CN109055532B - 胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物、试剂盒及应用。本发明针对聋致病基因GJB2、SLC26A4的编码区序列、7号和/或13号染色体上的相关SNP位点设计PCR扩增用的引物对，通过靶向捕获技术可以对致病基因目标区域进行富集，构建文库，继而进行上机测序和单体型分析，并可进一步用于分析相关基因信息，对于辅助诊断和治疗遗传性耳聋具有重要的指导和研究价值。本发明的引物组合物可实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析，使得对致病变异的检测和连锁分析在同一反应体系中完成，减少人为因素对结果的干扰，可以提高检测的准确度，并且可以有效降低ADO导致的误诊风险。

Description

胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物、试剂盒及 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术

遗传性耳聋是一大类遗传性疾病，据WHO统计，2013年全球听力残疾人数达3.6亿，占世界总人口5.3％，在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿。据各国统计，先天性听力障碍在目前出生缺陷中位居首位，发生率约1‰～3‰。根据2006年12月公布的第二次全国残疾人抽样调查结果，我国现有听力言语残疾者达2780万，占残疾人总数的33.52％，每年新发出生缺陷达90万例，其中先天性听力障碍约3.5万例，并以每年新生2～3万聋儿快速增长，其中超过50％的新生聋儿由遗传因素所致。

遗传性耳聋是我国主要的出生缺陷，且预后治疗难以达到完全康复，因此国内已开展耳聋出生缺陷三级预防。其中一级预防为孕前的婚育指导，即基因诊断或胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)；二级预防为产前筛查，即羊水或绒毛膜穿刺；三级预防为出生后的早期发现、干预，即听力和基因联合筛查。据统计，我国先天性聋患者中，50％是由于基因突变导致，语前聋患者中，20％是由于基因突变导致；耳聋人群中，15％左右患者是由于基因突变导致。由于技术平台、检测成本等因素的限制，目前临床耳聋出生缺陷的防控仍以三级预防为主。PGD检测早在上世纪八十年代末已有学者开始进行研究，发展至今已经历近半个世纪的应用与探索。自1999年中山大学附属第一医院生殖中心成功完成我国第一例PGD至今，PGD作为一种早期孕前诊断形式，在我国已被普遍接受。尤其是2015年1月，我国首例通过PGD检测，预防基因突变致重度遗传性耳聋的试管婴儿诞生，实现了我国首例遗传性耳聋PGD的一级预防。该临床案例中涉及的PGD检测方法主要为基于核苷酸短串联重复(short tandom repeats，STR)的连锁分析。因此，我国已具备通过PGD检测实现遗传性耳聋出生缺陷一级预防的技术条件及市场前景。但是传统的PGD检测主要通过以PCR为基础的一代测序技术或毛细管电泳检测STR完成分析，检测通量低、操作复杂、耗时长，通常无法实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析。该方法仅能对少数位点进行检测，因此等位基因脱扣导致误诊的风险也相对较高。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够使用在胚胎植入前进行遗传性耳聋基因检测用的引物组合物、试剂盒及应用。

一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物，包括用于PCR扩增7号染色体上SLC26A4基因编码区的引物对组合、用于PCR扩增13号染色体上GJB2基因编码区的引物对组合、用于PCR扩增7号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合、以及用于PCR扩增13号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合中的至少一个引物对组合。

在其中一个实施例中，所述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物包括四个引物对组合，四个引物对组合中的各引物对信息如后面表1所示，参考基因组为hg19，各引物对的序列与所述参考基因组上相应位点之间的序列完全匹配。

在其中一个实施例中，四个引物对组合分为两组，其中一组包括序号从1号至231号的共231对引物对，另一组包括序号从232号至462号的共231对引物对。

一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒，包括上述任一实施例所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物。

在其中一个实施例中，所述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒还包括PCR扩增混合液、引物消化液、DNA连接酶、连接缓冲液、P1接头、特异性接头以及DNA纯化试剂中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述特异性接头的序列如SEQ ID NO.4所示。

上述任一实施例所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物，或者上述任一实施例所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒在胚胎植入前遗传性耳聋基因检测过程中的应用。

