CN113980961A - 一种用于smn1和smn2基因数字pcr检测的组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测领域，公开了用于检测SMN1和SMN2基因的引物探针组合物，所述引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1～8所示。本发明的引物探针特异性强，且检测准确，其拷贝数值与临床结果一致，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及SMN1和SMN2基因数字PCR检测。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病，临床特征是脊髓前角细胞变性退化、导致对称性肌无力和肌萎缩，为一种常见的运动神经元疾病，主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱、病理征阴性，目前尚无有效治疗手段。SMA通常根据疾病严重程度与发病年龄分为三个亚型：I型患者在出生时或在6个月之前开始发病，不能独自坐或走路，并且通常在两年内死于呼吸功能不全；II型患者在6个月之后发病，可以独坐但在没有任何辅助设备帮助的情况下不能走路，并且寿命会大大减少：III型患者通常在1岁半后发病，可以独立地坐或走路，但在青春期或成人后一般行走能力有所退步，需要靠轮椅行动。
SMA在人群中的携带率约为1/35-1/50左右，发病率约为1/6000-1/10000左右。目前遗传学已经确认，SMA主要与两个高度同源的基因SMN1(NCBI Gene ID:6606)和SMN2(NCBI Gene ID:6607)密切相关，SMN1与SMN2在序列上仅有5个碱基的差别，主要通过7号外显子和8号外显子上的两个位点进行区分。94％的SMA患者是由于SMN1基因的缺失造成，而SMN2则被认为是SMN1的修饰基因，其突变不直接造成SMA表型，但是其拷贝数和SMA病情严重程度相关。
一般来说，大部分正常个体都有2份拷贝的SMN1基因与2份拷贝的SMN2基因，SMN2基因由于第7外显子上c.840位点C/T碱基的差异，表达的蛋白大部分会发生外显子7的跳跃，只有少量的全长SMN mRNA，也就是说SMN2表达的蛋白中只有10％为全长蛋白，所以如果某个人两份拷贝的SMN1基因都失去功能的话一定会患病，而只有一份SMN1基因起作用的个体为携带者，在SMN1基因都失去功能的情况下，SMN2基因拷贝数数目，则会影响患者的发病时间与疾病严重程度。
现有的SMA基因的检测方法主要包括两种方法，方法一采用qPCR方案分成两个反应或者三个反应，利用ΔΔCT法进行相对定量；方法二采用MLPA方案，进行测序分析。其中方法一存在qPCR方案做定量分析，稳定性差，难以给出稳定的阈值等缺点；方法二存在MLPA方案操作繁琐等缺点。因此亟需发明一种新的检测SMA基因的方法。
发明内容
本发明公开了一种检测SMN1和SMN2基因的引物探针组合物及相应的试剂盒，解决了现有技术中稳定性差、操作繁琐等问题。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种用于检测SMN1和SMN2基因的引物探针组合物，针对SMN1基因的第7和第8外显子，以及SMN2基因的第7和第8外显子进行引物和探针的设计，包括：
用于检测SMN1和SMN2基因的引物和探针序列分别如SEQ ID NO：1～8所示。
本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组合物。
优选的，所述试剂盒还包括PCR Mix，如Taq酶、镁离子、Tris-HCl缓冲液、甘油等PCR程序中所需要的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括内控体系，所述内控体系包括核苷酸序列如SEQ IDNO：9-11所示的核酸分子。
应当理解，本发明中公开的试剂盒成分并不限于以上几种，本领域技术人员可以根据需要添加或替换其他的成分，且均在本发明的保护范围之内。
本发明第三个方面公开了一种检测SMN1和SMN2基因的系统，包括本发明的引物探针组合物或本发明的试剂盒以及数字PCR平台。
所述数字PCR平台可以是多色荧光通道数字PCR平台；在优选的实施方式中，所述数字PCR平台是领航基因的多色荧光通道数字PCR平台，该平台包括数字PCR通用试剂盒(商品号20501)，微滴式数字PCR用反应预混液(商品号20502)和液滴数字PCR系统(商品号30012)。本领域技术人员可以根据商品说明书了解如何使用该平台并完成本发明所述的检测。
本发明第四个方面公开了一种检测SMN1和SMN2基因的方法，包括：使用上述的引物探针组合物或试剂盒或系统进行检测。
优选的，所述方法包括采集临床DNA样品，所述DNA样品的浓度大于10ng/μL。
优选的，所述方法中还包括使用内控体系，所述内控体系包括核苷酸序列如SEQID NO：9-11所示的核酸分子。
优选的，所述方法基于多重数字PCR技术进行检测。
术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。
更优选的，包括以下步骤：
(1)获得样本核酸；
(2)配制数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
优选的，所述扩增程序依次包括：98℃预变性5min；98℃变性15秒，60℃退火120秒，循环40次。
应当理解，扩增程序并不限于上述程序，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的扩增程序完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。
本发明第五个方面公开了根据上述的引物探针组合物、上述的试剂盒或上述的系统在基因检测中的应用；优选的，所述基因检测为SMN1和SMN2基因检测。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明开发了一种新的多重数字PCR体系以及利用该PCR体系进行SMN1和SMN2基因检测。该多重数字PCR体系解决了利用qPCR计算相对定量的不稳定性以及采用MLPA检测的繁琐操作。本发明的引物探针特异性强，且检测准确，其拷贝数值与临床结果一致，操作简便。
附图说明
图1A～D为本发明实施例中样品B的荧光散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种同时检测SMN1和SMN2基因的方法，包括：
一、依据SMN1基因E7外显子序列，SMN2基因E7外显子序列以及内参基因GAPDH的序列，采用primer express软件设计引物探针。具体信息如下：
