CN105925691B - 一种快速检测人13号、18号、21号、x和y染色体数目的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，该扩增检测试剂包括：1条荧光标记的通用扩增引物和13对重复序列扩增引物中的至少一对，各有3对重复序列引物分别用于检测21号、18号和13号染色体的数目，有4对重复序列引物用于检测X或Y染色体的数目。每对重复序列引物均能同时扩增位于不同两条染色体上的目标序列和参考序列，目标序列和参考序列是位于目标染色体和参考染色体两条染色体上的两个相似序列，通过目标序列和参考序列扩增量的比值能有效检测出目标序列所在染色体的数量。采用该试剂盒检测可在单个反应管中同时检测13号、18号、21号、X和Y染色体数目，结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒.
背景技术
染色体病主要是因染色体的数目或结构异常引起的疾病，临床上常会引起流产、死胎、早夭、先天性智力低下、发育滞后、多发畸形及性发育不全等疾病的发生。目前，此类疾病仍无理想的治疗方法，因此，及早进行产前诊断以选择性的终止妊娠是预防该类疾病发生的关键。
羊水细胞培养和染色体核型分析是实现染色体病产前诊断的经典方法(Caspersson T,Zech L,Johansson C,et al.Identification of human chromosomes byDNA-binding fluorescent agents[J].Chromosoma,1970,30(2):215-227.),但是，该方法存在费时(一般要两周以上)、容易培养失败以及不能检测较小的染色体结构畸变等缺点。荧光原位杂交(FISH)技术应用于产前快速诊断，无需进行细胞培养，24小时内就可得出检验结果(Ho SSY,Chua C,Gole L,et al.Same-day prenatal diagnosis of commonchromosomal aneuploidies using microfluidics-fluorescence in situhybridization[J].Prenatal Diagnosis,2012,32(4):321-328.等)；但是，由于该技术操作繁琐并且要求具有良好的技术专业性，使得该技术不能大量的进行临床标本的应用。因此，需要建立更加快速而有效的产前诊断方法来弥补以上方法的一些缺陷和不足。
随着分子生物学的发展,目前已出现了几种快速分子诊断非整倍体的方法。STR-QF-PCR方法是目前应用最广的一种方法，该方法能实现非整倍体的检测，该方法涉及的文章(Atef SH,Hafez S,Helmy S,et al.QF-PCR as a Rapid Technique for RoutinePrenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies[J].Pediatric Research,2011,70:412-412.)和专利(公开号为103614361A、101838689A、103555849A、101407843、103074416A的发明专利)的研究相对较多，但是该技术的主要缺点是诊断需要依靠多态性位点，而多态性位点可能在某一人群能较好的进行诊断，但因为种族的差异可能会出现在其它人群中无法进行诊断的情况(Mann K,Donaghue C,Fox SP,et al.Strategies for the rapid prenataldiagnosis of chromosome aneuploidy[J].Eur J Hum Genet,2004,12:907-915.)；并且，基于STR的QF-PCR需要多种荧光标记，受STR多态性分子标记的限制，每条染色体需要检测多个位点才能满足检测的要求，如果检测位点少，那么就可能出现不能检测的情况；而如果检测位点多，那么需要的引物也越多，因此，针对不同的染色体往往需要多管PCR才能进行诊断，从而也影响了其使用的方便性和操作的简便性。多重连接探针扩增(MLPA)技术最开始应用于基因拷贝数的变化，后来应用于非整倍体疾病的诊断(Slater HR,Bruno DL,RenH,et al.Rapid,high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novelquantitative method(MLPA)[J].Journal of medical genetics,2003,40(12):907-912.)，由于该技术需要杂交过夜、连接以及产物的后续毛细管电泳分析等步骤，不仅对DNA样本的质量要求高，而且实验的后续分析也需要专门的软件，因此，也存在操作繁琐，条件苛刻，技术要求高等不足(Willis AS,Veyver I,Eng CM.Multiplex ligation‐dependentprobe amplification(MLPA)and prenatal diagnosis[J].Prenat Diagn,2012；32:315-320.)。
在本发明人的前期研究中，基本实现了常见染色体非整倍体的检测，相关的研究已经在SCI杂志上发表(Kong X,Li L,Sun L,Fu K,Long J,Weng X,Ye X,Liu X,Wang B,Yan S,Ye H,Fan Z.Rapid diagnosis of aneuploidy using segmental duplicationquantitative fluorescent PCR[J].Plos One,2014,9(3):e88932.)。但是，前期的研究还存在着一些缺陷或不足，前期的研究中每管只能检测染色体的一个位点，位点相对较少，易造成假阴性或假阳性情况的发生；另一方面，前期的研究也没有开发出一条公共的扩增引物，因此，每对重复序列均需要单独进行荧光标记，从而造成检测成本的增加，优化的难度的也增加；再者，由于前期单管检测的位点少，因此，需要多管同时检测，从而容易造成实验的繁琐以及操作上的错误。综上所述，前期的研究主要还存在检测位点少，荧光标记过多，不能实现单管检测等缺点。
鉴于前期检测体系的不足，本发明人重新筛选并验证了一系列新的重复序列分子标记，通过一系列新的分子标记序列设计并合成了相应的扩增引物，经过长期的优化，使1条通用引物和13对重复序列引物能在同一个PCR反应体系中扩增，并扩增出26个不同片段大小的荧光标记产物。通过不同片段大小的重复序列的扩增量的荧光比值，即可判断出所检测目标染色体的拷贝数。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒。该试剂盒可以在单个反应管中实现人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的快速检测，且检测结果准确、可靠、特异性强。
