CN106011285B - 一种快速检测g6pd缺乏症基因突变的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，包括扩增检测试剂，所述扩增检测试剂包括下述(1)‑(5)中的至少一个引物对：(1)用于检测G6PD基因G1376T突变位点的特异扩增引物对；(2)用于检测G6PD基因G1388A突变位点的特异扩增引物对，(3)用于检测G6PD基因A95G突变位点的特异扩增引物对，(4)用于检测G6PD基因G871T突变位点的特异扩增引物对，(5)用于检测G6PD基因C1024T突变位点的特异扩增引物对。当试剂盒同时包括上述5对引物时，可以实现在单个反应管中同时检测G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型。

Description

一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD)缺乏是常见的遗传性红细胞酶病，又称蚕豆病,它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一个关键酶和限速酶，并普遍存在各种生物细胞内。G6PD缺乏会引起药物性溶血、感染性溶血和非球形细胞溶血性贫血等疾病的发生,新生儿由急性溶血性贫血可引起核黄疸,严重可导致智力低下等情况的发生。
G6PD缺乏症在世界范围内都比较普遍，并具有区域特异性，在热带和亚热带地区该病发病率较高，存在南高北低的趋势，不同民族差异明显，同一地区差异不显著等特点。在高发区G6PD缺乏症是引起新生儿高胆红素血症最主要的原因,严重者可因脑神经系统损害导致不可逆的智能和身体残疾,因此联合国卫生组织把该病列入6种主要应该预防和控制的遗传病之一。
G6PD缺乏症的分子基础是基因突变，G6PD基因是一个看家基因，位于x染色体长臂的2区8带，基因全长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码区长1548bp，编码515个氨基酸。随着对G6PD分子结构的不断阐明和研究的不断深入，用WHO标准化方法鉴定的G6PD生化变异型达400余种，基因突变型达到140余种。在中国人群中，A95G、G1376T、G1388A、G871T、C1024T等5种突变类型是中国人群中最常见基因突变型，约占总突变率的90％以上。
自1991年Chen等报告了基因全序列后，G6PD研究进入了基因水平，目前我国对常见已知G6PD基因突变的筛查方法有等位基因寡核苷酸探针杂交(Alleles-specificoligonucleotide probe，ASO)，该方法需要比较繁琐的PCR后的杂交盒洗脱等步骤，不仅操作繁琐，而且如果杂交或洗脱的条件控制不好时，易出现假阴性或假阳性的结果。错配碱基聚合酶反应/限制性内切酶图谱分析也能实现突变位点的检测，但此方法同样较为繁琐，而且经常出现酶切不完全的现象，造成结果判断不准确。杜传书报道的突变特异性扩增系统(ARMS)在中国人常见突变的检测中具有简便、快速、准确和经济等特点，但由于引物设计要求较高，早期还不能实现单管同时检测多个突变位点，因此，增加了实验的繁琐性，不利于突变位点检测的广泛推广应用。
随着分子诊断技术的不断发展，更多的检测方法应用于G6PD基因突变的检测。近年来发展起来的一种自动化、高通量的基因筛查技术—变性高效液相色谱(DenaturingHigh Performance Liquid Chromatographty，DHPLC)，已广泛用于遗传病基因突变筛查和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)的分析。这类技术的出现使G6PD突变的检测相对较便捷和稳定，但该方法需要较为昂贵的仪器设备，因此，也不利于市级以下单位的推广应用。高分辨率熔解曲线(HRM)对G6PD基因进行未知突变检测，有一定的优越性与易操作性,但是对于常见突变位点的检测，往往需要多管操作，因而不利于常见突变位点的筛查使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，具体来说是一种基于多重突变特异性扩增系统(ARMS)-多重熔解曲线技术快速检测G6PD基因位点G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型的突变的试剂盒。采用该试剂盒可在单管中同时检测G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型，而且在检测时无需进行PCR后的电泳检测分析，直接通过熔解曲线方法就能判断扩增的有无，检测更为快速、简便，且检测结果准确。
本发明所述的快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括下述(1)-(5)中的至少一个引物对：
(1)用于检测G6PD基因G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(2)用于检测G6PD基因G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示；
(3)用于检测G6PD基因A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
(4)用于检测G6PD基因G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
(5)用于检测G6PD基因C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示。