表1
二、样品
DNA样品：4例临床DNA样品，已用MLPA方案测试过。其中，一例标本SMN1基因E7和E8杂合缺失，SMN2基因正常；两例标本SMN1基因E7和E8杂合缺失，SMN2基因E7和E8杂合重复；一例标本SMN1基因E7和E8纯合缺失，SMN2基因E7和E8杂合重复。
三、数字PCR扩增体系
仪器：领航基因自主研发的多色荧光通道数字PCR平台。该平台包括：数字PCR通用试剂盒(商品号20501)，微滴式数字PCR用反应预混液(商品号20502)和液滴数字PCR系统(商品号30012)，按照PCR平台的说明书操作。
3.1 25×SMA引物探针混合液如下表2所示
表2
| 组分 | 储存液(μM) | 体积(μL/人份) |
| 水 | / | 0.15 |
| SMNE7-F | 400 | 0.0375 |
| SMNE7-R | 400 | 0.0375 |
| SMNE8-F | 400 | 0.0375 |
| SMNE8-R | 400 | 0.0375 |
| GAPDH-F | 400 | 0.0375 |
| GAPDH-R | 400 | 0.0375 |
| SMN1E7-P | 100 | 0.0375 |
| SMN2E7-P | 100 | 0.0375 |
| SMN1E8-P | 100 | 0.0375 |
| SMN2E8-P | 100 | 0.0375 |
| GAPDH-P | 100 | 0.075 |
| 合计 | / | 0.6 |
3.2 ddPCR反应体系如下表3所示
表3
| 试剂 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 水 | 10.4 | |
| 5×ddPCR Mix | 3 | 1× |
| 25×SMA | 0.6 | 1× |
| DNA | 1 | 10ng<上样量<100ng |
| 合计 | 15 |
3.3扩增程序
98℃5min【98℃15s，60℃2min】*40
3.4结果
3.4.1原始结果如表4所示
表4
3.4.2结果转换与复核
对3.4.1的数据进行换算，以vic通道拷贝数(人类正常基因组核酸序列为靶点)为分母，分别进行比值计算，由于vic通道为人类正常基因组，是2倍体，因此，比值0.5附近，说明目标基因是单拷贝，属于缺失型；比值1附近，说明目标基因是双拷贝，基因型正常，依次类推。结果如表5中第2-5列所示。表5第6-9列表示样品中的基因拷贝数，与MLPA方案已测结果一致。
表5
四、样品B散点图示例如图1所示，A～D分别为四个荧光标记的结果。
本发明的引物探针特异性正常，检测NTC均无扩增信号；检测4例临床样品，能够显示不同的荧光区域，且检测的拷贝数值与临床结果一致。
使用本发明的引物探针组合物，结合数字PCR方案，不仅可以实现绝对定量，而且对于低拷贝模板的样本，定量精密度数据更优，检测结果稳定性更强；而传统的荧光定量PCR方案对于低拷贝模板的比值输出，存在更大偏差，容易导致假阳性/假阴性结果的输出。采用领航基因数字PCR技术平台，实验流程均为一键式启动，人工操作时间少，操作简单，软件可自动分析数据，输出患者检测报告。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测SMN1和SMN2基因的引物探针组合物，所述引物和探针序列分别如SEQID NO:1～8所示。
2.一种用于检测SMN1和SMN2基因的试剂盒，包括权利要求1所述的引物探针组合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括ddPCR Mix。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内控体系，所述内控体系包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9-11所示的核酸分子。
5.一种检测SMN1和SMN2基因的系统，包括权利要求1所述的引物探针组合物或权利要求2～4任一项所述的试剂盒以及数字PCR平台。
6.一种检测SMN1和SMN2基因的方法，包括使用权利要求1所述的引物探针组合物或权利要求2～4任一项所述的试剂盒或权利要求5所述的系统进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括：采集临床DNA样品，所述DNA样品的浓度大于10ng/μL。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述方法基于多重数字PCR技术进行检测。
9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)获得样本核酸；
(2)配制数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出；优选地，所述扩增程序包括：98℃预变性5min；98℃变性15秒，60℃退火120秒，循环40次。
10.权利要求1所述的引物探针组合物或权利要求2～4任一项所述的试剂盒或权利要求5所述的系统在检测SMN1和SMN2基因中的应用。
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| CN116144750A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-05-23 | 合肥行知生物技术有限公司 | 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用 |
| CN117802223A (zh) * | 2024-03-01 | 2024-04-02 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 基于2-δδct方法检测smn1基因和smn2基因拷贝数的试剂盒及其使用方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111118151A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-05-08 | 广东永诺医疗科技有限公司 | 基于数字pcr法的人smn1与smn2基因拷贝数检测试剂盒 |
-
2021
- 2021-12-01 CN CN202111454170.3A patent/CN113980961A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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