本发明所述的快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，该扩增检测试剂包括：
一、下述(1)-(13)中的至少一个引物对：
(1)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-1与6号染色体特异重复序列chr6的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：2所示；
(2)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-2与5号染色体特异重复序列chr5-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：4所示；
(3)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-3与9号染色体特异重复序列chr9-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：6所示；
(4)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-1与8号染色体特异重复序列chr8的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：8所示；
(5)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-2与19号染色体特异重复序列chr19的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：10所示；
(6)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-3与5号染色体特异重复序列chr5-2的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：12所示；
(7)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-1与2号染色体特异重复序列chr2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：14所示；
(8)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与9号染色体特异重复序列chr9-2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：16所示；
(9)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-3与15号染色体特异重复序列chr15的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：18所示；
(10)同时扩增1号染色体特异重复序列chr1与Y染色体特异重复序列chrY-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：20所示；
(11)同时扩增X染色体特异重复序列chrX-1与Y染色体特异重复序列chrY-2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：22所示；
(12)同时扩增16号染色体特异重复序列chr16与X染色体特异重复序列chrX-2的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：24所示；
(13)同时扩增3号染色体特异重复序列chr3与X染色体特异重复序列chrX-3的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：26所示；
二、通用引物：同时扩增上述(1)-(13)中所有重复序列的通用引物，其序列如SEQID NO：27所示。
本发明技术方案中，每一对引物均可以同时扩增不同两条染色体上的不同片段大小的特异重复序列，每对引物可以单独使用，也可以任意两对以上组合使用。当试剂盒包括上述(1)-(13)中全部的引物对时，可以实现在单个反应管中实现人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的快速检测，还可实现对具有两个检测位点的5号和9号染色体的非整倍体进行检测，并能实现对只有一个检测位点的1号、2号、3号、6号、8号、15号、16号及19号染色体的非整倍体进行筛查。
本发明技术方案中，所涉及的各重复序列及其公开扩增引物如下述表1所示：
表1：
上述表1中的“重复序列编号”是指在本试剂盒或反应体系中给予重复序列的编号，同时，也是其在毛细管电泳中的片段大小排列顺序；“重复序列所在染色体”是指重复序列(实际是两条碱基相似度非常高的序列)分别定位于哪两条染色体；“重复序列的位点”是本试剂盒给予的检测序列位点的名字或代码；“公共扩增引物”是指本试剂盒中扩增对应重复序列所用到的公共扩增引物。以重复序列1(SD1)为例：SD1为13号染色体与6号染色体的重复序列(分别如图1a、图1b所示)；两条染色体上的重复序列分别为SD1-13(NC_000013.11：45533516-45533710)和SD1-6(NC_000006.11：66803785-66803976)；试剂盒选择了重复序列SD1-13和SD1-6上的chr13-1和chr6两段DNA序列作为PCR扩增的目标检测序列；引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为重复序列中的chr13-1和chr6序列的公共扩增引物(如图1c所示)。
本发明技术方案中，所述碱基序列SEQ ID NO：28至碱基序列SEQ ID NO：40，分别是由通用引物与相应重复序列的公共扩增引物中的上游引物相连形成加尾而获得，具体如下：
(1)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：1相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：28的引物序列；
(2)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：3相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：29的引物序列；
(3)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：5相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：30的引物序列；
