JP2018042548A - Dnaライブラリーの作製方法及びdnaライブラリーを用いたゲノムdna解析方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
【解決手段】ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する。
【選択図】図1
Description
(1)ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する、DNAライブラリーの作製方法。
(2)上記反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(1)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(3)上記反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(1)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(4)上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする(1)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(5)上記DNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする(1)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(6)(1)乃至(5)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーをDNAマーカーとして利用する、ゲノムDNA解析方法。
(7)(1)乃至(5)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーの塩基配列を決定し、それらの塩基配列に基づいて上記DNAマーカーの存否を確認する工程を含む(6)記載のゲノムDNA解析方法。
(8)上記DNAマーカーの存否を確認する工程では、DNAライブラリーの塩基配列のリード数から上記DNAマーカーの存否を確認することを特徴とする(7)記載のゲノムDNA解析方法。
(9)上記DNAライブラリーの塩基配列を既知の配列情報又は他の生物由来若しくは他の組織由来のゲノムDNAを用いて作製した上記DNAライブラリーの塩基配列と比較し、塩基配列の相違に基づいてDNAマーカーの存否を確認することを特徴とする(7)記載のゲノムDNA解析方法。
(10)上記DNAマーカーの塩基配列に基づいて、当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを準備する工程と、対象の生物から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記一対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程と、上記核酸増幅反応の結果から、上記ゲノムDNAにおける上記DNAマーカーの存否を確認する工程とを含む(6)記載のゲノムDNA解析方法。
(11)ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む第1の反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られた第1のDNA断片を取得する工程と、
得られた第1のDNA断片と、上記ランダムプライマーにおける少なくとも5’末端側の塩基配列と70%以上一致する塩基配列を3’末端に含むヌクレオチドをプライマーとして含む第2の反応液にて核酸増幅反応を行い、上記第1のDNA断片に上記ヌクレオチドを連結した第2のDNA断片を取得する工程とを含む、DNAライブラリーの作製方法。
(12)上記第1の反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(11)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(13)上記第1の反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(11)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(14)上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする(11)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(15)上記第1のDNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする(11)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(16)上記第2のDNA断片を増幅するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含む、又は、上記第2のDNA断片を鋳型とした核酸増幅反応若しくは繰り返される核酸増幅反応に使用するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含むことを特徴とする(11)記載のDNAライブラリーの作製方法。
(17)(11)乃至(15)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法で取得した第2のDNA断片、又は(16)記載のDNAライブラリーの作製方法で塩基配列決定反応に使用されるシーケンサー用プライマーに対する相補領域を含むプライマーを用いて取得したDNA断片について塩基配列を決定する工程を含む、DNAライブラリーの解析方法。
(18)(11)乃至(17)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーをDNAマーカーとして利用する、ゲノムDNA解析方法。
(19)(11)乃至(17)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーの塩基配列を決定し、それらの塩基配列に基づいて上記DNAマーカーの存否を確認する工程を含む(18)記載のゲノムDNA解析方法。
(20)上記DNAマーカーの存否を確認する工程では、DNAライブラリーの塩基配列のリード数から上記DNAマーカーの存否を確認することを特徴とする(19)記載のゲノムDNA解析方法。
(21)上記DNAライブラリーの塩基配列を既知の配列情報又は他の生物由来若しくは他の組織由来のゲノムDNAを用いて作製した上記DNAライブラリーの塩基配列と比較し、塩基配列の相違に基づいてDNAマーカーの存否を確認することを特徴とする(19)記載のゲノムDNA解析方法。
(22)上記DNAマーカーの塩基配列に基づいて、当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを準備する工程と、対象の生物から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記一対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程と、上記核酸増幅反応の結果から、上記ゲノムDNAにおける上記DNAマーカーの存否を確認する工程とを含む(18)記載のゲノムDNA解析方法。