本发明试剂盒中所涉及的引物是针对已知突变位点的G1376T、G1388A、A95G、G871T、C1024T等5种突变类型的位点引物，引物能特异的扩增发生突变的这5个位点，未发生突变的位点不会有扩增。本发明试剂盒中的引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2用于检测G1376T位点的突变情况；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3用于检测G1388A位点的突变情况；SEQID NO：4和SEQ ID NO：5用于检测A95G位点的突变情况；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7用于检测G871T位点的突变情况；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8用于检测C1024T位点的突变情况。其中，SEQ ID NO：1既作为检测G1376T位点突变的引物对中的上游序列，同时也作为检测G1388A位点突变的引物对中的上游序列；SEQ ID NO：6既作为检测C1024T位点突变的引物对中的上游序列，同时也作为检测G871T位点突变的引物对中的上游序列。
在实际的应用过程中，本发明所述试剂盒中每对引物均可单独使用，也可将其任意组合使用。当试剂盒包括上述(1)-(5)中全部的引物对时，可以实现在单个反应管中同时检测G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型。
本发明所述试剂盒采用的是熔解曲线法，因此，本发明试剂盒中还包括荧光染料，具体可以是LC Green染料、SYBR Green I染料、G-Green染料或现有技术中常规使用的其它染料。优选采用LC Green染料，这样可以进一步提高检测结果的准确性、稳定性和分辨率。
本发明所述试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mg2+等。
本发明所述试剂盒用于检测G1376T、G1388A、A95G、G871T、C1024T等5种突变类型，检测原理如下：本发明所述的试剂盒引物仅能特异的扩增发生突变的上述5种类型的位点，如果发生突变，相应的，在检测熔解曲线的结果中就会有熔解曲线峰；而如果没有发生不变，检测熔解曲线的结果就没有熔解曲线峰。
同时，不同突变位点的熔解曲线的熔点也不相同。当本发明试剂盒中的荧光染料为LC Green染料，酶液、缓冲液及其它现有试剂盒中的常规且必须组分(如dNTP、Mg2+等)均为北京康为世纪生物科技有限公司的产品时，本试剂盒对各突变位点进行扩增所得的扩增产物的熔点分别如下：突变位点G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T的突变扩增产物的熔点分别为78.5±0.2℃、81.0±0.2℃、83.5±0.2℃、86±0.2℃和87.5±0.2℃，进一步确定为78.5℃、81℃、83.5℃、86℃和87.5℃。可见，采用本发明所述试剂盒通过不同熔解曲线熔点的分析就能判断突变的位点和类型。
与现有技术相比，当本发明所述试剂盒同时包括(1)-(5)中全部的引物对时，可以实现在单个反应管中同时检测G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型，在PCR后仪器即可自动检测结果；而传统的ARMS不仅需要多管处理，而且需要PCR后电泳检测(如在检测本试剂盒中所提到的5种类型的突变时，传统的ARMS方法需要5个PCR管，分别检测这5种类型的突变；在扩增完成后，还需要通过电泳检测是否有扩增片段，从而再判断突变的情况)，因此，本发明所述试剂盒具有快速、简便、准确、可批量化、应用广泛、成本低廉等诸多优点。
附图说明
图1为G1376T突变位点扩增产物的熔解曲线；
图2为G1388A突变位点扩增产物的熔解曲线；
图3为A95G突变位点扩增产物的熔解曲线；
图4为G871T突变位点扩增产物的熔解曲线；
图5为C1024T突变位点扩增产物的熔解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒对正常标本、G1376T突变样本、G1388A突变样本、A95G突变样本、G871T突变样本和C1024T突变样本共1种正常样本和5种突变类型的样本进行检测。
1、突变特异性扩增系统引物的设计
突变特异性扩增系统(ARMS)最重要的是如何设计出特异性的引物，因为野生型和突变型的序列几乎完全相同，只是突变位点具有一个碱基的差异，因此，如果仅仅以突变位点为引物末端进行扩增，在扩增过程中很容易出现假阴性或假阳性的扩增产物，从而影响诊断的准确性。因此，还需要在突变位点之前的引物序列，人为的引入1-3个不相匹配的碱基，从而提高扩增的特异性。
2、试剂盒的组成：
2.1ARMS引物
(1)用于检测G6PD基因G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：
CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID NO：1)；
TGAAAATACGCCAGGCCTCAA(SEQ ID NO：2)；
(2)用于检测G6PD基因G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示：
CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID NO：1)；
TGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT(SEQ ID NO：3)；
(3)用于检测G6PD基因A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示：
CCCTGAGCCGGACCCA(SEQ ID NO：4)；
GATGCACCCATGATGATGAATTTGC(SEQ ID NO：5)；
(4)用于检测G6PD基因G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示：
TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID NO：6)；
