CN117265091A - 一种用于hla-drb3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于HLA‑DRB3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用，属于生物医学临床分子检测领域。本发明的引物组，包含3对根据DRB3、DRB4、DRB5基因特异性序列设计的扩增引物，以及12条测序引物，每个基因对应4条特异性测序引物。所述的特异性扩增引物能够准确特异的分别扩增DRB3、DRB4和DRB5，所述的特异性测序引物能够对DRB3、DRB4和DRB5基因亚型进行高分辨测序反应。本发明具有如下技术效果：本发明采用ARMS结合双特异碱基法设计的DRB3、DRB4、DRB5基因特异性扩增引物特异性高，配合本发明的特异性测序引物可以准确区分HLA‑DRB3/4/5基因亚型。通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HLA‑DRB3/4/5基因分型。操作快速简便，成本低，具有广泛的应用前景与临床参考价值。

Description

一种用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用，属于生物医学临床分子检测领域。

背景技术

人类白细胞抗原HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。HLA系统在抗原识别与呈递、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、类风湿关节炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。

快速而准确地检测人类白细胞抗原HLA-DRB3/4/5基因分型对临床疾病辅助诊断、医学研究及疾病病因学研究等具有重要意义。目前常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、SYBR Green I、Taqman荧光定量PCR法、测序法等。PCR-SSP(sequence specificprimer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法虽然操作简便快速，但无法实现高分辨的分型结果。测序法可以获得高分辨结果，但目前应用不广。

章元伟在硕士学位论文“基于NGS数据的HLA-DRB3，DRB4，DRB5基因分型方法”中使用了二代测序法，先设计了一组引物来扩增DRB3/4/5基因，对扩增产物进行随机打断，构建成文库，进行二代测序，不需要特异性测序引物。但是其流程复杂，而且二代测序的准确性不够高。一代测序法可以获得高分辨的分型结果，但首先需要设计特异性的扩增引物，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用。

本发明用于检测HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组设计原理如下：根据已知人类白细胞抗原基因序列，应用扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)分析法结合双特异碱基法，设计HLA-DRB3/4/5各基因特异性扩增引物。当引物序列与待测目标序列能完全匹配时，进行聚合酶链式(Polymerase Chain Reaction,PCR)反应。在反应过程中，目标核酸片段将被复制与放大，说明在样本中存在与特异性引物完全相同的基因序列，反之则否。利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR反应结果进行检测分析。当电泳胶经染色后通过凝胶成像系统分析，核酸片段会因大小不同而被区分开来。经过电泳初步鉴定的反应扩增物会被纯化进行下一步的测序分析以鉴定各个等位基因的序列，从而实现对HLA-DRB3/4/5的高分辨基因分型。

HLA约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域。普通的引物设计方法对于区分HLA基因亚型存在一定局限性，准确性不高。发明人首次使用了ARMS结合双突变碱基引物设计方法，首先于数据库中找到DRB3、DRB4、DRB5基因的特异性碱基，上游特异性扩增引物位于1号内含子末尾端，下游特异性扩增引物位于4号内含子前端，从而在第一步准确特异地扩增出DRB3/4/5特异性片段。并且，根据初步检测结果，在引物上又引入了一个错配碱基，提高了引物的特异性。该引物组准确性高，操作简便，具有广阔的应用前景。

在本发明的第一方面，提供了一种用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组，所述的引物组包括特异性PCR扩增引物组和测序引物组，所述的特异性PCR扩增引物组包含3对根据DRB3、DRB4、DRB5基因特异性序列设计的引物；所述的3对引物分别用于扩增DRB3所有亚型，DRB4所有亚型和DRB5所有亚型；

所述的3对特异性PCR扩增引物的核苷酸序列如下表所示：

所述的PCR扩增引物组，是根据改良的扩增阻碍突变系统ARMS分析法，结合双特异碱基法，设计特异性引物，所述的正向扩增引物和反向扩增引物的3’端均是各基因特异性碱基，并且在引物上额外引入一个错配碱基，提高了检测的特异性。

所述的测序引物组，包括12条特异性测序引物，其中有4条DRB3特异性测序引物，4条DRB4特异性测序引物，4条DRB5特异性测序引物。能够对DRB3、DRB4、DRB5基因的2号、3号、4号外显子进行高分辨测序。

所述的12条测序引物的核苷酸序列如下表所示：

在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组在制备检测HLA-DRB3/4/5基因分型的试剂盒中的应用。

在本发明的第三方面，提供了含有如第一方面所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组的试剂盒，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。

进一步地，所述的PCR反应试剂包括PCR反应液和高保真Taq酶。

进一步地，所述的PCR反应液包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl₂，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。

在本发明的第四方面，提供了采用如第一方面所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组进行非疾病诊断目的的检测HLA-DRB3/4/5基因分型的方法，所述的方法包括扩增反应和测序。

