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
  • the inventors introduced sequences of around ten nucleotides at the ends of the primers. This addition makes it possible to dispense with modified bases while maintaining high reading reliability during sequencing.
  • the present invention also relates to a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of a high throughput sequencing of the NGS type, as well as a reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA TM bases. .
  • the genotyping method according to the invention has several advantages: it is simple, rapid and inexpensive and makes it possible to process, simultaneously, a large series of samples.
  • This method is simple because it is 100% automated. It is offered as a ready-to-use kit. This format limits the manipulations by the experimenter and therefore the risks of error. It also saves time by reducing the number of actions to be performed.
  • This method is fast since the result is obtained in less than 48 hours. Indeed, it takes 6hl5 for the preparation of the bank, 32h for the sequencing and approximately 3h30 for the analysis, and this regardless of the number of patients diagnosed.
  • This method is flexible, the combinations of primers can be adapted over time to follow the evolution of the HLA nomenclature and ensure high genotyping precision with regard to the state of knowledge of the HLA system.
  • the method makes it possible to detect the new alleles of the HLA nomenclature without modification, since these alleles are amplified by the existing set of primers, but also to detect new alleles not yet listed in the HLA nomenclature but corresponding to SNPs ("Single Nucleotide Polymorphism" or point mutation).
  • the method allows the optimized identification of the alleles constituting an HLA genotyping.
  • a first object of the invention relates to a method for genotyping the HLA system from DNA samples comprising: a. a DNA amplification step by an indexed polymerase chain reaction under low multiplexing condition carried out in a microfluidic system, and using specific primer pairs of different alleles of at least one gene of the HLA system, in which: said at least one gene is HLA-DRB; said primers comprise at least the primers specific for HLA-DRB of sequences SEQ ID NO.
  • each of said primers comprises at 3 'a universal sequence and a stabilizer sequence; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA TM base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
  • index polymerase chain reaction or “indexed PCR” is meant a method of amplifying the sequences of interest making it possible to simultaneously generate the amplicons and to label them using a label specific to the sample. .
  • stabilizer sequence means a sequence of 8 to 12 nucleotides, namely 8, 9, 10, 11 or 12 nucleotides.
  • these sequences are rich in G and C, that is to say they contain between 45% and 65% of G and / or C bases. Their role is to stabilize the sequences during the step of sequencing, as explained below.
  • the stabilizing sequences are sequences of 8 to 12 nucleotides among which 45% to 65% are G or C. In a particular embodiment of the invention, they are sequences of 10 nucleotides. In another particular embodiment, the stabilizing sequences contain from 50% to 60% of G and / or C bases. For example, such a stabilizing sequence has 10 nucleotides and contains 5 to 6 G and / or C bases. .
  • low multiplexing conditions are understood to mean conditions making it possible to amplify a single target, or even 2, 3 or 4 targets simultaneously in the same reaction mixture.
  • universal sequence within the meaning of the invention, is meant a defined sequence which will be used in all the amplicons.
  • the method actually implements two types of sequences universal, a sense sequence and an antisense sequence so as to be able to define the orientation of the amplified sequences.
  • Step a amplification of the sequences of interest is based on an indexed PCR technology making it possible to simultaneously generate the amplicons and to label them using a specific label of the sample. In addition, it is implemented in a microfluidic system.
  • Amplification reaction of the sequences by PCR preferably in a microfluidic system (to save time and material), and addition of sample-specific labels to each amplified sequence.
  • This reaction uses two types of primers simultaneously: i. pairs of primers specific to the sequences to be amplified, these sense and antisense primers each comprising a universal sequence located at their 3 'end, characterized in that the universal sequences contain at the 5' end (between the specific primer and the universal sequence) a stabilizing sequence of around ten nucleotides (generally between 8 and 12 nucleotides) consisting of 45% to 65% of G or C nucleotides; ii.
  • sense and antisense primer pairs comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sense and antisense sequences respectively and a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
  • Such a technology may for example be based on that developed by the company Fluidigm (“Integrated Fluidic Circuit” or IFC). Using such technology, in addition to saving time, makes it possible to work under standardized conditions.
  • Fluidigm Integrated Fluidic Circuit
  • the specific primers further comprise a universal sequence located 3 'of said stabilizer sequence.
  • the invention provides 9 pairs of primers specific for exon 2 of the HLA-DRB gene. These primers make it possible to amplify all of the alleles known to date for this locus. They are represented by the sequences SEQ ID NO.l to SEQ ID NO.18.
  • the amplification step also implements pairs of primers intended for indexing the amplified sequences (called “indexing primers”) of sequences SEQ. ID NO.19 and SEQ ID NO.21.