TGCTCCTCTGAGATGCATTTCATCAT(SEQ ID NO：7)；
(5)用于检测G6PD基因C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示：
TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID NO：6)；
CCACCTCTCATTCTCCACATTGAA(SEQ ID NO：8)。
2.2其它组成成分：
Hotstar-Taq酶，缓冲液，LC Green染料，dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及Mg2+均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
3、PCR反应体系的配制：
按下述表1配制PCR反应体系：
表1：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
PCR反应体系为50uL。
4、样本的来源及处理
样本来源于经测序分析，已经确认为5种突变类型的样本，DNA样本采用实验室常规DNA提取方法进行提取，以双蒸水稀释至20ng/μL，并于-20℃保存备用。
5、PCR扩增程序：
PCR反应所用仪器为普通的PCR仪。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，32个循环；在72℃延伸10min；然后从72℃到92℃进行熔解曲线分析。
6、结果检测与分析：
试剂盒检测5种突变位点，只要有突变发生，即可扩增出相应的扩增产物，而不同的扩增产物其熔解曲线的熔点都有差异，因而可以根据不同熔解曲线熔点的差异判断突变的类型。其中：
G1376T突变位点的扩增产物熔解曲线的熔点为78.5℃(如图1所示)；
G1388A突变位点的扩增产物熔解曲线的熔点为81℃(如图2所示)；
A95G突变位点的扩增产物的熔点为83.5℃(如图3所示)；
G871T突变位点的扩增产物熔解曲线的熔点为86℃(如图4所示)；
C1024T突变位点的扩增产物熔解曲线的熔点为87.5℃(如图5所示)。
实验结果显示，试剂盒的检测体系能非常有效检测出G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T的突变位点，与测序结果一致，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
实施例2：用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
采用试剂盒对62例筛查阳性的样本进行检测，同时对本方法检测阳性的样本进行测序验证，以确认本方法的准确性。
判断依据：
当扩增产物熔解曲线的熔点为78.5℃时判定为位点G1376T突变；
当扩增产物熔解曲线的熔点为81℃时判定为位点G1388A突变；
当扩增产物熔解曲线的熔点为83.5℃时判定为位点A95G突变；
当扩增产物熔解曲线的熔点为86℃时判定为位点G871T突变；
当扩增产物熔解曲线的熔点为87.5℃时判定为位点C1024T突变。
对62例筛查阳性样本的检测结果见表2。
表2:G6PD基因突变的检测结果
实验结果表明，本发明所述基于多重突变特异性扩增系统(ARMS)-多重熔解曲线技术的试剂盒可实现单管同时检测G6PD基因突变位点G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5种突变类型的检测，检测结果与测序方法一致，准确率为100％，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。

Claims (4)

1.一种基于多重突变特异性扩增系统-多重熔解曲线技术快速检测G6PD缺乏症基因突变的试剂盒，包括荧光染料和扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括下述(1)-(5)五个引物对：
(1)用于检测G6PD基因G1376T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(2)用于检测G6PD基因G1388A突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示；
(3)用于检测G6PD基因A95G突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
(4)用于检测G6PD基因G871T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
(5)用于检测G6PD基因C1024T突变位点的特异扩增引物对，其上下游碱基序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示。
2.据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料为LC Green染料、SYBRGreen I染料或G-Green染料。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括缓冲液、酶液、Mg2+和dNTP。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中的荧光染料为LC Green染料，本试剂盒对各突变位点进行扩增所得的扩增产物的熔点分别如下：
(1)G1376T突变位点的扩增产物的熔点为78.5±0.2℃；
(2)G1388A突变位点的扩增产物的熔点为81.0±0.2℃；
(3)A95G突变位点的扩增产物的熔点为83.5±0.2℃；
(4)G871T突变位点的扩增产物的熔点为86±0.2℃；
(5)C1024T突变位点的扩增产物的熔点为87.5±0.2℃。
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