CN109715798A - Dna文库的制作方法和使用dna文库的基因组dna分析方法 - Google Patents

Dna文库的制作方法和使用dna文库的基因组dna分析方法 Download PDF

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Abstract

简便地制作再现性优异的DNA文库。用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的反应液进行核酸扩增反应，获得以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应而得的DNA片段。

Description

DNA文库的制作方法和使用DNA文库的基因组DNA分析方法
技术领域
本发明涉及能够在例如DNA标志物分析中利用的DNA文库的制作方法和使用DNA文库的基因组DNA分析方法。
背景技术
一般在基因组分析中，综合地分析基因组所含的遗传信息、例如碱基序列信息。但是，在确定基因组全体的碱基序列的分析中存在花费工序数和成本这样的问题。另外，在基因组大小较大的生物中，由于基因组的复杂性问题，因而基于碱基序列分析的基因组分析有边界。
专利文献1中公开了在扩增片段长度多态性(AFLP)标志物技术中，对与接头连结的限制性酶处理片段插入试样特异的鉴别序列(identifier)，仅鉴别限制性酶处理片段的序列的一部分的方法。在专利文献1所公开的方法中，通过对基因组DNA的限制性酶处理来减低基因组DNA的复杂性，以限制性酶处理片段的一部分作为对象确定碱基序列，从而充分地鉴定限制性酶处理片段。但是，在专利文献1所公开的方法中，需要对基因组DNA的限制性酶处理、使用接头的连接反应这样的工序数，难以降低成本。
另一方面，专利文献2公开了通过所谓RAPD(随机扩增多态性DNA，RandomlyAmplified Polymorphic DNA)法，从将从米试样提取的DNA用在适当引物存在下的PCR扩增而得的DNA条带中，发现与食味评价结果相关度高的识别用DNA标志物。在专利文献2所公开的方法中，公开了使用以特定序列限定的多种STS(序列标签位点，Sequence TaggedSites)化引物。此外，在专利文献2所公开的方法中，通过电泳检测使用STS化引物扩增的识别用DNA标志物。然而，专利文献2所公开的这样的RAPD法，PCR扩增的再现性显著低，一般不能作为DNA标志物技术采用。
另外，专利文献3公开了一种制作基因组文库的方法，其中以对象的基因组中比较经常出现的序列为基础设计的1种引物进行PCR，从而将基因组全区域几乎均等地扩增，其结果能够制作基因组文库。此外，专利文献3中虽然有通过使用包含随机序列的随机引物进行PCR能够制作基因组文库这样的记述，但关于实际的方案和实验结果没有任何记载。因此，专利文献3所记载的方法为了特定基因组出现频率而需要基因组碱基序列信息，可预计为此花费的工序数和成本。进而，在专利文献3所记载的方法中，存在为了实现对基因组全体进行扩增而不能降低基因组DNA的复杂性这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第5389638号公报
专利文献2：日本特开2003-79375号公报
专利文献3：日本特许第3972106号公报
发明内容
发明所要解决的课题
此外，利用DNA标志物的基因连锁分析等基因组信息分析需要通过更简便且再现性优异的方法制作DNA文库。如上所述，作为制作DNA文库的方法已知各种方法，但现状是不知道简便性和/或再现性充分的方法。于是，本发明鉴于这样的事实，目的在于提供更简便且再现性优异的DNA文库的制作方法和使用DNA文库的基因组DNA分析方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，在使用随机引物的PCR中，通过将反应液中的该随机引物的浓度规定在指定范围，能够实现优异的再现性，从而完成了本发明。
本发明包含以下内容。
(1)DNA文库的制作方法，用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的反应液进行核酸扩增反应，获得以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应而得的DNA片段。
(2)根据(1)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述反应液包含4～200μM的所述随机引物。
(3)根据(1)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述反应液包含4～100μM的所述随机引物。
(4)根据(1)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述随机引物是9～30碱基长的核苷酸。
(5)根据(1)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述DNA片段为100～500碱基长。
(6)基因组DNA分析方法，利用通过(1)～(5)的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库作为DNA标志物。
(7)根据(6)所述的基因组DNA分析方法，包括：
确定通过(1)～(5)的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库的碱基序列，基于这些碱基序列确认所述DNA标志物是否存在的工序。
(8)根据(7)所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，在确认所述DNA标志物是否存在的工序中，由DNA文库的碱基序列的读出数来确认所述DNA标志物是否存在。
(9)根据(7)所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，将所述DNA文库的碱基序列与已知的序列信息、或者使用其他生物来源或其他组织来源的基因组DNA制作的所述DNA文库的碱基序列进行比较，基于碱基序列的差异来确认DNA标志物是否存在。
(10)根据(6)所述的基因组DNA分析方法，包括：
基于所述DNA标志物的碱基序列，准备特异地扩增该DNA标志物的一对引物的工序；
以从对象生物提取的基因组DNA作为模板，使用所述一对引物进行核酸扩增反应的工序；和
由所述核酸扩增反应的结果，确认所述基因组DNA中所述DNA标志物是否存在的工序。
(11)DNA文库的制作方法，包括：
用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的第1反应液进行核酸扩增反应，获得以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应而得的第1DNA片段的工序；和
用包含所得的第1DNA片段、和作为引物的核苷酸的第2反应液进行核酸扩增反应，获得在所述第1DNA片段上连接了所述核苷酸的第2DNA片段的工序，
所述核苷酸在3’末端包含与所述随机引物中的至少5’末端侧的碱基序列70％以上一致的碱基序列。
(12)根据(11)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1反应液包含4～200μM的所述随机引物。
(13)根据(11)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1反应液包含4～100μM的所述随机引物。
(14)根据(11)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述随机引物为9～30碱基长的核苷酸。
(15)根据(11)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1DNA片段为100～500碱基长。
(16)根据(11)所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，扩增所述第2DNA片段的引物包含用于碱基序列确定反应的区域，或者在以所述第2DNA片段作为模板的核酸扩增反应或重复的核酸扩增反应中使用的引物包含用于碱基序列确定反应的区域。
(17)DNA文库的分析方法，包括：
对于通过(11)～(15)的任一项所述的DNA文库的制作方法获得的第2DNA片段、或通过权利要求16所述的DNA文库的制作方法使用下述引物获得的DNA片段，确定碱基序列的工序，
所述引物包含与用于碱基序列确定反应的测序仪用引物互补的区域。
(18)基因组DNA分析方法，利用通过(11)～(17)的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库作为DNA标志物。
(19)根据(18)所述的基因组DNA分析方法，包括：
确定通过(11)～(17)的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库的碱基序列，基于这些碱基序列确认所述DNA标志物是否存在的工序。
(20)根据(19)所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，在确认所述DNA标志物是否存在的工序中，由DNA文库的碱基序列的读出数来确认所述DNA标志物是否存在。
(21)根据(19)所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，将所述DNA文库的碱基序列与已知的序列信息、或者使用其他生物来源或其他组织来源的基因组DNA制作的所述DNA文库的碱基序列进行比较，基于碱基序列的差异来确认DNA标志物是否存在。
(22)根据(18)所述的基因组DNA分析方法，包括：
基于所述DNA标志物的碱基序列，准备特异地扩增该DNA标志物的一对引物的工序；
以从对象生物提取的基因组DNA作为模板，使用所述一对引物进行核酸扩增反应的工序；和
由所述核酸扩增反应的结果确认所述基因组DNA中所述DNA标志物是否存在的工序。
(23)DNA文库，是通过上述(1)～(5)和(11)～(16)的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2016-129048号的说明书和/或附图所记载的内容、日本专利申请2016-178528号的说明书和/或附图所记载的内容、以及日本专利申请2017-071020号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明所涉及DNA文库的制作方法以使用随机引物的核酸扩增法作为基础，因而能够非常简便地制作DNA文库。另外，本发明所涉及DNA文库的制作方法虽然是使用随机引物的核酸扩增法，但所扩增的核酸片段的再现性也优异。因此，根据本发明所涉及DNA文库的制造方法，能够利用所制作的DNA文库作为DNA标志物，能够在基因连锁分析等基因组DNA分析中使用。
因此，使用本发明所涉及DNA文库的基因组DNA分析方法使用简便且以优异的再现性制备的DNA文库，因此能够进行低成本且高精度的基因组DNA分析。
附图说明
图1是显示本发明所涉及DNA文库的制作方法和利用DNA文库的基因组DNA分析方法的流程图。
图2是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板通过通常条件的PCR扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图3是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板在退火温度45℃扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图4是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板在退火温度40℃扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图5是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板在退火温度37℃扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图6是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以酶量2.5单位(unit)扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图7是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以酶量12.5单位(unit)扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图8是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以MgCl2浓度2倍扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图9是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以MgCl2浓度3倍扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图10是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以MgCl2浓度4倍扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图11是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用8碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图12是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用9碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图13是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用11碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图14是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用12碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图15是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用14碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图16是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用16碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图17是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用18碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图18是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用20碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图19是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度2μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图20是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度4μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图21是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度6μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图22是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度6μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图23是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度8μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图24是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度8μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图25是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度10μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图26是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度10μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图27是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度20μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图28是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度20μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图29是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度40μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图30是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度40μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图31是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度60μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图32是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度60μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图33是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度100μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图34是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度100μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图35是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度200μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图36是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度200μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图37是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度300μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图38是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度300μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图39是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度400μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图40是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度400μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图41是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度500μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图42是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度500μM扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图43是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度600μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图44是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度700μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图45是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度800μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图46是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度900μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图47是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板以随机引物浓度1000μM扩增而得的DNA文库的电泳图像获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图48是显示以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物扩增而得的DNA文库的MiSeq分析结果的特性图。
图49是显示由以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图50是显示由以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图51是显示以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物扩增而得的DNA文库的MiSeq分析结果的特性图。
图52是显示由MiSeq获得的读出图谱的稻日本晴基因组信息的位置的特性图。
图53是显示随机引物与稻基因组的错配碱基数的次数分布的特性图。
图54是显示标志物N80521152中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图55是显示PCR标志物N80521152中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图56是显示标志物N80997192中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图57是显示PCR标志物N80997192中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图58是显示标志物N80533142中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图59是显示PCR标志物N80533142中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图60是显示标志物N91552391中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图61是显示PCR标志物N91552391中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图62是显示标志物N91653962中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图63是显示PCR标志物N91653962中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图64是显示标志物N91124801中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的读出数的特性图。
图65是显示PCR标志物N91124801中的甘蔗NiF8、Ni9和它们的杂交后代的电泳图像的照片。
图66是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用9碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图67是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用9碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图68是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用10碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图69是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用10碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图70是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用11碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图71是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用11碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图72是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用12碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图73是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用12碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图74是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用14碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图75是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用14碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图76是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用16碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图77是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用16碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图78是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用18碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图79是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用18碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图80是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用20碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图81是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用20碱基长的随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图82是显示对于以甘蔗NiF8的DNA作为模板将8～35碱基长的随机引物在0.6～300μM的浓度范围使用而扩增的DNA文库研究再现性的结果的特性图。