(4)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：7相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：31的引物序列；
(5)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：9相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：32的引物序列；
(6)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：11相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：33的引物序列；
(7)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：13相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：34的引物序列；
(8)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：15相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：35的引物序列；
(9)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：17相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：36的引物序列；
(10)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：19相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：37的引物序列；
(11)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：21相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：38的引物序列；
(12)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：23相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：39的引物序列；
(13)将通用引物(SEQ ID NO：27)与SEQ ID NO：25相连接，得到通用引物加尾的序列为SEQ ID NO：40的引物序列。
本发明技术方案中，所述的通用引物需要进行荧光标记以得到荧光标记的通用引物，将所述通用引物与重复序列的公共扩增引物中的一条相连形成加尾，那么，单条荧光标记的通用引物就能同时扩增13对重复序列，扩增出26个带荧光标记的PCR扩增产物。具体在荧光标记时，可以应用市面上各种常见的荧光标记对其进行标记，本申请中，优选采用6-FAM荧光标记于5’端，其中荧光基团FAM指羧基荧光素。
本发明试剂盒用于检测21-三体、18-三体、13-三体和性染色体数目异常的原理如下：本发明所述的试剂盒通过在染色体间特异重复序列(两个相似序列)的两端完全相同的DNA序列部位设计一对共同的扩增引物(如图1c所示)，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它条件的干扰，从而保证了两个序列(即为一个重复序列)扩增效率的一致性。将重复序列的其中一条公共扩增引物与通用引物相连接一起合成，那么扩增后的重复序列产物就带上了荧光标记，再根据荧光信号的高度计算重复序列间的峰值比例，即通过定量重复序列间的荧光比值判断两条染色体之间拷贝数的变化。对于常染色体，正常样本的重复序列的相对定量比值为2:2，即比值为1；而三体样本的比值为3:2，即比值为1.5(如后续表3所示)；对于性染色体的判断，利用常染色体与X染色体进行比较，利用常染色体与X染色体进行比较，X染色体与Y染色体进行比较，以判断染色体的数目(如后续表4所示)。
具体地，13号、18号、21号、X和Y染色体拷贝数根据重复序列间扩增产物的荧光值的比例来计算，分别如下：
(1)13号染色体拷贝数的计算是根据chr13-1与chr6扩增产物的荧光比值、chr13-2与chr5-1扩增产物的荧光比值以及chr13-3与chr9-1扩增产物的荧光比值；
(2)18号染色体拷贝数的计算是根据chr18-1与chr8扩增产物的荧光比值、chr18-2与chr19扩增产物的荧光比值以及chr18-3与chr5-2扩增产物的荧光比值；
(3)21号染色体拷贝数的计算是根据chr21-1与chr2扩增产物的荧光比值、chr21-2与chr9-2扩增产物的荧光比值以及chr21-3与chr15扩增产物的荧光比值；
(4)Y染色体拷贝数的计算是根据chr1与chrY-1扩增产物的荧光比值以及chrX-1与chrY-2扩增产物的荧光比值；
(5)X染色体拷贝数的计算是根据chrX-1与chrY-2扩增产物的荧光比值、chr16与chrX-2扩增产物的荧光比值以及chr3与chrX-3扩增产物的荧光比值。
进一步的，本发明提供的试剂盒中还包括有分子量内标，采用荧光染料标记分子量内标，包括75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500等14个片段长度，使用时加入电泳混合液与待测样本一起电泳，用于检测等位基因的片段长度。
本发明试剂盒中所涉及的引物均是来源于所筛选出的染色体间特异的重复序列，特异重复序列的开发是研究成果的关键，试剂盒所开发的重复序列主要有：
13号染色体与6号染色体间的重复序列分别为SD1-13(NC_000013.11：45533516-45533710)和SD1-6(NC_000006.11：66803785-66803976)；
13号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD2-13(NC_000013.11：103445949-103446146)和SD2-5(NC_000005.9：127445772-127445571)；
13号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD3-13(NC_000013.11：19056785-19063757)和SD3-9(NC_000009.11：96398139-96391197)；