其中，所述的扩增反应体系如下：总体积12.4μL，包括PCR反应液6μL，酶0.4μL，扩增引物混合液3μL，DNA模板3μL；所述的PCR扩增反应，其反应程序为95℃2分钟；93℃10秒、66℃4分，30个循环；72℃5分，4℃直到取出。

本发明包括如下技术效果：

1)与现有的硕士学位论文“基于NGS数据的HLA-DRB3，DRB4，DRB5基因分型方法”相比，现有方法使用了二代测序法，先设计了一组引物来扩增DRB3/4/5基因，对扩增产物进行随机打断，构建成文库，进行二代测序，不需要特异性测序引物，但是其流程较多，而且二代测序法的准确度不够高。而本发明使用的Sanger测序方法，针对多态性高度集中的2号外显子至4号外显子区域设计长片段扩增引物，并设计了特异性测序引物，对扩增产物进行特异性的一代测序，提高了分型结果的准确性，且简化了流程。采用本发明ARMS结合双特异碱基引物设计方法设计的特异性扩增引物，特异性高，配合本发明的测序引物，可以准确区分HLA-DRB3/4/5基因亚型。

2)含有本发明的特异性扩增引物及通用测序引物的试剂盒，可以准确判断实验样本的HLA-DRB3/4/5基因分型。能够用于检测人类白细胞抗原HLA-DRB3/4/5基因分型。

附图说明

图1为本发明的特异性扩增引物的电泳图。扩增产物阴阳性完全正确，特异性好，无杂带。

图2为无错配双特异碱基组扩增引物，扩增产物特异性较差，杂带多，部分样本阴阳性不正确。

图3为有错配单特异碱基组扩增引物，扩增产物特异性较差，杂带多，部分样本阴阳性不正确。

图4-1为Sample 1测序图，基因型为DRB3*03:01DRB3*03:01，DRB5*01:01DRB5*01:01。扩增产物(DRB3组和DRB5组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-2为Sample 2测序图，基因型为DRB3*03:01DRB3*03:01，DRB4*01:03DRB4*01:03。扩增产物(DRB3组和DRB4组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-3为Sample 3测序图，基因型为DRB4*01:03DRB4*01:03，DRB5*01:01DRB5*01:01。扩增产物(DRB4组和DRB5组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-4为Sample 4测序图，基因型为DRB3*02:02DRB3*02:02。扩增产物(DRB3组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-5为Sample 5测序图，基因型为DRB3*02:02DRB3*02:02，DRB4*01:03DRB4*01:03。扩增产物(DRB3组和DRB4组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-6为Sample 6测序图，基因型为DRB3*02:02DRB3*02:02，DRB4*01:03DRB4*01:03。扩增产物(DRB3组和DRB4组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-7为Sample 7测序图，基因型为DRB4*01:03DRB4*01:03，DRB5*01:01DRB5*01:01。扩增产物(DRB4组和DRB5组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-8为Sample 8测序图，基因型为DRB3*02:02DRB3*03:01。扩增产物(DRB3组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-9为Sample 9测序图，基因型为DRB3*03:01DRB3*03:01，DRB4*01:03DRB4*01:03。扩增产物(DRB3组和DRB4组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-10为Sample 10测序图，基因型为DRB3*02:02DRB3*02:02，DRB5*01:01DRB5*01:01。扩增产物(DRB3组和DRB5组)测序峰图结果好，判读正确。

图4-11为Sample 11测序图，基因型为DRB3*01:01DRB3*01:01，DRB5*01:01DRB5*01:01。扩增产物(DRB3组和DRB5组)测序峰图结果好，判读正确。

图5为无错配双碱基突变组扩增引物其扩增产物的测序图举例。测序图谱杂峰较多，结果无法判读。

图6为有错配单碱基突变组扩增引物其扩增产物的测序图举例。测序图谱杂峰较多，结果无法判读。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明中，涉及的主要原材料清单如下：

实施例1

1原料和设备：

1.1试剂盒组分：

1.1.1本发明的特异性扩增引物组和特异性测序引物组：

本发明的特异性扩增引物组，包含3对根据HLA-DRB3/4/5基因特异性序列设计的引物。所述的3对引物分别用于扩增DRB3所有亚型，DRB4所有亚型，DRB5所有亚型，序列为SEQ ID NO：#01～#06；

本发明的特异性测序引物组，包括12条特异性测序引物，序列为SEQ ID NO：#07～#18。

所述的3对特异性PCR扩增引物组核苷酸序列如下表所示：

所述的测序引物核苷酸序列如下表所示：

1.1.2设计了两组普通扩增引物

第一组为无错配双特异碱基组的特异性扩增引物组，序列如下：

第二组为有错配单特异碱基组的特异性扩增引物组，序列如下：

1.1.3引物配制方案

①将各引物配制为12OD/mL引物溶液；

②扩增引物溶液(AMP MIX)的配制

③测序引物溶液(SEQ MIX)的配制

1.1.4PCR反应试剂

DNA聚合酶：为高保真Taq聚合酶；

PCR反应液：包括0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl₂，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。

