CN106566874A

CN106566874A - 检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组及检测试剂盒

Info

Publication number: CN106566874A
Application number: CN201610720761.3A
Authority: CN
Inventors: 郭东星; 辛德莉; 胡文娟; 侯安存; 申昆玲
Original assignee: Beijing Friendship Hospital
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2036-08-24
Also published as: CN106566874B

Abstract

本发明公开了一种检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组，其中，所述引物组以肺炎支原体23S rRNA V区野生型序列及A2063G和A2064G突变型序列为模板设计而成；所述引物组由野生型上游引物序列如SEQ ID No.1所示、A2063G突变型上游引物序列如SEQ ID No.2所示、A2064G突变型上游引物序列如SEQ ID No.3所示，及通用下游引物序列如SEQ ID No.4所示组成。本发明检测试剂盒具有很高的灵敏度及特异性。能够对突变DNA和野生模板DNA进行定量，有效区分各种基因型，计算各种基因型相应比例。可实现临床肺炎支原体感染患者体内菌群基因型和含量变化的动态监测，利于临床研究肺炎支原体耐药机制和进展过程，便于观察临床治疗疗效。

Description

检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物，具体地说是检测肺炎支原体耐药A2063G和A2064G突变型序列的特异性引物及由其制备得到的检测试剂盒。

背景技术

临床治疗肺炎支原体感染用药主要为大环内酯类、四环素类和喹诺酮类，自2000年日本首次分离出肺炎支原体耐大环内酯类菌株以来，全世界范围内相继报道耐药肺炎支原体感染，尤以亚洲耐药现象最为严重，中国和日本均有多次报道耐药率超过90％，研发检测肺炎支原体耐药的检测试剂盒迫在眉睫。近年来，多个国家报道称发现同一患者同时感染多种基因型肺炎支原体，包括同时感染无突变型和A2063G突变型、A2063G和A2064G突变型，以及同时感染上述三种基因型菌株。本发明的发明人前期实验发现，同一患者同时感染多种基因型的现象正在增加，但是目前常用检测方法存在很大局限性。

目前常用的肺炎支原体耐药检测方法主要是以测序为基础的基因型分析方法和常规实时定量PCR，这些方法(1)灵敏度不高，很难准确检测到微量耐药菌；(2)无法定量或计算突变型比例；(3)不能动态监测临床治疗中患者体内耐药菌的产生及富集过程；(4)操作繁琐，耗时较长。具体介绍如下：

1.巢式PCR联合DNA直接测序法：巢式PCR须联合凝胶电泳和基因测序来确定结果，耗时较长，且2轮PCR操作繁琐，容易导致污染，对实验人员技术水平要求高；DNA易降解，直接测序法对DNA模板要求较高，所需仪器设备成本较高，难以在一般的实验室及医院广泛普及。DNA测序法往往以检测优势菌群为主，难以检测到微量菌群。随着多种基因型混合感染现象的增加，巢式PCR重复性降低，结果不稳定。该方法不能定量检测，目前多已被实时定量PCR取代。

2.常规实时定量PCR：具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量的特点，能够定量，操作简单。但是普通实时定量PCR也须联合DNA测序法来确定耐药位点是否发生突变。如本领域技术人员公开了一种检测肺炎支原体耐药突变的方法，见中国专利CN102002522B。其采用常规实时定量PCR的方法扩增目的基因，并利用Cycling探针技术通过测定扩增产物荧光强度，实现实时监控扩增产物量的目的。其缺陷是，(1)灵敏度不佳，仅为10²拷贝/PCR反应。(2)其仅能定量一种突变基因型，无法确定待测样本中各种基因突变类型所占百分比例(临床样本常出现混合基因型)。(3)多重荧光定量PCR方法中，使用多种荧光标记的探针法大大增加了检测成本，对设备要求较高，不利于大范围推广使用，尚未有商业化检测试剂盒。