在其中一个实施例中，所述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测过程包括如下步骤：

对DNA样本使用所述引物组合物进行PCR扩增；

PCR扩增结束后终止反应，在扩增产物上连接测序接头。

在其中一个实施例中，分装和加入引物池前的PCR扩增体系为：含有10～100ng的DNA样本xμl、5×扩增混合液4μl以及无核酸酶水(6-x)μl的10μl体系，或者含有10～100ng的DNA样本xμl、5×扩增混合液5μl以及无核酸酶水(7.5-x)μl的12.5μl体系，0＜x＜6；

体系配制完成后平均分装至两个PCR管，每管5μl，一管加入5μl引物池1、另一管加入5μl引物池2，分别进行PCR扩增。

在其中一个实施例中，PCR扩增的条件为：99℃、2min；99℃、15sec，60℃、4min，15～18个循环；10℃保温。

本发明经过研究发现，传统的PGD检测基于PCR技术结合一代测序技术或STR连锁分析，主要通过以PCR为基础的一代测序技术或毛细管电泳检测STR，完成分析，检测通量低、操作复杂、耗时长。传统技术通常无法实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析，而若想达到此目的，需要通过不同的实验操作，完成对致病突变和连锁分析位点的检测，检测过程中人为操作引入错误的风险增高(如样本混淆或污染等)，且对检测结果的分析过程仍需人工完成。此外，受技术本身的限制，该方法仅能对少数位点进行检测，因此等位基因脱扣导致误诊的风险相对较高。由于STR位点在染色体上的分布不均，且覆盖密度较低，因此常常无法检测到染色体重组的发生，降低了检测的准确度。单核苷酸多态性(SNP)位点的检测技术可以解决部分上述问题。尤其是近年来SNP芯片技术在基因检测领域应用较多，在辅助生殖领域主要用于基因拷贝数变异(Copy Number Variations，CNV)及染色体结构变异(如相互易位、罗氏易位)的检测，而在单基因遗传病PGD检测中并未广泛应用，主要是成本太高，而且对致病变异的直接检测效果欠佳。

随着二代测序(NGS)技术的推广应用，测序成本的不断降低，NGS技术在辅助生殖领域的研究也越来越多。通过NGS结合胚胎活检不仅可以准确检测全部染色体的非整倍体异常，同时对基因信息的检测也在逐渐被广泛应用。本发明正是基于NGS技术，针对耳聋致病基因GJB2、SLC26A4的编码区序列、7号和/或13号染色体上的遗传性耳聋相关SNP位点设计PCR扩增用引物对，通过靶向捕获技术可以对遗传病致病位点目标区域进行富集、建库、上机测序，进一步用于分析相关基因信息，对于辅助诊断和治疗遗传性耳聋具有重要的指导和研究价值，尤其是可以用于胚胎植入前遗传性耳聋PGD检测。

本发明的引物组合物、试剂盒可实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析，使得对致病变异的检测和连锁分析在同一反应体系中完成，减少人为因素对结果的干扰，可以提高检测的准确度。此外，单次检测即可获得大量用于连锁分析的基因编码区或SNP位点基因型信息，有效降低了ADO导致的误诊风险。

本发明的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物及试剂盒在前期研发过程中，充分考虑了检测成本与人群适用性，对SNP位点的选择制订以下标准：所选SNP位点距离致病基因应不超过1M；每个基因连锁的SNP数量应不少于200个；SNP位点在基因上、下游均匀分布，平均每4-5Kb一个SNP位点。在选取SNP位点时，选取等位基因频率较高的位点(MAF≥0.36)，MAF值越接近0.5，夫妻双方一方杂合一方纯合的几率越高，从而有利于确保获得足够多的有效位点以保证致病位点的上下游至少存在两个有效位点。而不同人种间同一SNP位点的MAF值有较大的差异，因此在进行SNP位点选择时结合了1000G MAF数据库及自建的15万中国人群Base SNP数据库，使其更适用于中国人群。