18号染色体与8号染色体间的重复序列分别为SD4-18(NC_000018.10：55302603-55302903)和SD4-8(NC_000008.11：74166980-74166674)；
18号染色体与19号染色体间的重复序列分别为SD5-18(NC_000018.10：3456352-3458411)和SD5-19(NC_000019.9：46640534-46640620)；
18号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD6-18(NC_000018.10：43887609-43888143)和SD6-5(NC_000005.9：74906109-74906672)；
21号染色体与2号染色体间的重复序列分别为SD7-21(NC_000021.9：44675538-44677965)和SD7-2(NC_000002.11：86371055-86406746)；
21号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD8-21(NC_000021.9：20174376-20175408)和SD8-9(NC_000009.11：115391095-115392117)；
21号染色体与15号染色体间的重复序列分别为SD9-21(NC_000021.9：14035550-14044799)和SD9-15(NC_000015.9：46532227-46541458)；
1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD10-1(202371840-202414823)和SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
X染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD11-X(NC_000023.11：11335972-11339369)和SD11-Y(NC_000024.9：6701615-6704983)；
16号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD12-16(NC_000016.9：69151913-69154553)和SD12-X(NC_000023.11：44633469-44636065)；
3号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD13-3(NC_000003.11：25797003-25799031)和SD13-X(NC_000023.11：78129748-78131776)。
本发明技术方案中所述的重复序列是指不同的两条染色体上的两个大部分碱基序列相同的两个DNA序列，在一些文献中，也称为相似序列或同源基因或同源序列等。
本发明所述的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dNTP、Mg2+等。
与现有技术相比，本发明所述试剂盒可实现单管快速检测21号、18号、13号、X和Y染色体数目，同时，由于采用通过荧光标记的引物进行荧光标记扩增，一条荧光标记的引物就能实现所有26个扩增产物的荧光标记，从而大大节约了检测成本；另一方面，本发明所述试剂盒基于重复片段的SD-QF-PCR技术既具有STR-QF-PCR方法的简便性和批量处理能力，也具有MLPA技术的基于非多态性检测的优势。因此，本发明所述试剂盒具有快速、简便、准确、可批量化、应用广泛、成本低廉等诸多优点。
附图说明
图1为6号染色体和13号染色体间的重复序列的位点及引物信息；其中，(a)为6号染色体上的特异重复序列chr6在6号染色体上的位置，(b)为13号染色体上的特异重复序列chr13-1在13号染色体上的位置；(c)为6号染色体上的特异重复序列chr6和13号染色体上的特异重复序列chr13-1，以及根据序列设计的公共扩增引物；
图2为质控品(正常样本)的重复序列的扩增产物电泳图谱；
图3为13-三体综合征羊水标本的扩增产物电泳图谱；
图4为18-三体综合征羊水标本的扩增产物电泳图谱；
图5为21-三体综合征羊水标本的扩增产物电泳图谱；
图6为Klinefelter综合征(47,XXY)羊水标本的扩增产物电泳图谱；
图7为Turner综合征(45,X)羊水标本的扩增产物电泳图谱；
图8为超雄综合征(47,XYY)羊水标本的扩增产物电泳图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒对正常标本、待测13-三体标本、待测18-三体标本、待测21-三体标本、待测47,XXY标本、待测45,X标本、待测47,XYY标本进行检测。
1、重复序列的比对查询
通过NCBI的Blast功能，对不同染色体上的序列进行比对，在其中找出目标染色体和参考序列染色体上两条染色体特异的重复序列，并通过设计不同的引物对重复序列的特异性进行验证，最后筛查出的重复序列如下：
(1)13号染色体与6号染色体间的重复序列分别为SD1-13(NC_000013.11：45533516-45533710)和SD1-6(NC_000006.11：66803785-66803976)；
(2)13号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD2-13(NC_000013.11：103445949-103446146)和SD2-5(NC_000005.9：127445772-127445571)；
(3)13号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD3-13(NC_000013.11：19056785-19063757)和SD3-9(NC_000009.11：96398139-96391197)；
(4)18号染色体与8号染色体间的重复序列分别为SD4-18(NC_000018.10：55302603-55302903)和SD4-8(NC_000008.11：74166980-74166674)；
(5)18号染色体与19号染色体间的重复序列分别为SD5-18(NC_000018.10：3456352-3458411)和SD5-19(NC_000019.9：46640534-46640620)；
(6)18号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD6-18(NC_000018.10：43887609-43888143)和SD6-5(NC_000005.9：74906109-74906672)；
(7)21号染色体与2号染色体间的重复序列分别为SD7-21(NC_000021.9：44675538-44677965)和SD7-2(NC_000002.11：86371055-86406746)；