本领域技术人员还提出了利用在特异性引物的上游引物中引入次黄嘌呤I来提高检测灵敏度的方法。但是发明人发现，此方法存在如下缺陷：(1)由于上游引物末端位置固定，错配碱基的位置对特异性引物与模板的结合能力至关重要，会一定程度上影响相应的灵敏度和准确性，因此次黄嘌呤的引入位点至关重要，并不是任意位点均可以实现高灵敏度的效果，设计出理想引物有很大难度。(2)虽然在上游引物中引入次黄嘌呤I可以在一定范围内提高灵敏度，但其会降低检测的特异性，使得灵敏度和特异性不能同时得到提升。

如何解决上述技术问题，是本领域技术人员研究的热点。

发明内容

本发明的第一目的在于解决现有技术中肺炎支原体耐药检测灵敏度较低的问题，第二解决现有技术中上游引物次黄嘌呤插入位点不利于提高灵敏度的问题，以及上游引物插入次黄嘌呤后会降低检测特异性，使得灵敏度和特异性不能同时提升的问题，而提出一种检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述引物组的检测试剂盒。

本发明的技术原理是：等位基因特异性实时定量PCR检测技术(allele specificreal-time PCR，AS-PCR)是一种区分单核苷酸多态性的实时定量PCR技术，即根据等位基因位点设计特异性引物和非特异性引物：特异性引物的3’末端与突变位点碱基互补(即引入错配碱基)，理论上只扩增突变型模板，并对突变DNA进行定量；非特异性引物不区分突变，能同时等效地扩增野生型和突变型模板，并对模板总量进行定量，因此采用AS-PCR技术不仅能够检测突变基因而且能够对突变DNA的比例进行定量，非常适合应用于临床检测。

错配碱基的设置是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3’—5’外切矫正活性的特点，当引物3’端的特异碱基与模板形成错配时，链延伸反应会因3’,5’—磷酸二酯键形成障碍而受阻，导致PCR反应产物量大幅下降。因此，引物3'端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率，错配时引发扩增效率大大降低。在AS-PCR中，根据实时定量PCR反应中特异性引物和非特异性引物扩增反应的Ct值并结合相应标准曲线即可区分野生型和突变型菌株，并计算突变菌株DNA所占比例。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下具体技术方案：

一种检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组，其中，所述引物组以肺炎支原体23S rRNA V区野生型序列及A2063G和A2064G突变型序列为模板设计而成；所述引物组由野生型上游引物序列如SEQ ID No.1所示、A2063G突变型上游引物序列如SEQ ID No.2所示、A2064G突变型上游引物序列如SEQ ID No.3所示，及下游引物序列如SEQ ID No.4所示组成。

SEQ ID No.1(23NU)：5’-TTAGGCGCAACGGGACGG-3’

SEQ ID No.2(2063MU)：5’-TTAGGCGCAACGGGAIIIG-3’

SEQ ID No.3(2064MU)：5’-TTAGGCGCAACGGGAIIIAG-3’

SEQ ID No.4(23D)：5’-CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACIGC-3’

所述野生型模板序列如SEQ ID No.5所示。

SEQ ID No.5：ttaggcgcaacgggacggaa(2063)a(2064)

gaccccgtgaagctttactgtagcttaatattgatcaggacattatcatgtagagaataggtaggagcaatcgatgcaagttcgctaggacttgttgatgcgaaaggtggaatactacccttggttgtgtgctgttctaattggtaactgttatccag。

所述突变型模板序列如SEQ ID No.6所示，2063及2064位点均由a突变为g；

SEQ ID No.6：ttaggcgcaacgggacggag(2063)g(2064)

上述的特异性引物组在制备检测肺炎支原体耐药突变基因的PCR试剂中的应用。

一种检测肺炎支原体耐药突变基因的PCR试剂，其中，所述试剂包括上述的特异性引物组及PCR反应液。

所述PCR反应液为：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW2601M)；去核酸水。UltraSYBR Mixture是专用于染料法(SYBR Green I)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2X，包含Goldstar Taq DNA Polymerase、PCR buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、Mg²⁺和ROX校正染料。属于本领域技术人员公知PCR反应预混液，市售购买可得。

