CN111235261B - 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1～29基因分型的试剂盒 - Google Patents
用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1～29基因分型的试剂盒 Download PDFInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明提供了用于检测HPA 1~29基因分型的PCR扩增引物组和Taqman探针组合，所述的组合包含16个引物组。本发明还提供了含有所述的PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒。本发明具有如下技术效果：本发明采用ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术对HPA 1~29基因进行定性分型检测，并在传统ARMS基础上进行了改良，克服了现有检测方法的种种缺陷，具有广泛的应用前景与临床参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测人类血小板特异性抗原HPA 1～29基因分型的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
血小板是哺乳动物血液中的有形成分之一，形状不规则，无细胞核，其主要功能是凝血和止血，并在炎症反应中发挥重要作用。血小板表面存在着大量抗原，通常分为两类：一类是与其他血细胞或组织共有的抗原，称血小板相关抗原，如HLA-I类抗原、ABO抗原系统等；另一类是血小板特异性抗原，表现出血小板独特的遗传多态性，即人类血小板抗原(Human Platelet Antigen，HPA)。
HPA是位于血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)上的抗原表位，是血小板本身固有的抗原。同种血小板抗体一般由输血、妊娠或造血干细胞移植等免疫刺激而产生。研究显示，约2.5％的妊娠妇女会产生血小板抗体，在初次输血患者中约1.7％带有血小板抗体，而在多次输血患者中，约有8％产生血小板特异性抗体。迄今共有35个HPA被发现和正式命名，分别为HPA-1-29w，其中HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15是双等位基因抗原系统，其他22种抗原是单个低频抗原。HPA基因多态性主要是由于相应血小板膜糖蛋白结构基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)引起，从而导致相应位置的单个氨基酸变异所致。
如今，随着血小板制品临床应用的日益广泛，其输注过程中产生的问题也明显增多，分子生物学技术的发展，为血小板基因分型提供了极大的可能，对临床血小板制品的应用影响重大。若机体缺乏某种血小板抗原，在妊娠期、输血或器官移植后接触到此抗原，可引起血小板输注无效症(Platelet Transfusions Refractoriness，PTR)、输血后紫癜(Post-transfusion Purpura，PTP)和胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(Foetal andNeonatal Allo-immune Thrombocytopenia，FNAIT)。因此，临床输注血小板制品前，应进行血小板交叉配型，为患者选择合适的血小板输注。同时，对人群的血小板基因分型将有助于建立HPA型别已知的血小板供者库，提高临床血小板制品输注有效性，缓解血小板制品紧张的状况。因此，血小板基因分型不仅便于提供兼容的血液制品，保证同种型别的个体进行血小板输注，防止输血相关并发症，对临床输血安全具有重要意义，还将有助于PTR、PTP、FNAIT及血栓性疾病的辅助检查和病因学诊断。
传统血小板血清学分型方法主要包括血小板免疫荧光检测法(PIFTs)、血小板抗原单克隆抗体固定化(MAIPA)及流式细胞术，但由于其对样本要求高、特异性抗血清的缺乏、无法快速自动获得结果且重复性差等因素的限制，加上血小板基因型检测技术日渐成熟，大部分实验室均采用血小板基因分型技术。目前主要的血小板基因分型方法有PCR-RFLP法、PCR-SSOP法、PCR-SSP法、PCR-SBT法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-RFLP即PCR-限制性片段长度多态性检测技术，基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。此方法需构建等位基因特异性酶切位点，操作复杂，结果不能自动获得且带有主观性。PCR—SSOP即PCR-特异性序列寡核苷酸探针，基本方法是用人工合成的HPA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检样品经PCR扩增的HPA基因片段杂交，从而确定HPA型别。此法存在大量探针设计困难，以及在实验程序的最佳条件摸索中需要投入巨大的人力物力，并需配备杂交仪，而且实验室间可重复性差、准确度有待提高。PCR-SSP即序列特异性引物技术，基本方法是设计出一整套等位基因特异性引物，借助PCR技术获得HPA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HPA型别。此法操作相对简单，省去酶切、杂交等步骤，PCR扩增后直接电泳观察结果，如今广泛应用于临床。但其结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高。PCR-SBT(PCR-直接测序法)也可用于HPA基因分型，但由于价格昂贵、操作复杂、时间冗长等原因，未在临床得到广泛应用。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。
Taqman荧光定量PCR法，即在PCR反应体系中加入一条与靶片段两引物内的序列互补的荧光标记探针，探针为5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定性分析或通过标准曲线进行定量分析的方法。Taqman荧光PCR通常应用一对引物和一条探针，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定；多重Taqman荧光PCR是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。因此，多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。
中国专利CN201010170627.3，名称为“一种HPA等位基因分型检测试剂盒”，提供了一种HPA等位基因分型检测试剂盒。试剂盒中含有引物和MGB-探针，该试剂盒可以根据扩增后观察两种荧光曲线的不同和散点图的分布，判断等位基因基因型，从而完成HPA等位基因分型检测。其应用MGB探针，FAM/VIC分别标记HPA各亚型a/b基因型，根据扩增后两种荧光曲线来判断等位基因型，该方法成本较高，每个亚型需a/b两条MGB探针，不适用于广泛应用。
扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)分析法一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法，其依据的基本原理是：TaqDNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，因此对于3’末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3’末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异性扩增片段，从而表明模板DNA没有与引物3’末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异性扩增片段，表明模板DNA上具有与引物3’末端相应的突变。特异性引物设计和筛选是ARMS技术中的关键，在引物中引入第二个错配碱基可以提高检测的准确性和灵敏度。所以该方法在实际应用中具有简便、快速、费用低、准确性和灵敏度高等特点，一旦方法建立后比其他SNP分型技术具有更适合大规模检测的特点，具有广阔的应用前景。
