WO2022050721A1 - Hla 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2022050721A1
WO2022050721A1 PCT/KR2021/011854 KR2021011854W WO2022050721A1 WO 2022050721 A1 WO2022050721 A1 WO 2022050721A1 KR 2021011854 W KR2021011854 W KR 2021011854W WO 2022050721 A1 WO2022050721 A1 WO 2022050721A1
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amplifying
pcr
amplification
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김지연
송해인
장미미
김광중
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주식회사 엔젠바이오
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    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Definitions

  • the present invention relates to a composition for amplifying HLA gene and its use, and more particularly, primers capable of amplifying HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and DPB1, respectively.
  • Compositions comprising the set and uses thereof.
  • HLA Human Leukocyte Antigen
  • a fundamental obstacle in solid organ and hematopoietic stem cell transplantation is rejection as a result of an immune response to antigens of others, and complete HLA matching between donor and recipient is the most important factor for successful transplantation.
  • the histocompatibility test examines loci such as HLA-A, HLA-B, and HLA-DR, and if all three loci are suitable, it is judged as 6/6 match or zero match.
  • the 5-year survival rate is 84% for siblings with perfectly matched HLA, 73% for families with one HLA haplotype, and 66% for non-conforming donors. As it increases, the survival rate gradually decreases.
  • HLA inspection methods currently being implemented are classified into low resolution, middle resolution, and high resolution according to the resolution of the inspection.
  • the serological method which is a low-resolution analysis, requires a high level of skill and experience, and as inconsistent results are reported compared to DNA tests, the DNA test that can be easily performed in small laboratories is gradually replacing the existing serological test method. is rapidly being replaced.
  • the SSOP (sequence specific oligonucleotide probe) method used for medium-resolution analysis is a method of determining a result based on a hybridization reaction pattern with a probe immobilized on a strip after PCR amplification.
  • the SSOP method has the advantage of being somewhat easier to read due to less vague results due to cross-reactivity and weak reactivity, which are common in serological tests, and the ability to process a large amount of samples at the same time. There are disadvantages in that it takes some time because it is passed through, and that there is sometimes ambiguity in the determination of positive bands.
  • the PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer) technique used for medium-resolution analysis selectively amplifies genes using the nucleotide sequence difference of PCR primers, and adjusts the number of PCR primer sets to obtain a desired level of trait. It is a method of judging.
  • the PCR-SSP technique has the advantage of being able to immediately check the results through electrophoresis after PCR because only a specific allele group is amplified in the PCR process and the result is determined, but it has the disadvantage of being difficult to test multiple samples at the same time.
  • sequence-based typing (SBT) method used as a high-resolution method is the best method for new trait analysis, and it is also a method that contributed to the rapid increase in the number of HLA traits.
  • SBT sequence-based typing
  • NGS Next-generation sequencing
  • HLA genes are HLA-A, HLA-B, HLA-C, which belong to class I molecules expressed in almost all cells, and HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, which belong to class II molecules expressed mainly in cells of the immune system.
  • polymorphism is the most severe among human genes, and more than 18,000 types of alleles have been identified so far.
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C which belong to class I molecules
  • HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1 genes which belong to class II molecules, which are mainly expressed in cells of the immune system, respectively Produces primers annealed specifically in the upstream region and downstream region of method was reported (Hosomichi, K. et al., BMC Genomics, 14:355, 2013).
  • Ehrenberg et al. added one type of primer (for HLA-A and HLA-C) or three types of primer (for HLA-DRB1) to the above-mentioned primer by PCR was reported to be performed (Ehrenberg, PK et al., BMC Genomics, 15:864, 2014).
  • uniform amplification is affected by a different number of primers for each gene in the above-mentioned PCR.
  • HLA-DRB1 since the primer sequence is completely identical to a gene other than the target gene, an unintended gene may be amplified.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a composition for HLA gene amplification with high sensitivity and accuracy.
  • human leukocyte antigens HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1
  • a primer set capable of specifically amplifying the DPB1 allele it was confirmed that the HLA allele of the sample could be analyzed with high sensitivity and accuracy, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for sequencing the HLA gene using the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for typing HLA gene using the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for HLA gene amplification comprising the composition.
  • composition for HLA gene amplification comprising the primer sets of (a) to (k) shown in Table 1 below:
  • the present invention also provides a method for amplifying an HLA gene, comprising using the primer set.
  • the present invention also provides a method for sequencing an HLA gene, including the amplification product obtained by the above method.
  • the present invention also provides a method for typing HLA gene, comprising using the nucleotide sequence information obtained by the above method.
  • the present invention also provides a kit for HLA gene amplification, including the primer set.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an amplification position for each HLA locus of a primer set (HLAaccuTest) according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a histocompatibility test method using a primer set (HLAaccuTest) according to the present invention.
  • 5 shows the results of amplifying 11 HLA loci in 5 samples using a primer set according to the present invention and a product of another company.
  • FIG. 6 shows the results of comparative analysis of the allele balance of alleles of DRB1 and DQB1 for 165 clinical samples using the primer set according to the present invention and a third-party product.
  • next-generation sequencing refers to Next Generation Sequencing, and also refers to next-generation sequencing and next-generation sequencing.
  • This refers to a technology that fragments the whole genome and performs sequencing in a large capacity based on a chemical reaction (hybridization) of the fragment, or amplifies target gene regions by multiplex PCR to perform sequencing in large capacity, It includes technologies from Agilent, Illumina, Roche, and Life Technologies, and in a broad sense, it is defined as including technologies such as Pacificbio's technology, Nanopore Technology, etc., which are third-generation technologies, and fourth-generation technologies.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the technology originally referred to as Next Generation Sequencing (NGS) corresponds to the second generation technology in terms of automation.
  • NGS is a name called to distinguish it from the first automation device before, and to distinguish it from the Next NGS device (also referred to as next-generation or third-generation NGS) that was created later.
  • Next NGS device also referred to as next-generation or third-generation NGS
  • NGS is used in a broad sense encompassing all of the sequencing technology after the automated Sanger sequencing technology.
  • each of HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and genes are amplified and collected in one tube, and then analyzed by the NGS method. , designed a primer set capable of analyzing the type of each HLA gene with high sensitivity and accuracy, and confirmed that the performance was significantly superior to that of other companies used in the past (FIG. 5).