图83是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用1种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图84是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用1种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图85是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用2种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图86是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用2种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图87是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用3种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图88是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用3种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图89是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用12种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图90是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用12种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图91是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用24种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图92是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用24种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图93是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用48种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图94是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用48种随机引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图95是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基B扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图96是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基B扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图97是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基C扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图98是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基C扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图99是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基D扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图100是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基D扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图101是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基E扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图102是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基E扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图103是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基F扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图104是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基F扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图105是显示以基因组DNA作为模板用随机引物10碱基A扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图106是显示以基因组DNA作为模板用随机引物10碱基A扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图107是示意性地显示供于新一代测序装置的DNA文库的制作方法的特性图。
图108是示意性地显示供于新一代测序装置的DNA文库的制作方法的特性图。
图109是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基G扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图110是显示由以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基G扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图111是显示由对于甘蔗NiF8以使用随机引物10碱基G制作的DNA文库作为模板利用新一代测序仪用引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图112是显示由对于甘蔗NiF8以使用随机引物10碱基G制作的DNA文库作为模板利用新一代测序仪用引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图113是显示以甘蔗NiF8的DNA作为模板用随机引物10碱基G扩增而得的DNA文库的MiSeq分析结果的特性图。
图114是显示由以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物12碱基B扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图115是显示由以稻日本晴的DNA作为模板随机引物12碱基B扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图116是显示由以对于稻日本晴使用随机引物12碱基B制作的DNA文库作为模板利用新一代测序仪用引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第一次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图117是显示由以对于稻日本晴使用随机引物12碱基B制作的DNA文库作为模板利用新一代测序仪用引物扩增而得的DNA文库的电泳图像(第二次)获得的扩增片段长与荧光单位(FU)的关系的特性图。
图118是显示将以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物12碱基B扩增而得的DNA文库通过MiSeq进行分析而得的读出图谱、和随机引物序列与稻日本晴参考序列的一致率的分布的特性图。
图119是显示以稻日本晴的DNA作为模板用随机引物12碱基B扩增而得的DNA文库的MiSeq分析结果的特性图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明所涉及DNA文库的制作方法中，用以具有任意的碱基序列的引物(以下，记为随机引物)为高浓度的方式制备的反应液进行核酸扩增反应，以扩增而得的核酸片段作为DNA文库。其中，高浓度是指与通常的核酸扩增反应中的引物浓度相比为高浓度。即，本发明所涉及DNA文库制作方法在使用与通常的核酸扩增反应中的引物浓度相比为高浓度的随机引物的方面具有特征。其中，作为反应液所含的模板，可以使用从制作DNA文库的对象生物制备的基因组DNA。
此外，本发明所涉及DNA文库的制作方法中，对于对象生物种没有任何限定，可以以包含人的动物、植物、微生物、病毒等任何生物种作为对象。即，根据本发明所涉及DNA文库的制作方法，从任何生物种都可以制作DNA文库。
本DNA文库的制作方法中，通过如上所述规定随机引物的浓度，能够以高的再现性扩增核酸片段(核酸片段群)。其中，再现性是指在使用同一模板和同一随机引物进行多次核酸扩增反应时，多次核酸扩增反应之间所扩增的核酸片段一致的程度。即，高再现性(再现性高)是指在使用同一模板和同一随机引物进行多次核酸扩增反应时，多次核酸扩增反应之间所扩增的核酸片段的一致度高。
关于再现性的高低，例如，可以使用同一模板和同一随机引物进行多次核酸扩增反应，将各次得到的扩增片段进行电泳，对于所得的荧光单位(Fluorescence Unit:FU)计算斯皮尔曼等级相关系数，基于该系数进行评价。斯皮尔曼等级相关系数一般用ρ表示，作为一例用ρ＞0.9评价为有再现性。
〔随机引物〕
作为能够在本发明所涉及DNA文库的制作方法中使用的随机引物，对其序列没有任何限定，可以使用例如9～30碱基长的核苷酸。特别是随机引物是指具有任意的序列的9～30碱基长的核苷酸，对核苷酸的种类(序列的种类)不特别限定，为1种以上的核苷酸、优选为1～10000种核苷酸、更优选为1～1000种核苷酸、更优选为1～100种核苷酸、最优选为1～96种核苷酸。通过作为随机引物使用上述范围的核苷酸(核苷酸群)，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。此外，在作为随机引物包含多种核苷酸的情况下，不需要所有核苷酸为相同碱基长(9～30碱基长)，也可以包含不同碱基长的多种核苷酸。
通常，为了获得核酸扩增反应后的特定扩增子，要根据该扩增子设计引物的碱基序列。例如，以夹着基因组DNA等模板DNA中的与扩增子对应的位置的方式设计一对引物。此时，引物以与模板所含的特定区域杂交的方式设计，因而可称为“特异引物”。
与此相对，随机引物与为了获得特定扩增子而设计的引物不同，并不是以与模板DNA中的特定区域杂交的方式设计的，而是为了获得随机的扩增子而设计。随机引物的碱基序列可以为任何序列，能够通过与模板DNA所含的互补区域偶发地杂交而参与随机的扩增子扩增。
即，随机引物如上所述，可以说是参与随机的扩增子扩增的具有任意序列的核苷酸。其中所谓任意序列没有任何限定，例如，可以作为从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的组中随意选择的碱基序列而设计，也可以作为特定碱基序列而设计。作为特定碱基序列，可列举例如，包含限制性酶识别序列的碱基序列、具有用于新一代测序仪的接头序列的碱基序列。