  • indexing primers include: a. at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and b. a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
  • index within the meaning of the invention, is meant a sequence used as label or bar code.
  • indexes are polymorphic short sequences. A unique particular index is associated with samples from the same patient and allows the labeling of the sequences of this patient during the amplification step. The samples from different patients being mixed during sequencing, these indexes are used to know which patient to associate the sequences with after analysis.
  • adapter necessary for sequencing within the meaning of the invention is understood to mean a sequence allowing the sequences to be fixed on a support with a view to their sequencing.
  • binding sequences required for sequencing can be used according to the invention are SEQ ID NO.24 and SEQ ID NO.25 II is adapters "P5" and "P7” proposed by the Illumina company and adapted ® to NGS sequencing. These examples are nonlimiting because the person skilled in the art can use other adapter systems depending on the NGS technology employed.
  • the amplification of the DNA sequences in a microfluidic system makes it possible to carry out 48 PCRs per sample and to process 48 different samples simultaneously (i.e. a total of 2304 reaction chambers treated at one time), the PCR products each carrying a specific specific label. of the sample. Thus, it is possible to pool and mix all the PCR products in order to perform a single sequencing reaction. The result of the sequencing then provides two pieces of information per sequence: the reading of the sequence of interest and the identification of the sample from which this sequence originates. Thus, it is possible to perform a complete HLA genotyping for 48 patients simultaneously.
  • the genotyping method according to the invention can be carried out either from DNA of human or animal origin.
  • Step b. sequencing is based on a high throughput sequencing technology such as the NGS technology developed in particular by the company Illumina.
  • This type of technology implies a determined Tm (imposed by the technology used, in other words set by the supplier). This Tm turns out to be too high if it is desired to sequence amplicons obtained via an indexed PCR in a microfluidic system. Indeed, these primers configured to operate in a microfluidic system, and whose complementary sequences are then used during the amplification step generally have a lower Tm (in particular because they are short), which generate problems of 'instability. In such a case, it is conventionally recommended to integrate LNA TM bases into the sequences during the amplification so that the duplexes formed with the primers for sequencing and reading the indexes during the sequencing are stable. However, the addition of these LNA TM bases is expensive and constitute additional steps in the method.
  • stabilizing sequences make it possible to maintain a sufficient degree of hybridization for the NGS sequencing to take place correctly even when the half-hybridization temperature ( Tm) is high.
  • Tm half-hybridization temperature
  • the present invention proposes for the first time to combine an indexed PCR in a microfluidic system with an NGS sequencing for carrying out genotyping of the HLA system in a method that is simple and rapid to implement, and the cost of which is controlled.
  • the simplicity and speed are all the more remarkable as a ready-to-use kit for the implementation of this process is proposed.
  • Step b. of the method according to the invention is carried out using the sequencing and index reading primers, none of which contains LNA TM bases but each of which contains a stabilizing sequence, namely: a pair of sequencing primers of sequences SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22; these primers hybridize to the universal sequences and include a stabilizer sequence positioned at the 5 'end; they make it possible to amplify the sequences of interest for sequencing; a SEQ ID NO.23 sequence index read primer; it hybridizes to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizing sequence; this primer allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
  • the sequencing and index reading primers none of which contains LNA TM bases but each of which contains a stabilizing sequence, namely: a pair of sequencing primers of sequences SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22; these primers hybridize to the universal sequences and include a stabilizer sequence positioned at the 5 'end; they make
  • stabilizing sequences of the sequencing primers and of the index reading primer are complementary to the stabilizing sequences present on the sequences amplified with a view to sequencing. In other words, these stabilizing sequences have the same sequences as those present in the specific primers.
  • the method brings into play pairs of primers specific for the other genes of the HLA system so as to obtain a complete map of the patient's alleles.
  • the method can include in particular a genotyping of at least one gene chosen from the HLA A, HLA B, HLA C, DRB, DQA, DQB, DPA and DPB genes.
  • the method includes the genotyping of all the genes of the HLA system according to the same principle as that described above for the DRB gene, and allows the amplification of all or part of all of the alleles known to a time t.
  • One specificity of the present process lies in the high number of amplified targets which thus provides a great diversity of amplified sequences. Therefore, it is not necessary to use a base diversity control when sequencing.
  • a second subject of the invention relates to a kit for the successive implementation of an indexed PCR and high throughput sequencing of the NGS type without the use of an LNA TM base, intended for the genotyping of the HLA system comprising: a PCR plate comprising at least the primers for indexing sequences SEQ ID NO.19 and SEQ.