上述的特异性引物组或上述的PCR试剂在制备检测肺炎支原体耐药突变基因试剂盒中的应用。

一种检测肺炎支原体耐药突变基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述引物组。

一种检测肺炎支原体耐药突变基因的试剂盒，其中，所述试剂盒组成为：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture、权利要求1所述引物组、标准品、阴性对照和阳性对照。

所述标准品为十倍梯度稀释的肺炎支原体质粒；所述阴性对照为去核酸水；所述阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。

本发明的有益效果：

1.特异性好，结果准确，重复性好：为了保证检测特异性，本试剂盒特异性引物在临近3’末端人为引入错配碱基次黄嘌呤I，并首次在下游引物也引入错配碱基，以阻止非完全匹配的延伸。经验证，当突变模板含量在100％～0.1％时，检测到的百分含量和理论值具有良好的一致性；批次内和批次间变异系数(CV)均低于0.2。

2.灵敏度高：能够准确检测出微量菌群，本试剂盒的灵敏度达0.1％，即可检测突变DNA的比例低至0.1％；在临床耐药早期，突变菌株含量较少时，能够及时检测、早期诊断。

3.能够对突变DNA和野生型模板进行定量：有效区分样本中的各种基因型，计算各种基因型相应比例。

4.能够用于动态监测：可实现临床肺炎支原体感染患者体内菌群基因型和含量变化的动态监测，利于临床研究肺炎支原体耐药机制和进展过程，便于观察临床治疗疗效。

附图说明

图1为AS-PCR标准曲线(1)；

图2为AS-PCR标准曲线(2)；

图3为检测特异性(1)；

图4为检测特异性(2)；

图5为检测特异性(3)；

图6为检测特异性(4)；

图7A为准确性和灵敏度(2063MU)(1)

图7B为准确性和灵敏度(2064MU)(1)

图8A为准确性和灵敏度(A2063G)(2)

图8B为准确性和灵敏度(A2064G)(2)

图9A为2063MU引物扩增A2063G突变型标准品的扩增曲线；

图9B为2064MU引物扩增A2064G突变型标准品的扩增曲线；

图9C为23NU引物扩增野生型标准品的扩增曲线；

图10A为ASPCR检测野生型临床样本的扩增曲线；

图10B为ASPCR检测混合株(野生型+A2063G)的临床样本的扩增曲线；

图10C为ASPCR检测混合株(野生型+A2064G)的临床样本的扩增曲线；

图11A为2063MU/2064MU+23D※引物对分别扩增10⁷拷贝/μl A2063G突变模板和野生型模板的扩增曲线；

图11B为2063MU/2064MU+23D引物对分别扩增10⁷拷贝/μl A2063G突变模板和野生型模板的扩增曲线；

图11C为2063MU/2064MU+23D※引物对分别扩增10⁷拷贝/μl A2064G突变模板和野生型模板的扩增曲线；

图11D为2063MU/2064MU+23D引物对分别扩增10⁷拷贝/μl A2064G突变模板和野生型模板的扩增曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1肺炎支原体耐药突变基因检测方法的建立

1.引物设计

本试剂盒以肺炎支原体23S rRNA V区序列为模板设计上游引物(23NU、2063MU、2064MU)，在特异性引物2063MU的3’末端倒数第2、3、4位引入错配碱基次黄嘌呤I，在特异性引物2064MU的3’末端倒数第3、4、5位引入错配碱基次黄嘌呤I，并首次在其下游引物(23D)3’末端倒数第3位中引入了次黄嘌呤I，以提高引物特异性。本试剂盒研发过程中共设计十六对引物，经多次验证选取最佳引物对。

2.标准品构建：构建含有目的基因位点的野生型和突变型质粒，进行定量分析后以十倍梯度法稀释，以10⁸～10¹拷贝/μl作为标准品。利用标准品进行AS-PCR反应，绘制标准曲线。