在作为随机引物设计多种核苷酸的情况下，可以应用从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的组中随意选择而设计多种指定长度的碱基序列的方法。另外，在作为随机引物设计多种核苷酸的情况下，也可以应用设计多种由包含特定碱基序列的共有部分、和由包含任意的碱基序列的非共有部分组成的碱基序列的方法。其中，非共有部分可以是从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的组中随意选择的碱基序列，也可以是由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶组成的4种碱基的全部组合、或从这些全部组合中选出的一部分组合。对共有部分不特别限定，可以是任何碱基序列，例如，可以是包含限制性酶识别序列的碱基序列、具有用于新一代测序仪的接头序列的碱基序列、特定基因家族共有的碱基序列。
在作为多种随机引物，从4种碱基随意选择而设计多种指定长度的碱基序列的情况下，优选将全体的30％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上、进一步优选为90％以上设计成70％以下的同一性、优选为60％以下的同一性、更优选为50％以下的同一性、最优选为40％以下的同一性。在作为多种随机引物，从4种碱基随意选择而设计多种指定长度的碱基序列的情况下，通过对于上述范围的核苷酸设计成上述范围的同一性，能够对于对象生物种的基因组DNA全体获得扩增片段。即，能够提高扩增片段的均一性。
在作为多种随机引物，设计多种由包含特定碱基序列的共有部分、和包含任意的碱基序列的非共有部分组成的碱基序列的情况下，例如，可以设计成以3’末端侧的数碱基作为非共有部分、并以其余的5’末端侧作为共有部分。如果以3’末端侧的n个碱基作为非共有部分，则可以设计4n种随机引物。其中，作为n个，可以为1～5个，优选为2～4个，更优选为2～3个。
例如，作为由共有部分和非共有部分组成的随机引物，可以设计5’末端侧为用于新一代测序仪的接头序列(共有部分)、3’末端侧为2碱基(非共有部分)的合计16种随机引物。此外，如果3’末端侧为3碱基(非共有部分)，则可以设计合计64种随机引物。随机引物的种类越多，则越能够完整地对于对象生物种的基因组DNA全体获得扩增片段。因此，在设计由共有部分和非共有部分组成的随机引物时，3’末端侧的碱基优选为3碱基。
但是，例如，在设计由共有部分和3碱基的非共有部分组成的64种碱基序列之后，也可以使用选自这64种碱基序列的63种以下的随机引物。换言之，有时与使用全部64种随机引物的情况相比，使用63种以下的随机引物的情况下，在核酸扩增反应、使用新一代测序仪的分析中显示更优异的结果。具体地，在使用64种随机引物的情况下，有时特定核酸扩增片段的读出数显著变多。这时，使用从64种随机引物中除去参与该特定核酸扩增片段的扩增的1或多种随机引物后的其余的63种以下的随机引物会得到更良好的分析结果。
此外，使用由共有部分和2碱基的非共有部分组成的16种随机引物的情况也同样地，有时使用选自16种随机引物的15种以下的随机引物的情况下，在核酸扩增反应、使用新一代测序仪的分析中显示更优异的结果。
另一方面，作为随机引物使用的核苷酸特别优选设计成GC含量为5～95％的范围，更优选设计成GC含量为10～90％的范围，进一步优选设计成GC含量为15～80％的范围，最优选设计成GC含量为20～70％的范围。通过作为随机引物使用GC含量为上述范围的核苷酸的集合，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。此外，GC含量是指核苷酸链全体所含的鸟嘌呤和胞嘧啶的比例。
进而，作为随机引物使用的核苷酸特别优选设计成相对于全体的长度连续碱基为80％以下，更优选设计成相对于全体的长度连续碱基为70％以下，进一步优选设计成相对于全体的长度连续碱基为60％以下，最优选设计成相对于全体的长度连续碱基为50％以下。或者，作为随机引物使用的核苷酸特别优选设计成连续碱基的数为8个以下，更优选设计成连续碱基的数为7个以下，进一步优选设计成连续碱基的数为6个以下，最优选设计成连续碱基的数为5个以下。通过作为随机引物使用连续碱基数为上述范围的核苷酸的集合，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
进一步另外，作为随机引物使用的核苷酸特别优选设计成分子内不具有6碱基长以上、优选为5碱基以上、更优选为4碱基以上的互补区域。通过设计成核苷酸不具有上述范围的互补区域，能够防止分子内的双链形成，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
进一步另外，在作为随机引物设计多种核苷酸的情况下，特别优选设计成多种核苷酸之间不具有6碱基长以上、优选为5碱基以上、更优选为4碱基以上的互补区域。设计成多种核苷酸之间不具有上述范围的互补区域，能够防止核苷酸之间的双链形成，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
进一步另外，在作为随机引物设计多种核苷酸的情况下，特别优选设计成3’末端侧的6碱基以上、优选为5碱基以上、更优选为4碱基以上不形成互补的序列。通过设计成多种核苷酸的3’末端侧的上述范围不具有互补的序列，能够防止核苷酸之间的双链形成，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
此外，互补区域和互补的序列是指例如具有80～100％的同一性的区域和序列(例如如果对于5碱基长的区域，则指4碱基或5碱基互补的区域和序列)，或者具有90～100％的同一性的区域和序列(例如如果对于5碱基长的区域，则指5碱基互补的区域和序列)。
进一步另外，作为随机引物使用的核苷酸优选设计成适合核酸扩增反应中的温度循环条件(特别是退火温度)的Tm值。虽然不特别限定，但Tm值可以通过最接近碱基对法、Wallace法和GC％法等公知的计算方法计算。具体地，作为随机引物使用的核苷酸特别优选设计成Tm值为10～85℃、优选为12～75℃、更优选为14～70℃、最优选为16～65℃。通过设计成核苷酸的Tm值为上述范围，在核酸扩增反应中的指定的温度循环条件(特别是指定的退火温度)下，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
进一步另外，在作为随机引物设计多种核苷酸的情况下，特别优选设计成在多种核苷酸之间各核苷酸的Tm值的波动为50℃以下、优选为45℃以下、更优选为40℃以下、最优选为35℃以下。通过设计成多种核苷酸之间Tm值的波动为上述范围，在核酸扩增反应中的指定的温度循环条件(特别是指定的退火温度)下，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。
〔核酸扩增反应〕
在本发明所涉及DNA文库的制作方法中，通过使用上述的随机引物和作为模板的基因组DNA的核酸扩增反应，获得大量的扩增片段。特别是在核酸扩增反应中，使反应液中的随机引物的浓度与通常的核酸扩增反应中的引物浓度相比为高浓度。由此，能够在实现高的再现性的同时，以基因组DNA作为模板获得大量的扩增片段。由此，所得的大量的扩增片段能够作为可以用于基因型判定等的DNA文库使用。
其中，核酸扩增反应，是指用包含成为模板的基因组DNA、上述的随机引物、DNA聚合酶、成为底物的脱氧核苷三磷酸(dNTP，即dATP、dCTP、dTTP和dGTP的混合物)和缓冲液的反应液，施加指定的温度循环条件，从而合成扩增片段的反应。此外，对于核酸扩增反应，反应液中需要指定浓度的Mg2+，在上述的组成中缓冲液包含MgCl2。在缓冲液不包含MgCl2的情况下，除了上述组成还要包含MgCl2。
特别是在核酸扩增反应中，随机引物的浓度优选适应随机引物的碱基长而适宜设定。其中，随机引物的碱基长在使用不同碱基长的多种核苷酸作为随机引物的情况下，取其平均值(可以为单纯平均，也可以为加进了核苷酸量的加权平均)。
具体地，使用9～30碱基长的随机引物，在该随机引物浓度为4～200μM的条件、优选为4～100μM的条件下进行核酸扩增反应。如果在该条件下，则能够通过核酸扩增反应在实现高的再现性的同时获得大量的扩增片段、特别是100～500碱基长的大量的扩增片段。
更具体地，随机引物的浓度在随机引物为9～10碱基长的情况下，优选为40～60μM。随机引物的浓度在随机引物为10～14碱基长的情况下，设随机引物的碱基长为y、随机引物的浓度为x时，优选满足y＞3E+08x-6.974且为100μM以下。随机引物的浓度在随机引物为14～18碱基长的情况下，优选为4～100μM。随机引物的浓度在随机引物为18～28碱基长的情况下，优选为4μM以上，且满足y＜8E+08x-5.533。随机引物的浓度在随机引物为28～29碱基长的情况下，优选为6～10μM。通过将随机引物的浓度适应随机引物的碱基长如上所述设定，能够在实现高的再现性的同时，更确实地获得大量的扩增片段。
此外，上述的y＞3E+08x-6.974和y＜8E+08x-5.533的不等式如后述的实施例中说明的那样，是详细调查随机引物的长度与浓度的关系，结果作为能够再现性良好地获得100～500碱基长的大量的DNA片段的范围而计算出的。
另外，对核酸扩增反应中成为模板的基因组DNA不特别限定，当反应液的量为50μl时，优选为0.1～1000ng，更优选为1～500ng，进一步优选为5～200ng，最优选为10～100ng。通过使成为模板的基因组DNA的量为该范围，能够不阻碍来自随机引物的扩增反应，并且在实现高的再现性的同时获得大量的扩增片段。
对基因组DNA的制备方法不特别限定，可以应用现有公知的方法。另外，可以通过利用市售的试剂盒，从对象生物种简便地制备基因组DNA。此外，作为基因组DNA，可以直接使用通过现有公知方法、市售的试剂盒从生物提取的，也可以将从生物提取的进行纯化后使用，也可以使用限制性酶处理、超音波处理后的。
另外，核酸扩增反应中作为DNA聚合酶，不特别限定，可以使用在用于核酸扩增反应的温度循环条件下具有DNA聚合酶活性的酶。具体地，可以使用用于通常的核酸扩增反应的耐热性DNA聚合酶。例如，作为DNA聚合酶，可列举Taq DNA聚合酶等嗜热细菌来源的DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等超嗜热古生菌(Archaea)来源的DNA聚合酶。特别是核酸扩增反应中，优选与上述的随机引物一起作为DNA聚合酶使用Pfu DNA聚合酶。通过使用这些DNA聚合酶，能够在实现高的再现性的同时更确实地获得大量的扩增片段。
进一步，核酸扩增反应中，对成为底物的脱氧核苷三磷酸(dNTP、即dATP、dCTP、dTTP和dGTP的混合物)的浓度不特别限定，可以为5μM～0.6mM，优选为10μM～0.4mM，更优选为20μM～0.2mM。通过使成为底物的dNTP的浓度为该范围，能够防止通过由DNA聚合酶导致的误插入而发生错误，能够在实现高的再现性的同时获得大量的扩增片段。
进一步，核酸扩增反应中，作为缓冲液，不特别限定，可列举如上所述包含MgCl2、例如包含Tris-HCl(pH8.3)和KCl的溶液。其中，作为Mg2+的浓度，不特别限定，例如为0.1～4.0mM，优选为0.2～3.0mM，更优选为0.3～2.0mM，进一步优选为0.5～1.5mM。通过将反应液中的Mg2+浓度设定为该范围，能够在实现高的再现性的同时获得大量的扩增片段。
进一步另外，作为核酸扩增反应中的温度循环条件，不特别限定，可以采用通常的温度循环。具体作为温度循环，可以例示如下循环：首先，用于将模板的基因组DNA分离成单链的最初的热变性温度；然后，将“热变性温度→退火温度→延伸反应温度”进行多次(例如，20～40次)；最后如果需要，为指定时间延伸反应温度；最后为用于保存的温度。
作为热变性温度，例如可以为93～99℃、优选为95～98℃、更优选为97～98℃。作为退火温度，也依赖于上述随机引物的Tm值，例如可以为30～70℃、优选为35～68℃、更优选为37～65℃。作为延伸反应温度，例如为70～76℃、优选为71～75℃、更优选为72～74℃。另外，作为用于保存的温度例如可以为4℃。
另外，最初的热变性在上述的温度范围内例如为5秒～10分钟、优选为10秒～5分钟、更优选为30秒～2分钟。“热变性温度→退火温度→延伸反应温度”的循环中的热变性在上述的温度范围例如为2秒～5分钟、优选为5秒～2分钟、更优选为10秒～1分钟。“热变性温度→退火温度→延伸反应温度”的循环中的退火在上述的温度范围例如为1秒～3分钟、优选为3秒～2分钟、更优选为5秒～1分钟。“热变性温度→退火温度→延伸反应温度”的循环中的延伸反应在上述的温度范围内例如为1秒～3分钟、优选为3秒～2分钟、更优选为5秒～1分钟。
另外，作为本发明所涉及DNA文库的制作方法，也可以是通过采用热启动法的核酸扩增反应来获得扩增片段的方法。热启动法是指在“热变性温度→退火温度→延伸反应温度”的循环之前防止由错误起始、引物二聚体造成的非特异扩增的方法。热启动法中，使用通过结合抗DNA聚合酶抗体、进行化学修饰而抑制了DNA聚合酶活性的状态的酶。在该状态下，DNA聚合酶活性被抑制，能够防止温度循环之前的非特异的反应。热启动法中，通过在最初的温度循环时将温度设定得较高来使DNA聚合酶活性恢复，之后核酸扩增反应进行。
如上，通过使用上述的9～30碱基长的随机引物、使反应液中的该随机引物浓度为4～200μM进行核酸扩增反应，能够以基因组DNA作为模板用随机引物获得大量的扩增片段。在使用上述的9～30碱基长的随机引物、反应液中的该随机引物浓度为4～200μM的情况下，形成再现性非常高的核酸扩增反应。即，根据上述的核酸扩增反应，能够在实现非常高的再现性的同时获得大量的扩增片段。因此，所得的大量的扩增片段可以在以基因组DNA作为对象的基因分析中作为DNA文库使用。
另外，通过使用上述的9～30碱基长的随机引物、使反应液中的该随机引物浓度为4～200μM进行核酸扩增反应，特别能够以基因组DNA作为模板获得约100～500碱基长的大量的扩增片段。该约100～500碱基长的大量的扩增片段是适合例如利用新一代测序仪的碱基序列的大量分析的大小，能够获得高精度的序列信息。即，根据本发明，能够制作包含约100～500碱基长的DNA片段的DNA文库。
进一步，通过使用上述的9～30碱基长的随机引物、使反应液中的该随机引物浓度为4～200μM进行核酸扩增反应，特别能够对于基因组DNA的全体均一地获得扩增片段。换言之，在使用该随机引物的核酸扩增反应中，不是偏于基因组DNA的指定区域扩增DNA片段，而是分散在基因组全体地扩增DNA片段。即，根据本发明，能够对基因组全体制作均一的DNA文库。