  • a PCR plate comprising at least the primers specific for the various alleles of the HLA-DRB gene of sequences SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 and SEQ ID NO.18; a reaction mixture for NGS sequencing without LNA TM base comprising at least one pair of primer for sequencing hybridizing to the universal sequences of sequence SEQ ID NO. 21 and SEQ ID NO. 22 and at least one primer for reading the index of SEQ ID NO. 23, each of these primers comprising a stabilizing sequence.
  • this kit further comprises at least one of the following elements: a buffer solution, preferably presented in tubes; reaction mixtures for NGS sequencing without LNA TM base, preferably presented in tubes; a user manual
  • Master Mix is meant generically a mixture comprising Taq polymerase, a buffered solution containing MgCh, dNTPs (mixture of the four deoxyribonucleotides: dATP (deoxy-adenine tri-phosphate), dCTP (deoxy-cytosine tri phosphate), dGTP (deoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (deoxy-thymine tri-phosphate), a solution of DMSO and a buffer that reduces the adhesion of molecules to the plastic.
  • the PCR plates are placed on the same support, said support being a microfluidic plate comprising reaction wells and nanochamps. It is possible to use an IFC (Integrated Fluidic Circuit) support plate from the company Fluidigm.
  • IFC Integrated Fluidic Circuit
  • the invention relates to a kit as defined above in which the PCR plates in which the primers are deposited are placed on a microfluidic plate for the implementation of indexed PCR, said microfluidic plate comprising two 48-well zones for depositing, on the one hand, specific primers and, on the other hand, primers allowing indexing and reaction micro-chambers.
  • a third subject of the invention relates to a reaction mixture for NGS sequencing without the use of an LNA TM base comprising the following primers: a pair of primers of sequences SEQ. ID NO.21 and SEQ ID NO.22; this consists of a sense sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 5 'of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5' end and an antisense sequencing primer hybridizing to the universal sequence located at 3 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5 ′ end; a SEQ ID NO.23 sequence index read primer; this hybridizes to the universal sequence juxtaposing the index and comprises a stabilizing sequence positioned at one of its ends.
  • the two sequencing primers capable of hybridizing to the universal sequences located on either side of the sequence to be analyzed allow the amplification of the latter while the sense primer hybridizes downstream of the sequence. to be analyzed allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
  • the method according to the invention are particularly suitable for genotyping for treating a large number of sequences (between 48 and 96) in a single reaction, in particular in the event of high polymorphism.
  • the amplicons should not be too long (preferably ⁇ 500bp) and the multiplexing should be moderate (between 2 and 3 targets per PCR reaction). It thus makes it possible to answer complex questions of organization in laboratories by simultaneously treating a large number of patients for HLA typing.
  • Figure 1 Schematic representation of the primers used according to a particular embodiment of the present invention.
  • A Specific Primers
  • B Universal and Stabilizer Sequences
  • C P5-P7 and Index Adapters
  • D Sense Sequencing Primer
  • E Antisense Sequencing Primer
  • E Index Read Primer .
  • Figure 2 Representation of an amplified sequence as a description of a particular embodiment.
  • Biological samples to be analyzed are prepared for PCR, DNA is extracted and purified. This preparation step is well known to those skilled in the art and results in samples exhibiting standardized DNA concentrations.
  • the actual amplification reaction is carried out in a microfluidic plate of the IFC type from Fluidigm.
  • the reaction mixtures containing the specific primers are deposited in a first zone of 48 wells and the primers intended for indexing as well as the Master Mix are deposited in a second zone of 48 wells.
  • the specific primers making it possible to amplify the various alleles described of exon 2 of the HLA-DRB gene used are the sequences SEQ ID NO.l to SEQ ID NO.18.
  • the indexing primers used are the sequences SEQ. ID NO.19 and SEQ ID NO.20.
  • the amplification reaction takes place under standard conditions, in an automaton of the Juno type from the company Fuidigm for example.
  • sequences are recovered, purified and quantified in order to be sequenced.
  • the sequencing is carried out in an NGS sequencer from the company Illumina.
  • the sequencing is carried out using the pair of primers for sequencing sequences SEQ ID NO.21 and SEQ ID NO.22 to amplify the sequences to be analyzed and a primer for reading sequence index SEQ ID NO. 23 to identify the patient to which the sequence relates.
  • HLA typing is presented in group G, that is to say by presenting the alleles of exon 2 for each of the genes of class 2 (DRB, DQA, DQB, DPA and DPB genes).
  • Table 1 Summary of the sequences described

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Abstract

L'invention a trait à un procédé de génotypage du système HLA permettant de traiter simultanément un grand nombre d'échantillons d'ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage HLA comportant une première étape d'amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l'état de la technique. L'invention est plus particulièrement appliquée au génotypage avec une résolution G groupe du locus HLA-DRB, un gène majeur dans la détermination du typage HLA.