3.ASPCR方法建立：筛选能够区分野生型和突变型模板的特异性引物；

4.性能验证：对本试剂盒的特异性、灵敏度、准确性、重复性进行验证，并在方法验证后检测临床样本。

实施例2本发明试剂盒的制备及使用方法

本发明试剂盒的组成：

1.用于检测肺炎支原体突变基因的引物序列组，所述引物组由野生型上游引物序列如SEQ ID No.1所示、A2063G突变型上游引物序列如SEQ ID No.2所示、A2064G突变型上游引物序列如SEQ ID No.3所示，及通用下游引物序列如SEQ ID No.4所示组成。

2.PCR反应液可以为本领域技术人员公知组成，本发明推荐组成为：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture(With ROX)25μl，(UltraSYBR Mixture,购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW2601M)。去核酸水22μl、模板2μl。

本发明试剂盒使用方法：

1.待检样本中DNA的提取：采用全基因组DNA提取试剂盒(Universal Genomic DNAkit，购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW22985)提取待测样本DNA。

2.AS-PCR扩增

采用试剂盒对上述提取物进行扩增。

PCR反应体系：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture(With ROX)25μl，上游引物(SEQ IDNo.1、2、3)和下游引物(SEQ ID No.4)各0.5μl，去核酸水22μl，模板2μl。

反应条件为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环；95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

3.结果判读

本发明试剂盒还包含标准品、阴性对照和阳性对照，标准品为十倍梯度稀释的肺炎支原体质粒，用于样品检测时构建标准曲线进行定量；阴性对照为去核酸水；阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。每次检测样品时必须设立阴性对照和阳性对照，两种对照对于结果判读起决定性作用。

有效扩增：阴性对照阴性，阳性对照阳性；

无效扩增：阴性对照和阳性对照均阳性提示体系污染；

无效扩增：阴性对照和阳性对照均阴性提示体系错误或试剂失效。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

(1)结果判定方法：

首先进行MP感染阴阳性判定：以取高于样品噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，Tm(melting temperature)值与阳性对照相符，以非特异性引物(23NU)Ct(cyclethreshold)值判断MP DNA的存在。见表1。

表1

Ct值(23NU)	结果判定
		≦39	阳性
>39	阴性

然后对MP感染判定阳性的样本进行耐药突变阴阳性判定：

以取高于样品噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，Tm(meltingtemperature)值与阳性对照相符，以特异性引物(2063MU、2064MU)Ct(cycle threshold)值和△Ct(Ct(特异性引物)-Ct(非特异性引物))≦12判断MP耐药突变DNA的存在。见表2。

表2

特异性引物Ct值(2063MU、2064MU)和△Ct值	结果判定
		≦39且△Ct≦12	耐药阳性
>39或△Ct>12	耐药阴性

(2)数据处理方法：

a.绘制标准曲线

采用ABI公司荧光定量PCR仪7500的SDS软件分析实验结果并绘制标准曲线。

用特异性引物(2063MU、2064MU)与非特异性引物(23NU)分别扩增对应的标准品，以标准品浓度对数值为横坐标，相应Ct值为纵坐标，得到相应的特异性和非特异性标准曲线。

b.对总DNA和突变DNA进行定量并计算耐药菌群突变比例

通过非特异性标准曲线和非特异性引物(23NU)扩增样品的Ct值对MP总DNA进行定量，通过特异性标准曲线和相应的特异性引物(2063MU、2064MU)扩增的Ct值对相应的耐药突变DNA进行定量。根据下面公式计算耐药菌群比例：

耐药突变比例＝突变DNA拷贝数/总DNA拷贝数×100％

实施例2试剂盒灵敏度及特异性验证实验

(1)标准曲线绘制

用特异性引物(SEQ ID No.2 2063MU、SEQ ID No.3 2064MU)与非特异性引物(SEQID No.1 23NU)分别扩增对应突变型标准品(每反应做3孔，Ct＝MeanCt±SD)，以标准品浓度对数值为横坐标，相应Ct值为纵坐标，得到相应的特异性和非特异性标准曲线，如图1及图2所示，标准曲线几乎重叠，说明特异性引物序列中非匹配碱基(I)的引入未影响引物的扩增效率，模板量与Ct值具有良好的相关性，能够对模板进行定量。其中，图1中标准曲线1：◆所在直线为2063MU引物扩增A2063G突变型标准品得到的特异性标准曲线；y＝-3.2215x+38.008；R²＝0.9992。标准曲线2：●所在直线为23NU引物扩增A2063G突变型标准品得到的非特异性标准曲线；y＝-3.4723x+39.526；R²＝0.99934。图2中标准曲线1：◆所在直线为2064MU引物扩增A2064G突变型标准品得到的特异性标准曲线；y＝-3.312x+39.129；R²＝0.9914。标准曲线2：●所在直线为23NU引物扩增A2064G突变型标准品得到的非特异性标准曲线；y＝-3.3364x+38.986；R²＝0.9897。