  • the PCR bias of the PCR products of the HLA-DRB1 and HLA-DQB1 loci is less than when using the NGSgo kit (GenDx), which is stable for heterozygote type. It was confirmed that the allele balance could be secured (FIG. 6).
  • the target region of the exon amplified by PCR is When detecting narrowness, the exon ambiguity rate was high, but the HLAaccuTest primer set of the present invention targets all exons of DQB1 and DPB1 ( FIG. 7 ), so it is possible to reduce exon ambiguity when typing HLA-DQB1/DPB1. confirmed that it is possible.
  • the present invention relates to a composition for amplifying HLA gene comprising the primer sets of (a) to (k) shown in Table 1 below:
  • the amplification may be characterized by amplification using NGS, and may be characterized for analysis of histocompatibility during bone marrow or organ transplantation.
  • the 'untranslated region', untranslated region (UTR) of the present invention includes the 5' end or 3' end of each HLA gene in addition to the exon region translated into protein and the intron region between the exons. Specifically, Table 2 below sequence of the indicated length.
  • the 'oligonucleotide' of the present invention generally refers to a nucleotide polymer composed of about 10 to about 100 nucleotides. However, the length of nucleotides may be greater than or equal to 100 or less than or equal to 10.
  • the 'nucleotide' of the present invention is a basic unit of a nucleic acid composed of a phosphate group, a 5-carbon sugar and a nitrogen base.
  • the 5-carbon sugar in RNA is ribose.
  • the 5-carbon sugar in DNA is 2-deoxyribose.
  • the sugar contains a hydroxyl group (-OH) at 5-carbon sugar-2.
  • the term also includes analogs of the above basic units, such as the methoxy group at the 2 position of ribose.
  • the primers of the present invention can be cloned using a conventional cloning method (Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982) or a commercially available DNA synthesizer. It can be obtained in large quantities by chemical synthesis.
  • the primers of the present invention are preferably isolated or purified. "Isolated or purified” means that an operation is applied to remove components other than the desired component from a natural or synthesized state.
  • the purity (percentage of target primers comprised in the total nucleic acid) of the isolated or purified primers in (w/w)% is generally at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 90%, most preferably is greater than or equal to 95% (eg, 100%).
  • the purity of the primer may be appropriately changed depending on the solvent and the state of the solid or liquid.
  • the unit of purity may be (w/v)% or (v/v)%, and the desired purity may be appropriately calculated in consideration of the above-mentioned definition of purity in (w/w)%.
  • primers may be provided as a solid in dry or alcohol precipitation, or may be provided dissolved in water or a suitable buffer (eg, TE buffer, etc.).
  • a suitable buffer eg, TE buffer, etc.
  • the 'amplicon' of the present invention means an amplification product amplified by a primer.
  • the primer can amplify each gene, maintain a GC ratio in the range of 30 to 80%, and may be characterized as complementary to a gene sequence without a columnar repeating arrangement.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • LAMP strand displacement amplification and loop-mediated isoth ermal amplification
  • PCR is the most well-known nucleic acid amplification method, and many modifications and applications thereof have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR, and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR.
  • real-time PCR differential display PCR (D-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), DL-PCR (PC), inverse polymerase chain reaction (inverse polymerase chain reaction: IPCR), vectorette PCR, and TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) have been developed for specific applications.
  • D-PCR differential display PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • PC DL-PCR
  • IPCR inverse polymerase chain reaction
  • vectorette PCR vectorette PCR
  • TAIL-PCR thermal asymmetric interlaced PCR
  • PCR can be used without limitation as long as it is a known PCR method other than the method described above, but it may preferably be characterized as a long range PCR, but is not limited thereto.
  • a primer set satisfying the above conditions was configured as shown in Table 3 below.
  • DNA serving as a template for PCR may be prepared from a test sample.
  • the test sample is not particularly limited and includes, for example, a body fluid sample such as blood bone marrow aspiration biopsy (BMA), and cells such as an oral mucosa.
  • BMA blood bone marrow aspiration biopsy
  • cells such as an oral mucosa.
  • DNA can be prepared using known methods such as protease K/phenol extraction method, phenol/chloroform extraction method, alkali dissolution method, boiling method, and the like.
  • a commercially available DNA/RNA extraction kit can be used to quickly and conveniently prepare high-purity DNA from a trace sample.
  • reaction conditions of PCR for HLA using the primer set of the present invention may be, for example, the following conditions:
  • thermal denaturation step (eg, 92°C to 98°C);
  • annealing step (eg, 55°C to 72°C);
  • elongation phase (eg, 65°C to 80°C).
  • the annealing step and the elongation step can be performed in one step (shuttle method), or there is a method comprising setting the annealing temperature higher and gradually lowering the temperature in each cycle. can be adopted (touchdown method). Alternatively, they may be combined.
  • the temperature of the annealing step and the stretching step is typically 65 to 72°C.
  • the annealing step and the elongation step can be performed in one step (shuttle method), or there is a method comprising setting the annealing temperature higher and gradually lowering the temperature in each cycle. can be adopted (touchdown method). Alternatively, they may be combined.
  • the temperature of the annealing step and the stretching step is typically 65 to 72°C.
  • the method of sequence analysis using NGS varies depending on the type of NGS, and for example, may be performed according to each company's manual (eg, NexteraR XT DNA Library Prep Reference Guide). Paired-end analysis is preferably used to sequence the obtained sample. Next, a summary of the sequencing procedure using MiSeq from Illumina, Inc. is described. Even when other devices (Ion Proton manufactured by Life Technologies, GS FLX+ manufactured by Roche Diagnostics K.K., etc.) are used, the nucleotide sequence can be similarly determined by a method suitable for the device ( FIG. 2 ).
  • the amplification product of each sample is tagged using a DNA sample processing kit.
  • index sequences different for each sample are added to both sides of the obtained fragment sequence, and PCR is performed.
  • the pooled amplification products are sequenced using MiSeq.
  • the genotype of the HLA gene can be determined (typed) using a database (later read) based on the sequencing information of the amplification product obtained by NGS.
  • databases include the IPD-IMGT/HLA database in which more than 18,000 types of alleles are registered.