(8)21号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD8-21(NC_000021.9：20174376-20175408)和SD8-9(NC_000009.11：115391095-115392117)；
(9)21号染色体与15号染色体间的重复序列分别为SD9-21(NC_000021.9：14035550-14044799)和SD9-15(NC_000015.9：46532227-46541458)；
(10)1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD10-1(202371840-202414823)和SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
(11)X染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD11-X(NC_000023.11：11335972-11339369)和SD11-Y(NC_000024.9：6701615-6704983)；
(12)16号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD12-16(NC_000016.9：69151913-69154553)和SD12-X(NC_000023.11：44633469-44636065)；
(13)3号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD13-3(NC_000003.11：25797003-25799031)和SD13-X(NC_000023.11：78129748-78131776)。
2、试剂盒的组成：
2.1通用引物的设计
通过NCBI的Blast功能，设计一条长度为20bp，与人类或其它动物DNA序列没有同源性的一段DNA片段作为通用引物，通用引物序列具体如下所示。采用6-FAM荧光标记于5’端，即得通用荧光标记引物。
TYYW:5’-TGCACGCTGACGACTGGTAC-3’(SEQ ID NO：27)。
2.2试剂盒重复序列的扩增引物
本发明所述的快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒，根据筛选选出了13个重复序列，设计、合成并验证了一系列的引物，最后，试剂盒成功优化出了13对扩增引物。每对扩增引物中有一条采用通用引物连接加尾，以便能用荧光标记的通用引物对13个重复序列进行同时扩增，扩增出带有荧光标记的扩增产物，以便后续毛细管电泳分析检测。
(1)检测13号染色体数目的引物：
本发明总共筛选出了3个重复序列用于检测13号染色体的数目，分别是SD1(chr13-1和chr6)、SD2(chr13-2和chr5-1)和SD3(chr13-3和chr9-1)用于检测13号染色体的数目：
SD1(chr13-1和chr6)的扩增引物为：
5’-CCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3’(SEQ ID NO：1)；
5’-GCAAGATGAAGGGGATGTCCA-3’(SEQ ID NO：2)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD1上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACCCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3’(SEQ ID NO：28)；
SD2(chr13-2和chr9-1)的扩增引物为：
5’-CTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3’(SEQ ID NO：3)；
5’-TGCAAGATAGTGCAGCCTGG-3’(SEQ ID NO：4)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD2上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACCTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3’(SEQ ID NO：29)；
SD3(chr13-3和chr5-1)的扩增引物为：
5’-GGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3’(SEQ ID NO：5)；
5’-GGGCTGCTCAGGGTTCC-3’(SEQ ID NO：6)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD3上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACGGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3’(SEQ ID NO：30)；
序列chr6和chr13-1在染色体的定位分别如图1(a)、图1(b)中所示，重复序列的具体碱基序列以及相应的引物设计如图1(c)所示。
(2)检测18号染色体数目的引物：
本发明总共筛选出了3个重复序列用于检测18号染色体的数目，分别是SD4(chr18-1和chr8)、SD5(chr18-2和chr19)和SD6(chr18-3和chr5-2)用于检测18号染色体的数目：
SD4(chr18-1和chr8)的扩增引物为：
5’-TGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3’(SEQ ID NO：7)；
5’-TCATGCCTGGTCATTTGGGT-3’(SEQ ID NO：8)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD4上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3’(SEQ ID NO：31)；
SD5(chr18-2和chr19)的扩增引物为：
5’-GGGCCAAACCCAACCCT-3’(SEQ ID NO：9)；
5’-ATATCTGTGTTTTGTCCCACACC-3’(SEQ ID NO：10)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD5上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACGGGCCAAACCCAACCCT-3’(SEQ ID NO：32)；