Description

PROCEDE DE GENOTYPAGE HLA SIMPLE ET RAPIDE
L'invention a trait à un procédé de génotypage du système HLA permettant de traiter simultanément un grand nombre d'échantillons d'ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage HLA comportant une première étape d'amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l'état de la technique. L'invention est plus particulièrement appliquée au génotypage avec une résolution G groupe du locus HLA-DRB, un gène majeur dans la détermination du typage HLA.
Domaine technique
Le système human leucocyte antigen (HLA), aussi appelé complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), est constitué par un ensemble de gènes très polymorphes. Il est situé sur le bras court du chromosome 6 et s'étend sur une distance comprise entre 3 et 4 mégabases, divisée en trois régions : (i) la région de Classe I télomérique (loci HLA A, B, C), (ii) la région de Classe II centromérique (loci HLA DRB, DQ.B et DPB) et (iii). Des dizaines de nouveaux allèles de ces gènes sont décrits chaque année ; ils sont nommés et répertoriés dans une classification internationale identifiée sous le nom de « Nomenclature HLA ».
Le génotypage du HLA est associé à la préparation et au suivi de greffe mais permet également l'identification de marqueurs de prédisposition à certaines maladies autoimmunes, telles que le lupus érythémateux, la myasthénie acquise, le syndrome de Sjogren et la sclérose en plaques, mais aussi à différents cancers, au diabète de type I, et à d'autres maladies moins fréquentes comme l'hépatite chronique active, l'uvéite antérieure, le somnanbulisme, la narcolepsie ...
Les méthodes actuelles de génotypage HLA sont principalement basées sur la biologie moléculaire, notamment le séquençage à haut débit, et des kits commerciaux facilitent leur mise en œuvre.
Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Génération Sequencing) permet d'opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant : Les séquences à analyser sont tout d'abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise. Afin de permettre un multiplexage élevé et dans ce contexte assurer la stabilité des duplex d'ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, des bases LNA™(pour « Locked Nucleix Acid » ou « acide nucléique bloqué ») sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé.
Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple.
Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d'enrichir la librairie en séquences d'intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR).
Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélangerdes échantillons provenant de patients différents. Afin d'identifier les séquences provenant d'un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l'étape d'amplification par l'ajout de séquences étiquettes ou « index ». La méthode de PCR indexée est connue de l'homme du métier et décrite par exemple dans l'article de Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11)
Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l'aide d'un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l'ADN est mise en œuvre pour augmenter l'amplitude de lecture des séquences. Cette méthode est appliquée au génotypage HLA, en particulier des gènes HLA-A, B, HLA-C et HLA-DQB1.
Le document EP 1964929 B1 décrit un procédé et un kit de génotypage par PCR en temps réel au moyen d'amorces et de sondes spécifiques qui permettent d'obtenir un niveau élevé de sous-typage du locus complet HLA-B. Cette méthode repose sur une étape d'amplification par PCR de séquences d'intérêt en utilisant une batterie de conteneurs contenant chacun un couple d'amorces spécifiques d'une séquence à amplifier et un couple de sondes marquées avec un marqueur fluorescent, suivie d'une étape de détection des signaux fluorescents des sondes et une analyse des températures de fusion des sondes hybridées et enfin d'une étape de comparaison du motif des températures de fusion par rapport à un référentiel de sorte à déterminer l'allèle amplifié. L'interprétation de l'allèle en présence est obtenue en 65 minutes.
Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d'un génotypage depuis la préparation de l'échantillon jusqu'à l'obtention du résultat qui s'étale sur plusieurs jours.
Il existe un besoin de disposer d'une méthode de séquençage des gènes polymorphes du systèmes HLA précise et rapide à coût raisonnable.
Exposé de l'invention
La présente invention concerne un procédé de génotypage du système HLA à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a . une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d'au moins un gène du système HLA, dans laquelle : ledit au moins un gène est le HLA-DRB ; lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA- DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et chacune desdites amorces comprend en 3' une séquence universelle et une séquence stabilisatrice ; b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base ™mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d'une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage.
La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée en système microfluidique et d'un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu'un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™.
Avantages de l'invention La méthode de génotypage selon l'invention présente plusieurs avantages : elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d'échantillons.
Elle combine une PCR indexée réalisée dans un système microfluidique (gain de temps et de matériel) avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité).
Cette méthode est simple car 100% automatisée. Elle est proposée sous la forme d'un kit prêt à l'emploi. Ce format limite les manipulations par l'expérimentateur et donc les risques d'erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer.
Cette méthode est rapide puisque le résultat est obtenu en moins de 48 heures. En effet, il faut compter 6hl5 pour la préparation de la banque, 32h pour le séquençage et 3h30 environ pour l'analyse, et ceci quel que soit le nombre de patients diagnostiqués.