  • An example of a typing method based on nucleotide sequence information of an amplification product obtained by NGS includes mapping reads to alleles of a plurality of HLA genes, applying the results to a linear programming problem, and Method comprising detecting a suitable allele pair (OptiType) (Szolek, A. et al., Bioinformatics, Vol. 30, pp. 3310-3316, 2014), assembling a novel read mapping result and results determining the allele from (HLA reporter) (Huang, Y. et al., Genome Med, Vol. 7, pp.
  • OptiType suitable allele pair
  • the present invention relates to a method for sequencing an HLA gene, characterized in that the primer set is used.
  • the present invention relates to a method for typing HLA gene, characterized in that the base sequence information obtained by the method is used.
  • the present invention relates to a kit for amplifying HLA gene, including the primer set.
  • the kit of the present invention may include other reagents necessary for PCR and reagents for NGS library production in addition to the above-mentioned primer set of the present invention.
  • the above-mentioned reagents do not adversely affect the reaction after coexistence with the primer set of the present invention and preservation, they may be mixed with the primer set and included in the kit.
  • the above-mentioned reagents and the primer set of the present invention may be provided separately without being mixed.
  • the above-mentioned reagents include DNA extraction reagents, DNA polymerase enzymes, dNTPs, reaction buffers, enhancers for improving amplification efficiency in PCR, instructions, and the like.
  • the above-mentioned DNA polymerase enzyme may be a commercially available product.
  • DNA polymerase enzymes include PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, Tks Gflex DNA Polymerase, Go Tag manufactured by Promega, LongRange PCR Enzyme Mix manufactured by Qiagen, LongAmp Taq DNA Polymerase manufactured by NEB and Long PCR Enzyme Mix manufactured by Thermo Scientific, but is not limited thereto.
  • Example 2 Confirmation of amplification performance of HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and DPB1 using the prepared primers
  • HLA HLA from 157 standard samples (Coriell Institute, International Histocompatibility Working Group, University of California Los Angeles) for HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and DPB1 genes. The type analysis performance of the locus was confirmed.
  • gDNA obtained from each sample was amplified by LR-PCR and the presence or absence of amplification was confirmed through electrophoresis, and PCR amplification conditions were as follows:
  • Example 3 Confirmation of amplification performance of HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and DPB1 using the prepared primers
  • HLA-A/B/C HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 and DPB1 genes
  • the primer set (HLAaccuTest) prepared in Example 1
  • a third-party product Alltype NGS kit, One lambda
  • the performance was confirmed using a total of 5 cell lines.
  • gDNA obtained from each sample was amplified by LR-PCR, and the presence or absence of amplification was confirmed through electrophoresis, and PCR amplification conditions were the same as in Example 2:
  • Example 5 Reduction of ambiguity according to gene target region expansion
  • the target region of the exon amplified by PCR is narrow, so when detecting the exon, The rate of exon ambiguity was high.
  • the HLAaccuTest primer set of the present invention targets all exons of DQB1 and DPB1 (FIG. 7). Therefore, it is possible to reduce axon ambiguity in HLA-DQB1/DPB1 typing.
  • HLA-DQB1/DPB1 typing was performed using the HLAaccuTest kit and Alltype NGS kit (One lambda) of the present invention for gDNA isolated from 96 samples provided by the Korea Centers for Disease Control and Prevention.
  • composition for HLA gene amplification according to the present invention can analyze the HLA gene type with high sensitivity and accuracy, and is useful for histocompatibility test for bone marrow or organ transplantation.

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Abstract

본 발명은 HLA 유전자 증폭용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1 유전자 각각을 증폭할 수 있는 특이적 프라이머를 포함하는 HLA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물을 이용하면, HLA 유전자를 높은 정확도로 충분한 양을 증폭할 수 있어 관련된 HLA typing을 높은 민감도와 정확도 수행할 수 있어 유용하다.

Description

HLA 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 HLA 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1을 각각 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
사람 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA)은 조혈모세포(골수) 및 장기 등의 이식 시 거부 반응을 일으키는 주요 인자를 생성하는 면역 반응 조절 유전자로, 조직적합항원으로도 알려져 있다. 타인의 골수 세포나 바이러스 등 외래 물질이 신체에 들어올 경우 사람의 신체는 자신을 보호하기 위하여 이를 제거하기 위한 행동을 취하게 되며, 이때, 그 물질이 자기 자신과 같은 것인지 여부의 판단에서 중요한 역할을 하는 것이 HLA이다.
고형 장기와 조혈모세포 이식에 있어 근본적인 장애는 타인의 항원에 대한 면역반응의 결과인 거부현상으로, 공여자와 수여자간의 완전한 HLA형 일치가 성공적인 이식을 위한 가장 중요한 요소이다. 보통 조직적합성 검사는 HLA-A, HLA-B, HLA-DR 등의 유전자좌를 검사하며, 이들 3개 유전자좌에 대해 모두 적합한 경우 6/6 적합(match) 또는 0 부적합 (zero match)로 판단된다.
장기이식 시, 5년 생존율은 HLA가 완전히 일치하는 형제자매의 경우 84%, HLA 1개 일배체형 일치 가족의 경우는 73%, 타인인 공여자의 경우 66% 등의 순서로 부적합한 HLA 항원의 개수가 증가할수록 생존율이 단계적으로 낮아진다.
조혈모세포이식의 경우, 공여자의 전체 면역 시스템이 환자에게 이식되기 때문에 더 정확하고 정밀한 검사 (High resolution HLA typing)가 필요하며, 고해상도 수준에서 불일치하면 거부반응, 급성 이식편대숙주병, 사망률 등이 높아진다는 연구 결과가 보고되었다(N Engl J Med, 92:3515-20, 1998).
현재 시행되고 있는 HLA 검사 방법으로는 검사의 해상도(resolution)에 따라 저해상도(low resolution), 중해상도(middle resolution), 고해상도(high resolution)로 분류된다.
저해상도 분석인 혈청학적 방법은 고도의 숙련된 기술과 경험이 요구되며, DNA 검사법들과 비교하여 불일치하는 결과가 보고되면서, 점차 소규모 검사실에서도 쉽게 수행할 수 있는 DNA 검사법이 기존의 혈청학적 검사 방법을 급속히 대체하고 있다.