1.2样本的来源

1.2.1血液样本采集

血液样本可以用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。

1.2.2核酸样本萃取

可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。

1.2.3核酸样本定量

萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其他适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于10-40ng/μl，不可将核酸样本溶解于含有超过0.5mM螯化物如乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液。

1.2.4核酸样本质量规范

核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.1之间。

1.3所需实验设备

PCR仪、测序仪、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8连管水平头)。

2基因分型过程

选取11例EDTA抗凝全血样本，分别用本发明的引物组、无错配双特异碱基组的特异性扩增引物组以及有错配单特异碱基组的特异性扩增引物组进行扩增。每个样本均进行DRB3、DRB4、DRB5、DRB3-1、DRB4-1、DRB5-1、DRB3-2、DRB4-2、DRB5-29组引物扩增，对DRB3阳性条带进行DRB3-2F、DRB3-2R、DRB3-3F、DRB3-4F 4个测序反应，对DRB4阳性条带进行DRB4-2F、DRB4-2R、DRB4-3F、DRB4-4F 4个测序反应，对DRB5阳性条带进行DRB5-2F、DRB5-2R、DRB5-3F、DRB5-4F 4个测序反应。

2.1反应体系的配制：反应体系下表所示：

PCR反应体系

组分名称	加量μL/管
		PCR反应液	6
扩增引物混合液	3
		Taq酶	0.4
核酸样本	3
		总体积	12.4

将反应管盖上盖子，短暂离心后，放入荧光定量PCR仪中。

2.2PCR反应程序：如下表所示：

PCR反应程序

2.3电泳

按8～10volts/cm跑胶，200V，约10～20分钟。紫外透射仪上照相，确认PCR产物的质量。

2.4PCR产物纯化

针对希望进行测序的反应孔，加入4μL ExoSAP-IT^TM，以去除多余引物和DNA。

参照下表设定程序，开始进行纯化步骤。总反应时间约为1小时。

ExoSap PCR反应程序设定

2.5测序反应

在每一反应孔中加入1.5μL BDT测序试剂；

在每一反应孔中加入2.5μL测序用引物；

加入1μL纯化后的PCR产物至每一反应孔。

2.6测序产物纯化

利用乙醇沉淀法，去除多余BDT。

2.7上机测序

测序前，可选择加入10μL的HiDi formamide，PCR仪加热处理后上测序仪。

3实验结果分析

3.1本发明的特异性扩增引物，扩增产物特异性高，无杂带，阴阳性型别完全正确。电泳图见图1。

3.2无错配双特异碱基组扩增引物，扩增产物特异性较差，杂带多，电泳图见图2。

3.3有错配单特异碱基组扩增引物，扩增产物特异性较差，杂带多，电泳图见图3。

3.3本发明的特异性扩增引物，其扩增产物的测序结果完全正确，可以准确判断实验样本的HLA-DRB3/4/5基因分型，测序图见图4-1至图4-11。

3.4无错配双碱基突变组扩增引物，其扩增产物的测序图杂乱或无信号，无法读取HLA-DRB3/4/5基因型别，典型图谱举例见图5。

3.5有错配单碱基突变组扩增引物，其扩增产物的测序图杂乱或无信号，无法读取HLA-DRB3/4/5基因型别，典型图谱举例见图6。

结论：本发明的特异性扩增引物特异性高，配合本发明的特异性测序引物可以准确区分HLA-DRB3/4/5基因亚型。通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HLA-DRB3/4/5基因分型。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组，其特征在于，所述的引物组包括特异性PCR扩增引物组和测序引物组；

所述的特异性PCR扩增引物组包含3对根据DRB3、DRB4、DRB5基因特异性序列设计的引物；所述的3对引物分别用于扩增DRB3所有亚型，DRB4所有亚型和DRB5所有亚型；

所述的3对特异性PCR扩增引物的核苷酸序列如下表所示：

所述的测序引物组，包括12条特异性测序引物，其中有4条DRB3特异性测序引物，4条DRB4特异性测序引物，4条DRB5特异性测序引物。能够对DRB3、DRB4、DRB5基因的2号、3号、4号外显子进行高分辨测序；

所述的12条测序引物的核苷酸序列如下表所示：

。

2.如权利要求1所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组在制备检测HLA-DRB3/4/5基因分型试剂盒中的应用。

3.含有如权利要求1所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应液和高保真Taq酶。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。

6.采用如权利要求1所述的用于HLA-DRB3/4/5基因分型的引物组进行非疾病诊断目的的检测HLA-DRB3/4/5基因分型的方法，其特征在于，所述的方法包括扩增反应和测序。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的扩增反应体系如下：总体积12.4μL，包括PCR反应液6μL，酶0.4μL，扩增引物混合液3μL，DNA模板3μL；所述的PCR扩增反应，其反应程序为95℃2分钟；93℃10秒、66℃4分，30个循环；72℃5分，4℃直到取出。