Elle est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage efficace et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s'inscrit dans une démarche de maîtrise des coûts de santé publique et de productivité.
Cette méthode est flexible, les combinaisons d'amorces peuvent être adaptées au cours du temps pour suivre l'évolution de la nomenclature HLA et assurer une grande précision de génotypage au regard de l'état des connaissances du système HLA.
De plus, la méthode permet de détecter les nouveaux allèles de la nomenclature HLA sans modification, dès lors que ces allèles sont amplifiés par le jeu d'amorces existant, mais également de détecter de nouveaux allèles non encore répertoriés dans la nomenclature HLA mais correspondant à des SNP (« Single Nucléotide Polymorphisme » ou mutation ponctuelle).
Grâce à ces deux aspects - adaptation des amorces et détection de tous les allèles amplifiés sur les sites polymporphes - la méthode permet l'identification optimisée des allèles constitutifs d'un génotypage HLA
Elle permet le traitement d'un grand nombre d'échantillons en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle du kit, il est possible de génotyper en même temps 48 patients.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne un procédé de génotypage du système HLA à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a . une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d'au moins un gène du système HLA, dans laquelle : ledit au moins un gène est le HLA-DRB ; lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA- DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et chacune desdites amorces comprend en 3' une séquence universelle et une séquence stabilisatrice ; b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
Par « réaction de polymérisation en chaîne indexée » ou « PCR indéxée », on entend une méthode d'amplification des séquences d'intérêt permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l'aide d'une étiquette spécifique de l'échantillon.
Par « séquence stabilisatrice » au sens de l'invention, on entend une séquence de 8 à 12 nucléotides, à savoir 8, 9, 10, 11 ou 12 nucléotides. De plus, ces séquences sont riches en G et C c'est-à-dire qu'elles contiennent entre 45% et 65% de bases G et/ou C. Elles ont pour vocation de stabiliser les séquences lors de l'étape de séquençage, comme cela est expliqué après.
Dans un mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices sont des séquences de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ce sont des séquences de 10 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation particulier, les séquences stabilisatrices contiennent de 50% à 60% de bases G et/ou C. A titre d'exemple, une telle séquence stabilisatrice a 10 nucléotides et contient 5 à 6 bases G et/ou C.
Les conditions de « faible multiplexage » s'entendent de conditions permettant d'amplifier une seule cible, voire 2, 3 ou 4 cibles simultanément dans un même mélange réactionnel.
Par « séquence universelle » au sens de l'invention, on entend une séquence définie qui sera utilisée dans tous les amplicons. La méthode met en réalité en œuvre deux types de séquences universelles, une séquence sens et une séquence antisens de sorte à pouvoir définir l'orientation des séquences amplifiées.
L'étape a. d'amplification des séquences d'intérêt repose sur une technologie de PCR indexée permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l'aide d'une étiquette spécifique de l'échantillon. De plus, elle est mise en œuvre en système microfluidique.
Elle peut être résumée comme suit :
1. Conception des couples d'amorces spécifiques des séquences alléliques à amplifier et préparation de mélanges réactionnels pouvant combiner plusieurs couples d'amorces (simplexage ou multiplexage faible)
2. Préparation des échantillons biologiques à analyser (normalisation de la concentration)
3. Réaction d'amplification des séquences par PCR, de préférence dans un système microfluidique (pour gain de temps et de matériel), et ajout d'étiquettes spécifiques de l'échantillon sur chaque séquence amplifiée. Cette réaction met en œuvre deux types d'amorces simultanément : i. des couples d'amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces sens et antisens comprenant chacune une séquence universelle située à leur extrémité 3', caractérisées en ce que les séquences universelles contiennent à l'extrémité 5' (entre l'amorce spécifique et la séquence universelle) une séquence stabilisatrice d'une dizaine de nucléotides (généralement entre 8 et 12 nucléotides) constituée de 45% à 65% de nucléotides G ou C; ii. des couples amorces sens et antisens comprenant au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles sens et antisens respectivement et une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
4. Récupération, purification et quantification des produits de PCR indexés (amplicons) en vue de leur séquençage.
Une telle technologie peut être par exemple basée sur celle développée par la société Fluidigm (« Integrated Fluidic Circuit » ou IFC). Utiliser une telle technologie, outre le gain de temps, permet de travailler dans des conditions standardisées.