중해상도 분석을 위해 이용되는 SSOP(sequence specific oligonucleotide probe) 방법은 PCR 증폭 후에 스트립에 고정된 프로브와의 혼성화 반응 양상을 토대로 결과를 판정하는 방법이다. SSOP 방법은 혈청학적 검사법에서 흔히 보이는 교차 반응 및 약한 반응성 등으로 인해 모호한 결과가 보이는 현상이 적어 판독이 다소 용이하다는 점과 많은 양의 검체를 동시에 처리할 수 있는 장점이 있으나, PCR 후에 혼성화 과정을 거치므로 시간이 다소 걸린다는 점과 양성 밴드 판정에 있어 애매한 경우가 간혹 발생한다는 단점이 있다.
중해상도 분석을 위해 이용되는 PCR-SSP(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer) 기법은 PCR 프라이머의 염기서열 차이를 이용하여 유전자를 선택적으로 증폭하며, PCR 프라이머 세트의 수를 조절하여 원하는 수준의 형질을 판정하는 기법이다. PCR-SSP 기법은 PCR 과정에서 특정 대립유전자군만 증폭하여 그 결과를 판정하기 때문에 PCR 이후 전기영동을 통해 바로 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있는 반면 다수의 검체를 동시에 검사하기가 어렵다는 단점이 있다.
고해상도 방법으로 이용되는 SBT(sequence-based typing) 방법은 새로운 형질 분석을 위한 가장 우수한 방법이며, HLA 형질 수의 급격한 증가에 기여한 방법이기도 하다. 그러나, 대립유전자의 변이부분이 시스(cis)형인지 트랜스(trans)형인지를 구별하지 못하는 위상 모호성(phase ambiguity) 문제가 있고, 시간과 노동력, 비용이 많이 드는 단점이 있다.
검사 대상 exon 이외에 추가 영역에 대한 분석을 수행해야만 구분되는 대립유전자의 빈도 또한 증가하고 있으며, 질병에 특이적인 HLA 유전자형, 즉 강직성 척추염에서의 HLA-B27, 베체트 질환에서의 HLA-B51, 건선에서의 HLA-Cw*06 유전자 형별에 대한 검사법의 유전자 증폭 조건이 모두 달라서 기존 검사법으로 동시 검사를 수행하기 어려운 실정이다.
최근 분자진단에 도입되고 있는 차세대염기서열분석(NGS) 기술이 초고해상도 검사로서 기존 검사법의 한계(판독 모호성)를 극복할 수 있는 대안으로 부상하고 있으며, 기존 고해상도 방법인 SBT(sequence-based typing)를 사용한 결과에 비해 현저히 모호성이 줄어든 결과가 보고되고 있다 (Proc Natl Acad Sci U S A.;109(22):8676-81, 2012). 그러나, 아직까지는 NGS 기기를 이용한 서열분석(sequencing) 비용이 상대적으로 높기 때문에 서열분석 처리량과 비용 면에서 기존 SBT에 기초한 HLA 분석 방법에 비해 NGS 기반 방법이 현저히 우수한 것으로 인정될 수 없으며, 또한, 특정 NGS 기기에 의존적이라는 단점이 있다. HLA 고해상도 분석법의 내재적 한계인 위상 모호성의 문제를 근원적으로 해결하고 낮은 비용으로 대량 샘플 처리가 용이한 HLA 고해상도 검사법의 개발이 여전히 요구되고 있다.
HLA 유전자는 거의 모든 세포에서 발현되는 부류 I 분자에 속하는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 주로 면역계의 세포에서 발현되는 부류 II 분자에 속하는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP로, 사람이 갖고 있는 유전자중 다형성(polymoprphism)이 가장 심한 특징을 가지고 있고, 현재까지 약 18,000 종류 이상의 대립유전자가 밝혀졌다.
호소미치(Hosomichi) 등은 부류 I 분자에 속하는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 주로 면역계의 세포에서 발현되는 부류 II 분자에 속하는 HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1 유전자 각각의 상류 영역 및 하류 영역에 특이적으로 어닐링(annealing)된 프라이머를 생산하고 프라이머 및 차세대 서열 분석기(next-generation sequencer, NGS)를 이용한 긴(long range) PCR 방법으로 HLA 유전자의 염기서열을 결정하는 방법을 보고하였다(Hosomichi, K. et al., BMC Genomics, 14:355, 2013). 그러나, 다른 발명자들은 일본인을 대상으로 한 예비 실험에서, 상기 언급된 프라이머를 사용한 긴 PCR은 HLA-C에 대해서는 높은 증폭 효율 및 HLA-DRB1에 대해서는 매우 낮은 증폭 효율을 나타냈기 때문에 균일한 증폭을 달성할 수 없다는 문제점 및 HLA-DRB1에서, 특정 종류의 대립유전자는 거의 증폭되지 않았으며 HLA-DRB3 등과 같은 표적 이외의 유전자가 증폭될 뿐만 아니라, 대상체가 일본인일 경우 뿐만 아니라 아시아인, 백인 또는 흑인인 경우에도 비슷한 문제를 보고하였다(Ehrenberg, P.K. et al., BMC Genomics, 15:864, 2014).
상기 언급된 방법의 문제를 해결하기 위해, Ehrenberg 등이 1 종류의 프라이머 (HLA-A 및 HLA-C의 경우) 또는 3 종류의 프라이머 (HLA-DRB1의 경우)를 상기 언급된 프라이머에 첨가하여 PCR을 수행하였다는 것이 보고되었다(Ehrenberg, P.K. et al., BMC Genomics, 15:864, 2014). 그러나, 균일한 증폭은 상기 언급된 PCR에서 각 유전자에 대해 상이한 수의 프라이머에 의해 영향을 받는다. 또한, HLA-DRB1과 관련하여, 프라이머 서열은 표적 유전자 이외의 유전자와 완전히 동일하므로 의도하지 않은 유전자가 증폭될 수 있다.