(23)上記(1)乃至(5)及び(11)乃至(16)いずれか記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリー。
本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、任意の塩基配列を有するプライマー(以下、ランダムプライマー)を高濃度となるように調整した反応液で核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をDNAライブラリーとするものである。ここで、高濃度とは、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度であることを意味する。すなわち、本発明に係るDNAライブラリー作製方法は、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度のランダムプライマーを使用することに特徴を有している。ここで、反応液に含まれる鋳型としては、DNAライブラリーを作製する対象の生物から調整したゲノムDNAを使用することができる。
本発明に係るDNAライブラリーの作製方法に使用できるランダムプライマーとしては、その配列には何ら限定されず、例えば9〜30塩基長のヌクレオチドを使用することができる。特に、ランダムプライマーとは、任意の配列を有する、9〜30塩基長のヌクレオチドであって、ヌクレオチドの種類(配列の種類)は特に限定されず、1種類以上のヌクレオチド、好ましくは1〜10000種類のヌクレオチド、より好ましくは1〜1000種類のヌクレオチド、より好ましくは1〜100種類のヌクレオチド、最も好ましくは1〜96種類のヌクレオチドを意味する。ランダムプライマーとして上述の範囲のヌクレオチド(ヌクレオチド群)を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、ランダムプライマーとして、複数のヌクレオチドを含む場合、全てのヌクレオチドが同じ塩基長(9〜30塩基長)である必要はなく、異なる塩基長の複数のヌクレオチドを含んでいても良い。
本発明に係るDNAライブラリーの作製方法では、上述したランダムプライマー及び鋳型としてのゲノムDNAを用いた核酸増幅反応によって、多数の増幅断片を取得する。特に、核酸増幅反応において、反応液中のランダムプライマーの濃度を、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度とする。これにより、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をゲノムDNAを鋳型として得ることができる。これにより、得られた多数の増幅断片は、遺伝子型判定等に利用できるDNAライブラリーとして使用することが可能となる。
上述のように作製されたDNAライブラリーを使用することで、遺伝子型解析等のゲノムDNA解析を行うことができる。上述のように、DNAライブラリーは、非常に高い再現性を有しており、次世代シーケンサーに適したサイズを有しており、ゲノム全体に亘って均一性を有している。したがって、DNAライブラリーは、DNAマーカー(遺伝マーカー、遺伝子マーカーとも称される)として使用することができる。ここで、DNAマーカーとは、ゲノムDNA内に存在する特徴的な塩基配列を広く意味する。また、DNAマーカーとしては、特に、遺伝的形質に関連する目印となるゲノム上の塩基配列とすることもできる。DNAマーカー、例えば遺伝子型同定、連鎖地図、遺伝子マッピング、マーカーを利用した選抜工程を含む育種、マーカーを利用した戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、バルクセグリガント分析、品種識別、又は連鎖不均衡マッピング等に利用することができる。
以上のように、反応液中の当該ランダムプライマーを高濃度として核酸増幅反応を行うことで、ゲノムDNAを鋳型として多数の増幅断片を再現性良く得ることができる。得られた増幅断片は、その両末端にランダムプライマーと同じ塩基配列を有するため、当該塩基配列を利用することによって簡便に次世代シーケンス技術に供することができる。
1.フローチャート
本実施例では、図1に示したフローチャートに従って、各種生物種から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、各種ランダムプライマーセットを用いたPCRによりDNAライブラリーを作製した。また、作製したDNAライブラリーを用いて、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
本実施例では、サトウキビ品種NiF8、Ni9及びその交雑後代22系統、並びにイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA、Ni9由来のゲノムDNA、交雑後代22系統由来のゲノムDNA、日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。また、本実施例では、ヒトDNAについてはタカラバイオよりHuman Genomic DNAを購入し、ヒト由来のゲノムDNAとして使用した。
3.1 PCR条件とDNA断片のサイズの関係
3.1.1 ランダムプライマーの設計
ランダムプライマーを設計するにあたり、GC含量を20〜70%の範囲とし、連続塩基数が5以下となる条件を設定した。また、塩基長については、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長、20塩基長、22塩基長、24塩基長、26塩基長、28塩基長、29塩基長、30塩基長及び35塩基長の16種類を設定した。各塩基長について、それぞれ96種類の塩基配列を設計し、96種類のランダムプライマーからなるセットを作製した。なお、10塩基長については、6セット(各セットに96種類のランダムプライマーが含まれる)を設計した(これら6セットを、10塩基A〜10塩基Fと称する)。すなわち、本実施例では、21種類のランダムプライマーセットを作製した。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ここで説明した標準PCRを含め、ランダムプライマーを用いたPCRによって得られた多数の核酸断片をDNAライブラリーと称する。
3.1.2で得られたDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100バイオアナライザ(Agient Technologies)で電気泳動し、蛍光ユニット(Fluorescence Unit: FU)を得た。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、種々のアニーリング温度で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、アニーリング温度として37℃、40℃及び45℃を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び2.5unit又は12.5unitのDNA DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、所定濃度のMgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、MgCl2濃度として、通常の2倍(2.0mM)、3倍(3.0mM)及び4倍(4.0mM)を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマーとして、上述した8塩基長(表7)、9塩基長(表8)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に所定濃度のランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマー濃度として、2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900及び1000μMを検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、本実験では、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