由此可见，本领域亟需一种操作简便快捷，价格适中，且准确度高的检测方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测人类血小板特异性抗原HPA 1～29基因分型的方法和试剂盒。
本发明的原理是：采用扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)分析法结合Taqman荧光PCR技术对HPA 1～29基因进行定性分型检测。根据数据库中公布的中国人群HPA基因序列，应用ARMS分析法设计各亚型特异性引物，并设计各位点特异性探针，以FAM/HEX/ROX/CY5标记，每管设计有中国人群频率为100％的亚型，可监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对HPA1～29基因的定性分型检测。
除HPA-14b是由于3个碱基缺失外，HPA基因多态性主要是由于相应血小板膜糖蛋白结构基因中的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)引起。普通的引物设计方法对于区分HPA基因亚型存在一定局限性，准确性不高，或者需要设计特异性探针，成本较高。
由于HPA基因多态性高，各亚型的序列高度相似，大部分只存在一个碱基的差别，在实际检测中，很容易出现假阳性，为了更准确地进行检测，避免假阳性的发生，发明人使用了ARMS引物设计方法，并在传统ARMS基础上进行了改良，增加了扩增引物的特异性，提高了检测的准确性。
发明人的主要技术思路如下：发明人根据检测结果，设计了四类引物——正常无错配引物、弱错配引物、强错配引物和联合错配引物。我们首先检测正常无错配引物，若检测结果完全正确，则引物可用；若检测结果出现弱假阳，则使用弱错配引物，即在正常引物5’端5个碱基以内引入一个错配碱基，若检测结果完全正确，则引物可用；若仍存在假阳，则使用强错配引物，在距离3’突变碱基1～4个碱基位置，引入一个错配碱基，若检测结果完全正确，则引物可用；若仍存在假阳，则使用联合错配引物，即在引物5’端5个碱基以内和距离3’突变碱基1～4个碱基位置同时引入错配碱基，从而提高引物检测的特异性。
本发明的方法仅需要设计特异性ARMS引物，Taqman探针均为通用型，在提高准确性和灵敏度的同时，极大的降低了成本，更适合大规模检测的特点，具有广阔的应用前景。
本发明使用多重Taqman荧光PCR方法，是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。HPA基因亚型众多，运用多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。另外，本发明使用冻干方法，将引物探针混合液冻干于96孔板底部，大大提高的引物探针的稳定性，具有较好的实际应用价值。
本发明的技术方案如下：
用于检测HPA 1～29基因分型的PCR扩增引物组和Taqman探针组合，所述的组合包含如下表所示的16个引物组，每个引物组含有的引物对和探针的核苷酸序列如下表所示：
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5，3’端的淬灭基团为BHQ-1或BHQ-2。
SEQ ID No.001～110的核苷酸序列如下表所示：
本发明提供了含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，所述的试剂盒每孔设计有中国人群频率为100％的亚型，用于内部质控，监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。
使用多重荧光PCR技术在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的基因型存在与否。
本发明提供了含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒，所述的试剂盒包含的PCR扩增引物组和Taqman探针均冻干于96孔板底部。
所述的试剂盒中PCR扩增引物组和Taqman探针分布于16孔中，一个96孔板可进行6个样本的检测。
所述的试剂盒中还包括PCR反应混合液、Taq酶和光学封膜。
所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
本发明具有如下技术效果：本发明采用ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术对HPA 1～29基因进行定性分型检测，并在传统ARMS基础上进行了改良，克服了现有检测方法的种种缺陷，具有广泛的应用前景与临床参考价值。
附图说明
图1-1～图1-16分别为1号孔至16号孔的扩增曲线。
图2为Sample1测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图3为Sample2测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图4为Sample3测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图5为Sample4测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图6为Sample5测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图7为Sample6测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
具体实施方式
实施例1
1.原料与设备
1.1PCR反应混合液的配制：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，按上述比例配制6*PCR反应混合液50mL，-20℃长期保存，4℃暂存备用。
1.2反应板的配制：
1.2.1引物探针混合液配制：引物0.54OD/mL，探针1.05μM，配成6*引物探针混合液。
1.2.2按下表点板：
SEQ ID No.001～110的核苷酸序列如下表所示：
1.2.3反应板冻干：按下表程序将反应板冻干。包装于避光锡箔袋，-20℃保存。
1.3样本的来源
1)血液样本采集
血液样本用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)、乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素(Heparin)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。
2)核酸样本萃取
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
3)核酸样本定量
萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于15-40ng/μl。
4)核酸样本质量规范
核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.0之间。
1.4所需实验设备
荧光定量PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机、96孔板离心机。
2.基因分型过程
2.1反应体系的配置：每一个样本需同时进行16管独立的实时荧光PCR反应，一个反应板进行6个样本检测。按下表配制混合母液：
表1：PCR反应体系
取18μL配制好的混合液分装至反应板各孔中，贴上光学封膜，短暂离心后，放入荧光PCR仪中。
2.2PCR反应程序：如表2所示：
表2：PCR反应程序
请依各型号的自动循环控温仪操作手册进行程序设定，荧光信号采集点设定在65℃；荧光信号采集波长设定FAM、HEX、ROX、CY5。