HLA 유전자 타이핑에 대한 다른 접근법으로서, 상기 언급된 6 종류의 HLA 유전자를 위해, 데이터베이스를 기반으로 HLA 대립유전자의 다양한 서열에 상응하는 120-염기 프로브(probe)를 설계하는 단계, 및 NGS에 의해 cDNA 및 프로브를 혼성화(hybridizing)하여 수득된 게놈 단편을 판독하는 단계를 포함하는 방법이 보고되었다(Wittig, M. et al., Nucleic Acids Res., 43: e70, 2015). 그러나, 이 방법에서, 데이터베이스에 등록된 HLA 대립유전자의 가능한 한 많은 서열을 커버하도록 무려 10,000 종류의 프로브가 설계되었으며, 이는 결국 감소된 증폭 균일성 및 수집 효율의 문제를 유발한다. 또한, 커버된 HLA 대립유전자 이외의 대립유전자를 검출하기 어렵고 표적 유전자 이외의 유전자의 게놈 단편이 혼합될 수 있는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 HLA 유전자 증폭용 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 인간백혈구 항원 중 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 분석할 경우, 샘플의 HLA 대립유전자를 높은 민감도와 정확도로 분석할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 민감도와 정확도가 향상된 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1유전자 증폭 및 형별 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 HLA 유전자의 서열분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 HLA 유전자의 타이핑 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 HLA 유전자 증폭용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
다음 표 1에 표시된 (a)~(k)의 프라이머 세트를 포함하는 HLA 유전자 증폭용 조성물을 제공한다:
(a) HLA-A 유전자를 증폭할 수 있는 제1 내지 제6 프라이머 세트;
(b) HLA-B 유전자를 증폭할 수 있는 제7 내지 제10 프라이머 세트;
(c) HLA-C 유전자를 증폭할 수 있는 제11 내지 제18 프라이머 세트;
(d) HLA-DRB1 유전자를 증폭할 수 있는 제19 내지 제27 프라이머 세트;
(e) HLA-DRB3 유전자를 증폭할 수 있는 제28 내지 제35 프라이머 세트;
(f) HLA-DRB4 유전자를 증폭할 수 있는 제36 내지 제43 프라이머 세트;
(g) HLA-DRB5 유전자를 증폭할 수 있는 제44 및 제45 프라이머 세트;
(h) HLA-DQA1 유전자를 증폭할 수 있는 제46 내지 제56 프라이머 세트;
(i) HLA-DQB1 유전자를 증폭할 수 있는 제57 내지 제65 프라이머 세트;
(j) HLA-DPA1 유전자를 증폭할 수 있는 제66 내지 제76 프라이머 세트; 및
(k) HLA-DPB 유전자를 증폭할 수 있는 제77 내지 제81 프라이머 세트.
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본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 사용하는 것을 포함하는, HLA 유전자를 증폭하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 수득된 증폭산물을 포함하는, HLA 유전자의 서열분석(sequencing) 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 수득된 염기서열 정보를 사용하는 것을 포함하는, HLA 유전자의 타이핑(typing) 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는, HLA 유전자 증폭용 키트(kit)를 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트(HLAaccuTest)의 각 HLA 유전자 좌위별 증폭 위치를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트(HLAaccuTest)를 이용하여 조직적합성 검사 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트(HLAaccuTest)를 이용하여 157개의 표준검체에 대한 각 HLA 유전자 좌위의 형별 분석성능의 정확도 시험결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 세트(HLAaccuTest)를 이용하여 165개의 임상검체에 대한 HLA-A, B, C, DRB1 및 DQB1의 대립유전자 형별 분석의 임상적 성능 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머 세트와 타사 제품을 이용하여 5개의 샘플에서 11개의 HLA 유전자 좌위를 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머 세트와 타사 제품을 이용하여 165개의 임상검체에 대한 DRB1 및 DQB1의 대립유전자의 allele balance를 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 프라이머 세트와 타사 제품의 DQB1과 DPB1의 전체 Exon을 타겟팅 범위를 비교하여 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 “NGS”는 Next Generation Sequencing을 의미하는 것으로, 차세대 시퀀싱, 차세대 염기서열 분석을 의미하기도 한다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각 내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하거나, multiplex PCR로 표적 유전자 영역들을 증폭시켜 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio사의 기술, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.
본래 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)으로 지칭되는 기술은 자동화로는 제2세대 기술에 해당된다. NGS는 이전의 첫 자동화 기기와 구분하고, 이후에 탄생한 Next NGS 기기(차차세대, 혹은 제3세대 NGS라고도 지칭됨)와 따로 구분하기 위하여 불리는 이름이다. 그러나, 효율적인 염기서열 분석 기술의 개발경쟁이 가속화되고 새로운 기술의 도입 및 플랫폼의 사용 목적에 기초한 염기서열 분석 기술이 지속적으로 개발됨에 따라, 각 세대의 염기서열 분석기술은 그 구분이 모호해지고, NGS는 자동화된 생어 염기서열 분석기술 이후의 염기서열 분석기술을 모두 아우르는 광의의 의미로 사용되고 있다.
본 발명에서는 HLA 유전자 형질을 높은 민감도와 정확도로 분석하기 위해, 정확하고 충분한 양의 증폭산물을 수득할 수 있는 조성물을 설계하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 유전자를 각각 증폭하여 하나의 튜브에 모은 다음, NGS 방법으로 분석하여, 높은 민감도와 정확도로 각 HLA 유전자의 형별을 분석할 수 있는 프라이머 세트를 설계하여 그 성능이 기존에 사용되는 타회사 제품 대비 월등히 뛰어난 것을 확인하였다(도 5).
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 HLAaccuTest 프라이머 세트를 사용한 경우, HLA-DRB1와 HLA-DQB1 유전자좌의 PCR 산물의 PCR bias가 NGSgo 키트(GenDx 사)를 사용한 경우보다 적어, Heterozygote 형별에 대해 안정적인 allele balance를 확보할 수 있는 것을 확인하였다(도 6).
