CN111363794A - 用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法，该检测引物组的引物序列包括1227A和β‑actin，引物β‑actin作为内参序列。本发明旨在建立用于检测RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析法，该方法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔解曲线，具有较高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、成像等操作，缩短了检测时间，且减少了PCR产物交叉污染的可能性。
Description
技术领域
本发明属于基因分析技术领域，特别涉及一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法。
背景技术
Rh血型系统因其复杂多态性及临床重要性而备受关注，其中RhD抗原免疫原性最强，相应的抗D是导致严重胎儿新生儿溶血病的最主要抗体。RhD抗原存在诸多的变异型，根据红细胞膜上D抗原表达的数目和性质，大致可分为弱D、部分D以及东亚人群常见的Del型等。
各种RhD变异型基因背景机制不一，免疫原性也不相同，尤其是Del表型的检测及个体RhD抗原免疫应答情况值得重视。有调查发现东亚人群中初筛为RhD阴性者中，约17～30％为Del型。Del表型最初由Okubo等人报道发现，其D抗原表达非常弱，每个红细胞膜上D抗原拷贝数低于200个，常规血清学检测不出，需要通过吸收放散技术才能检测到。该操作步骤较繁琐，对检测人员的手法和经验有一定要求，操作不当易产生错误结果，同时血清学方法只能检测出Del表型，并不能明确其分子机制。
随着DEL型分子机制的阐明，血型基因检测方法的发展为DEL型鉴定提供了新的技术手段。现已知导致Del表型的等位基因已超过17个，例如：RHD(IVS3+1A)、RHD c.3G>A、RHDc.1227G>A等；其中最常见的分子遗传背景为RHD基因exon9 c.1227G>A同义突变(RHD*01EL.01等位基因)，约占98％，因此该型又被称为Asia type DEL血型(亚洲型DEL血型)。由于1227位为exon93'端最后1位碱基，该突变虽未导致氨基酸的变化，但可能影响mRNA的正常拼接或拼接效率，导致RHD基因表达程度降低。
目前对于RHD c.1227G>A检测，常用的检测手段为PCR-SSP法。但该方法的不足之处在于PCR结束后，需开盖上样、电泳、成像等操作，耗时较长，且增加了产物交叉污染的风险。因此，建立RHD c.1227G>A等位基因的高效、便捷的检测方法十分必要。
发明内容
基于此，本发明的目地是提供一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测分析方法：熔解曲线分析法(Melting curve analysis)。该方法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔解曲线，具有较高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、成像等操作，缩短了检测时间，且减少了PCR产物交叉污染的可能性。该方法无需专门地探针设计，操作简单且成本较低。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组，其特征在于所述引物序列包括如下：
其中，引物β-actin作为内参序列，引物β-actin采用现有技术实现。
引物设计依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中公开的人类基因序列，选择适合的特异性突变点设计引物。该检测上游引物3'末端的最后一个碱基与等位基因特异性碱基互补，即特异性识别RHD exon91227A位点，特异性引物对仅扩增与其相匹配的等位基因，从而具有检测及分析特异、准确的效果。
一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的分析方法，该方法首先提取外周血基因组DNA，其次选用SYBR Green I作为染料，分别进行RHD exon9c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增，并对扩增产物进行熔解曲线分析，该方法采用下列引物序列：
其中，引物β-actin作为内参序列。
当两种熔解峰均出现时，判定为RHD exon9 c.1227G>A阳性；只有β-actin峰时，判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性；无β-actin峰时，判为试验无效。
进一步，所述的引物是按照下列方法设计的：查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494)，针对1227A特异性突变位点，定义：上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A，同时避免发夹结构和重复序列，扩增产物为140bp，应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。设计后引物进行BLAST搜索，避免扩增其它非特异性序列。
该引物可以特异性检测出RHD exon9 c.1227G>A，而正常不含有此突变位点的基因序列不会被扩增，因此可以高效明确地将两者进行区分，特异性地检测出含此突变位点的样本。