3.2.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.2.1で得られたDNAライブラリーから、KAPA Library Preparation Kit(Roche)を用いてMiSeq解析用シーケンスライブラリーを作製した。
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いて、3.2.2で得られたMiSeq解析用シーケンスライブラリーをリード長100塩基のペアエンド条件のもと解析した。
3.2.3で得られたリードデータから、ランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し、相関係数で再現性を評価した。
3.3.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(日本晴由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
日本晴由来ゲノムDNAから作製したDNAライブラリーを用いたシーケンスライブラリーの作製、MiSeq解析及びリードデータ解析は、それぞれ3.2.2、3.2.3及び3.2.4に記載した方法に従った。
3.3.2で得られたリードパターンについて、日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してリードパターンをbowtie2にてマッピングし、各リードパターンのゲノム位置を特定した。
3.3.3で特定した各リードパターンの位置情報に基づいて、ランダムプライマーの配列と当該ランダムプライマーがアニールするゲノム上の配列を比較し、ミスマッチ数をカウントした。
3.4.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA、交雑後代由来ゲノムDNA又は日本晴由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.4.1で作製した各DNAライブラリーを、それぞれ1レーン16サンプル及びリード長100塩基のペアエンド条件でタカラバイオヘ解析を委託し、それぞれからリードデータを取得した。
3.4.2で得られたリードデータからランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントした。
3.4.3の解析の結果として得られたリードパターンのリード数からNiF8及びNi9特有の多型を検出し、そのリードパターンをマーカーとした。また、リード数をもとに交雑後代22系統の遺伝子型を判別した。遺伝子型判別の精度は、交雑後代2系統の反復データでの再現性をもとに評価した。
3.5.1 プライマーの設計
3.4.4で特定したマーカーのうちNiF8型3マーカー、Ni9型3マーカーの合計6マーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報からプライマーをそれぞれ設計した(表22)。
TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(TAKARA)を用いて、2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA又は交雑後代由来ゲノムDNA:15ng)を鋳型に、1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2 X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、3.5.1で設計した0.4μMプライマーを加え、最終反応量25μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、94℃で1分とし、その後、94℃で30秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒を1サイクルとして30サイクル行った後、72℃で10分間維持し、その後、4℃で保存する条件とした。増幅したDNA断片は、TapeStation(Agilent Technologies)で電気泳動した。
3.5.2で得られた電気泳動の結果から、バンドの有無によりマーカーの遺伝子型を判別し、マーカーのリード数と比較した。
3.6.1 高濃度条件下でのランダムプライマー長の影響
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度10μMの所定の長さのランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、9塩基長(表8)、10塩基長(表1、10塩基A)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)を検討した。PCRの温度サイクル条件は、9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、所定の長さのランダムプライマーを所定の濃度となるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、表1〜21に示した8塩基長から35塩基長のランダムプライマーを検証し、ランダムプライマーの濃度として0.6〜300μMの範囲を検証した。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、表1に示した10塩基長からなる96種類のランダムプライマー(10塩基A)から選ばれる1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーとして、表1のNo.1から順にランダムプライマーを選び検証した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:30ng)に、表2〜6に示したランダムプライマーの5セットから選ばれる1セットを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
2.に記載したゲノムDNA(ヒト由来ゲノムDNA:30ng)に、最終濃度60μMのランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
4.1 PCR条件とDNAライブラリーのサイズの関係