本发明在前期设计过程中存在目的基因编码区覆盖率不高，部分区域未能实现扩增，后经优化，将SLC26A4基因编码区覆盖提升至92.47％，GJB2基因编码区覆盖提升至91.27％，且编码区热点致病突变均已覆盖。

附图说明

图1～图3为实施例1的基因型检测结果；

图4～图5为实施例2的基因型检测结果；

图6为P1接头与特异性接头的序列结构示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物，其包括用于PCR扩增7号染色体上SLC26A4基因编码区的引物对组合、用于PCR扩增13号染色体上GJB2基因的编码区引物对组合、用于PCR扩增7号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合、以及用于PCR扩增13号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合中的至少一个引物对组合。

四个引物组合中各引物对的信息优选如下表1所示。

表1

参考基因组为hg19，各引物对的序列与参考基因组上相应位点之间的序列完全匹配。所述完全匹配是指与参考基因组的相应序列完全一致或完全互补配对，例如，正向引物的序列可以与参考基因组上的相应序列完全一致，而反向引物的序列可以与参考基因组上的相应序列完全互补配对。更具体地，例如参考基因上靠近rs7993500单核苷酸多态性位点的第20498737位碱基至第20498758位碱基的序列是5’-GAATGTCCTCAAGGCTGCTCTA-3’(SEQID NO.1)，因此正向引物的序列即为5’-GAATGTCCTCAAGGCTGCTCTA-3’(SEQ ID NO.1)，第20498886位碱基至第20498915位碱基的序列是5’-ATTGTGAATAACGCTTCTATGAAGATGAGT-3’(SEQ ID NO.2)，因此反向引物的序列即为5’-ACTCATCTTCATAGAAGCGTTATTCACAAT-3’(SEQID NO.3)。

在一个具体的示例中，该胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物包括四个引物对组合。优选的，根据避免引物序列之间形成引物二聚体而进行进一步设计，将四个引物对组合分为两组，其中一组包括序号从1号至231号的共231对引物对，另一组包括序号从232号至462号的共231对引物对，也即四中引物对组合分为两个引物池，分别为引物池1和引物池2，每个引物池内的引物对可混合在一起，两个引物池分别对模板DNA进行独立地PCR扩增，可以防止多重PCR扩增时造成相互干扰，保证扩增结果的特异性。

本发明还提供了一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒，其包括上述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物。

进一步，在一个具体示例中，该遗胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒还包括PCR扩增混合液、引物消化液、DNA连接酶、连接缓冲液、P1接头、特异性接头以及DNA纯化试剂中的至少一种。

P1接头和特异性接头与扩增序列进行连接，形成可用于测序的文库序列，图6所示的是P1接头和特异性接头与扩增序列形成的序列结构，其中，特异性接头的序列为5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’(SEQ ID NO.4)，A引物的序列为5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.5)；P1接头的序列为5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’(SEQ ID NO.6)，P1引物的序列为5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3’(SEQ ID NO.7)。

进一步，特异性接头中有10个连续的不同碱基组成的序列，用以区分不同接头，具体可选自下表2所示序列中的一种。

表2

上述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物，或者上述胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒可应用在胚胎植入前遗传性耳聋基因检测的过程中。

具体地，在一个示例中，胚胎植入前遗传性耳聋基因检测的过程包括如下步骤：

对DNA样本使用引物组合物进行PCR扩增；

PCR扩增结束后终止反应，在扩增产物上连接测序接头，上机测序。

DNA样本可以是基因组DNA或者扩增的DNA产物。其中基因组DNA样品可以是血液、组织或细胞来源样本提取的DNA；扩增的DNA产物可以是单细胞全基因组扩增产物。

在一个具体示例中，分装和加入引物池前的PCR扩增的体系为：含有10～100ng的DNA样本xμl、5×扩增混合液4μl以及无核酸酶水(6-xμl)的10μl体系，或者含有10～100ng的DNA样本xμl、5×扩增混合液5μl以及无核酸酶水(7.5-x)μl(0＜x＜6)的)12.5μl体系。若采用总体积为12.5μl的反应体系，后续同10μl体系操作不变，配制完成后平均分至两管，每管5μl，丢弃剩余的2.5μl反应液，一管加入5μl引物池1、另一管加入5μl引物池2分别进行PCR扩增，该操作可避免移液误差导致的反应体系不足，但同时造成反应试剂的浪费。

