KR101686440B1 - 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 snp 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 이용하여 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종을 정확, 신속하게 판단할 수 있는 키트, 마이크로어레이 및 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단방법에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커를 활용하면, 신속하고 정확한 토종닭 판별이 가능하며, 토종닭과의 교잡종을 판별할 수 있다.

Description

한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 SNP 마커 및 이의 용도 {SNP markers for discriminating Korean Brown Cornish line of chicken and use thereof}
본 발명은 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 이용하여 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종을 정확, 신속하게 판단할 수 있는 키트, 마이크로어레이 및 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단방법에 관한 것이다.
토종닭은 1960년대 이전까지 국내에서 소규모 농가 수준에서 사육되어져 왔지만, 이후 생산성이 높게 개량된 실용계의 도입과 양계시설 규모화 및 전업화가 이루어지면서 대부분 소멸되었다. 최근 세계적으로 자국의 재래가축의 유전자원의 중요성이 부각되면서 국내에서도 토종닭에 대한 관심이 증가하였다. 이에 농촌진흥청 국립축산과학원에서는 전국에서 수집된 토종닭을 바탕으로 복원 및 계통조성 사업을 15년에 걸쳐 시행하였고, 2007년 토종닭 순계 품종을 완성하였다. 토종닭에 대한 명확한 정의는 2008년 농촌진흥청 국립축산과학원에서 수행한 “토종닭 사육 및 인증기준 설정 연구”에서 협의회와 공청회를 걸쳐 다음과 같이 정의하였다. 토종닭은 예로부터 국내에서 사육되어온 닭으로 근래 다른 품종의 혼입 없이 순수 혈통을 유지해 온 품종으로 사육유래가 명확한 재래종과, 외국 품종으로서 국내에 순계로 도입되어 최소 7세대 이상 계대유지에 의하여 우리나라 기후 풍토에 적응된 품종으로 경위가 명확하고 계대번식 및 세대별 검정기록이 있는 토착종으로 구분된다. 또한 매년 1세대 간격으로 계대를 유지하여 최소 7세대 이상 순수혈통으로 유지되어온 기록과 품종고유의 특징을 보유하고 있으며, 그 유전적 특성이 유지되는 집단을 토종닭 순계라고 정의하였다. 농촌진흥청 국립축산과학원은 복원된 토종닭을 바탕으로 이용가치를 높이기 위하여 산란능력과 육질이 우수한 겸용종과 성장이 빠르고 육질이 우수한 육용 및 맛이 좋은 재래종 순계를 3원교배하여 맛이 좋고, 성장이 빠른‘우리 맛닭’을 개발하여 산업화에 성공하였다.
기존에 분자유전학적 품종 특성 평가를 위하여 축산분야에서는 주로 각 품종에 대한 유전자 내 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 활용한 개체식별 및 특성 평가 방법과, 초위성체 DNA(microsatellite, MS)의 개체별 유전자형을 활용한 유전자 감식 기법 등이 개발되어 활용되었다.
본 발명과 관련된 선행기술로는 한국공개특허공보 제2013-0050832호 “토종닭 순계와 실용계의 유전적 특성 및 품종식별력 분석 방법”(2013.05.16.)이 있다.
본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 신속하고 정확한 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단을 가능하게 하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 SNP 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP의 다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 마이크로어레이가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계에서 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SNP 마커를 활용하면, 신속하고 정확한 토종닭 판별이 가능하며, 토종닭과의 교잡종을 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 국내 토종닭 시장 활성화 과정에서 종계 거래의 불법 사기 발생을 미연에 방지하고 투명한 유통질서의 확립이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유전자 마커 영역의 기능 분석을 통한 우수 형질 관련 육종 기술 개발이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 토종닭 계통별 우수 유전자를 이용한 교잡 체계 개발이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP의 염색체상의 위치를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 길이는 제한되지 않으나 5 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 있어 상기 서열번호 1 내지 4는 9번 염색체 상의 Arf -GAP domain and FG repeats-containing protein 1(AGFG1) 유전자의 인트론 영역에 자리하고 있다. 상기 AGFG1 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있고, GenBank Accession No.XM_422611로 표시된다.
본 발명의 SNP 마커는 표 4에 표시된 마커로서, 개체의 SNP 마커의 다형성 부위가 붉은 색으로 표시된 염기일 경우, 한국 토착 갈색 코니쉬 S 개체로 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 닭의 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 “제제”는 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 상기 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제에는 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제제는 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 내지 12의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 상기 프라이머는 바람직하게 15~30 염기쌍의 길이로 이루어져 있다.
상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 프라이머는 하기 표 1에 나타난다.
Figure 112015050480917-pat00001
상기 프라이머는 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머가 하나의 세트로 구성되며, 서열번호 1의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어지며, 서열번호 2의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트로 이루어지며, 서열번호 3의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트로 이루어지며, 서열번호 4의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR 증폭과정에 적용되는 경우, "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명에 있어 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.