此外，使用上述的随机引物进行核酸扩增反应之后，可以对所得的扩增片段进行限制性酶处理、大小选择处理和序列捕获处理等。通过对扩增片段进行这些限制性酶处理、大小选择处理和序列捕获处理，能够从所得的扩增片段中获得特定扩增片段(具有特定限制性酶部位的片段、特定大小范围的扩增片段、具有特定序列的扩增片段)。并且，可以使用通过这些各种处理而得的特定扩增片段作为DNA文库。
〔基因组DNA分析方法〕
通过使用如上所述制作的DNA文库，能够进行基因型分析等基因组DNA分析。如上所述，DNA文库具有非常高的再现性，具有适合新一代测序仪的大小，对于基因组全体具有均一性。因此，DNA文库可以作为DNA标志物(也称为遗传标志物、基因标志物)使用。其中，DNA标志物广义地指存在于基因组DNA内的特征碱基序列。另外，作为DNA标志物，特别可以是成为与遗传性状相关的记号的基因组上的碱基序列。DNA标志物可以在例如基因型鉴定、连锁图谱、基因作图、包含利用标志物的筛选工序的育种、利用标志物的回交、数量性状基因座作图、集群分离分析(bulk segregant analysis)、品种识别、或连锁不均衡作图等中利用。
例如，可以使用新一代测序仪等确定如上所述制作的DNA文库的碱基序列，基于所得的碱基序列确认DNA标志物是否存在。
作为一例，可以由所得的碱基序列的读出数确认DNA标志物是否存在。其中，作为新一代测序仪不特别限定，也被称为第2代测序仪，是指能够同时并行地确定数千万的DNA片段的碱基序列的碱基序列确定装置。作为新一代测序仪的测序原理，不特别限定，可列举例如：通过桥式PCR法和边合成边测序(Sequencing-by-synthesis)法在流动池上扩增目的DNA，一边合成一边进行测序这样的原理；或者，通过乳液PCR法和测定DNA合成时释放的焦磷酸的量来进行序列确定的焦磷酸测序法来进行测序这样的原理。更具体地，作为新一代测序仪，可列举イルミナ社(Illumina)的MiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq和HiSeq X系列、ロシュ社的Roche 454 GS FLX测序仪等。
另外，作为其他例，可以通过将对于如上所述制作的DNA文库得到的碱基序列与参考用的碱基序列进行比较来确认DNA标志物是否存在。其中，参考用的碱基序列是指成为基准的已知的序列，例如，可以是储存在数据库中的已知序列。即，对于指定的生物，如上所述制作DNA文库，确定其碱基序列，将DNA文库的碱基序列与参考用的碱基序列进行比较。并且，可以将与参考用的碱基序列不同的碱基序列作为与该指定的生物相关的DNA标志物(存在于基因组DNA内的特征碱基序列)。另外，通过对于特定的DNA标志物按照常规方法进一步分析，能够确定与遗传性状(表型)的相关性。即，能够从如上所述特定的DNA标志物中，特定出与表型相关的DNA标志物(也有时称为筛选标志物)。
进一步作为其他例，可以通过将对于如上所述制作的DNA文库得到的碱基序列与使用其他生物来源的基因组DNA或其他组织来源的基因组DNA制作的上述DNA文库的碱基序列进行比较，来确认DNA标志物是否存在。即，对于2种以上的生物或2种不同组织，分别如上所述制作DNA文库，确定它们的碱基序列，将DNA文库的碱基序列彼此进行比较。并且，可以将在DNA文库之间不同的碱基序列作为与供试的生物或组织相关的DNA标志物(存在于基因组DNA内的特征碱基序列)。另外，通过对于特定的DNA标志物按照常规方法进一步分析，能够确定与遗传性状(表型)的相关性。即，能够从如上所述特定的DNA标志物中，特定出与表型相关的DNA标志物(也有时称为筛选标志物)。
此外，还可以基于所得的碱基序列设计特异地扩增该DNA标志物的一对引物。通过使用所设计的一对引物、以从对象生物提取的基因组DNA作为模板进行核酸扩增反应，能够确认提取的基因组DNA中DNA标志物是否存在。
或者，如上所述制作的DNA文库可以在调查微生物等的多样性的宏基因组分析、肿瘤组织等的体细胞基因组突变分析、利用微阵列的基因型分析、倍数性的判定分析、染色体数的计算分析、染色体的增减分析、染色体的部分插入/缺失/复制/转座分析、外来基因组的混入分析、亲子判别分析、交配种子纯度检验分析这样的分析中利用。
〔在新一代测序技术中的应用〕
如上，通过使反应液中的该随机引物为高浓度而进行核酸扩增反应，能够以基因组DNA作为模板再现性良好地获得大量的扩增片段。所得的扩增片段在其两末端具有随机引物和同源碱基序列，因此通过利用该碱基序列能够简便地提供给新一代测序技术。
具体地，首先，如上所述，用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的反应液(第1反应液)进行核酸扩增反应，以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应获得大量的扩增片段(第1DNA片段)。接下来，在包含获得的大量的扩增片段(第1DNA片段)、和基于上述随机引物的碱基序列设计的引物(称为新一代测序仪用引物)的反应液(第2反应液)中进行核酸扩增反应。其中，新一代测序仪用引物是包含用于碱基序列确定反应的区域的核苷酸。更具体地，例如，新一代测序仪用引物是其3’末端的碱基序列为与第1DNA片段的5’末端侧的碱基序列70％以上一致的碱基序列、优选为80％以上一致的碱基序列、更优选为90％以上一致的碱基序列、进一步优选为95％以上一致的碱基序列、进一步优选为97％以上一致的碱基序列、最优选为100％一致的碱基序列的引物，可以是具有利用新一代测序装置的碱基序列确定反应(测序反应)所需的区域的核苷酸。
其中，作为新一代测序仪用引物所含的“用于碱基序列确定反应的区域”，根据新一代测序仪的种类不同而不同，因此不特别限定，例如，在新一代测序仪利用测序用引物执行碱基序列确定反应的情况下，可以为与该测序用引物的碱基序列互补的碱基序列。另外，在新一代测序仪利用结合指定的DNA的捕获珠执行碱基序列确定反应的情况下，“用于碱基序列确定反应的区域”可以为与结合该捕获珠的DNA的碱基序列互补的碱基序列。进一步，在新一代测序仪是由末端具有发夹环的DNA链通过具有纳米大小的孔的蛋白质时的电流变化读取序列的情况下，“用于碱基序列确定反应的区域”可以为与形成该发夹环的碱基序列互补的碱基序列。
通过如上所述设计新一代测序仪用引物的3’末端的碱基序列，新一代测序仪用引物能够与第1DNA片段的3’末端在严格条件下杂交，能够以第1DNA片段作为模板扩增第2DNA片段。其中，严格条件下是指形成所谓的特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，例如，可以参考Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Third Edition)来适宜确定。具体地，可以通过DNA杂交(Southern hybridization)时的温度、溶液所含的盐浓度、和DNA杂交的洗涤工序时的温度、溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如，钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地，为5×SSC(83mM NaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
特别是在使用多种随机引物获得第1DNA片段的情况下，可以与全部随机引物对应地准备新一代测序仪用引物，也可以与一部分随机引物对应地准备新一代测序仪用引物。
例如，在作为多种随机引物使用除了3’末端的数碱基(例如1～3碱基左右)以外由共有的碱基序列组成的随机引物(3’末端的数碱基为任意的序列)的组的情况下，所得的大量的第1DNA片段的5’末端全部具有共有的序列。因此，使新一代测序仪用引物的3’末端的碱基序列为与在第1DNA片段的5’末端侧共有的碱基序列70％以上一致的碱基序列。这样通过设计新一代测序仪用引物，形成与全部随机引物对应的新一代测序仪用引物。通过使用该新一代测序仪用引物，能够以第1DNA片段的全部作为模板扩增第2DNA片段。
另外，同样地，在作为多种随机引物使用除了3’末端的数碱基(例如1～3碱基左右)以外由共有的碱基序列组成的随机引物(3’末端的数碱基为任意的序列)的组的情况下，也可以以所得的大量的第1DNA片段中的一部分作为模板获得第2DNA片段。具体地，通过使新一代测序仪用引物的3’末端的碱基序列为与在第1DNA片段的5’末端侧共有的碱基序列和与其连续的数碱基的序列(相当于随机引物的3’末端的数碱基(任意序列))70％以上一致的碱基序列，能够以一部分第1DNA片段作为模板扩增第2DNA片段。
另一方面，在使用全部由任意的碱基序列组成的多种随机引物获得第1DNA片段的情况下，可以与第1DNA片段的全部对应地使用多种新一代测序仪用引物获得第2DNA片段，也可以与第1DNA片段中的一部分对应地使用多种新一代测序仪用引物获得第2DNA片段。
如上，使用新一代测序仪用引物扩增而得的第2DNA片段，具有新一代测序仪用引物所含的利用新一代测序装置的碱基序列确定反应(测序反应)所需的区域。测序反应所需的区域根据新一代测序装置不同而不同，因而不特别限定。例如，用于通过桥式PCR法和边合成边测序(Sequencing-by-synthesis)法在流动池上扩增目的DNA，一边合成一边进行测序这样的原理的新一代测序装置的情况下，新一代测序仪用引物包含桥式PCR所需的区域和边合成边测序(Sequencing-by-synthesis)法所需的区域。桥式PCR所需的区域是指与固定在流动池上的寡核苷酸杂交的区域，是包含新一代测序仪用引物的5’末端的9碱基长的区域。另外，边合成边测序(Sequencing-by-synthesis)法所需的区域是测序反应中使用的测序引物所杂交的区域，是新一代测序仪用引物的中途部的区域。
另外，作为新一代测序装置，可列举Ion Torrent测序装置。在使用Ion Torrent测序装置的情况下，新一代测序仪用引物在5’末端侧具有所谓离子接头，与实施乳液PCR的粒子结合。另外，在Ion Torrent测序装置中，将用通过乳液PCR扩增的模板涂覆后的粒子放置在离子芯片上，供于测序反应。
此外，对使用包含新一代测序仪用引物和第1DNA的第2反应液的核酸扩增反应不特别限定，可以应用通常的核酸扩增反应的条件。即，可以采用上述的〔核酸扩增反应〕栏所记载的那样的条件。例如，第2反应液包含成为模板的第1DNA片段、上述的新一代测序仪用引物、DNA聚合酶、成为底物的脱氧核苷三磷酸(dNTP、即dATP、dCTP、dTTP和dGTP的混合物)和缓冲液。
特别是作为新一代测序仪用引物的浓度，可以为0.01～5.0μM，优选为0.1～2.5μM，最优选为0.3～0.7μM。
另外，对在核酸扩增反应中成为模板的第1DNA片段不特别限定，当反应液的量为50μl时，优选为0.1～1000ng，更优选为1～500ng，进一步优选为5～200ng，最优选为10～100ng。
对成为模板的第1DNA片段的制备方法不特别限定，可以直接使用利用上述的随机引物的核酸扩增反应结束后的反应液，也可以从该反应液纯化第1DNA片段后使用。
另外，对于核酸扩增反应中使用的DNA聚合酶的种类、成为底物的脱氧核苷三磷酸(dNTP、即dATP、dCTP、dTTP和dGTP的混合物)的浓度、缓冲液组成、温度循环条件，可以是上述的〔核酸扩增反应〕栏中记载的那样的条件。另外，在使用新一代测序仪用引物的核酸扩增反应中，可以采用热启动法，也可以通过核酸扩增反应获得扩增片段。
如上，通过使用以利用随机引物获得的第1DNA片段作为模板、使用新一代测序仪用引物扩增的第2DNA片段，能够简便地制作可以适用于新一代测序装置的DNA文库。
此外，上述的例子中，以使用随机引物获得的第1DNA片段作为模板、使用新一代测序仪用引物扩增而得的第2DNA片段作为DNA文库，但本发明的技术范围不限于该例。例如，本发明所涉及DNA文库也可以以使用随机引物获得的第1DNA片段作为模板扩增第2DNA片段，进一步使用该第2DNA片段作为模板使用新一代测序仪用引物获得第3DNA片段，将该第3DNA片段作为可以适用于新一代测序装置的DNA文库。
为了制作可以适用于新一代测序装置的DNA文库，同样地，可以通过在以第2DNA片段作为模板的核酸扩增反应之后，重复以所得的DNA片段作为模板的核酸扩增反应，在最后的核酸扩增反应中使用新一代测序仪用引物而制作。此时，对重复的核酸扩增反应的次数不特别限定，为2～10次、优选为2～5次、更优选为2～3次。
实施例
以下，使用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于以下的实施例。
〔实施例1〕
1.流程图
本实施例中，按照图1所示的流程图，以从各种生物种提取的基因组DNA作为模板，通过使用各种随机引物组的PCR制作DNA文库。另外，使用制作的DNA文库，进行利用所谓新一代测序仪的序列分析，基于所得的读出数据分析基因型。
2.材料
本实施例中，从甘蔗品种NiF8、Ni9和它们的杂交后代22系统、以及稻品种日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)提取和纯化基因组DNA，分别作为NiF8来源的基因组DNA、Ni9来源的基因组DNA、杂交后代22系统来源的基因组DNA、日本晴来源的基因组DNA使用。另外，本实施例中，对于人DNA从タカラバイオ购买Human Genomic DNA(人类基因组DNA)，作为人来源的基因组DNA使用。
3.方法
3.1PCR条件和DNA片段的大小的关系
3.1.1随机引物的设计
设计随机引物时，设定GC含量为20～70％的范围、连续碱基数为5以下的条件。另外，对于碱基长，设计8碱基长、9碱基长、10碱基长、11碱基长、12碱基长、14碱基长、16碱基长、18碱基长、20碱基长、22碱基长、24碱基长、26碱基长、28碱基长、29碱基长、30碱基长和35碱基长的16种。对于各碱基长，分别设计96种碱基序列，制作由96种随机引物组成的组。此外，对于10碱基长，设计了6组(各组包含96种随机引物)(将这6组称为10碱基A～10碱基F)。即，本实施例中，制作了21种随机引物组。
这21种随机引物组所含的随机引物的碱基序列示于表1～21。
表1.随机引物列表(10碱基A)
表2.随机引物列表(10碱基B)
表3.随机引物列表(10碱基C)
表4.随机引物列表(10碱基D)
表5.随机引物列表(10碱基E)
表6.随机引物列表(10碱基F)
表7.随机引物列表(8碱基)
表8.随机引物列表(9碱基)
表9.随机引物列表(11碱基)
表10.随机引物列表(12碱基)
表11.随机引物列表(14碱基)
表12.随机引物列表(16碱基)