2.3实验结果分析：
检测样本所有孔中内标基因CY5 Ct值均小于35且扩增曲线正常的情况下，可继续进行结果判读。将ABI 7500原始结果文件输出为Excel文件，并将其导入判读软件中，软件可直接分析出待检样本HPA 1～29基因型别。结果举例如下：
结论：整个实验流程仅需约2个小时，实验结果准确，通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HPA 1～29基因型。
图1-1～图1-16分别为1号孔至16号孔的扩增曲线。标记探针扩增曲线正常且Ct＜32，判断该标记探针为阳性反应；无扩增曲线升起或Ct≥32，判断该标记探针为阴性反应。
图2为Sample1测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图3为Sample2测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图4为Sample3测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图5为Sample4测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图6为Sample5测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图7为Sample6测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 用于检测人类血小板特异性抗原HPA 1~29基因分型的试剂盒
<160> 110
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gacgaaaata cctgcaatca 20
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aacaaaaggt taacattttc agttat 26
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ggaagcatgg tggaagtaag ta 22
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ataaaaggga aagtgcatac aacactg 27
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cacattcttg gtaaatcctg t 21
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acattcttgg taaatcctgc 20
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ttagaatatg gatcaatatg cag 23
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ccttatgatg acctattctt tgaaaagt 28
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gggtaccaag ctggcaac 18
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aactgaccag gtgacccgct tc 22
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attgcttagg gcccgc 16
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gggagcccta catgata 17
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cctgcaggct gggactc 17
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ccaagcacca gctctcc 17
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gtggagtgta agaagtttga at 22
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ctgaatcctg ctgtgaagtg 20
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ctgaatcctg ctgtgaagta 20
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ggatgttgaa gctgcaaaga c 21
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cctacctcag accaagacac ccgt 24
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<211> 25
<212> DNA
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atgtgattga agataacact gtcac 25
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atgtgattga agataacact gtcat 25
<210> 94
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<212> DNA
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caacataata aacatcagat cttt 24
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catatcacac ccttccctgt gagc 24
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aagattgtgc tgctggaag 19
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gaggtgataa cttcatgggt ctg 23
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<400> 110
tgtgagctcc tgccagcagt 20
Claims (5)
1.用于检测HPA 1～29基因分型的PCR扩增引物组和Taqman探针组合，其特征在于，所述的组合包含如下表所示的16个引物组，每个引物组含有的引物对和探针的核苷酸序列如下表所示：
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5，3’端的淬灭基团为BHQ-1或BHQ-2。
2.含有如权利要求1所述的PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR反应混合液、Taq酶和光学封膜。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸dNTP、1.8mM氯化镁、60.3mM氯化钾，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、甘油0.6％v/v，二甲基亚砜5％v/v和甲酰胺2.5％v/v，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针均冻干于96孔板底部。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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