通常のPCR条件に倣って、ランダムプライマーを利用したPCR(上記3.1.2)では、増幅されたDNAライブラリーのサイズは2kbp以上と高分子であり、目的のサイズとする100bp〜500bpには増幅は見られなかった(図2)。100bp〜500bpのDNAライブラリーが得られなかったのは、ランゲムプライマーが500bp以下の領域でプライマーとし機能する確率が低いためと考えられた。目的のサイズである100bp〜500bpのDNAライブラリーを作製するには、再現性良く非特異的増幅を誘発する必要があると考えられた。
上記3.1.8に記載した実験の結果を表23に纏めた。
上記3.2で説明したように、DNAライブラリー作製の再現性を確認するため、NiF8から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについて次世代シーケンサーMiSeqにより解析した結果を図48に示した。なお、上記3.2.4の結果として47,484個のリードパターンが得られた。反復間でリード数を比較した結果、電気泳動の結果と同様、反復間で相関係数r=0.991と高い相関を示した。以上の結果から、ランダムプライマーにより再現性良くDNAライブラリー作製可能と考えられた。
上記3.3で説明したように、ゲノム情報が公開されているイネ日本晴から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製し、電気泳動した結果を図49及び50に示した。図49及び50に示した結果から、ρが0.979と非常に高い値を示した。また、MiSeqによりリードデータを解析した結果を図51に示した。図51に示した結果から、相関係数rは0.992と非常に高い値を示した。これらの結果より、イネを対象としても、ランダムプライマーを使用することで非常に高い再現性を持ってDNAライブラリーを作製できることが明らかとなった。
上記3.4で説明したように、サトウキビNiF8、Ni9、及びその交雑後代22系統を用いて、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製、次世代シーケンサーHiSeqで解析し、リードデータをもとに両親の多型検出及び交雑後代の遺伝子型を判別した。その結果を表24に示した。
上記3.5で説明したように、表22に示したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、リード数と比較した。NiF8型のマーカーN80521152のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図54及び55に示した。NiF8型のマーカーN80997192のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図56及び57に示した。NiF8型のマーカーN80533142のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図58及び59に示した。Ni9型のマーカーN91552391のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図60及び61に示した。Ni9型のマーカーN91653962のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図62及び63に示した。Ni9型のマーカーN91124801のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図64及び65に示した。
上記3.6.1で説明したように、9塩基長(表8)、10塩基長(表1、10塩基A)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)のランダムプライマーを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図66〜81に示した。また、表25にこれらの結果を纏めた。
上記3.7で説明したように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマー(濃度は60μM)を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図83〜94に示した。また、表27にこれらの結果を纏めた。
上記3.8で説明したように、表2〜6に示したランダムプライマーのセット(10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基F)それぞれを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図95〜104に示した。また、表28にこれらの結果を纏めた。
上記3.9で説明したように、ヒト由来ゲノムDNA及び最終濃度60μMのランダムプライマー(10塩基A)を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図105及び106に示した。図105は反復実験の一回目の結果を示し、図106は反復実験の二回目の結果を示している。図105及び106に示すように、ヒト由来のゲノムDNAを用いた場合であっても、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
1.フローチャート
本実施例では、図107及び108に示した模式図に従って、ゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーを用いたPCRにより第1のDNA断片を作製し、続いて、作製した第1のDNA断片を鋳型とし、次世代シーケンサー用プライマーを用いたPCRにより第2のDNA断片を作製し、作製した第2のDNA断片をシーケンサー用ライブラリーとして、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
本実施例では、サトウキビ品種NiF8及びイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA及び日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。
3.1 サトウキビNiF8での検討
3.1.1 ランダムプライマーと次世代シーケンサー用プライマーの設計
本例では、ランダムプライマーは、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける3’末端の10塩基をもとに設計した。すなわち、本例ではランダムプライマーとしてGTTACACACG(配列番号2041、10塩基G)を使用した。また、次世代シーケンサー用プライマーは、同様にイルミナ社のNextera adaptorの配列情報をもとに設計した(表29)。
上記2.で説明したNiF8由来のゲノムDNA(30 ng)に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)に、60μM ランダムプライマー(10塩基G)をそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR(98℃を2分後、98℃を10秒間、50℃を15秒間、72℃を20秒を30サイクル反応後、4℃で保存)によりDNAライブラリー(第1のDNA断片)を作製した。