表13.随机引物列表(18碱基)
表14.随机引物列表(20碱基)
表15.随机引物列表(22碱基)
表16.随机引物列表(24碱基)
表17.随机引物列表(26碱基)
表18.随机引物列表(28碱基)
表19.随机引物列表(29碱基)
表20.随机引物列表(30碱基)
表21.随机引物列表(35碱基)
3.1.2标准PCR
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度0.6μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环，然后在4℃保存的条件。此外，本实施例中，包含这里说明的标准PCR在内，将通过使用随机引物的PCR得到的大量的核酸片段作为DNA文库。
3.1.3DNA文库的纯化和电泳
将3.1.2中得到的DNA文库用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，用Agilent 2100生物分析仪(Agient Technologies)进行电泳，获得荧光单位(Fluorescence Unit:FU)。
3.1.4退火温度的研究
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度0.6μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、各种退火温度15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。此外，本实施例中，作为退火温度研究了37℃、40℃和45℃。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.1.5酶量的研究
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度0.6μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和2.5单位(unit)或12.5单位(unit)的DNA DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.1.6MgCl2浓度的研究
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度0.6μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、指定浓度的MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。此外，本实施例中，作为MgCl2浓度，研究了通常的2倍(2.0mM)、3倍(3.0mM)和4倍(4.0mM)。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.1.7随机引物的碱基长的研究
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度0.6μM随机引物、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。此外，本实施例中，作为随机引物，研究了上述的8碱基长(表7)、9碱基长(表8)、11碱基长(表9)、12碱基长(表10)、14碱基长(表11)、16碱基长(表12)、18碱基长(表13)和20碱基长(表14)。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.1.8随机引物浓度的研究
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入指定浓度的随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。此外，本实施例中，作为随机引物浓度，研究了2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000μM。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。另外，本实验中，通过斯皮尔曼等级相关评价了重复数据的再现性(ρ＞0.9)。
3.2利用MiSeq确认再现性
3.2.1DNA文库的制作
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度60μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.2.2测序文库的制作
由3.2.1中得到的DNA文库，使用KAPA Library Preparation Kit(Roche)制作MiSeq分析用测序文库。
3.2.3MiSeq分析
使用MiSeq Reagent Kit V2 500Cycle(Illumina)，对3.2.2中得到的MiSeq分析用测序文库，基于读出长100碱基的双端测序(pair end)条件进行分析。
3.2.4读出数据分析
从3.2.3中得到的读出数据中删除随机引物的序列信息，特定出读出图谱。然后对于每个读出图谱计算出读出数，比较重复之间的读出数，用相关系数评价再现性。
3.3稻品种日本晴的分析
3.3.1DNA文库的制作
在2.所记载的基因组DNA(日本晴来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度60μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.3.2测序文库制作、MiSeq分析和读出数据分析
使用由日本晴来源基因组DNA制作的DNA文库的测序文库的制作、MiSeq分析和读出数据分析分别依照3.2.2、3.2.3和3.2.4所记载的方法。
3.3.3基因组均一性的评价
对于3.3.2中得到的读出图谱，相对于日本晴的基因组信息(NC_008394～NC_008405)用bowtie2将读出图谱作图，特定出各读出图谱的基因组位置。
3.3.4非特异的扩增
基于3.3.3中特定的各读出图谱的位置信息，将随机引物的序列与该随机引物所退火的基因组上的序列进行比较，计算出错配数。
3.4多态性检测和基因型判别
3.4.1DNA文库的制作
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA、Ni9来源基因组DNA、杂交后代来源基因组DNA或日本晴来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度60μM随机引物(10碱基A)、0.2mMdNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.4.2HiSeq分析
将3.4.1中制作的各DNA文库分别在1泳道16样品和读出长100碱基的双端测序(pair end)条件下委托タカラバイオ进行分析，分别获得读出数据。
3.4.3读出数据分析
从3.4.2中得到的读出数据中删除随机引物的序列信息，特定出读出图谱。然后对于每个读出图谱计算出读出数。
3.4.4多态性检测和基因型判别
从作为3.4.3的分析结果而得的读出图谱的读出数，检测NiF8和Ni9特有的多态性，以其读出图谱作为标志物。另外，基于读出数判别杂交后代22系统的基因型。基因型判别的精度基于杂交后代2系统的重复数据的再现性进行评价。
3.5利用PCR标志物的确认实验
3.5.1引物的设计
对于3.4.4中特定的标志物中的NiF8型3标志物、Ni9型3标志物的合计6标志物，由双端测序(pair end)的标志物序列信息分别设计引物(表22)。
3.5.2PCR和电泳
使用TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(TAKARA)，以2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA、Ni9来源基因组DNA或杂交后代来源基因组DNA:15ng)为模板，加入1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、3.5.1中设计的0.4μM引物，以最终反应量25μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，94℃ 1分钟，然后，将94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 30秒作为1循环进行30循环后，72℃维持10分钟，然后，4℃保存的条件。扩增的DNA片段用TapeStation(Agilent Technologies)进行电泳。
3.5.3基因型数据比较
由3.5.2中得到的电泳的结果，根据条带的有无来判别标志物的基因型，与标志物的读出数进行比较。
3.6随机引物浓度与长度的关系
3.6.1高浓度条件下随机引物长的影响
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度10μM的指定长度的随机引物、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。本实验中，作为随机引物的长度，研究了9碱基长(表8)、10碱基长(表1、10碱基A)、11碱基长(表9)、12碱基长(表10)、14碱基长(表11)、16碱基长(表12)、18碱基长(表13)和20碱基长(表14)。PCR的温度循环条件在使用9碱基长的随机引物的反应系中是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、37℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。PCR的温度循环条件在使用10碱基长以上的长度的随机引物的反应系中是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.6.2随机引物的浓度与长度的关系
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)以指定浓度加入指定长度的随机引物，并加入0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。本实验中，作为随机引物的长度，验证了表1～21所示的8碱基长至35碱基长的随机引物，作为随机引物的浓度验证了0.6～300μM的范围。
PCR的温度循环条件在使用8碱基长和9碱基长的随机引物的反应系是，首先，98℃2分钟，然后，将98℃ 10秒、37℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。PCR的温度循环条件在使用10碱基长以上的长度的随机引物的反应系中是，首先，98℃2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ＞0.9)。
3.7随机引物数
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)中以最终浓度60μM加入选自表1所示的由10碱基长组成的96种随机引物(10碱基A)中的1种、2种、3种、12种、24种或48种随机引物，并加入0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。本实验中，作为1种、2种、3种、12种、24种或48种随机引物，从表1的No.1开始依次选择随机引物进行验证。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ＞0.9)。
3.8随机引物序列
在2.所记载的基因组DNA(NiF8来源基因组DNA:30ng)以最终浓度60μM加入选自表2～6所示的5组随机引物中的1组，并加入0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ＞0.9)。
3.9使用人来源基因组DNA的DNA文库
在2.所记载的基因组DNA(人来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度60μM的随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ＞0.9)。
4.结果和考察
4.1PCR条件与DNA文库的大小的关系
在仿效通常的PCR条件、利用随机引物的PCR(上述3.1.2)中，被扩增的DNA文库的大小为2kbp以上的高分子，在目的大小的100bp～500bp未见扩增(图2)。认为未得到100bp～500bp的DNA文库是因为随机引物在500bp以下的区域作为引物发挥功能的概率低。认为为了制作目的大小的100bp～500bp的DNA文库，需要再现性良好地诱发非特异的扩增。
于是，对于认为影响PCR的特异性的退火温度(上述3.1.4)、酶量(上述3.1.5)、MgCl2浓度(上述3.1.6)、引物长(上述3.1.7)和引物浓度(上述3.1.8)与DNA文库大小的关系进行了研究。
在上述3.1.4所记载的实验中，将退火温度为45℃时的结果示于图3、退火温度为40℃时的结果示于图4、退火温度为37℃时的结果示于图5。如图3～5所示，如果将退火温度降低到45℃、40℃和37℃，则虽然高分子DNA文库的扩增量增加，但是看不到低分子DNA文库的扩增。
上述3.1.5所记载的实验中，将酶量为2倍时的结果示于图6、酶量为10倍时的结果示于图7。如图6和7所示，即使将酶量增至通常的2倍、10倍，也是虽然高分子DNA文库增加，但是看不到低分子DNA文库的扩增。
在上述3.1.6所记载的实验中，将MgCl2浓度为通常的2倍时的结果示于图8、MgCl2浓度为通常的3倍时的结果示于图9、MgCl2浓度为通常的4倍时的结果示于图10。如图8～10所示，即使将MgCl2浓度增至通常的2倍、3倍、4倍，也是虽然高分子DNA文库的扩增量变化，但看不到低分子DNA文库的扩增。
在上述3.1.7所记载的实验中，将随机引物长为8碱基长、9碱基长、11碱基长、12碱基长、14碱基长、16碱基长、18碱基长和20碱基长时的结果分别示于图11～18。如图11～18所示，即使使用任一长度的随机引物，与图2所示的结果(10碱基长的随机引物)相比也看不到大的变化。
将上述3.1.8所记载的实验结果归纳于表23。
表23