본 발명에 있어 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 마이크로어레이가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 마커에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계에서 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 시료는 닭의 게놈 DNA 일 수 있고, 상기 게놈 DNA는 닭의 개체의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다. 본 발명의 방법에서, gDNA의 추출은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)).
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 내지 12 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 A인 경우; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 T인 경우; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 G인 경우; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 C인 경우 닭의 품종이 한국 토착 갈색 코니쉬 S라고 판단할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1: 한국 토종닭 5품종 12계통에 대한 혈액 확보 및 DNA 추출
2012년도 국립축산과학원 가금과에서 보유한 한국 토종닭 5품종 12계통 (재래종: 적갈색 재래종, 황갈색 재래종, 흑색 재래종, 백색 재래종, 회색 재래종; 연산 오계; 로드아일랜드레드: 한국 로드아일랜드레드 C, 한국 로드아일랜드레드 D; 코니쉬: 한국 갈색 코니쉬 S, 한국 흑색 코니쉬 H; 화이트레그혼: 한국 화이트레그혼 F, 한국 화이트레그혼 K)으로부터 각 계통 별 암컷 5수, 수컷 5수를 임의로 선발하여 계통 별 총 10수씩 총 120개체를 선발하여 각 3 ml 정도의 혈액을 EDTA-vacutainer에 담아서 채취하였다. 채취한 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 전기영동 방법과 spectrophotometer를 이용하여 농도와 순도를 확인하였으며, 모든 genomic DNA는 차세대염기서열해독(Next Generation Sequencing; NGS)에 부합하였다.
실시예 2: NGS 기법을 이용한 개체 별 전장 염기서열 해독 및 변이 탐색
고순도의 genomic DNA를 Illumina사에서 제공한 방법에 따라 평균 300 bp 크기의 paired-end(PE) 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리에 대한 염기서열 해독은 Illumina사(Illumina, San Diego, CA, USA)의 HiSeq 2000 기기를 사용하여 수행되었다. 생산된 염기서열(read) 데이터는 BWA(version0.6.2)를 사용하여 닭 기준 유전체 서열 Galgal4에 맵핑하여 SAM 파일을 형성하였다. 그리고 PICARD(v1.90)을 이용하여 맵핑된 SAM 파일에 read group을 설정하여, 위치 별로 정렬하였으며, duplicated read를 제거하였고, non-paired mate read를 수정하였다. 이후의 단계에서는 GATK(v2.4-9)를 이용하였다. 부정확한 mismatch를 제거하고 정확한 indel을 찾기 위해 Realigner TargetCreator와 IndelRealigner를 사용하였다. 그리고 sequencing context, platform, position bias를 보정하기 위해 BaseRecalibrator를 사용하였다. 총 120개 개체의 pooled genotyping 데이터에 대한 SNP 비교를 위해서는 UnifiedGenotyper를 사용하였으며, variant filtering을 수행하였다(MQ0 ≥ 500&&((MQ0/(1.0XDP)>0.1), quality <100.0∥MQ<30.0 ∥ DP <500 ∥DP>10,000). Calling된 Variant Call format(VCF) 파일을 입력파일로 하여 Beagle(v3.3.2)를 사용하여 diploid haplotype phasing을 수행하였으며, phasing되지 않은 영역은 제외하였다(표 2). 하기 표 2는 토종닭 5품종 12계통에 대한 NGS 데이터 생산량을 나타낸다.
Figure 112015050480917-pat00002
Figure 112015050480917-pat00003
실시예 3: 품종 또는 계통 별 특이 SNP 탐색
마련된 variant 데이터로부터 계통 기준으로 특이 SNP를 결정하였다. 특이 SNP는 기준 유전체 서열 Galgal4의 유전자형과 다른 유전자형을 보이면서 다른 계통 또는 품종에서는 기준 유전체 서열 유전자형과 모두 같은 경우로 정의하였다. 품종 또는 계통 특이 SNP의 위치에서 앞뒤의 거리, read depth, homozygous SNP를 지닌 개체 수, heterozygous SNP를 지닌 개체 수를 표시하였으며, heterozygous SNP를 지닌 개체 수가 없는 경우를 특이 SNP로 결정한 결과, GGA9_8984815C/A, GGA9_8985671C/T, GGA9_8986275A/G, GGA9_8987552G/C를 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP로 선정하였다 (표 3 및 4). 하기 표 3은 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP 목록 및 유전자형을 비교한다. 하기 표 4는 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP 서열(± 200 bp)을 나타낸다.
Figure 112015050480917-pat00004
Figure 112015050480917-pat00005
실시예 4: 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP에 대한 위치 특성 분석
한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP, GGA9_8984815C/A, GGA9_8985671C/T, GGA9_8986275A/G, GGA9_8987552G/C는 모두 9번 염색체 상에 위치하고 있으며, 4개의 특이 SNP 모두 Arf -GAP domain and FG repeats-containing protein 1(AGFG1) 유전자의 인트론 영역에 자리하고 있다 (도 1).