3.1.2のDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100 バイオアナライザ(Agilent Technologies)で電気泳動し、蛍光ユニット(Fluorescence Unit:FU)を得た。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
3.1.3で精製した第1のDNA断片(100 ng)に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)に、0.5μMの次世代シーケンサー用プライマーをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR(95℃を2分後、98℃を15秒間、55℃を15秒間、72℃を20秒を25サイクル反応後、72℃を1分後、4℃で保存)により次世代シーケンサー用のDNAライブラリー(第2のDNA断片)を作製した。次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.1.4の次世代シーケンサー用のDNAライブラリー(第2のDNA断片)をMiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用い、リード長100塩基のペアエンド条件のもとMiSeqで解析した。
3.1.5のリードデータからリードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し相関係数で再現性を評価した。
3.2.1 ランダムプライマーと次世代シーケンサー用プライマーの設計
本例では、ランダムプライマーは、イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける3’末端の10塩基をもとに設計した。すなわち、本例では、ランダムプライマーとして、Nextera adapterにおける3’末端に位置する10塩基と、当該10塩基の3’末端に2塩基の任意の配列を付加した全長12塩基からなる16種類の塩基配列を設計した(表30、12塩基B)。
上記2.で説明した日本晴由来のゲノムDNA(30 ng)に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)に、40μM ランダムプライマー(12塩基B)をそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR(98℃を2分後、98℃を10秒間、50℃を15秒間、72℃を20秒を30サイクル反応後、4℃で保存)によりDNAライブラリー(第1のDNA断片)を作製した。
3.2.2のDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100 バイオアナライザ(Agilent Technologies)で電気泳動し蛍光ユニット(Fluorescence Unit:FU)を得た。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
3.2.3で精製した第1のDNA断片(100ng)に最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.0 mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)に、0.5μMの次世代シーケンサー用プライマーをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCR(95℃を2分後、98℃を15秒間、55℃を15秒間、72℃を20秒を25サイクル反応後、72℃を1分後、4℃で保存)により次世代シーケンサー用のDNAライブラリー(第2のDNA断片)を作製した。次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.2.4の次世代シーケンサー用のDNAライブラリー(第2のDNA断片)をMiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いリード長100 塩基のペアエンド条件のもとMiSeqで解析した。
3.2.5のリードパターンを日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してbowtie2にてマッピングし、ランダムプライマーの配列とゲノムDNAとの一致率を確認した。また、3.2.5のリードデータからリードパターンを特定、リードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し相関係数で再現性を評価した。
4.1 サトウキビNiF8での検討結果
イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adaptorにおける3’末端の10塩基からなるランダムプライマー(10塩基G)を利用し、60μlの高濃度条件でPCRしたときの電気泳動の結果を図109及び110に示した。図109及び110に示すように、100bp〜500bpを含む幅広い領域で増幅が見られた(第1のDNA断片)。幅広い領域で増幅が確認できた理由としては、ランダムプライマーと一致するゲノムDNA領域以外においても増幅が見られたためと考えられた。また、反復データ間の順位相関係数が0.957と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
イルミナ社の次世代シーケンサー用のアダプタNextera adapterにおける3’末端に位置する10塩基と、当該10塩基の3’末端に2塩基の任意の配列を付加した全長12塩基からなる16種類のランダムプライマー(12塩基B)を利用し、40μlの高濃度条件でPCRしたときの電気泳動の結果を図114及び115に示した。図114及び115に示すように、100bp〜500bpを含む幅広い領域で増幅が見られた(第1のDNA断片)。幅広い領域での増幅が確認できた理由としては、4.1と同様、ランダムプライマーと一致するゲノムDNA領域以外においても増幅したためと考えられた。また、本例でも順位相関係数が0.950と0.9以上だったことから、増幅パターンに高い再現性が認められた。
1.材料および方法
1.1 材料
本実施例では、イネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。
1.2 DNAライブラリーの作製
1.1に記載したゲノムDNA(日本晴由来ゲノムDNA:30ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーは、MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した。
1.3 シーケンスライブラリーの作製
1.2で得られたDNAライブラリーから、KAPA Library Preparation Kit(Roche)を用いてMiSeq解析用シーケンスライブラリーを作製した。
1.4 MiSeq解析
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いて、1.3で得られたMiSeq解析用シーケンスライブラリーをリード長100塩基のペアエンド条件のもと解析した。
1.5 塩基配列情報の解析
1.4で得られたリードデータから、ランダムプライマーの配列情報を削除し、各リードの塩基配列情報を特定した。各リードの塩基配列情報を、イネカサラスのゲノム情報(kasalath_genome)にbowtie2でマッピングし、各染色体毎にマーカーとして1塩基多型(SNP)および挿入欠失変異(inDel)を同定した。