如图19～47所示，表明在使用10碱基长的随机引物的情况下，在随机引物浓度为6μM时对于1kbp的DNA片段观察到扩增，随着浓度上升，DNA片段低分子化。另外，在随机引物浓度为6～500μM的情况下对于再现性进行研究的结果是，虽然在通常的10倍的6μM下ρ为0.889有些低，但在相当于通常的13.3倍的8μM以上的情况下，进一步在相当于833.3倍的500μM的情况下，ρ均显示0.9以上的高值。由该结果表明，通过将随机引物的浓度与通常的PCR条件相比大幅提高，能够在实现高的再现性的同时扩增1kbp以下的DNA片段。但是，在随机引物的浓度超过500μ而过高的情况下，不能观察到所期望的大小的DNA片段的扩增。因此表明，为了再现性优异地扩增低分子的DNA片段，随机引物的浓度存在高于通常的PCR时、且为指定值以下这样的最适的范围。
4.2利用MiSeq确认再现性
将如上述3.2中说明的那样，为了确认DNA文库制作的再现性，对于以从NiF8提取的基因组DNA作为模板、用随机引物扩增而得的DNA文库利用新一代测序仪MiSeq进行分析而得的结果示于图48。此外，作为上述3.2.4的结果得到了47,484个读出图谱。在重复之间比较读出数的结果显示，与电泳的结果同样地，在重复之间显示相关系数r＝0.991的高相关。由以上的结果认为，通过随机引物能够再现性良好地进行DNA文库制作。
4.3稻品种日本晴的分析
如上述3.3中说明的那样，以从基因组信息公开了的稻日本晴提取的基因组DNA作为模板，通过随机引物制作DNA文库，将电泳的结果示于图49和50。由图49和50所示的结果，ρ显示0.979的非常高的值。另外，将通过MiSeq分析读出数据而得的结果示于图51。由图51所示的结果，相关系数r显示0.992的非常高的值。由这些结果表明，即使以稻作为对象，也能够通过使用随机引物以非常高的再现性制作DNA文库。
另外，如上述3.3.3中说明的那样，将所得的读出图谱相对于日本晴基因组信息作图的结果表明，以每6.2kbp l处的比例，对于基因组无偏移地均一地扩增了DNA片段(图52)。另外，将随机引物的序列与基因组信息进行比较的结果是，存在平均3.6个错配，以99.0％的引物对发生1个以上的错配(图53)。由以上的结果表明，利用随机引物的DNA文库是对于基因组全体均一且再现性良好地通过非特异的扩增而制作的。
4.4甘蔗多态性检测和基因型判别
如上述3.4中说明的那样，使用甘蔗NiF8、Ni9、和它们的杂交后代22系统，通过随机引物制作DNA文库，利用新一代测序仪HiSeq进行分析，基于读出数据判别两亲的多态性检测和杂交后代的基因型。将其结果示于表24。
表24.甘蔗NiF8的Ni9标志物数和基因型判別精度
如表24所示，对于NiF8型能够制作8,683个标志物，对于Ni9型能够制作11,655个标志物，合计能够制作20,338个标志物。另外，杂交后代的基因型判别的再现性高达99.97％，认为基因型判别精度极高。特别是甘蔗是多倍体(8x+n)，染色体数也极多，为100～130条，基因组大小也极大，为10Gbp，是人的3倍以上。因此，现状是对于基因组DNA全体进行基因型判别是极为困难的。如上所述，通过使用随机引物，能够制作极大量的标志物，对于甘蔗也可以进行精度高的基因型判别。
4.5利用PCR标志物的确认实验
如上述3.5中说明的那样，使用表22所示的引物，对于NiF8、Ni9、和它们的杂交后代22系统进行PCR，通过电泳判别基因型，与读出数进行比较。NiF8型的标志物N80521152的读出数和电泳图像分别示于图54和55。NiF8型的标志物N80997192的读出数和电泳图像分别示于图56和57。NiF8型的标志物N80533142的读出数和电泳图像分别示于图58和59。Ni9型的标志物N91552391的读出数和电泳图像分别示于图60和61。Ni9型的标志物N91653962的读出数和电泳图像分别示于图62和63。Ni9型的标志物N91124801的读出数和电泳图像分别示于图64和65。
如图54～65所示，上述3.5中设计的全部PCR标志物的结果均与新一代测序仪的分析结果一致，由此认为使用新一代测序仪的基因型判别能够作为标志物技术利用。
4.6随机引物浓度与长度的关系
将如上述3.6.1中说明的那样，使用9碱基长(表8)、10碱基长(表1、10碱基A)、11碱基长(表9)、12碱基长(表10)、14碱基长(表11)、16碱基长(表12)、18碱基长(表13)和20碱基长(表14)的随机引物制作DNA文库的结果示于图66～81。另外，表25中归纳这些结果。
表25
如图66～81所示，表明在使用相当于通常的13.3倍的10.0μM的高浓度随机引物的情况下，在9碱基长～20碱基长的范围，能够在实现非常高的再现性的同时扩增低分子的DNA片段。特别是发现了随机引物的碱基长越长(特别是12碱基长以上)，则扩增片段越低分子化的倾向。此外，使用9碱基长的随机引物时，通过将退火温度设定为37℃，能够增加DNA片段的扩增量。
另外，上述3.6.2中说明的那样，为了明确随机引物的浓度与长度的关系，在随机引物为8～35碱基长、随机引物浓度为0.6～300μM的范围进行PCR，尝试DNA文库的制作。结果示于表26。
表26.相对于DNA文库随机引物的浓度与长度的关系
○：再现性良好地扩增覆盖100～500碱基的DNA文库(ρ>0.9)
×：DNA文库未覆盖100～500碱基，或者再现性低(ρ<＝0.9)
－：未实施
如表26所示，通过随机引物的长度为9～30碱基长、且随机引物的浓度为4.0～200μM，能够再现性高地扩增低分子(100～500碱基)的DNA片段。特别是通过随机引物的长度为9～30碱基长、且随机引物的浓度为4.0～100μM，能够再现性高且确实地扩增低分子(100～500碱基)的DNA片段。
另外，对表26所示的结果进一步进行详细研究，结果判定，随机引物的长度与浓度如图82所示，特别优选在框所包围的区域内制备。更具体地，随机引物的浓度在随机引物为9～10碱基长的情况下，优选为40～60μM。随机引物的浓度在随机引物为10～14碱基长的情况下，设随机引物的碱基长为y、随机引物的浓度为x时，优选满足y>3E+08x-6.974且为100μM以下。随机引物的浓度在随机引物为14～18碱基长的情况下，优选为4～100mM。随机引物的浓度在随机引物为18～28碱基长的情况下，优选为4μM以上且满足y<8E+08x-5.533。随机引物的浓度在随机引物为28～29碱基长的情况下，优选为4～10μM。此外，这些y>3E+08x-6.974和y<8E+08x-5.533是基于Microsoft Excel的乘幂近似计算出的算式。
如上表明，通过将随机引物的碱基长和浓度规定在指定范围，能够再现性高地扩增低分子(100～500碱基)的DNA片段。例如，已知新一代测序仪如果分析高分子DNA片段，则数据精度显著降低。如本实施例所示，通过将随机引物的碱基长和浓度规定在指定范围，能够再现性良好地制作适合新一代测序仪的分析的分子大小的DNA文库，可以说适合新一代测序仪标志物分析。
4.7随机引物数
将如上述3.7中说明的那样，使用1种、2种、3种、12种、24种或48种随机引物(浓度为60μM)制作DNA文库的结果示于图83～94。另外，表27中归纳这些结果。
表27
如图83～94所示，表明在1种、2种、3种、12种、24种或48种随机引物的任一情况下，都能够在实现非常高的再现性的同时获得低分子的DNA片段。特别是判明随着随机引物的种类增加，电泳图像的峰变小，处于偏差消失的倾向。
4.8随机引物序列
将如上述3.8中说明的那样，分别使用表2～6所示的随机引物的组(10碱基B、10碱基C、10碱基D、10碱基E和10碱基F)制作DNA文库的结果示于图95～104。另外，表28中归纳这些结果。
表28
如图95～104所示，表明在使用10碱基B、10碱基C、10碱基D、10碱基E和10碱基F的任一组的情况下，都能够在实现非常高的再现性的同时扩增低分子的DNA片段。
4.9人DNA文库制作
将如上述3.9中说明的那样，使用人来源基因组DNA和最终浓度60μM的随机引物(10碱基A)制作DNA文库的结果示于图105和106。图105显示重复实验的第一次的结果，图106显示重复实验的第二次的结果。如图105和106所示，表明即使在使用人来源的基因组DNA的情况下，也能够在实现非常高的再现性的同时扩增低分子的DNA片段。
〔实施例2〕
1.流程图
本实施例中，按照图107和108所示的示意图，以基因组DNA作为模板，通过使用随机引物的PCR制作第1DNA片段，接着以制作的第1DNA片段作为模板，通过使用新一代测序仪用引物的PCR制作第2DNA片段，以制作的第2DNA片段作为测序仪用文库，进行利用所谓新一代测序仪的序列分析，基于所得的读出数据分析基因型。
2.材料
本实施例中，从甘蔗品种NiF8和稻品种日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)提取和纯化基因组DNA，分别作为NiF8来源的基因组DNA和日本晴来源的基因组DNA使用。
3.方法
3.1甘蔗NiF8中的研究
3.1.1随机引物和新一代测序仪用引物的设计
本例中，随机引物基于イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera adapter中的3’末端的10碱基设计。即，本例中作为随机引物使用GTTACACACG(序列号2041、10碱基G)。另外，新一代测序仪用引物同样地基于イルミナ社的Nextera adaptor的序列信息设计(表29)。
表29
3.1.2DNA文库的制作
在上述2.中说明的NiF8来源的基因组DNA(30ng)中分别加入最终浓度0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)、60μM随机引物(10碱基G)，以最终反应量50μl通过PCR(98℃ 2分钟后、将98℃ 10秒、50℃ 15秒、72℃ 20秒进行30循环反应后，在4℃保存)制作DNA文库(第1DNA片段)。
3.1.3纯化和电泳
将3.1.2的DNA文库用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行电泳，获得荧光单位(Fluorescence Unit：FU)。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ>0.9)。
3.1.4新一代测序仪用的DNA文库的制作
在3.1.3中纯化的第1DNA片段(100ng)中分别加入最终浓度0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)、0.5μM的新一代测序仪用引物，以最终反应量50μl通过PCR(95℃ 2分钟后、将98℃ 15秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒进行25循环反应后，72℃ 1分钟，然后在4℃保存)制作新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)。新一代测序仪用的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.1.5MiSeq分析
将3.1.4的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)使用MiSeq Reagent Kit V2500Cycle(Illumina)，基于读出长100碱基的双端测序(pair end)条件用MiSeq进行分析。
3.1.6读出数据分析
由3.1.5的读出数据特定出读出图谱。然后对于每个读出图谱计算出读出数，将重复之间的读出数进行比较，用相关系数评价再现性。
3.2稻品种日本晴中的研究
3.2.1随机引物和新一代测序仪用引物的设计
本例中，随机引物基于イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera adapter中的3’末端的10碱基设计。即，本例中，作为随机引物，设计了由位于Nextera adapter中的3’末端的10碱基、和在该10碱基的3’末端附加2碱基的任意序列而得的全长12碱基组成16种碱基序列(表30、12碱基B)。
表30
另外，本例中，与3.1.1同样地使用基于イルミナ社的Nextera adaptor的序列信息设计的新一代测序仪用引物。
3.2.2DNA文库的制作
在上述2.中说明的日本晴来源的基因组DNA(30ng)中分别加入最终浓度0.2mMdNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)、40μM随机引物(12碱基B)，以最终反应量50μl通过PCR(98℃ 2分钟后、将98℃ 10秒、50℃ 15秒、72℃20秒进行30循环反应后、在4℃保存)制作DNA文库(第1DNA片段)。
3.2.3纯化和电泳
将3.2.2的DNA文库用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行电泳，获得荧光单位(Fluorescence Unit：FU)。另外，通过斯皮尔曼等级相关来评价重复数据的再现性(ρ>0.9)。
3.2.4新一代测序仪用的DNA文库的制作
在3.2.3中纯化的第1DNA片段(100ng)中，分别加入最终浓度0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)、0.5μM的新一代测序仪用引物，以最终反应量50μl通过PCR(95℃ 2分钟后、将98℃ 15秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒进行25循环反应后、72℃ 1分钟后、在4℃保存)制作新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)。新一代测序仪用的DNA文库的纯化和电泳通过与3.1.3同样的方法进行。
3.2.5MiSeq分析
将3.2.4的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)使用MiSeq Reagent Kit V2500Cycle(Illumina)基于读出长100碱基的双端测序(pair end)条件用MiSeq进行分析。
3.2.6读出数据分析
将3.2.5的读出图谱相对于日本晴的基因组信息(NC_008394～NC_008405)用bowtie2作图，确认随机引物的序列与基因组DNA的一致率。另外，从3.2.5的读出数据特定出读出图谱，对于每个读出图谱计算出读出数，将重复之间的读出数进行比较，用相关系数评价再现性。