본 발명이 또 다른 실시예에서는 HLA-DQB1과 HLA-DPB1의 경우, 기존의 타사 제품인 NGSgo 키트(GenDx 사)와 Alltype NGS 키트(One lambda사)의 경우, PCR에 의하여 증폭되는 엑손의 타겟 영역이 좁아 검출 시, 엑손 모호성(exon ambiguity) rate가 높았으나, 본 발명의 HLAaccuTest 프라이머 셋트는 DQB1과 DPB1의 전체 Exon을 타겟팅하고 있어(도 7), HLA-DQB1/DPB1 타이핑 시에 엑손 모호성을 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 다음 표 1에 표시된 (a)~(k)의 프라이머 세트를 포함하는 HLA 유전자 증폭용 조성물에 관한 것이다:
(a) HLA-A 유전자를 증폭할 수 있는 제1 내지 제6 프라이머 세트;
(b) HLA-B 유전자를 증폭할 수 있는 제7 내지 제10 프라이머 세트;
(c) HLA-C 유전자를 증폭할 수 있는 제11 내지 제18 프라이머 세트;
(d) HLA-DRB1 유전자를 증폭할 수 있는 제19 내지 제27 프라이머 세트;
(e) HLA-DRB3 유전자를 증폭할 수 있는 제28 내지 제35 프라이머 세트;
(f) HLA-DRB4 유전자를 증폭할 수 있는 제36 내지 제43 프라이머 세트;
(g) HLA-DRB5 유전자를 증폭할 수 있는 제44 및 제45 프라이머 세트;
(h) HLA-DQA1 유전자를 증폭할 수 있는 제46 내지 제56 프라이머 세트;
(i) HLA-DQB1 유전자를 증폭할 수 있는 제57 내지 제65 프라이머 세트;
(j) HLA-DPA1 유전자를 증폭할 수 있는 제66 내지 제76 프라이머 세트; 및
(k) HLA-DPB 유전자를 증폭할 수 있는 제77 내지 제81 프라이머 세트.
[표 1]
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본 발명에 있어서, 상기 증폭은 NGS를 이용한 증폭인 것을 특징으로 할 수 있어, 골수 또는 장기이식 시의 조직적합성 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
도 1에는 상기 표 1에 나타낸 본 발명에 따른 프라이머 세트의 각 HLA 유전좌위별 증폭 위치를 나타내었다. 본 발명의 '비번역부위', Untranslated Region(UTR)은 단백질로 번역되는 엑손 영역과 엑손 사이의 인트론 영역 이외에 각 HLA 유전자의 5' 말단 또는 3' 말단을 포함하며, 구체적으로는 아래 표 2에 나타난 길이의 서열을 포함한다.
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본 발명의 '올리고뉴클레오타이드'는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.
본 발명의 '뉴클레오타이드'는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.
본 발명의 프라이머는 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 프라이머는 바람직하게 단리 또는 정제된다. "단리 또는 정제된"이라는 것은 천연 또는 합성된 상태로부터 목적 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 적용됨을 의미한다. (w/w)%에서 단리 또는 정제된 프라이머의 순도(총 핵산에 포함된 표적 프라이머의 백분율)는 일반적으로 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상(예컨대, 100 %)이다. 프라이머의 순도는 용매 및 고체 또는 액체의 상태에 따라 적절히 변화될 수 있다. 순도의 단위는 (w/v)% 또는 (v/v)%일 수 있고, 목적하는 순도는 상기 언급된 (w/w)%에서 순도의 정의를 고려하여 적절하게 계산될 수 있다.
이들 프라이머는 건조 상태 또는 알코올 침전 상태에서 고체로 제공될 수 있거나, 또는 물 또는 적합한 완충액(예컨대, TE 완충액 등)에 용해시켜 제공될 수도 있다.
본 발명의 '앰플리콘'은 프라이머에 의해 증폭되는 증폭 산물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 유전자를 증폭할 수 있고, GC 비율이 30 내지 80% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타겟 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 PCR은 상기 기재된 방법 이외의 공지된 PCR 방법이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 long range PCR인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 조건을 만족하는 프라이머 세트를 하기 표 3와 같이 구성하였다.
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본 발명에서, PCR의 주형(template)이 되는 DNA는 시험 샘플로부터 제조될 수 있다. 시험 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 혈액 골수흡인생검(BMA) 등과 같은 체액 샘플, 구강 점막 등과 같은 세포를 포함한다.
DNA는 프로테아제 K/페놀 추출법, 페놀/클로로포름 추출법, 알칼리 용해법, 비등법 등과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 시판되는 DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 미량 샘플로부터 빠르고도 간편하게 순도 높은 DNA를 제조할 수 있다.
발명의 프라이머 세트를 사용하는 HLA를 위한 PCR의 반응조건은 예를 들어 하기 조건일 수 있다:
열 변성 단계 (예컨대, 92°C 내지 98°C);
어닐링 단계 (예컨대, 55°C 내지 72°C); 및
신장 단계 (예컨대, 65°C 내지 80°C).
상기 언급된 PCR에서, 어닐링 단계 및 신장 단계는 하나의 단계 (셔틀 방법(shuttle method))로 수행될 수 있거나, 또는 어닐링 온도를 더 높게 설정하고 각 사이클에서 온도를 점차적으로 낮추는 것을 포함하는 방법이 채택될 수 있다(터치다운 방법(touchdown method)). 대안적으로, 이들은 조합될 수 있다. 셔틀 방법이 수행될 때, 어닐링 단계 및 신장 단계의 온도는 전형적으로 65 내지 72 ℃이다.
상기 언급된 PCR에서, 어닐링 단계 및 신장 단계는 하나의 단계 (셔틀 방법(shuttle method))로 수행될 수 있거나, 또는 어닐링 온도를 더 높게 설정하고 각 사이클에서 온도를 점차적으로 낮추는 것을 포함하는 방법이 채택될 수 있다(터치다운 방법(touchdown method)). 대안적으로, 이들은 조합될 수 있다. 셔틀 방법이 수행될 때, 어닐링 단계 및 신장 단계의 온도는 전형적으로 65 내지 72 ℃이다.
NGS를 사용한 서열 분석의 방법은 NGS의 종류에 따라 다르며, 예를 들어 각 회사의 매뉴얼 (예컨대, NexteraR XT DNA Library Prep Reference Guide)에 따라 수행될 수 있다. 수득된 샘플을 서열 분석하기 위해 페어드-엔드 분석(Paired-end analysis)이 바람직하게 사용된다. 다음에, Illumina, Inc.의 MiSeq을 사용한 서열 분석 절차의 요약이 기재된다. 다른 장치(Life Technologies에 의해 제조된 Ion Proton, Roche Diagnostics K.K.의 GS FLX+ 등)를 사용하는 경우에도, 장치에 적합한 방법에 의해 염기서열을 유사하게 결정할 수 있다(도 2).