SD6(chr18-3和chr5-2)的扩增引物为：
5’-TGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3’(SEQ ID NO：11)；
5’-CAGCCTCACTTAATTCTGAGGT-3’(SEQ ID NO：12)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD6上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3’(SEQ ID NO：33)；
(3)检测21号染色体数目的引物：
本发明总共筛选出了3个重复序列用于检测21号染色体的数目，分别是SD7(chr21-1和chr2)、SD8(chr21-2和chr9-2)和SD9(chr21-3和chr15)用于检测21号染色体的数目：
SD7(chr21-1和chr2)的扩增引物为：
5’-AGCTCCAGATCACCATGCTC-3’(SEQ ID NO：13)；
5’-AAAACTGGCCCGAAGGGTAG-3’(SEQ ID NO：14)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD7上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACAGCTCCAGATCACCATGCTC-3’(SEQ ID NO：34)；
SD8(chr21-2和chr9-2)的扩增引物为：
5’-AGGCAAACATTATACACACAATGG-3’(SEQ ID NO：15)；
5’-TCTGCTGCCTGTCAATATTTGT-3’(SEQ ID NO：16)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD8上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACAGGCAAACATTATACACACAATGG-3’(SEQ ID NO：35)；
SD9(chr21-3和chr15)的扩增引物为：
5’-TCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3’(SEQ ID NO：17)；
5’-TACTTTAATTAGCTGACAGCATGTG-3’(SEQ ID NO：18)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD9上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACTCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3’(SEQ ID NO：36)
(4)检测X和Y染色体数目的引物：
本发明总共筛选出了4个重复序列用于检测性染色体的数目，分别是SD10(chr1和chrY-1)、SD11(chrX-1和chrY-2)、SD12(chr16和chrX-2)和SD13(chr3和chrX-3)用于检测X和Y染色体的数目：
SD10(chr1和chrY-1)的扩增引物为：
5’-GGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3’(SEQ ID NO：19)；
5’-TCTGGAATGTGGCTGCTGT-3’(SEQ ID NO：20)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD10上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3’(SEQ ID NO：37)；
SD11(chrX-1和chrY-2)的扩增引物为：
5’-ACTGTCTAGACAATCACCCCA-3’(SEQ ID NO：21)；
5’-AAAAGTATGATCCAGCTACTACAGA-3’(SEQ ID NO：22)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD11上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACACTGTCTAGACAATCACCCCA-3’(SEQ ID NO：38)；
SD12(chr16和chrX-2)的扩增引物为：
5’-AGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3’(SEQ ID NO：23)；
5’-TTTCCCTCCAGGACCACCTT-3’(SEQ ID NO：24)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD12上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACAGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3’(SEQ ID NO：39)；
SD13(chr3和chrX-3)的扩增引物为：
5’-GGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3’(SEQ ID NO：25)；
5’-CCTGGTAATACAGCTCAGTGTCA-3’(SEQ ID NO：26)；
采用通用引物(SEQ ID NO：27)对SD13上游引物进行加尾连接：
5’-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3’(SEQ ID NO：40)；
2.3其它组成成分：
Hotstar-Taq酶，缓冲液，dATP、dTTP、dCTP和dGTP以及Mg2+均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
3、PCR反应体系的配制：
按下述表2配制PCR反应体系：
表2：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
PCR反应体系为50uL。
4、样本的来源及处理
样本来源于经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本，DNA样本采用实验室常规DNA提取方法进行提取，以双蒸水稀释至20ng/μL，并于-20℃保存备用。
5、PCR扩增程序：
PCR反应所用仪器为普通的PCR仪。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；在72℃延伸30min；最后于15℃保温备用。