4.结果和考察
4.1甘蔗NiF8中的研究结果
将利用由イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera adaptor中的3’末端的10碱基组成的随机引物(10碱基G)，以60μl的高浓度条件进行PCR时的电泳的结果示于图109和110。如图109和110所示，在包含100bp～500bp的广泛区域发现扩增(第1DNA片段)。作为能够在广泛的区域确认扩增的理由，认为是由于在与随机引物一致的基因组DNA区域以外也发现了扩增。另外，重复数据之间的等级相关系数为0.957的0.9以上，因此对扩增图谱确认了高的再现性。
接下来，将如3.1.4中说明的那样，使用新一代测序仪用引物进行PCR时的电泳的结果示于图111和112。即，为了制作连接了新一代测序仪的接头Nextera adaptor的DNA文库(第2DNA片段)，以第1DNA片段作为模板利用由イルミナ社的Nextera adaptor序列组成的新一代测序仪用引物进行PCR。イルミナ社的新一代测序仪在DNA文库包含大量100bp以下的短片段、1kbp以上的长片段的情况下，分析精度极端下降。本实施例中制作的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)如图111和112所示，以500bp附近为峰主要分布在150bp～1kbp的范围，因而认为作为新一代测序仪用的DNA文库是适合的。另外，由于重复数据之间的等级相关系数为0.989的0.9以上，对扩增图谱确认了高的再现性。
另外，将所得的DNA文库(第2DNA片段)用新一代测序仪MiSeq进行分析的结果是，得到了3.5Gbp和3.6Gbp的读出数据。另外，显示MiSeq的数据精度的>＝Q30的值为93.3％和93.1％。制造商推荐值为读出数据3.0Gbp以上和>＝Q30 85.0％以上，因此认为本实施例中制作的新一代测序仪的DNA文库(第2DNA片段)能够在新一代测序仪的分析中利用。为了确认再现性，对于MiSeq中得到的34,613个读出图谱比较了重复之间的读出数。结果示于图113。如图113所示，与电泳的结果同样地，读出数在重复之间显示r＝0.996的高的相关。
如以上说明的那样，在通过以高浓度利用由イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera Adaptor的3’末端的10碱基组成的随机引物的PCR获得DNA文库(第1DNA片段)之后，通过利用由Nextera Adaptor的序列组成的新一代测序仪用引物的PCR，能够简便且再现性良好地制作包含大量的片段的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)。
4.2稻日本晴中的研究结果
将利用由位于イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera adapter中的3’末端的10碱基、和在该10碱基的3’末端附加了2碱基的任意的序列的全长12碱基组成的16种随机引物(12碱基B)，在40μl的高浓度条件进行PCR时的电泳的结果示于图114和115。如图114和115所示，在包含100bp～500bp的广泛区域看到了扩增(第1DNA片段)。作为能够在广泛区域确认扩增的理由，与4.1同样地，认为是因为在与随机引物一致的基因组DNA区域以外也发生了扩增。另外，本例中等级相关系数也为0.950的0.9以上，对扩增图谱确认了高的再现性。
接下来，将如3.2.4中说明的那样，使用新一代测序仪用引物进行PCR时的电泳的结果示于图116和117。即，为了制作连接了新一代测序仪的接头Nextera adaptor的DNA文库(第2DNA片段)，以第1DNA片段作为模板利用由イルミナ社的Nextera adaptor序列组成的新一代测序仪用引物进行PCR。其结果是，本实施例中制作的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)如图116和117所示，以300bp附近为峰主要分布在150bp～1kbp的范围，因而认为适合作为新一代测序仪用的DNA文库。另外，重复数据之间的等级相关系数为0.992的0.9以上，因而对扩增图谱确认了高的再现性。
另外，将所得的DNA文库(第2DNA片段)用新一代测序仪MiSeq进行分析的结果是，得到了4.0Gbp和3.8Gbp的读出数据。另外，显示MiSeq的数据精度的>＝Q30的值为94.0％和95.3％。由该结果认为，与4.1.1同样地，本实施例中制作的新一代测序仪的DNA文库(第2DNA片段)能够在新一代测序仪的分析中利用。对于MiSeq中得到的19,849个读出图谱，为了评价随机引物序列与基因组的一致率，将随机引物序列与日本晴参考序列进行比较的结果示于图118。如图118所示，随机引物序列与日本晴参考序列的平均一致率为34.5％。特别由于没有随机引物序列与日本晴参考序列完全一致的读出图谱，因而认为任一读出图谱都是随机引物结合不与随机引物一致的序列而扩增的。认为这与生物分析仪的结果一致。为了确认读出图谱的再现性，在重复之间比较了读出数。将结果示于图119。如图119所示，与电泳的结果同样地，在重复之间显示r＝0.999的高的相关。
如以上说明的那样，在通过以高浓度利用由位于イルミナ社的新一代测序仪用的接头Nextera Adaptor中的3’末端的10碱基、和在该10碱基的3’末端附加了2碱基的任意的序列的全长12碱基组成的16种随机引物的PCR获得DNA文库(第1DNA片段)之后，通过利用由Nextera Adaptor的序列组成的引物的PCR，能够简便且再现性良好地制作包含大量的片段的新一代测序仪用的DNA文库(第2DNA片段)。
〔实施例3〕
1.材料和方法
1.1材料
在本实施例中，由稻品种日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)提取和纯化基因组DNA，作为日本晴来源的基因组DNA使用。
1.2DNA文库的制作
在1.1所记载的基因组DNA(日本晴来源基因组DNA:30ng)中加入最终浓度60μM随机引物(10碱基A)、0.2mM dNTP混合物、1.0mM MgCl2和1.25单位(unit)DNA聚合酶(TAKARA、PrimeSTAR)，以最终反应量50μl制备反应液。PCR的温度循环条件是，首先，98℃ 2分钟，然后，将98℃ 10秒、50℃ 15秒和72℃ 20秒作为1循环进行30循环后，4℃保存的条件。本实验中得到的DNA文库用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)进行纯化。
1.3测序文库的制作
由1.2中得到的DNA文库，使用KAPA Library Preparation Kit(Roche)制作MiSeq分析用测序文库。
1.4MiSeq分析
使用MiSeq Reagent Kit V2 500Cycle(Illumina)，对1.3中得到的MiSeq分析用测序文库基于读出长100碱基的双端测序(pair end)条件进行分析。
1.5碱基序列信息的分析
从1.4中得到的读出数据中删除随机引物的序列信息，特定出各读出的碱基序列信息。将各读出的碱基序列信息相对于稻カサラス的基因组信息(kasalath_genome)用bowtie2作图，对各染色体逐个作为标志物鉴定单碱基多态性(SNP)和插入缺失突变(inDel)。
2.结果和考察
将由稻日本晴来源的基因组DNA通过随机引物制作的DNA文库的碱基序列信息在稻カサラス的基因组信息中作图的结果示于表31。
表31
如表31所示，各染色体中能够鉴定出2,694～5,579个(平均3,812.6个、合计45,751个)的SNP。另外，如表31所示，各染色体中能够鉴定227～569个(平均349.3个、合计4,191个)InDel(插入/缺失，insertion/deletion)。由以上的结果表明，如本实施例所示，通过将利用随机引物制作的DNA文库的碱基序列信息与已知的碱基序列信息进行比较，能够特定出供试的生物中的基因组内存在的作为特征碱基序列的DNA标志物。
将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考而纳入本说明书中。

Claims (23)

1.DNA文库的制作方法，用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的反应液进行核酸扩增反应，获得以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应而得的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述反应液包含4～200μM的所述随机引物。
3.根据权利要求1所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述反应液包含4～100μM的所述随机引物。
4.根据权利要求1所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述随机引物是9～30碱基长的核苷酸。
5.根据权利要求1所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述DNA片段为100～500碱基长。
6.基因组DNA分析方法，利用通过权利要求1～5的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库作为DNA标志物。
7.根据权利要求6所述的基因组DNA分析方法，包括：
确定通过权利要求1～5的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库的碱基序列，基于这些碱基序列确认所述DNA标志物是否存在的工序。
8.根据权利要求7所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，在确认所述DNA标志物是否存在的工序中，由DNA文库的碱基序列的读出数来确认所述DNA标志物是否存在。
9.根据权利要求7所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，将所述DNA文库的碱基序列与已知的序列信息、或者使用其他生物来源或其他组织来源的基因组DNA制作的所述DNA文库的碱基序列进行比较，基于碱基序列的差异来确认DNA标志物是否存在。
10.权利要求6所述的基因组DNA分析方法，包括：
基于所述DNA标志物的碱基序列，准备特异地扩增该DNA标志物的一对引物的工序；
以从对象生物提取的基因组DNA作为模板，使用所述一对引物进行核酸扩增反应的工序；和
由所述核酸扩增反应的结果，确认所述基因组DNA中所述DNA标志物是否存在的工序。
11.DNA文库的制作方法，包括：
用包含基因组DNA和高浓度的随机引物的第1反应液进行核酸扩增反应，获得以基因组DNA作为模板通过该核酸扩增反应而得的第1DNA片段的工序；和
用包含所得的第1DNA片段、和作为引物的核苷酸的第2反应液进行核酸扩增反应，获得在所述第1DNA片段上连接了所述核苷酸的第2DNA片段的工序，
所述核苷酸在3’末端包含与所述随机引物中的至少5’末端侧的碱基序列70％以上一致的碱基序列。
12.根据权利要求11所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1反应液包含4～200μM的所述随机引物。
13.根据权利要求11所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1反应液包含4～100μM的所述随机引物。
14.根据权利要求11所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述随机引物为9～30碱基长的核苷酸。
15.根据权利要求11所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，所述第1DNA片段为100～500碱基长。
16.根据权利要求11所述的DNA文库的制作方法，其特征在于，扩增所述第2DNA片段的引物包含用于碱基序列确定反应的区域，或者在以所述第2DNA片段作为模板的核酸扩增反应或重复的核酸扩增反应中使用的引物包含用于碱基序列确定反应的区域。
17.DNA文库的分析方法，包括：
对于通过权利要求11～15的任一项所述的DNA文库的制作方法获得的第2DNA片段、或通过权利要求16所述的DNA文库的制作方法使用下述引物获得的DNA片段，确定碱基序列的工序，
所述引物包含与用于碱基序列确定反应的测序仪用引物互补的区域。
18.基因组DNA分析方法，利用通过权利要求11～17的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库作为DNA标志物。
19.根据权利要求18所述的基因组DNA分析方法，包括：
确定通过权利要求11～17的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的DNA文库的碱基序列，基于这些碱基序列确认所述DNA标志物是否存在的工序。
20.根据权利要求19所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，在确认所述DNA标志物是否存在的工序中，由DNA文库的碱基序列的读出数来确认所述DNA标志物是否存在。
21.根据权利要求19所述的基因组DNA分析方法，其特征在于，将所述DNA文库的碱基序列与已知的序列信息、或者使用其他生物来源或其他组织来源的基因组DNA制作的所述DNA文库的碱基序列进行比较，基于碱基序列的差异来确认DNA标志物是否存在。
22.根据权利要求18所述的基因组DNA分析方法，包括：
基于所述DNA标志物的碱基序列，准备特异地扩增该DNA标志物的一对引物的工序；
以从对象生物提取的基因组DNA作为模板，使用所述一对引物进行核酸扩增反应的工序；和
由所述核酸扩增反应的结果确认所述基因组DNA中所述DNA标志物是否存在的工序。
23.DNA文库，是通过权利要求1～5、和权利要求11～16的任一项所述的DNA文库的制作方法制作的。
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