イネ日本晴由来のゲノムDNAからランダムプライマーにより作製したDNAライブラリーの塩基配列情報をイネカサラスのゲノム情報にマッピングした結果を表31に示した。
Claims (23)
- ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する、DNAライブラリーの作製方法。
- 上記反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項1記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項1記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記DNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする請求項1記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 請求項1乃至5いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーをDNAマーカーとして利用する、ゲノムDNA解析方法。
- 請求項1乃至5いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーの塩基配列を決定し、それらの塩基配列に基づいて上記DNAマーカーの存否を確認する工程を含む請求項6記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAマーカーの存否を確認する工程では、DNAライブラリーの塩基配列のリード数から上記DNAマーカーの存否を確認することを特徴とする請求項7記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAライブラリーの塩基配列を既知の配列情報又は他の生物由来若しくは他の組織由来のゲノムDNAを用いて作製した上記DNAライブラリーの塩基配列と比較し、塩基配列の相違に基づいてDNAマーカーの存否を確認することを特徴とする請求項7記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAマーカーの塩基配列に基づいて、当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを準備する工程と、対象の生物から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記一対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程と、上記核酸増幅反応の結果から、上記ゲノムDNAにおける上記DNAマーカーの存否を確認する工程とを含む請求項6記載のゲノムDNA解析方法。
- ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む第1の反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られた第1のDNA断片を取得する工程と、
得られた第1のDNA断片と、上記ランダムプライマーにおける少なくとも5’末端側の塩基配列と70%以上一致する塩基配列を3’末端に含むヌクレオチドをプライマーとして含む第2の反応液にて核酸増幅反応を行い、上記第1のDNA断片に上記ヌクレオチドを連結した第2のDNA断片を取得する工程とを含む、DNAライブラリーの作製方法。 - 上記第1の反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項11記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記第1の反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項11記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする請求項11記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記第1のDNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする請求項11記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 上記第2のDNA断片を増幅するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含む、又は、上記第2のDNA断片を鋳型とした核酸増幅反応若しくは繰り返される核酸増幅反応に使用するプライマーが塩基配列決定反応に使用される領域を含むことを特徴とする請求項11記載のDNAライブラリーの作製方法。
- 請求項11乃至15いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法で取得した第2のDNA断片、又は請求項16記載のDNAライブラリーの作製方法で塩基配列決定反応に使用されるシーケンサー用プライマーに対する相補領域を含むプライマーを用いて取得したDNA断片について塩基配列を決定する工程を含む、DNAライブラリーの解析方法。
- 請求項11乃至17いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーをDNAマーカーとして利用する、ゲノムDNA解析方法。
- 請求項11乃至17いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリーの塩基配列を決定し、それらの塩基配列に基づいて上記DNAマーカーの存否を確認する工程を含む請求項18記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAマーカーの存否を確認する工程では、DNAライブラリーの塩基配列のリード数から上記DNAマーカーの存否を確認することを特徴とする請求項19記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAライブラリーの塩基配列を既知の配列情報又は他の生物由来若しくは他の組織由来のゲノムDNAを用いて作製した上記DNAライブラリーの塩基配列と比較し、塩基配列の相違に基づいてDNAマーカーの存否を確認することを特徴とする請求項19記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記DNAマーカーの塩基配列に基づいて、当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを準備する工程と、対象の生物から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記一対のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う工程と、上記核酸増幅反応の結果から、上記ゲノムDNAにおける上記DNAマーカーの存否を確認する工程とを含む請求項18記載のゲノムDNA解析方法。
- 請求項1乃至5、及び請求項11乃至16いずれか一項記載のDNAライブラリーの作製方法により作製されたDNAライブラリー。
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