6、毛细管电泳分析：将1uL PCR产物与23uL甲酰胺和1uL分子量标准品(AppliedBiosystems)混合。该混合物在95℃下变性3分钟，并放置在冰上，以防止重新退火，直到进一步分析。使用pop4凝胶(ABI)在ABI3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)进行电泳分析。对PCR产物进行分离，采用GeneMapper ID软件V3.2(Applied Biosystems)进行数据分析。分别统计SD-QF-PCR和染色体核型分析检测结果，并进行比对分析。
7、结果检测与分析：
当样本为正常标本时，21号、18号和13号染色体序列与参考染色体序列间的重复序列(相似序列)的扩增量比值为2:2，即1:1的比值关系(检测结果见图2)；而当目标染色体为三体时，其比值关系则为3:2，即为1.5:1的关系(检测结果见图3、图4、图5)。21号、18号和13号染色体的数目与检测比值的关系见表3。
表3：
当样本为正常男性标本时，X:Y＝1:1，常染色体:性染色体(X或Y)为2:1的比值关系；当样本为正常女性标本时，Y＝0，常染色体:X染色体为2:2的比值关系(检测结果见图2)。
当样本为47,XXY样本时，X:Y＝2:1；常染色体:Y染色体为2:1的比值关系；常染色体:X染色体为2:2的比值关系(检测结果见图6)。
当样本为45,X样本时，Y＝0；常染色体:X染色体为2:1的比值关系(检测结果见图7)。
当样本为47,XYY样本时，X:Y＝1:2；常染色体:Y染色体为2:2的比值关系；常染色体:X染色体为2:1的比值关系(检测结果见图8)。
X与Y染色体的数目与检测的比值关系见表4。
表4：
| 染色体核型 | X染色体:Y染色体 | 常染色体:X染色体 | 常染色体:Y染色体 |
| 46,XX | Y＝0(2:0) | 2:2 | Y＝0(2:0) |
| 46,XY | 1:1 | 2:1 | 2:1 |
| 45,X | Y＝0(1:0) | 2:1 | Y＝0(2:0) |
| 47,XXY | 2:1 | 2:2 | 2:1 |
| 47,XYY | 1:2 | 2:1 | 2:2 |
实验结果显示，试剂盒的检测体系能非常有效检测出21号，18号，13号，X和Y染色体的数目，与传统的染色体核型分析判断的结果一致，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。
实施例2：用实施例1所述试剂盒、方法、步骤等对临床标本进行检测
采用试剂盒对33例正常标本，12例21-三体标本，3例13-三体标本，6例18-三体标本，3例45,X样本，2例47,XXY样本，1例47,XYY样本进行检测，所有样本均来源自经传统的染色体核型分析方法确定核型的DNA样本。
通过21号染色体与2号，9号和15号染色体间的重复序列的荧光比值判断21号染色体的拷贝数。
通过18号染色体与8号，19号和5号染色体间的重复序列的荧光比值判断18号染色体的拷贝数。
通过13号染色体与6号，5号，9号染色体间的重复序列的荧光比值判断13号染色体的拷贝数。
通过X染色体与3号，16号和Y染色体间的重复序列的荧光比值判断X染色体的拷贝数。
通过Y染色体与1号和X染色体间的重复序列的荧光比值判断Y染色体的拷贝数。
21号，18号和13号染色体的检测结果见表5。
表5:13号、18号和21号染色体目标序列与参考序列间荧光比值结果及分析
X和Y染色体的检测结果见表6。
表6:X和Y染色体目标序列与参考序列间荧光比值结果及分析
实验结果表明，试剂盒可实现单管多重定量荧光PCR快速、准确和稳定的检测出13号、18号、21号、X和Y染色体的数目，检测结果与传统的染色体核型分析方法一致，准确率为100％，结果可读性好，分析、检测过程简单、高效。
Claims (7)
1.一种快速检测人13号、18号、21号、X和Y染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括：
一、下述(1)-(13)所述的引物对：
(1)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-1与6号染色体特异重复序列chr6的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：2所示；
(2)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-2与5号染色体特异重复序列chr5-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：4所示；
(3)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13-3与9号染色体特异重复序列chr9-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：6所示；
(4)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-1与8号染色体特异重复序列chr8的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：8所示；
(5)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-2与19号染色体特异重复序列chr19的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：10所示；
(6)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18-3与5号染色体特异重复序列chr5-2的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：12所示；
(7)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-1与2号染色体特异重复序列chr2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：14所示；
(8)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与9号染色体特异重复序列chr9-2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：16所示；
(9)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-3与15号染色体特异重复序列chr15的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：18所示；