1. 각 샘플의 증폭 생성물은 DNA 샘플 처리키트를 사용하여 태그멘테이션(Tagmentation)한다.
2. 인덱스 키트를 사용하여, 샘플마다 다른 인덱스 서열을 수득된 단편 서열의 양측에 첨가하고 PCR을 수행한다.
3. 증폭 생성물을 정제한다.
4. 각 샘플로부터의 증폭 생성물을 사용하여, 라이브러리 크기(library size)를 확인한다.
5. 샘플 사이의 농도를 조정한다.
6. 샘플의 증폭 생성물을 풀링(pooling)하고, 풀링된 증폭 생성물에 대해 정량적 PCR을 수행한다.
7. 풀링된 증폭 생성물을 MiSeq를 사용하여 서열분석한다.
이러한 방식으로, HLA 유전자의 유전자형은 NGS에 의해 수득된 증폭 생성물의 염기서열 정보를 기반으로 한 데이터베이스(이후 리드)를 사용하여 결정(타이핑)될 수 있다. 데이터베이스의 예는 18,000 종류 이상의 대립유전자가 등록된 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스를 포함한다.
NGS에 의해 수득된 증폭 생성물의 염기서열 정보를 기반으로 한 타이핑 방법의 예는, 리드를 복수의 HLA 유전자의 대립유전자에 맵핑(mapping)하는 단계, 그의 결과를 선형 프로그래밍 문제에 적용하는 단계 및 가장 적합한 대립유전자 쌍을 검출하는 단계를 포함하는 방법(OptiType)(Szolek, A. et al., Bioinformatics, Vol. 30, pp. 3310-3316, 2014), 리드 맵핑 결과를 신규로 조립하는 단계 및 결과로부터 대립유전자를 결정하는 단계(HLA reporter) (Huang, Y. et al., Genome Med, Vol. 7, pp. 25, 2015), 항원-제시 부위의 엑손으로부터의 대립유전자 쌍과 비교하는 단계 및 후속적으로 탐색 범위를 모든 엑손으로 확장시키는 단계, 따라서 IPD-IMGT/HLA (HLA-HD)의 모든 대립유전자의 타이핑을 가능하게 하는 단계(Kawaguchi, et al., Human Mutation, Vol. 38, pp. 788-797, 2017) 등을 포함하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 하는, HLA 유전자의 서열분석(sequencing) 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법에 의해 수득된 염기서열 정보를 사용하는 것을 특징으로 하는, HLA 유전자의 타이핑(typing) 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 프라이머 세트를 포함하는, HLA 유전자 증폭용 키트(kit)에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 본 발명의 프라이머 세트 이외에 PCR에 필요한 다른 시약 및 NGS 라이브러리 제작용 시약을 포함할 수 있다. 상기 언급된 시약이 본 발명의 프라이머 세트와 공존하여 보존한 후 반응에 악영향을 미치지 않는 경우, 프라이머 세트와 혼합되어 키트에 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 언급된 시약 및 본 발명의 프라이머 세트는 혼합되지 않고 별도로 제공될 수 있다. 상기 언급된 시약의 예는 DNA 추출시약, DNA 폴리머라아제 효소, dNTP, 반응 완충액, PCR에서 증폭효율을 향상시키는 인헨서, 설명서 등을 포함한다. 상기 언급된 DNA 폴리머라아제 효소는 시판되는 제품일 수 있다. DNA 폴리머라아제 효소의 예는 PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라아제, Tks Gflex DNA 폴리머라아제, Promega에 의해 제조된Go Tag, Qiagen에 의해 제조된 LongRange PCR Enzyme Mix, NEB에 의해 제조된 LongAmp Taq DNA Polymerase 및 Thermo Scientific에 의해 제조된 Long PCR Enzyme Mix를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생체시료 분석을 위한 프라이머 제작
HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1유전자의 형별을 효과적으로 분석하기 위하여, 상기 표 1과 같은 구성의 서열번호 1 내지 182의 프라이머를 제작하였다(표 3).
실시예 2: 제작된 프라이머를 이용한 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1의 증폭성능 확인
HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1 유전자에 대한 157개의 표준검체(Coriell Institute, International Histocompatibility Working Group, University of California Los Angeles )의 각 HLA 유전자 좌위의 형별 분석 성능을 확인하였다.
실험 방법은 각 샘플로부터 수득한 gDNA를 LR-PCR로 증폭하여 전기영동을 통해 증폭 유무를 확인하였으며, PCR 증폭조건은 다음과 같다:
Figure PCTKR2021011854-appb-img-000016
한 결과를 도 3에 나타내었으며, 100% 정확도로 각 형별분석이 가능한 것을 확인하였다.
HLA-A/B/C, HLA-DRB1 및 DQB1 유전자에 대한 165개의 임상검체(화순전남대학교병원)의 각 HLA 유전자 좌위의 형별 분석 성능을 확인한 결과를 도 4에 나타내었으며, 모두 99.4% 이상의 정확도로 각 형별분석이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 3: 제작된 프라이머를 이용한 HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1증폭 성능 확인
HLA-A/B/C, HLA-DRB1/3/4/5, DQA1, DQB1, DPA1 및 DPB1유전자에 대하여, 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트(HLAaccuTest)와 타사제품(Alltype NGS 키트, One lambda사)과의 비교실험을 총 5개의 세포주를 이용하여 성능을 확인하였다.
실험 방법은 각 샘플로부터 수득한 gDNA를 LR-PCR로 증폭하여 전기영동을 통해 증폭 유무를 확인하였으며, PCR 증폭조건은 실시예 2와 같다:
그 결과, 도 5에 기재된 바와 같이, One lambda사의 키트를 사용한 경우, 특정 검체에서 HLA 유전자가 증폭되지 않았으나, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 경우(HLAaccuTest)는 absence locus인 DRB5를 제외하고는 모든 유전자가 증폭되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 대립유전자(allele) 특이적 PCR 산물의 바이어스 최소화에 따른 대립유전자 비율(allele balance)의 향상
HLA의 11개 유전자좌 중 HLA-DRB1와 HLA-DQB1의 경우는 유전형(genotype)에 따라, 인트론(intron) 내에 긴 삽입부위(large-insertion)가 존재하는 경우가 있다 [표 5]. 이러한 긴 삽입부위는 상기 두 유전자좌를 PCR로 증폭하는 경우, PCR 산물의 크기의 차이가 유전형 별로 심하게 차이(PCR bias)가 나게 된다.
