CN111363794A - 用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法 - Google Patents
用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法,该检测引物组的引物序列包括1227A和β‑actin,引物β‑actin作为内参序列。本发明旨在建立用于检测RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析法,该方法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔解曲线,具有较高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异,同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、成像等操作,缩短了检测时间,且减少了PCR产物交叉污染的可能性。
Description
技术领域
本发明属于基因分析技术领域,特别涉及一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组及分析方法。
背景技术
Rh血型系统因其复杂多态性及临床重要性而备受关注,其中RhD抗原免疫原性最强,相应的抗D是导致严重胎儿新生儿溶血病的最主要抗体。RhD抗原存在诸多的变异型,根据红细胞膜上D抗原表达的数目和性质,大致可分为弱D、部分D以及东亚人群常见的Del型等。
各种RhD变异型基因背景机制不一,免疫原性也不相同,尤其是Del表型的检测及个体RhD抗原免疫应答情况值得重视。有调查发现东亚人群中初筛为RhD阴性者中,约17~30%为Del型。Del表型最初由Okubo等人报道发现,其D抗原表达非常弱,每个红细胞膜上D抗原拷贝数低于200个,常规血清学检测不出,需要通过吸收放散技术才能检测到。该操作步骤较繁琐,对检测人员的手法和经验有一定要求,操作不当易产生错误结果,同时血清学方法只能检测出Del表型,并不能明确其分子机制。
随着DEL型分子机制的阐明,血型基因检测方法的发展为DEL型鉴定提供了新的技术手段。现已知导致Del表型的等位基因已超过17个,例如:RHD(IVS3+1A)、RHD c.3G>A、RHDc.1227G>A等;其中最常见的分子遗传背景为RHD基因exon9 c.1227G>A同义突变(RHD*01EL.01等位基因),约占98%,因此该型又被称为Asia type DEL血型(亚洲型DEL血型)。由于1227位为exon93'端最后1位碱基,该突变虽未导致氨基酸的变化,但可能影响mRNA的正常拼接或拼接效率,导致RHD基因表达程度降低。
目前对于RHD c.1227G>A检测,常用的检测手段为PCR-SSP法。但该方法的不足之处在于PCR结束后,需开盖上样、电泳、成像等操作,耗时较长,且增加了产物交叉污染的风险。因此,建立RHD c.1227G>A等位基因的高效、便捷的检测方法十分必要。
发明内容
基于此,本发明的目地是提供一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测分析方法:熔解曲线分析法(Melting curve analysis)。该方法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔解曲线,具有较高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异,同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、成像等操作,缩短了检测时间,且减少了PCR产物交叉污染的可能性。该方法无需专门地探针设计,操作简单且成本较低。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组,其特征在于所述引物序列包括如下:
其中,引物β-actin作为内参序列,引物β-actin采用现有技术实现。
引物设计依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中公开的人类基因序列,选择适合的特异性突变点设计引物。该检测上游引物3'末端的最后一个碱基与等位基因特异性碱基互补,即特异性识别RHD exon91227A位点,特异性引物对仅扩增与其相匹配的等位基因,从而具有检测及分析特异、准确的效果。
一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的分析方法,该方法首先提取外周血基因组DNA,其次选用SYBR Green I作为染料,分别进行RHD exon9c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析,该方法采用下列引物序列:
其中,引物β-actin作为内参序列。
当两种熔解峰均出现时,判定为RHD exon9 c.1227G>A阳性;只有β-actin峰时,判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性;无β-actin峰时,判为试验无效。
进一步,所述的引物是按照下列方法设计的:查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494),针对1227A特异性突变位点,定义:上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A,同时避免发夹结构和重复序列,扩增产物为140bp,应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。设计后引物进行BLAST搜索,避免扩增其它非特异性序列。