Dans un mode de réalisation préféré, les amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3' de ladite séquence stabilisatrice. L'invention fournit 9 couples d'amorces spécifiques de l'exon 2 du gène HLA-DRB. Ces amorces permettent d'amplifier l'ensemble des allèles connus à ce jour pour ce locus. Elles sont représentées par les séquences SEQ ID NO.l à SEQ ID NO.18.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, l'étape d'amplification met en outre en œuvre des couples d'amorces destinés à l'indexation des séquences amplifiées (dites « amorces d'indexation ») de séquences SEQ. ID NO.19 et SEQ ID NO.21. Ces amorces comprennent : a. au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et b. une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties.
Par « index » au sens de l'invention, on entend une séquence utilisée en tant qu'étiquette ou code-barre. Dans le contexte d'un séquençage NGS, les index sont des séquences courtes polymorphes. Un index particulier unique est associé aux échantillons provenant d'un même patient et permet l'étiquetage des séquences de ce patient lors de l'étape d'amplification. Les échantillons provenant de différents patients étant mélangés lors du séquençage, ces index servent à savoir à quel patient associer les séquences après analyse.
Par « adaptateur nécessaire au séquençage » au sens de l'invention, on entend une séquence permettant la fixation des séquences sur un support en vue de leur séquençage. Des exemples de séquences de fixation nécessaires pour le séquençage utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ ID NO.24 et SEQ ID NO.25 II s'agit des adapteurs « P5 » et « P7 » proposés par la société Illumina® et adaptés au séquençage NGS. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier peut utiliser d'autres systèmes adaptateurs en fonction de la technologie NGS employée.
L'amplification des séquences d'ADN dans un système microfluidique permet de réaliser 48 PCR par échantillon et de traiter 48 échantillons différents simultanément (soit un total de 2304 chambres réactionnelles traitées en une seule fois), les produits PCR portant chacun une étiquette particulière spécifique de l'échantillon. Ainsi, il est possible de regrouper et mélanger tous les produits PCR afin d'effectuer une seule réaction de séquençage. Le résultat du séquençage fournit alors deux informations par séquence : la lecture de la séquence d'intérêt et l'identification de l'échantillon d'où provient cette séquence. Ainsi, il est possible de réaliser un génotypage HLA complet pour 48 patients simultanément.
La méthode de génotypage selon l'invention peut être réalisée indifféremment à partir d'ADN d'origine humaine ou animale. L'étape b. de séquençage repose sur une technologie de séquençage à haut débit telle que la technologie NGS développée notamment par la société Illumina.
Ce type de technologie implique une Tm déterminée (imposée par la technologie utilisée, en d'autres termes paramétrée par le fournisseur). Cette Tm s'avère trop élevée si l'on souhaite séquencer des amplicons obtenus via une PCR indexée en système microfluidique. En effet, ces amorces configurées pour fonctionner en système microfluidique, et dont les séquences complémentaires sont ensuite utilisées lors de l'étape d'amplification ont généralement une Tm plus faible (notamment parce qu'elles sont courtes), ce qui génèrent des problèmes d'instabilité. Dans un tel cas, il est classiquement recommandé d'intégrer des bases LNA™dans les séquences lors de l'amplification pour que les duplex formés avec les amorces de séquençage et de lecture des index lors du séquençage soient stables. Or, l'ajout de ces bases LNA™est coûteux et constituent des étapes supplémentaires dans la méthode.
De manière très intéressante, les inventeurs ont démontré que des séquences d'une dizaine de nucléotides, appelées « séquences stabilisatrices » permettent de conserver un degré d'hybridation suffisant pour que le séquençage NGS se déroule correctement même lorsque la température de demi-hybridation (Tm) est élevée. Ainsi, ils ont montré que l'effet stabilisateur des bases LNA™peut être remplacé par l'ajout d'une séquence stabilisatrice et que cette séquence est suffisante pour le résultat du séquençage soit aussi fiable que lorsque des bases LNA™sont utilisées. Le fait de s'affranchir de l'utilisation de bases LNA™rend la méthode plus simple et moins coûteuse. Ainsi, la présente invention propose pour la première fois de combiner une PCR indexée en système microfluidique avec un séquençage NGS pour la réalisation d 'un génotypage du système HLA dans une méthode simple et rapide à mettre en œuvre, et dont le coût est maîtrisé. La simplicité et la rapidité sont d'autant plus remarquables qu'un kit prêt à l'emploi pour la mise en œuvre de ce procédé est proposé.