在一个具体示例中，PCR扩增的条件为：99℃、2min；99℃、15sec，60℃、4min，15～18个循环；10℃保温。一般15个循环即可，当DNA模板质量欠佳时，循环次数可增加至18个循环。

本文所述的引物组合物、试剂盒及应用仅限于新一代高通量半导体测序平台。

基因检测产物经DNA磁珠纯化后检测浓度，浓度质检合格后可使用Ion TorrentProton^TM测序平台进行上机测序。测序后可采用单体型分析软件，对待测样本对应的测序结果进行分析，完成单体型构建。通过连锁分析，可判断待检测胚胎样本的耳聋致病变异携带情况，同时分析耳聋致病突变位点的检测情况。

本发明基于NGS技术，针对耳聋致病基因GJB2、SLC26A4的编码区序列、7号和/或13号染色体上的相关SNP位点设计PCR扩增用的引物对，通过靶向捕获技术可以对检测的目标区域进行富集和扩增，构建基因文库。该基因文库可用于测序分析，并可进一步分析相关基因信息，对于辅助用于诊断和治疗遗传性耳聋具有重要的指导和研究价值，尤其是可以用PGD。本发明的引物组合物可实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析，使得对致病变异的检测和连锁分析在同一反应体系中完成，减少人为因素对结果的干扰，可以提高检测的准确度。此外，单次检测即可获得大量用于连锁分析的基因编码区或SNP位点基因型信息，有效降低了ADO导致的误诊风险。

以下结合具体实施例对本发明的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物、检测试剂盒及应用过程作进一步详细的说明。

实施例1家系样本致病变异分析

一、样本准备

提取夫妻双方及双方患病子代(先证者)的血液基因组DNA，Qubit 2.0测定DNA浓度，取一定量作为待检DNA样本。

二、靶向序列捕获及文库构建

1.靶向序列捕获

1)将DNA样本涡旋混匀离心后，放置于冰盒上，每个样本取两个0.2ml的PCR管，按照表3配制反应体系：

表3

组分	反应体积(μl)
		DNA样本	2(50ng)
无核酸酶水	4
		5×扩增混合液	4

2)配制完成后平均分装至两个0.2ml的PCR管，每管5μl。其中一管加入5μl的引物池1，另一管加入5μl引物池2，涡旋混匀，瞬时离心使PCR管内反应体系集中在管底，放入PCR仪，按照表4的反应程序设置并运行，以扩增基因组上目标区域。

表4

3)程序运行结束后，将一个PCR管中的10μl扩增产物转入另一管中，两管合并后的体积约20μl。

4)向合并后的反应体系中加入2μl引物消化液，总体系达到22μl。充分振荡混匀，瞬时离心将液体收集到管底。将PCR管放入PCR仪，按表5程序运行。

表5

温度	时间
		50℃	10min
55℃	10min
		60℃	20min
10℃	保温(最长1h)

2.文库构建

小心打开PCR管盖，向其中加入表6所示的反应体系，也可先向其中加入1μl特异性接头，再按照样本数配制除特异性接头以外的反应体系混合液，每个样本中分装7μl。

表6

成分	体积(μl)
		靶向序列捕获样本	22
连接缓冲液	4
		P1接头	1
特异性接头	1
		DNA连接酶	2
总体积	30μl

女方、男方和先证者所用特异性接头中的10个连续序列分别为SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10。

盖上盖子，充分振荡混匀，瞬时离心使反应体系处于管底。将PCR管放入PCR仪，按表7程序运行。

表7

温度	时间
		22℃	30min
68℃	5min
		72℃	5min
10℃	保温(不超过1h)