(2)特异性验证

通过以下两种方法鉴定：

①测定等量突变型与野生型模板的Ct值之差。用特异性引物分别扩增10⁷拷贝突变型和野生型质粒，每反应重复3次，分别得到相应的Ct值(MeanCt±SD)。当两者的△Ct>10时即说明特异性引物具有良好的分辨突变型与野生型模板的能力。实际检测目的基因型与其他基因型标准品的△Ct均>10，如图3和图4所示；其中，图3中a为2063MU扩增10⁷拷贝/μlA2063G模板的扩增曲线，b为2063MU扩增10⁷拷贝/μlA2064G模板的扩增曲线，c为2063MU扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，△Ctab＝11.2，△Ctac＝15.7。其中图4中a为2064MU扩增10⁷拷贝/μlA2064G模板的扩增曲线，b为2064MU扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，c为2064MU扩增10⁷拷贝/μlA2063G模板的扩增曲线，△Ctab＝10.6，△Ctac＝14.5。当特异性引物扩增的野生型质粒模板量低于10⁴拷贝时无法检测到相应的荧光信号，说明引物具有良好的特异性。

②测定野生型和突变型模板混合物的Ct值。将5×10⁷拷贝/μl的突变型模板视作突变型比例100％，将5×10⁶拷贝/μl的野生型模板加入到等体积的梯度稀释的5×10⁶～5×10²拷贝/μl的突变DNA中，得到突变型模板占比例为50％～0.01％的混合物，对混合物进行检测，每反应重复3次，其Ct值仍与未加野生型DNA的突变型标准曲线具有良好的一致性，如图5及图6所示，其中图5◆所在直线为2063MU引物扩增A2063G突变型标准品得到的特异性标准曲线；●为2063MU引物扩增梯度稀释的A2063G突变型模板和5×10⁶拷贝/μl野生型模板的混合物DNA；y＝-3.4011x+37.849；R2＝0.9997。图6◆所在直线为2064MU引物扩增A2064G突变型标准品得到的特异性标准曲线；●为2064MU引物扩增梯度稀释的A2064G突变型模板和5×106拷贝/μl野生型模板的混合物DNA；y＝-3.4539x+38.741；R2＝0.9974。

说明本试剂盒具有良好的特异性。

(3)准确性与灵敏度验证

使用特异性引物扩增10⁵拷贝/μl野生型模板，每反应做5孔，共重复3次，计算临界值＝Ct平均值+3SD；使用特异性引物扩增上述突变型模板比例为100％～0.01％的混合模板，每反应重复3次，得到相应的Ct值(MeanCt±SD)，均小于临界值，如图7A及7B所示。其中，图7A中直线为2063MU引物扩增10⁵拷贝/μl野生型模板得到的临界值；●为2063MU引物扩增A2063G突变模板比例为100％～0.01％的混合物所得Ct值。图7B中直线为2064MU引物扩增10⁵拷贝/μl野生型模板得到的临界值；●为2064MU引物扩增A2064G突变模板比例为100％～0.01％的混合物所得Ct值。