L'étape b. du procédé selon l'invention est réalisée à l'aide des amorces de séquençage et de lecture d'index, dont aucune ne contient de bases LNA™mais dont chacune contient une séquence stabilisatrice, à savoir : un couple d'amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO.22 ; ces amorces s'hybrident aux séquences universelles et comprennent une séquence stabilisatrice positionnée à l'extrémité 5' ; elles permettent d'amplifier les séquences d'intérêt pour le séquençage ; une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID NO.23 ; elle s'hybride à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprenant une séquence stabilisatrice; cette amorce permet l'amplification de l'index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée. Il est à noter que les séquences stabilisatrices des amorces de séquençage et de l'amorce de lecture d'index sont complémentaires des séquences stabilisatrices présentes sur les séquences amplifiées en vue du séquençage. En d'autres termes, ces séquences stabilisatrices ont les mêmes séquences que celles présentes dans les amorces spécifiques.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé met en jeu des couples d'amorces spécifiques des autres gènes du système HLA de sorte à obtenir une cartographique complète des allèles du patient. Ainsi, la méthode peut inclure notamment un génotypage d'au moins un gène choisi parmi les gènes HLA A, HLA B, HLA C, DRB, DQA, DQB, DPA et DPB. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la méthode inclut le génotypage de tous les gènes du système HLA selon le même principe que celui décrit précédemment pour le gène DRB, et permet l'amplification de tout ou partie de l'ensemble des allèles connus à un temps t.
Une spécificité du présent procédé réside dans le nombre élevé de cibles amplifiées qui apporte ainsi une grande diversité de séquences amplifiées. Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'utiliser de témoin de diversité de bases lors du séquençage.
Un second objet de l'invention concerne un kit pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée et d'un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™, destiné au génotypage du système HLA comprenant : une plaque PCR comprenant au moins les amorces d'indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ. ID NO.20, pré-aliquotées et mélangées au Master mix ; une plaque PCR comprenant au moins les amorces spécifiques des différents allèles du gène HLA-DRB de séquences SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 et SEQ ID NO.18; un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™comprenant au moins un couple d'amorce pour le séquençage s'hybridant aux séquences universelles de séquence SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO. 22 et au moins une amorce pour la lecture de l'index de SEQ ID NO. 23, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice.
Dans un autre mode de réalisation préféré, ce kit comprend en outre au moins un des éléments suivants : une solution tampon, préférentiellement présentée en tubes ; des mélanges réactionnels pour le séquençage NGS sans base LNA™, préférentiellement présentés en tubes ; une notice d'utilisation Par « Master Mix », on entend de manière générique un mélange comprenant de la Taq polymérase, une solution tamponnée contenant du MgCh, des dNTPs (mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri phosphate), dGTP (désoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate), une solution de DMSO et un tampon qui réduit l'adhésion des molécules sur le plastique.
De manière tout à fait préférée, les plaques PCR sont disposées sur un même support, ledit support étant une plaque microfluidique comprenant des puits et des nano-chambres de réaction. Il est possible d'utiliser une plaque de type IFC (Integrated Fluidic Circuit) support de la société Fluidigm.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un kit tel que défini précédemment lequel les plaques PCR dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d'une part des amorces spécifiques et d'autre part des amorces permettant l'indexation et des micro-chambres réactionnelles.
Un troisième objet de l'invention concerne un mélange réactionnel pour le séquençage NGS sans utilisation de base LNA™comprenant les amorces suivantes : un couple d'amorces de séquences SEQ. ID NO.21 et SEQ ID NO.22 ; celui-ci est constitué d'une amorce de séquençage sens s'hybridant à la séquence universelle située en 5' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' et d'une amorce de séquençage antisens s'hybridant à la séquence universelle située en 3' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' ; une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID NO.23 ; celle-ci s'hybride à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprend une séquence stabilisatrice positionnée à l'une de ses extrémités.
Dans ce mélange, les deux amorces de séquençage aptes à s'hybrider aux séquences universelles situées de part et d'autre de la séquence à analyser permettent l'amplification de cette dernière tandis que l'amorce sens s'hybridant en aval de la séquence à analyser permet l'amplification de l'index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée.
La méthode selon l'invention, ainsi que le kit associé sont particulièrement adaptés au génotypage pour traiter en une seule réaction un grand nombre de séquences (entre 48 et 96), notamment en cas de polymorphisme élevé. Toutefois les amplicons ne doivent pas être trop longs (de préférence < 500pb) et le multiplexage doit être modéré (entre 2 et 3 cibles par réaction PCR). Elle permet ainsi de répondre à des questions complexes d'organisation dans les laboratoires en traitant simultanément un grand nombre de patients en vue d'un typage HLA.
Les différents modes de réalisation préférés décrits précédemment peuvent être combinés entre eux, deux par deux ou de manière plus étendue, jusqu'à constituer un mode de réalisation préféré combinant tous les modes préférés.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig.l] Figure 1 : Représentation schématique des amorces utilisées selon un mode de réalisation particulier de la présente invention. (A) amorces spécifiques, (B) séquences universelles et stabilisatrices, (C) Adaptateurs P5-P7 et Index, (D) amorce de séquençage Sens, (E) amorce de séquençage Anti sens, (E) amorce de lecture d'index.