该引物可以特异性检测出RHD exon9 c.1227G>A,而正常不含有此突变位点的基因序列不会被扩增,因此可以高效明确地将两者进行区分,特异性地检测出含此突变位点的样本。
本发明根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,β-actin作为内参,单一扩增目的基因,选用SYBR Green I染料法。SYBR Green I为非饱和型荧光染料,非特异性与双链DNA结合,操作简单,性价比高,满足试验要求;该方法无需专门地探针设计,操作简单且成本较低。
PCR扩增结束经熔解曲线分析可明确样本是否含有RHD c.1227G>A等位基因,整个操作简便直接;闭管操作、避免污染;仪器自动分析、检测通量高;检测特异性高、结果判断直观。能够快速方便的应用于RHD exon9 c.1227G>A等位基因大规模人群筛查,尤其在RhD阴性孕妇筛查中具有较大的应用价值。
附图说明
图1为本发明所实现RHD c.1227G>A和β-actin的溶解曲线图。
图2为本发明所实现RHD外显子9测序分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明所实现的用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,该方法首先提取外周血基因组DNA,其次选用SYBR Green I作为染料,分别进行RHD exon9c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析。其特征在于其中,两种熔解峰均出现时,判定为RHD exon9c.1227G>A阳性;只有β-actin峰时,判定为RHD exon9c.1227G>A阴性;无β-actin峰时,判为试验无效。其中,本发明的核心在于采用下列引物序列:
其中,另采用引物β-actin作为内参序列。
引物是按照下列方法设计的:查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494),针对1227A特异性突变位点,定义:上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A,同时避免发夹结构和重复序列,扩增产物为140bp,应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。设计后引物进行BLAST搜索,避免扩增其它非特异性序列。引物β-actin是现有技术,在此不再赘述。
实施例如下:
实验对象
2018年10月-2020年1月于江苏省血液中心进行产前检查的孕妇87例,年龄21-41(中位数:29)岁;RhD初筛试验结果均为阴性,采外周静脉EDTA抗凝血约3mL;经本人知情同意。
主要试剂和仪器:
IgG/IgM型抗D试剂(Sanquin,荷兰);IgG型抗D试剂(上海血液生物医药有限责任公司,中国);基因组DNA提取试剂盒(原平皓公司,中国);2*Taq PCR Mix(博尔迪生物,中国);SYBR Green Master(Roche,瑞士);人类红细胞RhD基因分型试剂盒(PCR-SSP)(天津秀鹏生物技术,中国);Labofuge400R低温高速离心机(Heraeus Corp.德国);ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪(NanoDrop Corp.美国);Alphalmager HP凝胶成像系统(Applied Biosystem,美国);ABI7300扩增仪(AppliedBiosystems Corp,美国)。
方法:
血清学试验
采用间接抗人球试验的方法,使用3~4种不同克隆的IgG或IgM/IgG型抗D试剂进行RhD阴性确认。对于结果为阴性的样本进行吸收放散试验,检测是否为Del型。具体操作步骤参考《Del血型鉴定实验标准操作规程》,其中,吸收用试剂为IgG/IgM型抗D与IgG型抗D试剂混合使用,吸收时间为1h。
引物设计
查找GenBank数据库中RHD基因序列(序列号为NG_007494),针对1227A特异性位点,应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。经过预实验,优化后的引物序列参见表1。另采用引物β-actin作为内参序列。
表1
基因组DNA提取
离心吸取孕妇白膜层细胞,按照DNA提取试剂盒操作要求,提取基因组DNA,采用ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪测定DNA含量与纯度,样品-20℃保存待用。
熔解曲线分析
采用Real-time PCR分别扩增RHD exon9 c.1227G>A及β-actin(作为内参)。PCR总体积为20μl,引物浓度为300nM,调整DNA模板浓度约为50ng,2×SYBR Green mix 10μl。PCR条件为:50℃温育2min,95℃预变性10min,之后95℃变性15s,60℃退火延伸1min共40个循环。所有反应均设3个复孔,并以水为模板设空白对照。PCR反应结束后,使用仪器默认的熔解曲线分析程序(95℃15s,60℃1min,95℃15s,60℃1min)进行分析,期间连续监测荧光信号,根据熔解曲线的Tm值的差异进行基因分型。
对比研究