本发明根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物，β-actin作为内参，单一扩增目的基因，选用SYBR Green I染料法。SYBR Green I为非饱和型荧光染料，非特异性与双链DNA结合，操作简单，性价比高，满足试验要求；该方法无需专门地探针设计，操作简单且成本较低。
PCR扩增结束经熔解曲线分析可明确样本是否含有RHD c.1227G>A等位基因，整个操作简便直接；闭管操作、避免污染；仪器自动分析、检测通量高；检测特异性高、结果判断直观。能够快速方便的应用于RHD exon9 c.1227G>A等位基因大规模人群筛查，尤其在RhD阴性孕妇筛查中具有较大的应用价值。
附图说明
图1为本发明所实现RHD c.1227G>A和β-actin的溶解曲线图。
图2为本发明所实现RHD外显子9测序分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所实现的用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法，该方法首先提取外周血基因组DNA，其次选用SYBR Green I作为染料，分别进行RHD exon9c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增，并对扩增产物进行熔解曲线分析。其特征在于其中，两种熔解峰均出现时，判定为RHD exon9c.1227G>A阳性；只有β-actin峰时，判定为RHD exon9c.1227G>A阴性；无β-actin峰时，判为试验无效。其中，本发明的核心在于采用下列引物序列：
其中，另采用引物β-actin作为内参序列。
引物是按照下列方法设计的：查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494)，针对1227A特异性突变位点，定义：上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A，同时避免发夹结构和重复序列，扩增产物为140bp，应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。设计后引物进行BLAST搜索，避免扩增其它非特异性序列。引物β-actin是现有技术，在此不再赘述。
实施例如下：
实验对象
2018年10月-2020年1月于江苏省血液中心进行产前检查的孕妇87例，年龄21-41(中位数：29)岁；RhD初筛试验结果均为阴性，采外周静脉EDTA抗凝血约3mL；经本人知情同意。
主要试剂和仪器：
IgG/IgM型抗D试剂(Sanquin，荷兰)；IgG型抗D试剂(上海血液生物医药有限责任公司，中国)；基因组DNA提取试剂盒(原平皓公司，中国)；2*Taq PCR Mix(博尔迪生物，中国)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)；人类红细胞RhD基因分型试剂盒(PCR-SSP)(天津秀鹏生物技术，中国)；Labofuge400R低温高速离心机(Heraeus Corp.德国)；ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪(NanoDrop Corp.美国)；Alphalmager HP凝胶成像系统(Applied Biosystem，美国)；ABI7300扩增仪(AppliedBiosystems Corp,美国)。
方法：
血清学试验
采用间接抗人球试验的方法，使用3～4种不同克隆的IgG或IgM/IgG型抗D试剂进行RhD阴性确认。对于结果为阴性的样本进行吸收放散试验，检测是否为Del型。具体操作步骤参考《Del血型鉴定实验标准操作规程》，其中，吸收用试剂为IgG/IgM型抗D与IgG型抗D试剂混合使用，吸收时间为1h。
引物设计
查找GenBank数据库中RHD基因序列(序列号为NG_007494)，针对1227A特异性位点，应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。经过预实验，优化后的引物序列参见表1。另采用引物β-actin作为内参序列。
表1
基因组DNA提取
离心吸取孕妇白膜层细胞，按照DNA提取试剂盒操作要求，提取基因组DNA，采用ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪测定DNA含量与纯度，样品-20℃保存待用。
熔解曲线分析
采用Real-time PCR分别扩增RHD exon9 c.1227G>A及β-actin(作为内参)。PCR总体积为20μl，引物浓度为300nM，调整DNA模板浓度约为50ng，2×SYBR Green mix 10μl。PCR条件为：50℃温育2min，95℃预变性10min，之后95℃变性15s，60℃退火延伸1min共40个循环。所有反应均设3个复孔，并以水为模板设空白对照。PCR反应结束后，使用仪器默认的熔解曲线分析程序(95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃1min)进行分析，期间连续监测荧光信号，根据熔解曲线的Tm值的差异进行基因分型。
对比研究
采用商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(PCR-SSP法)对上述标本进行同步检测，严格按说明书操作。PCR反应条件为：反应条件为96℃2min，随即96℃20s，68℃60s，5个循环；96℃20s，65℃50s，72℃45s，10个循环；96℃20s，62℃50s，72℃45s，15个循环；72℃，5min，最后4℃保存。PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳(100V，30min)，用凝胶成像系统分析结果。