[Fig.2] Figure 2 : Représentation d'une séquence amplifiée en tant que descriptif d'un mode de réalisation particulier.
[Fig.3] Figure 3 : Résultat représentatif d'un génotypage HLA
EXEMPLE
EXEMPLE 1 : Génotypage HLA en particulier des allèles de l'exon 2 du gène HLA DRB en mettant en oeuvre le procédé selon l'invention
1. Amplification des séquences d'intérêt par PCR indexée
A partir de la Nomenclature HLA, base de données internationale répertoriant les différents allèles des gènes du système HLA, des couples d'amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces sont utilisées pour amplifier des séquences d'intérêt, en condition de multiplexage. A cet effet, des mélanges réactionnels combinant plusieurs couples d'amorces sont préparés.
Les échantillons biologiques à analyser (par exemple du sang total) sont préparés en vue de la PCR, l'ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l'homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées. La réaction d'amplification proprement dite est réalisée dans une plaque microfluidique de type IFC de Fluidigm. Les mélanges réactionnels contenant les amorces spécifiques sont déposées dans une première zone de 48 puits et les amorces destinées à l'indexation ainsi que le Master Mix sont déposés dans une seconde zone de 48 puits.
Les amorces spécifiques permettant d'amplifier les différents allèles décrits de l'exon 2 du gène HLA-DRB utilisées sont les séquences SEQ ID NO.l à SEQ ID NO.18.
Les amorces d'indexation utilisées sont les séquences SEQ. ID NO.19 et SEQ ID NO.20.
La réaction d'amplification se déroule en conditions standard, dans un automate de type Juno de la société Fuidigm par exemple.
Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées.
2. Séquençage NGS
Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina.
Le séquençage est réalisé à l'aide du couple d'amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.22 pour amplifier les séquences à analyser et d'une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID NO. 23 pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence.
3. Résultat du génotypage
Le résultat d'un génotypage HLA obtenu grâce à la méthodologie selon l'invention est présenté à la Figure 3.
Le typage HLA est présenté en groupe G, c'est-à-dire en présentant les allèles de l'exon 2 pour chacun des gènes de la classe 2 (gènes DRB, DQA, DQB, DPA et DPB). Tableau 1 : Récapitulatif des séquences décrites
[Tableau 1]
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de génotypage du système HLA à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a . une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, et mettant en œuvre des couples amorces spécifiques de différents allèles d'au moins un gène du système HLA, dans laquelle : ledit au moins un gène est le HLA-DRB ; lesdites amorces comprennent au moins les amorces sépcifiques du HLA- DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18; et chacune desdites amorces comprend en 3' une séquence universelle et une séquence stabilisatrice ; b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite séquence stabilisatrice comprend de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C .
3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2 dans lequel ladite séquence universelle est située en 3' de ladite séquence stabilisatrice.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite étape d'amplification d'ADN met en outre en œuvre au moins un couple d'amorces d'indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ ID NO.20.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'étape de séquençage est réalisée à l'aide des amorces suivantes : o un couple d'amorces de séquençage de séquences SEQ ID NO.21 Et SEQ ID NO.22 ; et o une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID NO.23.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes comprenant en outre des amorces spécifiques permettant l'amplification des différents allèles d'au moins l'un des gènes choisis parmi HLA A, HLA B, HLA C, DRB, DQA, DQB, DPA, DPB, chacune des amorces comprenant en 3' une séquence universelle et une séquence stabilisatrice.
7. Kit pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée et d'un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™, destiné au génotypage du système HLA comprenant : une plaque PCR comprenant au moins les amorces d'indexation de séquences SEQ ID NO.19 et SEQ. ID NO.20, pré-aliquotées et mélangées au Master mix ; une plaque PCR comprenant au moins les amorces spécifiques des différents allèles du gène HLA-DRB de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 , SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO.5 , SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 et SEQ ID NO.18; un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™comprenant au moins un couple d'amorce pour le séquençage s'hybridant aux séquences universelles de séquence SEQ ID NO. 21 et SEQ ID NO. 22 et au moins une amorce pour la lecture de l'index de SEQ ID NO. 23, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice.
8. Kit selon la revendication 7 dans lequel lesdites plaques dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d'une part des amorces spécifiques et d'autre part des amorces d'indexation et des micro-chambres réactionnelles.
9. Mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes : un couple d' amorces de séquences SEQ ID NO.21 et SEQ ID NO.22 ; une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID NO.23.
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