Figure PCTKR2021011854-appb-img-000017
본 실시예에서는 본 발명에 따른 HLAaccuTest 프라이머 세트와 NGSgo 키트(GenDx 사)를 사용하여, 165개의 임상검체에 대한 DRB1, DQB1 대립유전자에 대한 PCR을 실시하여, allele balance를 비교분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 HLAaccuTest 프라이머 셋트를 사용한 경우, HLA-DRB1와 HLA-DQB1 유전자좌의 PCR 산물의 PCR bias가 NGSgo 키트(GenDx 사)를 사용한 경우보다 적어, Heterozygote 형별에 대해 안정적인 allele balance를 확보할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 5: 유전자 타겟 영역 확장에 따른 모호성 감소
HLA의 11개 유전자 좌위 중 DQB1과 DPB1의 경우, 기존의 타사 제품인 NGSgo 키트(GenDx 사)와 Alltype NGS 키트(One lambda사)의 경우, PCR에 의하여 증폭되는 엑손의 타겟 영역이 좁아 검출 시, 엑손 모호성(exon ambiguity) rate가 높았다. 본 발명의 HLAaccuTest 프라이머 셋트는 DQB1과 DPB1의 전체 Exon을 타겟팅하고 있다(도 7). 따라서, HLA-DQB1/DPB1 타이핑 시에 엑손 모호성을 감소시킬 수 있다.
이를 확인하기 위하여, 질병관리본부에서 제공받은 96개 검체에서 분리한 gDNA를 대상으로 하여, 본 발명의 HLAaccuTest 키트와 Alltype NGS 키트(One lambda사)를 사용하여 HLA-DQB1/DPB1 타이핑을 실시하였다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, HLAaccuTest 키트를 사용한 결과가 엑손 모호성이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2021011854-appb-img-000018
본 발명에 따른 HLA 유전자 증폭용 조성물은 HLA 유전자의 형별을 높은 민감도와 정확도로 분석할 수 있어, 골수 또는 장기이식을 위한 조직적합성 검사에 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (6)

  1. 다음 표 1에 표시된 (a)~(k)의 프라이머 세트를 포함하는 HLA 유전자 증폭용 조성물:
    (a) HLA-A 유전자를 증폭할 수 있는 제1 내지 제6 프라이머 세트;
    (b) HLA-B 유전자를 증폭할 수 있는 제7 내지 제10 프라이머 세트;
    (c) HLA-C 유전자를 증폭할 수 있는 제11 내지 제18 프라이머 세트;
    (d) HLA-DRB1 유전자를 증폭할 수 있는 제19 내지 제27 프라이머 세트;
    (e) HLA-DRB3 유전자를 증폭할 수 있는 제28 내지 제35 프라이머 세트;
    (f) HLA-DRB4 유전자를 증폭할 수 있는 제36 내지 제43 프라이머 세트;
    (g) HLA-DRB5 유전자를 증폭할 수 있는 제44 및 제45 프라이머 세트;
    (h) HLA-DQA1 유전자를 증폭할 수 있는 제46 내지 제56 프라이머 세트;
    (i) HLA-DQB1 유전자를 증폭할 수 있는 제57 내지 제65 프라이머 세트;
    (j) HLA-DPA1 유전자를 증폭할 수 있는 제66 내지 제76 프라이머 세트; 및
    (k) HLA-DPB 유전자를 증폭할 수 있는 제77 내지 제81 프라이머 세트.
    [표 1]
    Figure PCTKR2021011854-appb-img-000019
    Figure PCTKR2021011854-appb-img-000020
    Figure PCTKR2021011854-appb-img-000021
    Figure PCTKR2021011854-appb-img-000022
    Figure PCTKR2021011854-appb-img-000023
  2. 제1항에 있어서, 상기 증폭은 Long range PCR을 이용한 증폭인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 골수 또는 장기이식 시의 조직적합성 검사용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항의 프라이머 세트를 사용하는 것을 포함하는, HLA 유전자의 서열분석(sequencing) 방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 수득된 염기서열 정보를 사용하는 것을 포함하는, HLA 유전자의 타이핑(typing) 방법.
  6. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, HLA 유전자 증폭용 키트(kit).
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117265091A (zh) * 2023-10-31 2023-12-22 江苏伟禾生物科技有限公司 一种用于hla-drb3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140206005A1 (en) * 2011-07-21 2014-07-24 Genodive Pharma Inc. Method and Kit for DNA Typing of HLA Gene
US20160060695A1 (en) * 2013-05-09 2016-03-03 Genodive Pharma Inc. Method and kit for multiplex dna typing of hla gene
KR20190059780A (ko) * 2017-11-23 2019-05-31 (주)오상헬스케어 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 검사 키트
KR20190116989A (ko) * 2017-02-13 2019-10-15 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 Hla 유전자를 위한 pcr 프라이머 세트, 및 이를 이용한 서열 분석 방법
KR20200051714A (ko) * 2017-09-06 2020-05-13 난트 홀딩스 아이피, 엘엘씨 Hla 조직 매칭 및 그에 관한 방법(hla tissue matching and methods therefor)

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140206005A1 (en) * 2011-07-21 2014-07-24 Genodive Pharma Inc. Method and Kit for DNA Typing of HLA Gene
US20160060695A1 (en) * 2013-05-09 2016-03-03 Genodive Pharma Inc. Method and kit for multiplex dna typing of hla gene
KR20190116989A (ko) * 2017-02-13 2019-10-15 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 Hla 유전자를 위한 pcr 프라이머 세트, 및 이를 이용한 서열 분석 방법
KR20200051714A (ko) * 2017-09-06 2020-05-13 난트 홀딩스 아이피, 엘엘씨 Hla 조직 매칭 및 그에 관한 방법(hla tissue matching and methods therefor)
KR20190059780A (ko) * 2017-11-23 2019-05-31 (주)오상헬스케어 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 검사 키트

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117265091A (zh) * 2023-10-31 2023-12-22 江苏伟禾生物科技有限公司 一种用于hla-drb3/4/5基因分型的引物组、试剂盒及应用

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