RHD基因测序
参考文献方法[Yan LX,Wu JJ,Zhu FM,et al.Molecularbasis ofD variants inChinese persons.Transfusion,2007；47(3):471-477]，对RHD外显子9进行测序分析，PCR总体积为20μl，引物浓度为200nM，PCR条件为：95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，1min；35个循环后72℃，10min；4℃。PCR产物经纯化后直接进行测序分析，测序引物同扩增引物。使用Sequencing Analysis和SeqScape软件进行测序图谱分析和序列比对。
结果：
血清学结果
87例标本中，RhD确认试验结果阳性者6例；对其余81例标本进行RhD吸收放散试验，结果为阳性者共15例。
熔解曲线分析
对全部87例样本分别进行RHD exon9 c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增，并对扩增产物进行熔解曲线分析。前者的Tm值(熔解温度)约为73度，后者约为88度，扩增阳性者分别在相应位置处出现单一峰型。在空白对照结果为阴性的前提下，两种熔解峰均出现时，判定为RHD exon9 c.1227G>A阳性；只有β-actin峰时，判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性；无β-actin峰时，判为试验无效(如图1所示)。共计16例样本检测出含有RHD c.1227G>A(占比18.4％)。
测序结果
对一例吸收放散试验结果为阴性，基因检测结果为阳性的样本进行RHD外显子9测序分析，证实含有c.1227G>A，如图2所示。
本次共对87例标本进行检测，其中16例含有RHD c.1227G>A等位基因，与商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(PCR-SSP法)结果一致，RHD c.1227G>A阳性率为18.4％。
本发明根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物，β-actin作为内参，单一扩增目的基因，选用SYBR Green I染料法。SYBR Green I为非饱和型荧光染料，非特异性与双链DNA结合，操作简单，性价比高，满足试验要求。根据溶解曲线出现的峰值不同，来判断不同的基因型，能够快速、准确地进行检测和分析，大大增加了基因检测的准确性和可靠性。
本发明建立的方法与直接单一，旨在检测出是否存在RHD c.1227G>A等位基因，虽然无法做到1227位点基因分型以及纯/杂合子判断，但是由于RHD c.1227G>A是亚洲型DEL血型的分子遗传背景，其RhD抗原表位没有发生变化。特别是，在亚洲型DEL孕妇中，均未发现抗D抗体产生。因此本发明对于RhD初筛阴性的孕妇进行RHD c.1227G>A检测，无论是纯合子、杂合子，或者合并其他RHD变异型情况，该等位基因的检出具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组，其特征在于所述引物序列包括如下：
1227A 140bp F：5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'
R：5'-ATGCTCCTTACTCCATTTT-3'
β-actin 137bp F：5'-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3'
R：5'-CGGCGGATCGGCAAA-3'
其中，引物β-actin作为内参序列。
2.一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的分析方法，该方法首先提取外周血基因组DNA，其次选用SYBR Green I作为染料，分别进行RHD exon9 c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增，并对扩增产物进行熔解曲线分析。两种熔解峰均出现时，判定为RHD exon9c.1227G>A阳性；只有β-actin峰时，判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性；无β-actin峰时，判为试验无效。其特征在于该方法采用下列引物序列：
1227A 140bp F：5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'
R：5'-ATGCTCCTTACTCCATTTT-3'
β-actin 137bp F：5'-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3'
R：5'-CGGCGGATCGGCAAA-3'
其中，引物β-actin作为内参序列。
3.如权利要求2所述的分析方法，其特征在于所述的引物是按照下列方法设计的：查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494)，针对1227A特异性突变位点，定义：上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A，同时避免发夹结构和重复序列，扩增产物为140bp，应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。
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