실시예 5: 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP 활용
한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 특이 SNP, GGA9_8984815C/A, GGA9_8985671C/T, GGA9_8986275A/G, GGA9_8987552G/C의 유전자형은 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통에서만 발견되므로, 이들 유전자형이 발견되는 개체는 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통과 교잡종이라고 판단할 수 있으며, 이들 유전자형을 이용하여 한국 토착 갈색 코니쉬 S 계통 집단 보존이 가능하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SNP markers for discriminating breed of chicken and use thereof <130> NPF-27241 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 401 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 1 aggagacatt agttttggag cagcccttgt agttattctg taattctatt ttgcaaatag 60 tatgtgaaag tgttttttgg tctataacgt ggagctttgt tctgaaatct cacctaaggg 120 tatttttttt tttggctgag tttatctagt tgaagacgac agtagtattg agcccttatt 180 ttctagggaa actgaagact atgcagagct gcagaatatt tgtagaagca taacactatg 240 ccgtagttca tgtataaatt gttaagtttg aaattgatac actagtgctt aacatttgca 300 gggcagaaag tgatatagtc ttcattttaa atctgttttt tctctttcta ggtggtagtg 360 aacaaggaag tggctttagt acagtagtgt ctgcatcagc a 401 <210> 2 <211> 401 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 2 acagtaataa ataccaaatg ccttttacag ttactgttga tattagaagc gccccttaaa 60 gcttttgttt tgtaacctta tcctgatggc ctctattcaa tattcattct cttgctgttg 120 gtggagagga ctctgtaact gctgctgagc aataaaaaaa agtctgactc aagtgcttgt 180 tataatctct gactcagggc ttcaatttct ggcatttgta ttgcaatttt gtactgcagt 240 tagcaaactc ggtgtaagca ttccttttct attttttttt acattcgttg tcagcatgta 300 aagttgcatt taatggttaa acaagcagtt ctgatttttc tgaatgtatg aattattttc 360 agcaatgctt ttggaacagt acctgtggct gctacttcac a 401 <210> 3 <211> 401 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 3 tcatggaatt ttatagataa aatattataa acctaatgtg agacagacta ttttttttaa 60 aagacttgat taaatagtgt tttttaatct ttcagcaaca ccttccacaa atccattcgt 120 agctgcccct gttgccccag tggcaccctc aacaaatcca ttccagacca atagccgagg 180 agcaacaggt taggaaaaaa gtcacagaac atttttacat acagtatttt ttgcactact 240 tgttttcttt tttttatgtg attgtgtatt tttcttgaag attttctata ttacttgtct 300 tcaggtctaa tgtgtttgtt taatgtagag ttgctttctt tcgttatgct tttttgtttg 360 ataggttttt ttgggggggt ggggcgggga aggaagagtt g 401 <210> 4 <211> 401 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 4 ttgtctggtc tctttgtggc ttccataagg cctctcggga gcaatgcact ctcacatatt 60 tcctcacgct cattttggta ggtggccaca ttcggtatga agtttattgt ggctagttgt 120 tcttgcttgt aaaaccttac tggtagctat ctggttctct gcacatagag tttcagaagc 180 cttacatgtt ttataatgga ctgggtgtgg gtgtctggca actcaacaaa aggagagaag 240 agcacagaaa tctataaagc aactaaaaca aaaccattat tgatatcctc cacagtcaca 300 ctagaatgac tatataagtt gagtgactat tgtagcttgt gttaacagta gtttgatacc 360 ttttgtgata tctcaagttg ctgctcaatc tgttgtgatt t 401 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 5 ttggagcagc ccttgtagtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 6 ctttctgccc tgcaaatgtt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 7 tctcttgctg ttggtggaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 8 tgtgaagtag cagccacagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 9 tcagcaacac cttccacaaa 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 10 aaaagcataa cgaaagaaag caa 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 11 ctggtctctt tgtggcttcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 12 tcagcaacac cttccacaaa 20

Claims (7)

  1. (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
    (d) 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 202번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 202번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커 세트.
  2. 제1항의 닭 품종을 판단할 수 있는 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제제는
    서열번호 1의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트;
    서열번호 2의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 7및 8의 프라이머 세트;
    서열번호 3의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 및
    서열번호 4의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 포함하는 한국토착 갈색 코니쉬 계통 닭의 품종 판단용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 기재된 조성물을 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 키트.
  5. 제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단용 마이크로어레이.
  6. 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드들을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계에서 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단방법.
  7. 제6항에 있어서,
    서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 A인 경우;
    서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 T인 경우;
    서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 G인 경우; 및
    서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 202 번째 염기의 대립유전자가 C인 경우 닭의 품종이 한국 토착 갈색 코니쉬 S라고 판단하는 한국 토착 갈색 코니쉬 계통 닭 품종 판단방법.
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