采用商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(PCR-SSP法)对上述标本进行同步检测,严格按说明书操作。PCR反应条件为:反应条件为96℃2min,随即96℃20s,68℃60s,5个循环;96℃20s,65℃50s,72℃45s,10个循环;96℃20s,62℃50s,72℃45s,15个循环;72℃,5min,最后4℃保存。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳(100V,30min),用凝胶成像系统分析结果。
RHD基因测序
参考文献方法[Yan LX,Wu JJ,Zhu FM,et al.Molecularbasis ofD variants inChinese persons.Transfusion,2007;47(3):471-477],对RHD外显子9进行测序分析,PCR总体积为20μl,引物浓度为200nM,PCR条件为:95℃,5min;95℃,30s;61℃,30s;72℃,1min;35个循环后72℃,10min;4℃。PCR产物经纯化后直接进行测序分析,测序引物同扩增引物。使用Sequencing Analysis和SeqScape软件进行测序图谱分析和序列比对。
结果:
血清学结果
87例标本中,RhD确认试验结果阳性者6例;对其余81例标本进行RhD吸收放散试验,结果为阳性者共15例。
熔解曲线分析
对全部87例样本分别进行RHD exon9 c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析。前者的Tm值(熔解温度)约为73度,后者约为88度,扩增阳性者分别在相应位置处出现单一峰型。在空白对照结果为阴性的前提下,两种熔解峰均出现时,判定为RHD exon9 c.1227G>A阳性;只有β-actin峰时,判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性;无β-actin峰时,判为试验无效(如图1所示)。共计16例样本检测出含有RHD c.1227G>A(占比18.4%)。
测序结果
对一例吸收放散试验结果为阴性,基因检测结果为阳性的样本进行RHD外显子9测序分析,证实含有c.1227G>A,如图2所示。
本次共对87例标本进行检测,其中16例含有RHD c.1227G>A等位基因,与商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(PCR-SSP法)结果一致,RHD c.1227G>A阳性率为18.4%。
本发明根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,β-actin作为内参,单一扩增目的基因,选用SYBR Green I染料法。SYBR Green I为非饱和型荧光染料,非特异性与双链DNA结合,操作简单,性价比高,满足试验要求。根据溶解曲线出现的峰值不同,来判断不同的基因型,能够快速、准确地进行检测和分析,大大增加了基因检测的准确性和可靠性。
本发明建立的方法与直接单一,旨在检测出是否存在RHD c.1227G>A等位基因,虽然无法做到1227位点基因分型以及纯/杂合子判断,但是由于RHD c.1227G>A是亚洲型DEL血型的分子遗传背景,其RhD抗原表位没有发生变化。特别是,在亚洲型DEL孕妇中,均未发现抗D抗体产生。因此本发明对于RhD初筛阴性的孕妇进行RHD c.1227G>A检测,无论是纯合子、杂合子,或者合并其他RHD变异型情况,该等位基因的检出具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的检测引物组,其特征在于所述引物序列包括如下:
1227A 140bp F:5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'
R:5'-ATGCTCCTTACTCCATTTT-3'
β-actin 137bp F:5'-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3'
R:5'-CGGCGGATCGGCAAA-3'
其中,引物β-actin作为内参序列。
2.一种用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的分析方法,该方法首先提取外周血基因组DNA,其次选用SYBR Green I作为染料,分别进行RHD exon9 c.1227G>A及β-actin荧光PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析。两种熔解峰均出现时,判定为RHD exon9c.1227G>A阳性;只有β-actin峰时,判定为RHD exon9 c.1227G>A阴性;无β-actin峰时,判为试验无效。其特征在于该方法采用下列引物序列:
1227A 140bp F:5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3'
R:5'-ATGCTCCTTACTCCATTTT-3'
β-actin 137bp F:5'-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3'
R:5'-CGGCGGATCGGCAAA-3'
其中,引物β-actin作为内参序列。
3.如权利要求2所述的分析方法,其特征在于所述的引物是按照下列方法设计的:查找GenBank数据库中RHD基因标准参考序列(NG_007494),针对1227A特异性突变位点,定义:上游引物(F链)3'端最后一个碱基序列特异性识别1227A,同时避免发夹结构和重复序列,扩增产物为140bp,应用Primer5引物设计软件进行扩增引物设计。
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