三、荧光定量PCR测定文库浓度

1.将文库稀释200倍，即NFH₂O(无核酸酶水):文库＝199:1，稀释好的文库震荡30s，离心5s。

2.按以下用量配制10个样本的反应混合液MIX，配制好的反应混合液震荡10s离心2s，离心过的MIX放置冰盒上进行分装使用。配制混合的顺序为NFH₂O、Kapa sybr fastmaster mix、引物和Rox Dye。Kapa sybr fast master mix和Rox Dye试剂用完立即放入-20℃冰箱保存。

3.按以要求分装反应混合液MIX，加样本与标准品，均在冰上操作。

S1管16μl Mix+4μl Standard#1

S2管16μl Mix+4μl Standard#2

……

S6管16μl Mix+4μl Standard#6

样本管16μl Mix+4μl稀释200倍的文库样本(共3例文库样本)

阴性对照16μl Mix+4μl H₂O

4.完成分装和加样，震荡混匀，离心5s，确保各个反应管没有气泡产生。将反应体系放入qPCR仪，运行以下程序：PCR体系为20μl，PCR反应程序为95℃，5min；(95℃，30s；60℃，45s)40个循环。

5.浓度计算：利用检测的标准品CT值，根据按照CT＝-klgX0+b线性公式，绘制标准曲线，根据标准曲线得到的k值、b值，计算每个文库样本的起始拷贝数，公式：lgConc＝(Ct-b)/k。

6.根据样本起始拷贝数，计算样本起始浓度(ng/μl)g/μl＝[2×文库分子长度(250bp)×333g/mol]×copies/μl/(6.02×1023/mol)×200。

四、上机测序

将文库稀释至100pM，取2μl进行测序文库的混合后，利用半导体高通量测序仪进行上机测序。

五、测序结果分析

通过单体型分析软件，对测序结果进行自动分析，构建夫妻(男女双方)及先证者单体型。检测结果如图1～图3所示，结果共检测到83个用于构建男女双方单体型的SNP位点，且致病位点基因型与遗传性耳聋基因检测报告一致，其中，SNP位置为20763485的位点有致病变异。

后续对胚胎进行连锁分析所获得的致病性情况与直接进行致病位点(chr13：20763485)检测的结果一致，因此本检测准确可靠。

实施例2胚胎植入前检测

1.样本准备

囊胚期胚胎滋养外胚层分离3～5个细胞作为待检样本。按照常规胚胎活检技术对囊胚期胚胎进行取样，取出的细胞用1×PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺)清洗3遍，放置于0.2ml的PCR管中，体积不超过2.5μl。单细胞样本先用PicoPlex^TM WGA kit进行全基因组扩增。

2.靶向序列捕获及文库构建

同实施例1。

8枚待检胚胎样本G30218032601P01至G30218032601P08所用接头分别为SEQ IDNO.11至SEQ ID NO.18。

3.荧光定量PCR测定文库浓度

同实施例1。

4.上机测序及测序结果分析

将文库稀释至100pM，取2μl进行测序文库的混合后，利用半导体高通量测序仪进行上机测序。

通过单体型分析软件，对测序结果进行自动分析，构建受检胚胎样本的单体型。检测结果如图4、图5所示，结果8枚胚胎中共检测到1枚致病胚胎，3枚正常胚胎，4枚致病变异携带胚胎，且致病位点基因型与连锁分析致病情况一致，说明检测结果准确可信。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物，其特征在于，包括用于PCR扩增7号染色体上SLC26A4基因编码区的引物对组合、用于PCR扩增13号染色体上GJB2基因编码区的引物对组合、用于PCR扩增7号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合、以及用于PCR扩增13号染色体上遗传性耳聋相关SNP位点的引物对组合，四个引物对组合中的各引物对信息如下表所示：

参考基因组为hg19，各引物对的序列与所述参考基因组上相应位点之间的序列完全匹配；

四个引物对组合分为两组，其中一组包括序号从1号至231号的共231对引物对，另一组包括序号从232号至462号的共231对引物对。

2.一种胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测用引物组合物。

3.如权利要求2所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增混合液、引物消化液、DNA连接酶、连接缓冲液、P1接头、特异性接头以及DNA纯化试剂中的至少一种。

4.如权利要求3所述的胚胎植入前遗传性耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所述特异性接头的序列如SEQ ID NO.4所示。

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