CN111378648A - 一种常温下快速提取纯化核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及一种应用于样本核酸提取纯化并使用于荧光PCR平台的多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂的提取纯化液及其应用。其特征在于所述提出方法包含氢氧化钠和硫酸铵，整个操作流程无需加热过程。本发明实现了常温下提取并纯化样本中的核酸，并使其能够满足核酸检测的要求。近年来，基因检测对于病原体的筛查和指导个体化用药有着非常重要的意义。血液样本基因组DNA的提取与纯化对检测结果至关重要。本发明实现了在常温下直接提取样本核酸，极大的简化了提取流程，值得推广。

Description

一种常温下快速提取纯化核酸的方法

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于常温下快速提取纯化核酸的方法。

背景技术

药物体内代谢、转运及作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可以影响药物在体内的有效浓度和个体对药物的敏感性，最终导致药物的个体差异化反应。随着分子生物学、基因组学和药物基因组学的发展，越来越多的药物基因组生物标记与药物个体差异化反应间的关系被阐明。药物基因组学已成为个体化用药、评估药效和药物不良反应发生风险、指导和评估新药研发的重要工具，部分上市新药、特别是靶向药仅限于特定基因型的适应症患者。因此，对患者进行药物相关的基因型检测已经越来越频繁和重要。

基因型检测方法有很多种，例如测序法、基于taqman的SNP分型检测、核酸杂交法等，且随着生物技术的不断发展，更精准、快捷的方法如雨后春笋般的冒出。目前，大部分方法都是基于核酸扩增后进行基因型检测的，因此，快捷的获取高质量的核酸作为扩增反应的模板至关重要。一方面，随着检测速度的提升，传统耗时的核酸提取和纯化已经成为整个检测过程的限速步骤，另一方面，传统的核酸提取纯化方法步骤繁多，容易出错和出现交差污染。

现在，提取纯化核酸的方法主要有硅胶膜纯化法、磁珠法、纤维素吸附法等，这些方法普遍存在成本高、操作繁琐、提取流程长、易交叉污染等问题。本发明针对现有核酸提取和纯化方法普遍存在的问题，提供了一种常温下快速提取纯化样本核酸的方法。本方法可以在常温条件下，10-20分钟内提取和纯化样本中的核酸，且用本方法获取的核酸可以用于大部分基因型检测的方法，保证检测反应的真实性和准确性。本发明快速、操作简便、成本低，具有广泛推广价值。

为达到上述目的，本发明要解决的技术问题是：在常温下快速方便的提取和纯化样本核酸。所述方法包含提取试剂盒和提取方法。提取试剂盒包含裂解液A和纯化液B。裂解液A为浓度为0.05-2 M 的氢氧化钠（NaOH）；纯化液B为浓度为0.1 M到过饱和浓度的硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]。

优选的，裂解液A为1 M 的氢氧化钠（NaOH）；

优选的，纯化液B为2 M的硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]；

提取方法为裂解液A与临床样本混匀0-5分钟后，直接加入纯化液B；静置0-20分钟后，8000g以上离心2-10分钟，所得上清即为分离且纯化的基因组DNA。0-1000倍稀释后用于核酸扩增或杂交反应。

优选的，裂解液A与临床样本体积为1：1，

优选的，纯化液B与裂解液A的体积为2：1，静置时间为5分钟，

优选的，离心条件为12000g离心2分钟，

优选的，分离纯化的基因组DNA可进行10倍稀释。

本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。

1. 本发明工作原理：利用强碱裂解细胞释放核酸，用硫酸铵中和碱性环境并沉淀样本中的蛋白质等杂质，从而分离纯化核酸。本发明针对的样本，包括血液、唾液、鼻咽拭子、尿液、肺泡灌洗液、痰液等样本。提取纯化的核酸包括DNA和RNA等。

2. 本发明中的常温是指一般的环境温度，主要是强调该方法无需使用金属浴、水浴锅等加热设备，但加热（无论是预热裂解液A,纯化液B或者将体系在高温下孵育）均能使本发明取得更好的提取纯化效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

实现了常温快速提取纯化基因组DNA。现有的快速法提取纯化基因组DNA多依赖于高温裂解释放核酸DNA，在高温操作中，容易导致意外事故或交叉污染。本方法无需高温步骤，也不需要将样品转移到水浴锅或金属浴等高温设备中，避免了上述缺点。

传统的硅胶膜或磁珠法需要“裂解，吸附和洗脱”等多步骤操作，这些操作步骤不仅繁琐耗时，容易出错，且多次开盖，更容易导致交叉污染。本方法将所有操作合在一管中进行，无需多次开盖，避免了繁琐操作和交叉污染。

实施例1. 样本为静脉采集的EDTA抗凝血。提取的基因组DNA以苏州旷远生物分子技术有限公司产品《人MTHFR基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法）》检测基因型。

为了监测本发明的有效性，在检测体系内平行的用苏州旷远生物分子技术有限公司产品《核酸提取纯化试剂盒》提取的基因组DNA作为模板进行检测，比对结果：

实施例2. 提取试剂的制备

配制一定浓度的氢氧化钠（NaOH）作为裂解液A；

配制一定浓度的的硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]作为纯化液B。

提取方法：吸取25微升EDTA抗凝血，加入25微升裂解液A，混匀后静置5分钟，加入50微升纯化液B，混匀后静置15分钟，12000g, 离心5分钟，上清即为分离纯化的基因组DNA，经纯净水10倍稀释后用于PCR检测。

平行对照基因组DNA严格按照说明书提取。

实施例3：荧光PCR检测人MTHFR基因多态性的准备

第一步：按照《人MTHFR基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法）》说明书配制PCR反应液（表1）：

表1.PCR反应体系组成

ddH<sub>2</sub>O	加至25μl
		PCR反应液	2.5μl
DNA聚合酶（5.0U/μl）	0.5μl
		基因组DNA	2μl

上述PCR反应液中的基因组DNA采用实施例2制备的基因组DNA;

第二步：上机检测

按照下表设置温度循环及信号采集程序

表3. PCR反应程序

注：“*”处设置Fam和VIC双通道采集荧光信号。

第四步：分析结果

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，比较本方法提取的基因组DNA和用苏州旷远生物分子技术有限公司产品《核酸提取纯化试剂盒》提取的基因组DNA作为模板的扩增结果，并根据扩增结果进行基因型判定。结果显示，两种方法提取的DNA基因型判定结果一致。

检测MTHFR等位基因反应体系内的内控荧光信号均合格。

注意：上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种常温下快速提取纯化核酸的方法，其特征在于：所述核酸提取裂解液、纯化液应用于样本核酸提取时，能够同时满足样本核酸的提取和纯化和荧光PCR反应的高效率进行。

2.根据权利要求1所述的一种核酸纯化液，其特征在于所述核酸纯化液中硫酸铵浓度在0.1M到饱和浓度。

3.根据权利要求1所述的纯化液，其特征在于所述纯化液中硫酸铵浓度为1M。

4.根据权利要求1所述的一种样本核酸提取裂解液，其特征在于所述核酸提取液中氢氧化钠浓度在0.2M到1M。