用非特异性引物和特异性引物同时扩增突变模板为100％～0.01％的混合模板，根据标准曲线可以得到相应的DNA模板拷贝数，进而计算出突变比例(突变比例＝特异性引物扩增得到的模板拷贝数/非特异性引物扩增得到的模板拷贝数×100％)。实际检测结果与理论值具有较好的吻合度，如图8A及图8B所示，图8A为A2063G突变模板理论比例为0.01％～100％的混合模板的检测比例；图8B为A2064G突变模板理论比例为0.01％～100％的混合模板的检测比例。突变比例为0.01％时其相应的Ct值仍显著小于临界值；当突变模板比例为0.1％时，与检测到的比例具有良好一致性，低于0.1％时，测得值将显著偏离理论值，因此最终确定本试剂盒检测肺炎支原体耐药位点突变基因比例的灵敏度可达0.1％。

用特异性引物和非特异性引物分别扩增相应的标准品，所得扩增曲线梯度均匀，灵敏度均达10拷贝，如图9A、图9B及图9C所示，其中，图9A为2063MU引物扩增A2063G突变型标准品的扩增曲线，从左到右依次为10⁸～10¹拷贝；图9B为2064MU引物扩增A2064G突变型标准品的扩增曲线，从左到右依次为10⁸～10¹拷贝；图9C为23NU引物扩增野生型标准品的扩增曲线，从左到右依次为10⁸～10¹拷贝。本发明非特异性引物和特异性引物检测相应基因型模板的灵敏度均达10拷贝。优于目前多数市售肺炎支原体检测试剂盒或其他肺炎支原体耐药位点检测方法(10²～10³拷贝)。

(4)重复性验证

用本发明试剂盒检测突变模板比例为100％～1％的Ct值，每个梯度浓度重复做3天，每天每次做3复孔，计算检测结果的变异系数，同一天3复孔的变异系数称为同批次的变异系数(intra-assay coefficient of variation)，3天之间的变异系数称为批次间的变异系数(inter-assay coefficient of variation)(表3)。2063MU引物检测A2063G位点突变比例，批次内的变异系数均小于0.06，批次间的变异系数均小于0.2；2064MU引物检测A2064G位点突变比例，批次内的变异系数均小于0.05，批次间的变异系数均小于0.15，均具有良好的重复性。

表3肺炎支原体耐药突变位点检测试剂盒的重复性验证

(5)检测临床标本应用

使用本试剂盒和巢式PCR联合DNA测序法分别检测178份临床咽拭子标本，本试剂盒检测总阳性率92.1％(164/178)，包括野生型14份，单A2063G突变型36份，混合株114份；巢式PCR联合DNA测序法阳性率为86％(153/178)。两种方法同时检测为阳性样本为150份，同为阴性11份，阳性符合率为91.5％、阴性符合率为78.6％、总符合率为90.4％，(表4)；在150份同时检测为阳性的样本中，两种方法结果相符的有146份。因此，本试剂盒与传统巢式PCR方法具有良好的符合率，另外，巢式PCR联合DNA检测法不能检测出混合株中的其他基因型，在这方面，本试剂盒检测临床标本检测能力明显优于传统巢式PCR联合DNA测序法。其中，图10A为ASPCR检测野生型临床样本的扩增曲线；图10B为ASPCR检测混合株(野生型+A2063G)的临床样本的扩增曲线；a是用非特异性引物扩增的扩增曲线；b是A2063G特异性引物扩增的扩增曲线图。图10C为ASPCR检测混合株(野生型+A2064G)的临床样本的扩增曲线。a是用非特异性引物扩增的扩增曲线；b是A2064G特异性引物扩增的扩增曲线。

表4肺炎支原体耐药突变基因检测试剂盒临床标本应用评价

实施例3下游引物插入及不插入次黄嘌呤对灵敏度和特异性影响的对比实验

1、实验说明：

(1)该实验中PCR反应体系及反应条件均与上述本发明试剂盒相同；

(2)配制PCR反应体系：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture(With ROX)25μl、上游引物和下游引物各0.5μl、去核酸水22μl、模板2μl。

引物序列：

SEQ ID No.2(2063MU)：5’-TTAGGCGCAACGGGAIIIG-3’

SEQ ID No.3(2064MU)：5’-TTAGGCGCAACGGGAIIIAG-3’

SEQ ID No.4(23D)：5’-CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACIGC-3’

SEQ ID No.7(23D※)：5’-CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC-3’