(10)同时扩增1号染色体特异重复序列chr1与Y染色体特异重复序列chrY-1的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：20所示；
(11)同时扩增X染色体特异重复序列chrX-1与Y染色体特异重复序列chrY-2的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：22所示；
(12)同时扩增16号染色体特异重复序列chr16与X染色体特异重复序列chrX-2的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：24所示；
(13)同时扩增3号染色体特异重复序列chr3与X染色体特异重复序列chrX-3的引物对，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：26所示；
二、通用引物：同时扩增上述(1)-(13)中所有重复序列的通用引物，其序列如SEQ IDNO：27所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述碱基序列SEQ ID NO：28至碱基序列SEQ ID NO：40，分别是由通用引物与相应重复序列的公共扩增引物中的上游引物相连形成加尾而获得，各重复序列及其公开扩增引物如下述表1所示：
表1：
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的通用引物采用荧光标记于5’端。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的通用引物采用6-FAM荧光标记于5’端。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：13号、18号、21号、X和Y染色体拷贝数根据重复序列间扩增产物的荧光值的比例来计算，具体如下：
(1)13号染色体拷贝数的计算是根据chr13-1与chr6扩增产物的荧光比值、chr13-2与chr5-1扩增产物的荧光比值以及chr13-3与chr9-1扩增产物的荧光比值；
(2)18号染色体拷贝数的计算是根据chr18-1与chr8扩增产物的荧光比值、chr18-2与chr19扩增产物的荧光比值以及chr18-3与chr5-2扩增产物的荧光比值；
(3)21号染色体拷贝数的计算是根据chr21-1与chr2扩增产物的荧光比值、chr21-2与chr9-2扩增产物的荧光比值以及chr21-3与chr15扩增产物的荧光比值；
(4)Y染色体拷贝数的计算是根据chr1与chrY-1扩增产物的荧光比值以及chrX-1与chrY-2扩增产物的荧光比值；
(5)X染色体拷贝数的计算是根据chrX-1与chrY-2扩增产物的荧光比值、chr16与chrX-2扩增产物的荧光比值以及chr3与chrX-3扩增产物的荧光比值。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒可实现对13号、18号、21号、X和Y染色体的检测。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中的重复序列的公共扩增引物来源于以下重复序列：
(1)13号染色体与6号染色体间的重复序列分别为SD1-13即NC_000013.11：45533516-45533710以及SD1-6即NC_000006.11：66803785-66803976；
(2)13号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD2-13即NC_000 013.11：103445949-103446146以及SD2-5即NC_000005.9：127445772-127445571；
(3)13号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD3-13即NC_000013.11：19056785-19063757以及SD3-9即NC_000009.11：96398139-96391197；
(4)18号染色体与8号染色体间的重复序列分别为SD4-18即NC_000018.10：55302603-55302903以及SD4-8即NC_000008.11：74166980-74166674；
(5)18号染色体与19号染色体间的重复序列分别为SD5-18即NC_000018.10：3456352-3458411以及SD5-19即NC_000019.9：46640534-46640620；
(6)18号染色体与5号染色体间的重复序列分别为SD6-18即NC_000018.10：43887609-43888143以及SD6-5即NC_000005.9：74906109-74906672；
(7)21号染色体与2号染色体间的重复序列分别为SD7-21即NC_000021.9：44675538-44677965以及SD7-2即NC_000002.11：86371055-86406746；
(8)21号染色体与9号染色体间的重复序列分别为SD8-21即NC_000021.9：20174376-20175408以及SD8-9即NC_000009.11：115391095-115392117；
(9)21号染色体与15号染色体间的重复序列分别为SD9-21即NC_000021.9：14035550-14044799和SD9-15即NC_000015.9：46532227-46541458；
(10)1号染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD10-1即202371840-202414823以及SD10-Y即NC_000024.10：26328480-26365418；
(11)X染色体与Y染色体间的重复序列分别为SD11-X即NC_000023.11：11335972-11339369以及SD11-Y即NC_000024.9：6701615-6704983；
(12)16号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD12-16即NC_000016.9：69151913-69154553以及SD12-X即NC_000023.11：44633469-44636065；
(13)3号染色体与X染色体间的重复序列分别为SD13-3即NC_000003.11：25797003-25799031以及SD13-X即NC_000023.11：78129748-78131776。
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