(3)进行实时定量PCR反应，反应条件为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃1min，共40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

2、实验结果：

分别采用23D※或23D作为下游引物与上游引物2063MU、2064MU进行组合，测定等量突变型与野生型模板的Ct值之差，比较23D※和23D引物的灵敏度和特异性差异。用不同组合的引物分别扩增10⁷拷贝突变型和野生型质粒，每反应重复3次，分别得到相应的Ct值(MeanCt±SD)。如图11所示；图11A、B、C、D为2063MU/2064MU+23D※与2063MU/2064MU+23D引物对扩增相应突变型和野生型模板的比较。其中，图11A中a为2063MU+23D※扩增10⁷拷贝/μl A2063G模板的扩增曲线，平均Cta＝19.5；b为该引物对扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，平均Ctb＝29；△Ctab＝9.5。图B中a为2063MU+23D扩增10⁷拷贝/μlA2064G模板的扩增曲线，平均Cta＝15.7；该引物对扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，平均Ctb＝32.6；△Ctab＝16.9。图C中a为2064MU+23D※扩增10⁷拷贝/μl A20634模板的扩增曲线，平均Cta＝18.5；b为该引物对扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，平均Ctb＝27.0；△Ctab＝8.5。图D中a为2064MU+23D扩增10⁷拷贝/μlA2064G模板的扩增曲线，平均Cta＝15.9；b为该引物对扩增10⁷拷贝/μl野生型模板的扩增曲线，平均Ctb＝26.5；△Ctab＝10.6。

图11B与图11D中△Ctab(Cta＝15.7/△Ctab＝10.6)明显大于图11A与图11C中△Ctab值(△Ctab＝9.5/△Ctab＝8.5)，说明引物对2063MU/2064MU+23D区分突变型模板和野生型模板的特异性明显优于引物对2063MU/2064MU+23D※；另外，引物对2063MU/2064MU+23D扩增突变型模板的Ct值(Cta＝15.7/Cta＝15.9)明显小于2063MU/2064MU+23D扩增相应模板的Ct值(Cta＝19.5/Cta＝18.5)，说明2063MU/2064MU+23D扩增突变型模板的灵敏度明显高于引物对2063MU/2064MU+23D※；

上述实验结果表明，在上游引物同为2063MU/2064MU的条件下，在下游引物(23D)序列中引入次黄嘌呤碱基具有重要作用，能够较大幅度地提升该方法检测突变型模板的灵敏度与特异性，有效的改进现有技术中灵敏度和特异性较差且不能同时提升的问题。

Claims

1.一种检测肺炎支原体耐药突变基因的特异性引物组，其特征在于，所述引物组以肺炎支原体23SrRNA的V区野生型基因序列及A2063G和A2064G突变型基因序列为模板设计而成；所述引物组由野生型上游引物序列如SEQ ID No.1所示、A2063G突变型上游引物序列如SEQ ID No.2所示、A2064G突变型上游引物序列如SEQ ID No.3所示，及下游引物序列如SEQID No.4所示组成。

2.如权利要求1所述的特异性引物组，其特征在于，所述野生型序列如SEQ ID No.5所示。

3.如权利要求1所述的特异性引物组，其特征在于，所述突变型序列如SEQ ID No.6所示。

4.权利要求1、2或3所述的特异性引物组在制备检测肺炎支原体耐药突变基因的PCR试剂中的应用。

5.一种检测肺炎支原体耐药突变基因的PCR试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1、2或3所述的特异性引物组及PCR反应液。

6.如权利要求5所述的PCR试剂，其特征在于，所述PCR反应液为：PCR缓冲液UltraSYBRMixture和去核酸水。

7.权利要求1所述的特异性引物组或权利要求6所述的PCR试剂在制备检测肺炎支原体耐药突变基因试剂盒中的应用。

8.一种检测肺炎支原体耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

9.一种检测肺炎支原体耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成为：PCR缓冲液UltraSYBR Mixture、权利要求1所述引物组、标准品、阴性对照和阳性对照。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为十倍梯度稀释的肺炎支原体质粒；所述阴性对照为去核酸水；所述阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。